JP7745878B2

JP7745878B2 - 植物における標的ｄｎａのメチル化を抑制する方法

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Publication number: JP7745878B2
Application number: JP2021567729A
Authority: JP
Inventors: 剛厚見; 健松村; 税増田; 剛犬飼; 航松永; 玲華礒田
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2020-12-25
Publication date: 2025-09-30
Anticipated expiration: 2040-12-25
Also published as: EP4083207A1; WO2021132669A1; CN114867857A; US20230056748A1; JPWO2021132669A1; EP4083207A4

Description

本発明は、植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法に関する。

植物の遺伝子発現は、エピジェネティクス制御と呼ばれるＤＮＡメチル化やヒストンの化学的修飾によって調節されている。これは、ＲＮＡサイレンシングによって引き起こされる現象で、ＲＮＡサイレンシングは転写後型遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）及び転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）の２つに大別される。植物は機能性成分の蓄積レベルの調節をこのエピジェネティクス制御に依存しており、これらの有用成分を植物に高レベルに蓄積させるためには、このエピジェネティクスを自在に操る技術が必要となる。しかしながら、エピジェネティクス制御は複雑すぎて、標的ＤＮＡのメチル化を特異的に解除することは不可能と考えられていた。

これまでに、ＤＮＡ配列特異的に脱メチル化を誘導する技術はほとんど存在しておらず、近年になってようやく、ｄＣＡＳ融合ＴＥＴ１を用いて脱メチル化を誘導する技術が報告されたに過ぎない（非特許文献１）。しかしながら、ｄＣＡＳ融合ＴＥＴ１を用いて脱メチル化を誘導する場合には、組み換え技術が必須であるため、簡便かつ迅速に脱メチル化を誘導することはできないといった問題が存在する。

国際公開第２０１４／１２９５６０号

Gallego-Bartolome J et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 55, E2125-E2134 (2018) Gallusci P et al., Trends in Plant Science 22, 610-623 (2017) Matzke M. A and Mosher R. A, Nature Reviews Genetics 15, 394-408 (2014) Philips J. G et al., PloS one, 12(2), e0171311 (2017) Otagaki S et al., Plant Biotechnology 23, 259-265 (2006)

本発明は、組み換え技術を用いて、あるいは、組み換え技術を用いることなく、簡便かつ迅速に植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制し、これにより、所望の形質を有する植物を作出することを目的とする。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害することによって、植物において標的ＤＮＡのメチル化を特異的に抑制することができるという驚くべき知見を見出した。

即ち、本発明の主旨は、以下に存する。
［１］植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法であって、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害することを含む、方法。
［２］前記スキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合の阻害が、前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列を含むショート・ダミーＲＮＡを前記植物細胞に導入することにより達成される、１に記載の方法。
［３］前記スキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合の阻害が、前記スキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を含むショート・ダミーＲＮＡを前記植物細胞に導入することにより達成される、１に記載の方法。
［４］前記標的ＤＮＡが、植物細胞において所望の形質を発現する遺伝子を制御するプロモーターである、１～３のいずれかに記載の方法。
［５］前記所望の形質を発現する遺伝子が、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積を制御する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、４に記載の方法。
［６］前記ショート・ダミーＲＮＡの植物細胞への導入が、植物ウイルスベクター法、アグロインフィルトレーション法、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、又はパーティクル・ガン法により行われる、１～５のいずれかに記載の方法。
［７］前記植物細胞が植物体の非単離細胞である、１～６のいずれかに記載の方法。
［８］前記植物細胞が培養細胞である、１～６のいずれかに記載の方法。
［９］所望の形質を有する植物を作出する方法であって、１～８のいずれかに記載の方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することを含む、方法。
［１０］植物由来の機能性成分を製造する方法であって、１～８のいずれかに記載の方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより前記植物細胞内で機能性成分を蓄積させ、そして、前記植物細胞から前記機能性成分を回収することを含む、方法。
［１１］植物由来の機能性成分を蓄積させるための発現系であって、
（Ａ）ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を産生する植物体又は植物細胞、及び
（Ｂ）前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列、又は前記スキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を含むショート・ダミーＲＮＡ、
を含む、発現系。

本発明によって、植物における標的ＤＮＡのメチル化を抑制することで、簡便かつ迅速に標的ＤＮＡのＴＧＳを特異的に制御することができる。これにより所望の形質を有する植物を得ることが可能となり、例えば、植物での有用タンパク質の生産や機能性成分の蓄積レベルの向上に大きく貢献する。

