JP7635994B2 - 被検出物質の検出方法および被検出物質の検出システム - Google Patents

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Description

本開示は、被検出物質の検出方法および被検出物質の検出システムに関する。
試料に含まれる可能性がある被検出物質を検出する様々な技術が実用化されている。被検出物質の例としては、アレルギー物質、がん細胞由来のタンパク質、核酸または小胞などが挙げられる。たとえばタンパク質の検出技術として、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay）法またはＳＰＲ（Surface Plasmon Resonance）法などが知られている。ＥＬＩＳＡ法により検出可能な被検出物質の最低濃度（検出限界）は０．３［ｎｇ／ｍＬ］程度とされ、ＳＰＲ法の検出限界は１［μｇ／ｍＬ］程度とされている。また、いずれの手法によっても被検出物質の検出には数時間を要する。
光を用いて被検出物質を検出する技術が提案されている。たとえば国際公開第２０１４／１９２９３７号（特許文献１）に開示された被検出物質の検出装置は、複数の金属ナノ粒子と、光源と、対物レンズと、受光器と、検出器とを備える。複数の金属ナノ粒子の各々は、被検出物質を特異的に付着可能なホスト分子で修飾されている。光源は、複数の金属ナノ粒子を集合させるための偏光を発する。対物レンズは、偏光を集光して、集光された偏光を、試料と複数の金属ナノ粒子とを含む液体に導入する。受光器は、液体からの光を受ける。検出器は、受光器からの信号に基づいて、被検出物質を検出する。
国際公開第２０１４／１９２９３７号 国際公開第２０１５／１７０７５８号
鈴木祥夫、入門講座「総タンパク質の定量法」、ぶんせき、２０１８年２月号ｐ．２～９
被検出物質の検出感度を高めたり被検出物質の検出時間を短縮したりする技術、言い換えれば、微量の被検出物質を迅速に検出可能な技術に対する要望が常に存在する。
本開示は、かかる課題を解決するためになされたものであり、本開示の目的は、被検出物質を迅速かつ高感度に検出することである。
本開示のある局面に従う被検出物質の検出方法は、第１～第３のステップを含む。第１のステップは、被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料をポンプを用いてマイクロ流路に流通させるステップである。第２のステップは、複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を液体試料に照射するステップである。第３のステップは、液体試料からの光（透過光、反射光または散乱光）を受けた受光器からの信号に基づいて被検出物質を検出するステップである。
受光器は、液体試料を撮影するカメラを含む。検出するステップ（第３のステップ）は、液体試料をカメラにより撮影した画像に基づき、被検出物質と複数の微粒子とが凝集することで形成された凝集体のサイズを表す指標を算出するステップと、被検出物質の濃度と指標との間に予め求められた対応関係を参照することによって、算出された指標から液体試料に含まれる被検出物質の濃度を算出するステップとを含む。
被検出物質の検出方法は、照射するステップ（第１のステップ）の後に非共鳴光の照射を停止するステップをさらに含む。検出するステップ（第３のステップ）は、非共鳴光の照射が停止してから所定期間だけ待機した後に受光器から取得された信号に基づいて、被検出物質を検出するステップを含む。
検出するステップ（第３のステップ）は、非共鳴光の照射継続中に受光器から取得した信号の強度変化に基づいて、液体試料に被検出物質が含まれているか否かを判定するステップを含む。
複数の微粒子の各々の比重は、複数の微粒子の分散媒の比重よりも大きい。照射するステップ（第２のステップ）は、非共鳴光を液体試料の上方から下方に向けて照射するステップを含む。
照射するステップ（第２のステップ）は、非共鳴光の焦点がマイクロ流路よりも非共鳴光の照射方向後方に位置する条件下で非共鳴光を液体試料に照射するステップを含む。
照射するステップ（第２のステップ）は、非共鳴光が照射されない領域が局所的に残った状態で、非共鳴光を液体試料に照射するステップを含む。
被検出物質の検出方法は、流通させるステップ（第１のステップ）に先立ち、液体試料の流速を、被検出物質と複数の微粒子とが凝集後に分裂することを抑制可能な流速に調整するステップをさらに含む。
被検出物質および複数の微粒子のうちの少なくとも一方は、その表面が蛍光分子により修飾されているか、その内部に蛍光分子をドープ（または発現）している。
前記複数の微粒子の直径と前記非共鳴光の波長域との組み合わせは、前記非共鳴光を前記複数の微粒子に照射した場合に前記非共鳴光がミー散乱を起こすように定められる。