図１は、ＲｄＤＭ経路におけるＤＮＡメチル化モデルを示す。図２は、ショート・ダミーＲＮＡによるｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体の捕捉に基づくＤＮＡメチル化解除モデルを示す。図３は、ショート・ダミーＲＮＡによるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４との結合の遮断に基づくＤＮＡメチル化解除モデルを示す。図４は、ショート・ダミーＲＮＡの標的となる３５Ｓプロモーターの配列、及びスキャフォールドＲＮＡが多く検出される（－５１から－７６）部分を標的に作成したショート・ダミーＲＮＡコンストラクト（ＳＤ－５１）の配列を示す。図５は、コントロール（１６ｃ及び２０８ＲＥＤ）と比較した、ＳＤ－５１をＣＭＶ－Ａ１ベクターによって発現させたベンタミアーナ当代（図中ではＳＤ－５１と表記）でのＧＦＰ発現復帰個体の蛍光画像を示す。図６は、ＳＤ－５１をＣＭＶ－Ａ１ベクターによって発現させたベンタミアーナ次世代でのＧＦＰ発現復帰個体（播種後３５日）の蛍光画像を示す。図７は、ＳＤ－５１をＣＭＶ－Ａ１ベクターによって発現させたベンタミアーナのＧＦＰ発現の表現型を分類した模式図を示す。

［１．諸言］
植物の遺伝子発現は、エピジェネティクス制御によって調節されている。「エピジェネティクス」とは、ＤＮＡの配列に変化を起こさず、かつ細胞分裂を経て伝達される遺伝子機能の変化やその仕組みを意味する。エピジェネティクスの１つとしては、ＤＮＡメチル化が知られている（非特許文献２）。この反応には、シトシンのピリミジン環の５位炭素原子又はアデニンのプリン環の６位窒素原子へのメチル基付加反応があるが、植物における遺伝子の発現は主にシトシンのメチル化によって制御されていると考えられている。すなわち、ＤＮＡのシトシンにおけるメチル化・脱メチル化により、塩基配列情報自体は変化することなく遺伝子発現のオン／オフが切り替わることになる。このようなＤＮＡメチル化による遺伝子発現の抑制は転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）と呼ばれる。
本発明は、植物におけるエピジェネティクス制御を人為的にコントロールすることによって、遺伝子組み換えを行うことなく所望の植物の表現型を変化させることが可能となる、という基本思想に基づく。

モデル植物であるシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）におけるＤＮＡメチル化の理解が大きく進んでいる。植物では、ＣｐＧ、ＣｐＨｐＧ及びＣｐＨｐＨ部位（Ｈはグアニン以外のヌクレオチドを表す）においてメチル化され、ＤＮＡにメチル基を転移させ共有結合させる主要なＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素としては、ＤＲＭ２、ＭＥＴ１、ＣＭＴ３及びＣＭＴ２が知られている。現在、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、ＤＮＡに新たなメチル標識を作成するｄｅｎｏｖｏ酵素とＤＮＡの親鎖のメチル化位置を認識しＤＮＡ複製の後の娘鎖に新たなメチル化を伝達する維持酵素の２種類に分類されるが、この中でＤＲＭ２のみがｄｅｎｏｖｏＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるとされている。細胞がどのようにしてｄｅｎｏｖｏＤＮＡメチル化の位置を決定しているかは明らかではないが、これまでの証拠から、多くの位置で、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化（RNA-directed DNA methylation：ＲｄＤＭ）機構が関わっていることが示唆されている。

上述のとおり、本発明は、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害することによって、植物において標的ＤＮＡのメチル化を特異的に抑制することができるという知見に基づくものである。したがって、まず、本発明の前提となるＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構について説明する。