本開示の他の局面に従う被検出物質の検出システムは、ホルダと、ポンプと、光源と、受光器と、演算装置とを備える。ホルダは、マイクロ流路が設けられた検出キットを保持するように構成されている。ポンプは、被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料をマイクロ流路に流通させる。光源は、複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を液体試料に照射する。受光器は、液体試料からの光（透過光、反射光または散乱光）を受ける。演算装置は、受光器からの信号に基づいて被検出物質の検出処理を実行する。
光源は、複数の微粒子によりミー散乱を起こす波長域の光を非共鳴光として液体試料に照射する。
受光器は、液体試料を撮影するカメラを含む。演算装置は、検出処理において、カメラにより撮影された画像から、被検出物質と複数の微粒子とが凝集することによって形成された凝集体のサイズを表す指標を算出する。演算装置は、被検出物質の濃度と指標との間に予め求められた対応関係を参照することによって、算出された指標から液体試料に含まれる被検出物質の濃度を算出する。
被検出物質の検出システムは、共焦点光学系をさらに備える。共焦点光学系は、光源からの非共鳴光を液体試料に照射し、かつ、液体試料からの透過光または反射光を受光器へと導く。演算装置は、カメラにより撮影された３次元画像から凝集体の体積を指標として算出する。
本開示によれば、被検出物質を迅速かつ高感度に検出できる。
ある被検出物質の検出原理を説明するための概念図である。 被検出物質の他の一例を示す図である。 他の被検出物質の検出原理を説明するための概念図である。 実施の形態１に係る抗原検出システムの全体構成を概略的に示す図である。 レーザ光の照射時における検出キットの様子を示す模式図である。 図５のＶＩ－ＶＩ線に沿う検出キットの断面図である。 レーザ光の照射時における検出キットを撮影した画像である。 検出キットへのレーザ光の照射態様を説明するための図である。 検出キットへのレーザ光の照射時におけるラテックスビーズの凝集メカニズムを説明するための図である。 ラテックスビーズのサイズとレーザ光の波長との間の関係を説明するための概念図である。 ラテックスビーズの消衰スペクトルの測定結果の一例を示す図である。 実施の形態１における第１の抗原検出処理を示すフローチャートである。 実施の形態１における第２の抗原検出処理を示すフローチャートである。 ターゲット抗原の濃度（ターゲット濃度）を算出するための検量線の一例を示す概念図である。 ターゲット濃度とラテックスビーズの凝集面積との間の関係の測定結果を示す図である。 サンプルの流速がラテックスビーズの凝集に及ぼす影響を説明するための概念図である。 被検出物質がＣＤ８０であり、レーザ光を検出キットの下方から上方に向けて照射した場合（上方照射時）におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。 図１７に示す画像から求められた、被検出物質がＣＤ８０である場合のターゲット濃度と凝集面積との間の関係を示す図である。 上方照射時においても凝集面積に誤差が生じる理由を説明するための概念図である。 被検出物質がＣＤ８０であり、１０倍レンズを用いた場合におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。 被検出物質がＣＤ８０であり、４０倍レンズを用いた場合におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。 図２０および図２１に示す画像から求められた、被検出物質がＣＤ８０である場合のターゲット濃度とラテックスビーズの凝集面積との間の関係を示す図である。 被検出物質がＦＤＰである実施例２におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。 被検出物質がＦＤＰである場合のターゲット濃度とラテックスビーズの凝集面積との間の関係を示す図である。 レーザ光の照射停止後に待機時間を設ける意味を説明するための概念図である。 被検出物質がＦＤＰである場合の上方照射時におけるターゲット濃度とラテックスビーズの凝集面積との間の関係を示す図である。 図２６に示す画像から求められた、被検出物質がＦＤＰである場合のターゲット濃度とラテックスビーズの凝集面積との間の関係を示す図である。 デフォーカス条件を説明するための図である。 被検出物質がＣＤ８０である場合にデフォーカス条件下でマイクロ流路の底面に生じた凝集体の画像を示す図である。 デフォーカス条件下におけるターゲット濃度と凝集面積との間の関係を示す図である。 デフォーカス条件下におけるラテックスビーズの凝集メカニズムを説明するための図である。 デフォーカス条件下におけるターゲット濃度と多層割合との間の関係を示す図である。 被検出物質がＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープである場合のデフォーカス条件下におけるターゲット濃度と多層割合との間の関係を示す図である。 ３種類の検出キットを撮影した画像である。 ３種類の検出キットの断面図である。 第１～第３のマイクロ流路の各々について、流路幅と照射スポット径との間の関係を説明するための断面拡大図である。 第２のマイクロ流路と第３のマイクロ流路との間のメカニズムの違いを説明するための図である。 第２のマイクロ流路よりもさらに流路幅が狭い場合においてラテックスビーズが閉塞している様子を撮影した画像を示す図である。 第３のマイクロ流路の底面に生じた凝集体の画像を示す図である。 ＥＬＩＳＡ法により得られた検量線を比較例として示す図である。 第３のマイクロ流路を用いて得られた検量線を示す図である。 被検出物質がエクソソームである場合にＥＬＩＳＡ法により得られた検量線を比較例として示す図である。 本実施例において被検出物質がエクソソームである場合に得られた検量線を示す図である。 ２種類のシリンジポンプを用いて得られた検量線を示す図である。 実施の形態２に係る抗原検出システムの全体構成を概略的に示す図である。 実施の形態２における第１の抗原検出処理を示すフローチャートである。 実施の形態２における第２の抗原検出処理を示すフローチャートである。 被検出物質がＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープであり、ビーズが蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路に形成された凝集体の光学顕微鏡像を示す図である。 被検出物質がＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープであり、ビーズが蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路に形成された凝集体の３次元蛍光像を示す図である。 被検出物質が非蛍光性エクソソームであり、ビーズが蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路に形成された凝集体の光学顕微鏡像を示す図である。 被検出物質が非蛍光性エクソソームであり、ビーズが蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路に形成された凝集体の３次元蛍光像を示す図である。 被検出物質が蛍光性エクソソームであり、ビーズが非蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路に形成された凝集体の２次元蛍光像を示す図である。
以下、本実施の形態について、図面を参照しながら詳細に説明する。なお、図中同一または相当部分には同一符号を付して、その説明は繰り返さない。
＜用語の説明＞
本開示およびその実施の形態において、「試料」とは、被検出物質を含む物質または被検出物質を含む可能性がある物質を意味する。試料は、たとえば動物（たとえばヒト、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、ラット、マウスなど）からの生体試料であり得る。生体試料は、たとえば、血液、組織、細胞、分泌液、体液等を含み得る。なお、「試料」はそれらの希釈物または分離物（血清、血漿等）を含んでもよい。「液体試料」とは、試料を含有する液体である。
本開示およびその実施の形態において、「被検出物質」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有し、検出キットを用いて検出される物質を意味する。被検出物質の形状は特に限定されず、たとえば球形状、楕円球形状、ロッド形状（棹形状）である。被検出物質が楕円球形状である場合、楕円球の短軸方向および長軸方向の長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。被検出物質がロッド状である場合、ロッドの幅および長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。