［ＲｄＤＭ機構］
ＲｄＤＭ機構とは、メチル化の標的となるＤＮＡ領域（標的ＤＮＡ）と少なくとも一部において同一の塩基配列を有する低分子二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を介して、標的ＤＮＡにメチル化が誘導される機構を意味する。
図１に示されるように、ＲｄＤＭ機構では、まずＰｏｌＩＶがメチル化された標的ゲノム領域にリクルートされ、標的領域のＲＮＡを転写する。ＰｏｌＩＶの転写産物は、その場でＲＮＡ－ＤＥＰＥＮＤＥＮＴＲＮＡＰＯＬＹＭＥＲＡＳＥ２（ＲＤＲ２）によって２本鎖ＲＮＡに変換され、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素であるＤＩＣＥＲ－ＬＩＫＥ３（ＤＣＬ３）によって２４ヌクレオチドのｓｉＲＮＡに切断される（非特許文献３）。このｓｉＲＮＡは、ＨＵＡＥＮＨＡＮＣＥＲ１（ＨＥＮ１）により３’末端にメチル化修飾を受けた後、ＡＲＧＯＮＡＵＴ４（ＡＧＯ４）に取り込まれサイレンシングエフェクター複合体（以降、「ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体」と称する）を形成する。ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれた相補的なｓｉＲＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＶ（ＰｏｌＶ）によって転写されるＲＮＡ（以降、「スキャフォールドＲＮＡ」と称する）と塩基対を形成することにより、当該複合体をリクルートする。次にｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を介して、ｓｉＲＮＡに対応したＤＮＡの領域にｄｅｎｏｖｏメチルトランスフェラーゼであるＤＯＭＡＩＮＳＲＥＡＲＲＡＮＧＥＤＭＥＴＨＹＬＴＲＡＮＳＦＥＲＡＳＥ（ＤＲＭ２）がリクルートされ、ＤＮＡをメチル化する。ＡＧＯ４、ＤＲＭ２、及びメチル化したＤＮＡとの結合能を有するＲＮＡ－ＤＩＲＥＣＴＥＤＤＮＡＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ１（ＲＤＭ１）、ＤＥＦＥＣＴＩＶＥＩＮＲＮＡ－ＤＩＲＥＣＴＥＤＤＮＡＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ１（ＤＲＤ１）そしてＤＥＦＥＣＴＩＶＥＩＮＭＥＲＩＳＴＥＭＳＩＬＥＮＣＩＮＧ３（ＤＭＳ３）がリクルートに重要な役割を果たすと考えられる。

標的ＤＮＡからＰｏｌＩＶやＰｏｌＶによって転写されるＲＮＡ（これらは同じ領域から転写されるため配列がほぼ同じであるが、ＰｏｌＶによって転写されるＲＮＡは特にスキャフォールドＲＮＡと呼ばれる）は、ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を介して、メチル基転移酵素ＤＲＭ２を標的ＤＮＡへ呼び込む働きがある。したがって、ＤＲＭ２を標的配列にリクルートする役割をもったｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列を含む短いＲＮＡ（以下、「ショート・ダミーＲＮＡ」と称する）によってｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を捕捉するか（図２）、あるいは、スキャフォールドＲＮＡにショート・ダミーＲＮＡを先に結合させて、ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４との結合を遮断すること（図３）により、ＤＲＭ２が標的配列にリクルートされることを防ぎ、これによって、ＤＮＡのメチル化を阻害することができる。

［２．植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法］
本発明の第１の観点によれば、植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法であって、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害することを含む、方法が提供される。

植物において所望の形質の発現を抑制するＤＮＡメチル化の要因となるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害することによって、ｓｉＲＮＡに対応したＤＮＡの領域に対するＤＲＭ２のリクルートが阻害されるため、植物において標的ＤＮＡのメチル化を特異的に抑制することが可能となる。前記スキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合の阻害は、例えば、前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列を含むショート・ダミーＲＮＡを前記植物細胞に導入することや、前記スキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を含むショート・ダミーＲＮＡを前記植物細胞に導入することによって達成することができる。

本発明において用いられる「ショート・ダミーＲＮＡ」とは、ＲｄＤＭを誘発しない程度に短く、かつ、ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡ及び／又はスキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部に結合可能なＲＮＡを意味する。ショート・ダミーＲＮＡは、標的ＤＮＡと少なくとも８０％以上、又は８５％以上、又は９０％以上、又は９２％以上、又は９４％以上、又は９５％以上、又は９６％以上、又は９７％以上、又は９８％以上、又は９９％以上の同一性を有する塩基配列からなることが好ましい。このような配列は、前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡ及び／又はスキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列であることから、ショート・ダミーＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体の捕捉に基づくＤＮＡメチル化解除モデル（図２）、及び／又はショート・ダミーＲＮＡによるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４との結合の遮断に基づくＤＮＡメチル化解除モデル（図３）において、ＤＲＭ２が標的配列にリクルートされることを防ぎ、これによって、標的ＤＮＡのメチル化を阻害することが可能となる。上述のとおり、標的ＤＮＡからＰｏｌＩＶによって転写されるＲＮＡとＰｏｌＶによって転写されるＲＮＡは、同じ領域から転写されるため、配列がほぼ同じであることから、いずれのＤＮＡメチル化解除モデルにおいても、同一の配列を有するショート・ダミーＲＮＡを使用することができる。ショート・ダミーＲＮＡは、典型的にはウイルスベクターから供給されるが、ウイルスベクターを使用しない場合には、植物発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した配列から転写されるような組換え植物を作出することにより供給することが可能である。しかしながら、ショート・ダミーＲＮＡの供給量はウイルスベクターから供給された方がはるかに優れていると考えられる。

前記ショート・ダミーＲＮＡの長さの上限は、例えば、２００ｂｐ以下、１９０ｂｐ以下、１８０ｂｐ以下、１７０ｂｐ以下、１６０ｂｐ以下、１５０ｂｐ以下、１４０ｂｐ以下、１３０ｂｐ以下、１２０ｂｐ以下、１１０ｂｐ以下、１００ｂｐ以下、９０ｂｐ以下、８０ｂｐ以下、７０ｂｐ以下、６０ｂｐ以下、又は５０ｂｐ以下であってよく、前記ショート・ダミーＲＮＡの長さの下限は、例えば、１９ｂｐ以上、２０ｂｐ以上、２１ｂｐ以上、２２ｂｐ以上、２３ｂｐ以上、２４ｂｐ以上、２５ｂｐ以上、３０ｂｐ以上、３５ｂｐ以上、４０ｂｐ以上、又は４５ｂｐ以上であってよい。前記ショート・ダミーＲＮＡの長さは、典型的には、１９ｂｐ～２００ｂｐであり、好適には、２０ｂｐ～８０ｂｐであり、最も好適には、２０ｂｐ～５０ｂｐである。

前記標的ＤＮＡは、植物における所望の形質の発現に関与し、かつメチル化によって抑制されているＤＮＡであれば特に制限されないが、例えば、植物細胞において所望の形質を発現する遺伝子を制御するプロモーターが挙げられる。所望の形質には、例えば、形、色、大きさなどの外観（形態）として観察される性質や、開花期など観察できる生理的な性質の他、病原菌や温度に対する抵抗性などの生理的な性質なども含まれるが、好ましくは、植物内における機能性成分（代謝成分）の蓄積に関する性質である。したがって、前記所望の形質を発現する遺伝子は、好ましくは、植物由来の機能性成分の合成あるいは蓄積を制御する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子である。

植物由来の機能性成分は、例えば、アセチレン、チオフェン、グリコシド、グルコシネート、プリン、ピリミジン、アルカロイド、フェノリックス（例えば、キノン）、精油、ビタミン類、テルペノイド（例えば、イリドイド、セスキテルペン、ジテルペノイド及びトリテルペノイド）、リグナン及びフラボノイド等が挙げられる。

植物細胞に対するショート・ダミーＲＮＡの導入は、組み換え技術を用いること、あるいは、これを簡便かつ迅速に行うために一過性発現系を用いることが好ましい。例えば、植物ウイルスベクター法、アグロインフィルトレーション法、ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システム、パーティクル・ガン法、又はこれらの組み合わせにより行われる。

植物ウイルスベクター法は、目的のＤＮＡを挿入した植物ウイルスゲノムのｃＤＮＡを試験管内転写し、得られたＲＮＡをベクターとして植物に接種して感染させ、ウイルス自身の増殖能及び全身移行能を利用して、目的遺伝子を植物に発現させる手法である。この手法は、ウイルスの自己複製能を利用して目的遺伝子を発現させるため、特に増殖能の高いＣＭＶやＴＭＶに基づくベクターを使用すれば、植物細胞当たりの目的遺伝子の発現量を高めることができる。

アグロインフィルトレーション法は、目的遺伝子を挿入したＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、物理的手法（シリンジ等による注入や減圧等による浸透などの手法）で植物組織内に導入し、植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物に一過性に発現させる手法である。この手法によれば、感染能の強いアグロバクテリウムを植物体の全身に物理的手法（注入又は浸透）で普く移行させて感染させ、植物の全組織で一様に目的遺伝子を発現させることができる。アグロバクテリウム（Agrobacterium）は、グラム陰性菌に属する土壌細菌であるリゾビウム属（Rhizobium）のうち、植物に対する病原性を有するものの総称であり、アグロバクテリウムの例としては、根頭癌腫病に関連するアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）が挙げられる。アグロバクテリウム由来のベクターを利用して植物に外来遺伝子を一過性発現させる場合、通常はベクターを物理的手法（シリンジ等による注入や減圧等による浸透などの手法）で植物組織内に導入し、植物に感染させる。アグロバクテリウム由来のベクターはＴ－ＤＮＡ領域の作用により強い感染能を有するため、植物体の全身に物理的手法（注入や浸透等）で普く移行させて感染させれば、植物の全組織でムラなく一様に外来遺伝子を発現させることができる。

ｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムは、目的遺伝子を挿入したＴＭＶ又はＰＶＸゲノムのｃＤＮＡをＴ－ＤＮＡベクター内に導入し、得られたＴ－ＤＮＡベクターで形質転換したアグロバクテリウムの培養液を、物理的手法（シリンジ等による注入又は減圧による浸透）で植物組織内に導入し、植物に感染させることにより、目的遺伝子を植物に一過性発現させる手法である。すなわち、ベクターを植物体の全身に物理的手法（注入又は浸透）で行き渡らせて感染させ、植物の全組織で目的遺伝子を発現させることができる。また、ウイルス（ＴＭＶ又はＰＶＸ）の自己複製能を利用して目的遺伝子を発現させるため、植物細胞当たりの目的遺伝子の発現量を高めることができる。このように、本手法は、上述の植物ウイルスベクター法及びアグロインフィルトレーション法の利点を兼ね備えた手法である。
また、２ｂタンパク質をコードする遺伝子の一部又は全部が外来遺伝子に置換されたキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）のＲＮＡ２ゲノムに相当する配列を、アグロバクテリウムのＴ－ＤＮＡ配列と機能的に組み合わせた核酸分子を、別途ＣＭＶのＲＮＡ１ゲノム及びＲＮＡ３ゲノム並びにタンパク質２ｂを機能的に発現する宿主植物に導入し、当該植物を栽培して外来遺伝子を発現させることにより、植物体の全身の細胞に外来遺伝子を普く移行させて発現させることができるとともに、各細胞での外来遺伝子の発現効率を高め、植物体全体として高発現を達成することができる（特許文献１）。本手法を用いることより、ＴＭＶやＰＶＸを用いた上述のｍａｇｎＩＣＯＮ（登録商標）システムに匹敵する技術になり、宿主植物の種類や導入可能な外来遺伝子サイズの自由度を高めることが可能となる。

パーティクル・ガン（パーティクル・ボンバードメント）法は、ＤＮＡ又はベクターをコーティングした金やタングステンなどの金属の微粒子を高速で射出することにより、目的ＤＮＡを細胞内に導入する手法である。

本発明において用いられるショート・ダミーＲＮＡを導入するためのベクターは、植物細胞内にショート・ダミーＲＮＡを導入できる限り、特に制限されないが、典型的には、植物ウイルスベクター又はＴ－ＤＮＡベクターであり、特に好ましくは、植物ウイルスベクターである。植物ウイルスベクターは、植物細胞の核に侵入できる限り特に制限されないが、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）、キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）、ジャガイモＸウイルス（ＰＶＸ）、クローバ葉脈黄化ウイルス（ＣlＹＶＶ）等の各種の一本鎖ＲＮＡウイルス、ビーンイエロードワーフウイルス（Bean yellow dwarf virus）（ＢｅＹＤＶ）、ビートカーリートップウイルス（Beet curly top virus）（ＢＣＴＶ）、キャベジリーフカールウイルス（Cabbage leaf-curl virus）（ＣａＬＣｕＶ）、ウィートドワーフウイルス（Wheat dwarf virus）（ＷＤＶ）、トマトイエローリーフカールチャイナウイルス（Tomato yellow leaf curl China virus）（ＴＹＬＣＣＮＶ）等の各種の一本鎖ＤＮＡウイルス及びカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）等の二本鎖ＤＮＡウイルス由来のベクター等が挙げられる。中でもＲＮＡウイルスであるキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）由来のベクターが特に好ましく、例えばＣＭＶ－Ａ１ベクターなどが挙げられる。

本発明を適用可能な植物の種は特に制限されないが、典型的には、イネ科、マメ科、アブラナ科、キク科、ナス科、バラ科、ウリ科、ヒルガオ科などの植物が挙げられる。好ましい植物としては、例えば、アルファルファ、オオムギ、インゲンマメ、カノーラ、ササゲ、綿、トウモロコシ、クローバー、ハス、レンズマメ、ルピナス、キビ、オートムギ、エンドウマメ、落花生、イネ、ライムギ、スイートクローバー、ヒマワリ、スイートピー、ダイズ、モロコシ、ライコムギ、クズイモ、ハッショウマメ、ソラマメ、コムギ、フジ、堅果植物等、シロイヌナズナ、コヌカグサ、ネギ、キンギョソウ、オランダミツバ、ナンキンマメ、アスパラガス、ロウトウ、カラスムギ、ホウライチク、アブラナ、ブロムグラス、ルリマガリバナ、ツバキ、アサ、トウガラシ、ヒヨコマメ、ケノポジ、キクニガナ、カンキツ、コーヒーノキ、ジュズダマ、キュウリ、カボチャ、ギョウギシバ、カモガヤ、チョウセンアサガオ、ジギタリス、ヤマノイモ、アブラヤシ、オオシバ、フェスキュ、イチゴ、フクロウソウ、ダイズ、ヒマワリ、キスゲ、パラゴムノキ、ヒヨス、サツマイモ、レタス、ヒラマメ、ユリ、アマ、ライグラス、ハス、トマト、マヨラナ、リンゴ、マンゴー、イモノキ、ウマゴヤシ、アフリカウンラン、タバコ、イガマメ、テンジクアオイ、チカラシバ、ツクバネアサガオ、アワガエリ、イチゴツナギ、サクラ、キンポウゲ、ラディッシュ、スグリ、トウゴマ、キイチゴ、サトウキビ、サルメンバナ、セネシオ、セタリア、シロガラシ、ナス、ソルガム、イヌシバ、カカオ、ジャジクソウ、レイリョウコウ、ブドウ等が挙げられる。

植物細胞の形態は任意であり、植物体内に存在する非単離の細胞でもよく、植物体から単離された組織培養物等の培養細胞でもよい。培養細胞の場合、分化した状態の細胞でも、脱分化を生じた細胞でも、再分化した細胞でもよい。

［３．所望の形質を有する植物を作出する方法］
上記の標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより、所望の形質を有する植物を作出することが可能となる。したがって、本発明の第２の観点において、所望の形質を有する植物を作出する方法であって、上述の方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することを含む方法が提供される。

［４．植物由来の機能性成分を製造する方法］
また、上記の標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成・蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより、簡便かつ迅速に植物由来の機能性成分を製造することが可能となる。したがって、本発明の第３の観点において、植物由来の機能性成分を製造する方法であって、上述の方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成・蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより前記植物細胞内で機能性成分を蓄積させ、そして、前記植物細胞から前記機能性成分を回収することを含む方法、ならびに、植物由来の機能性成分を蓄積させるための発現系であって、（Ａ）ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を産生する植物体又は植物細胞、及び（Ｂ）前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列、又は前記スキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列を含むショート・ダミーＲＮＡを含む発現系が提供される。

以下、実施例を示し、本発明を更に詳細に説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、適宜変更を加えて実施することが可能である。

［実験１］ショート・ダミーＲＮＡコンストラクトの作成
ショート・ダミーＲＮＡコンストラクトと相同なｓｉＲＮＡを合成する３５Ｓプロモーター（配列番号１）上の配列（下線部分）を図４に示す。ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体の捕捉に基づくＤＮＡメチル化解除モデル（図２）、及び／又はショート・ダミーＲＮＡによるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４との結合の遮断に基づくＤＮＡメチル化解除モデル（図３）における使用を想定して、この配列と相同なｓｉＲＮＡを発現するＳＤ－５１（5’-TAAGGGAGGACGCACAATCCCCCTAT-3’：配列番号２）をクローニングするため、５’末端にそれぞれＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイトを付加したオリゴＤＮＡ３５Ｓ（－）－ｓｄＲＮＡ－（－５１）－５Ｓｔ（5’-CGAGGCCTTAAGGGATGACGCACAATCCCACTA-3’：配列番号３）、３５Ｓ（－）－ｓｄＲＮＡ－（－５１）－３Ｍｌ（5’-CGCACGCGTATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTA-3’：配列番号４）を合成し、これらをＰＣＲによって２本鎖ＤＮＡにした。これをＣＭＶ－Ａ１ベクターの感染性ｃＤＮＡクローンプラスミドのクローニングサイト（ＳｔｕＩ及びＭｌｕＩ制限サイト）に常法に従って組み込んだ。

［実験２］ショート・ダミーＲＮＡコンストラクトの接種
（１）ショート・ダミーＲＮＡ（ＳＤ－５１）接種当代
本実験では、本発明者らが作成したベンタミアーナ２０８ＲＥＤ系統を材料として用いた。２０８ＲＥＤの作成経緯及び特性は下記の通りである。まず、導入されたＧＦＰ遺伝子によりＧＦＰ蛍光を発するベンタミアーナ１６ｃ系統（非特許文献４を参照のこと）に、このＧＦＰ遺伝子に連結してある３５Ｓプロモーターと相同な配列を組み込んだＣＭＶ－Ａ１ベクター（非特許文献５を参照のこと）を感染させた。このＣＭＶ－Ａ１ベクターの感染により、３５Ｓプロモーター配列内でＲｄＤＭ経路を介したシトシンメチル化が起こり、その結果ＧＦＰ遺伝子に転写型遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）が誘導されてＧＦＰ蛍光が消失した。この感染個体の自殖後代においてＧＦＰ遺伝子のＴＧＳが維持されている個体を毎世代選抜し、自殖第３世代（Ｓ３）において安定してＴＧＳが維持されている系統を２０８ＲＥＤ系統として本実験に用いた。
このＧＦＰ蛍光が消失した２０８ＲＥＤにショート・ダミーＲＮＡ（ＳＤ－５１）コンストラクトを含むＣＭＶ－Ａ１ベクター（ＣＭＶ－Ａ１－ＳＤ－５１）を接種したところ、接種した個体の３０％程度でＧＦＰの蛍光が復帰した（図５）。一方、ＣＭＶ－Ａ１－ＳＤ－５１を接種していない２０８ＲＥＤでは、実験に供試した全ての個体で蛍光が復帰してこなかった（図５）。以上の結果から、ＣＭＶ－Ａ１－ＳＤ－５１の感染により蛍光が復帰した個体ではショート・ダミーＲＮＡ（ＳＤ－５１）によりＧＦＰ遺伝子のＴＧＳが解除されたものと考えられた。

（２）ショート・ダミーＲＮＡ（ＳＤ－５１）接種後代
ＣＭＶ－Ａ１－ＳＤ－５１の感染によって蛍光が１６ｃ（オリジナルのＧＦＰ発現ベンタミアーナ）と同程度に復帰した２０８ＲＥＤの個体（１６ｃ型）から採種し、次世代（Ｓ１）及び次々世代（Ｓ２）を育成、各世代におけるＧＦＰ蛍光を観察した。両世代ともＧＦＰ蛍光の復帰は茎から観察され、徐々に植物体全体に広がっていった（図６）。ＧＦＰ蛍光の表現型は、ＲＥＤ（蛍光を示さない）、茎、葉柄、葉、及び１６ｃ型（１６cと同等なレベルのＧＦＰ蛍光を示す）の５グループに分類した（図７）。
ＧＦＰの蛍光が復帰した個体のＳ１及びＳ２において、成長に伴ってＧＦＰの蛍光が徐々に復帰していき、Ｓ２においては４０％程度の個体で１６ｃと同等なレベルのＧＦＰ蛍光を示した（表１）。

（３）ショート・ダミーＲＮＡ（ＳＤ－５１）接種当代及び次世代での３５ＳプロモーターにおけるＤＮＡメチル化率
２０８ＲＥＤの個体及び２０８ＲＥＤ個体にＣＭＶ－Ａ１－ＳＤ－５１を接種した当代及び次世代の個体の葉からｉｌｌｕｓｔｒａＤＮＡＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔＮｕｃｌｅｏｎＰｈｙｔｏｐｕｒｅ（GE Healthcare）を用いてＤＮＡを抽出し、抽出したＤＮＡに対してＥＺＤＮＡＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＫｉｔ（Zymo Research）を用いてバイサルファイト処理を行い、メチル化されていないシトシンのウラシルへの変換を行った。バイサルファイト処理を行ったＤＮＡから３５Ｓプロモーター領域をＴａＫａＲａＥｐｉＴａｑＨＳｆｏｒｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｔｒｅａｔｅｄＤＮＡ（TaKaRa）を用いてＰＣＲ増幅した。プラス鎖検出用のＰＣＲ用のプライマーとして３５Ｓ－３４６Ｆ－ｂｉｓｕＴ（5’-ATTGAGAYTTTTYAAYAAAGGGTA-3’：配列番号５）及び３５Ｓ＋１Ａ－ｂｉｓｕＡ（5’-CTCTCCAAATGAAATGAACTTC-3’：配列番号６）を用いた。マイナス鎖検出用のＰＣＲ用のプライマーとして、３５Ｓ（－）－５－ＢＳ（5’-TTATATAGAGGAAGGGTYTTGYGAAG-3’：配列番号７）、３５Ｓ（－）－３－ＢＳ（5’-CAATTRARACTTTTCAACAAAR-3’：配列番号８）を用いた。得られたＰＣＲ産物はＤｙｎａＥｘｐｒｅｓｓＴＡＰＣＲＣｌｏｎｉｎｇＫｉｔ（Bio Dynamics Laboratory）を使用し、ｐＴＡＣ１ベクターにライゲーションした。これをＥ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（TaKaRa）にトランスフォーメーションし、増殖後プラスミドを抽出した。抽出したプラスミドを常法に従いシークエンスした。シークエンス結果に基づき、３５Ｓプロモーター領域のシトシンにおけるメチル化頻度をＣＧ、ＣＨＧ（Ｈ＝Ａ／Ｃ／Ｔ）及びＣＨＨサイト別に比較した結果、いずれのサイトにおいてもＳＤ－５１接種個体でシトシンの脱メチル化が誘導されていることが確認された（表２）。

Claims

植物細胞において標的ＤＮＡのメチル化を抑制する方法であって、
前記方法が、ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、前記標的ＤＮＡの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害する工程を含み、
ここで、前記スキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を阻害する工程が、ショート・ダミーＲＮＡを前記植物細胞に導入することによって達成され、
前記ショート・ダミーＲＮＡが、ｉ）前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列であって、前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を捕捉する配列、又は、ｉｉ）前記スキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列であって、スキャフォールドＲＮＡとの結合を介して、スキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を遮断する配列のいずれかを含み（ただし、前記スキャフォールドＲＮＡを消去するものを除く）、前記ショート・ダミーＲＮＡの長さが、２０ｂｐ～５０ｂｐであり、そして、
前記標的ＤＮＡが、植物細胞において所望の形質を発現する遺伝子を制御するプロモーターである、方法。
前記所望の形質を発現する遺伝子が、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積を制御する酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子である、請求項１に記載の方法。
前記ショート・ダミーＲＮＡの植物細胞への導入が、植物ウイルスベクター法、アグロインフィルトレーション法、又はパーティクル・ガン法により行われる、請求項１又は２に記載の方法。
前記植物細胞が植物体の非単離細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
前記植物細胞が培養細胞である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
所望の形質を有する植物を作出する方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法を用いて、植物において所望の形質の発現に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することを含む、方法。
植物由来の機能性成分を製造する方法であって、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法を用いて、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与するＤＮＡのメチル化を抑制することにより前記植物細胞内で機能性成分を蓄積させ、そして、前記植物細胞から前記機能性成分を回収することを含む、方法。
植物由来の機能性成分を蓄積させるための発現系であって、前記発現系が、（Ａ）ＲＮＡ指令型ＤＮＡメチル化機構において、植物由来の機能性成分の合成もしくは蓄積に関与する遺伝子を制御するプロモーターの転写により産生されるスキャフォールドＲＮＡ及びｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を産生する植物体又は植物細胞、及び
（Ｂ）ｉ）前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体に取り込まれたｓｉＲＮＡと相補的な配列であって、前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体を捕捉する配列、又はｉｉ）前記スキャフォールドＲＮＡの少なくとも一部と相補的な配列であって、スキャフォールドＲＮＡとの結合を介して、スキャフォールドＲＮＡとｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合を遮断する配列を含むショート・ダミーＲＮＡ（ただし、前記スキャフォールドＲＮＡを消去するものを除く）、
を含み、前記ショート・ダミーＲＮＡの長さが、２０ｂｐ～５０ｂｐであり、そして、
前記ショート・ダミーＲＮＡによって前記スキャフォールドＲＮＡと前記ｓｉＲＮＡ－ＡＧＯ４複合体との結合が阻害されて、前記プロモーターのメチル化が抑制されることにより、前記植物体又は植物細胞において前記機能性成分が蓄積される、発現系。