被検出物質の例としては、細胞、微生物（細菌、真菌等）、小胞（エクソソーム、マイクロベクシル、アポトーシス小体等）、生体高分子（タンパク質、核酸、脂質、多糖類等）、抗原（アレルゲン等）およびウイルスなどが挙げられる。タンパク質の具体例としては、ＣＤ９，ＣＤ６３，ＣＤ８０，ＣＤ８１等のＣＤ（Cluster of Differentiation）分類された抗体、ＩＬ－６等のサイトカイン、または、アルブミンなどが挙げられる。核酸としてはＤＮＡまたはＲＮＡが挙げられる。具体的には、核酸は、遊離ＤＮＡ（cell free DNA, cfDNA）、がん細胞由来の血中腫瘍ＤＮＡ（circulating tumor DNA, ctDNA）、メッセンジャーＲＮＡ（mRNA）およびマイクロＲＮＡ（miRNA）などを含む。ただし、被検出物質は、生体由来の物質（生体物質）に限定されず、樹脂ビーズ金属ナノ粒子、金属ナノ粒子集合体、金属ナノ粒子集積構造体、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子などであってもよい。
本開示およびその実施の形態において、「微粒子」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有する物質を意味する。微粒子の形状は、球形状に限定されるものではなく、楕円球形状またはロッド形状などであってもよい。微粒子が楕円球形状である場合、楕円球の長軸方向の長さおよび短軸方向の長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。微粒子がロッド形状である場合、ロッドの幅および長さの少なくとも一方がナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでの範囲内であればよい。
微粒子の例としては、金属ナノ粒子、金属ナノ粒子集合体、金属ナノ粒子集積構造体、半導体ナノ粒子、有機ナノ粒子、樹脂ビーズ、磁性ビーズ、微小粒子状物質（ＰＭ：Particulate Matter）などが挙げられる。「金属ナノ粒子」とは、ナノメートルのオーダーのサイズを有する金属粒子である。「金属ナノ粒子集合体」とは、複数の金属ナノ粒子が凝集することによって形成された集合体である。「金属ナノ粒子集積構造体」とは、たとえば、複数の金属ナノ粒子が相互作用部位を介してビーズの表面に固定され、互いに隙間を設けて、金属ナノ粒子の直径以下の間隔で配置された構造体である。「半導体ナノ粒子」とは、ナノメートルのオーダーのサイズを有する半導体粒子である。「有機ナノ粒子」とは、ナノメートルオーダーのサイズを有する有機化合物からなる粒子である。「樹脂ビーズ」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有する樹脂からなる粒子である。「磁性ビーズ」とは、ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまでのサイズを有する磁性を帯びた粒子（磁性体を内部に分散または包埋したポリマー微粒子）である。「ＰＭ」とは、マイクロメートルオーダーのサイズを有する粒子状物質である。
本開示およびその実施の形態において、「ナノメートルオーダー」には、１ｎｍから１０００ｎｍ（＝１μｍ）までの範囲が含まれる。「マイクロメートルオーダー」には、１μｍから１０００μｍ（＝１ｍｍ）までの範囲が含まれる。したがって、「ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまで」には、１ｎｍから１０００μｍまでの範囲が含まれる。「ナノメートルオーダーからマイクロメートルオーダーまで」との用語は、典型的には数ｎｍ～数百μｍの範囲を意味し、好ましくは１００ｎｍ～１００μｍの範囲を意味し、より好ましくは１μｍ～数十μｍの範囲を意味し得る。
本開示およびその実施の形態において、「ホスト分子」とは、被検出物質に特異的に結合（特異的な付着であってもよい）することが可能な物質を意味する。ホスト分子と被検出物質との組み合わせとしては、たとえば、抗原と抗体、糖鎖とタンパク質、脂質とタンパク質、低分子化合物（リガンド）とタンパク質、タンパク質とタンパク質、一本鎖ＤＮＡと一本鎖ＤＮＡなどが挙げられる。これらの特異的親和性を有する両者のうちのいずれか一方が被検出物質である場合に、他方をホスト分子として用いることができる。すなわち、たとえば抗原が被検出物質である場合には、抗体をホスト分子として用いることができる。逆に抗体が被検出物質である場合には、抗原をホスト分子として用いることができる。また、ＤＮＡのハイブリダイゼーションにおいては、被検出物質がターゲットＤＮＡであり、ホスト分子がプローブＤＮＡである。また、ＤＮＡと特異的に結合する抗ＤＮＡ抗体（たとえば、二重鎖ＤＮＡと特異的に結合する抗ｄｓＤＮＡ、または、一本鎖ＤＮＡと特異的に結合する抗ｓｓＤＮＡなど）もホスト分子として用いることができる。なお、抗原は、アレルゲン、微生物（細菌、真菌など）、ウイルス、小胞などを含み得る。また、抗体の種類を変えることによって、検出可能なアレルゲン、微生物またはウイルスの種類を変えることもできる。したがって、本開示により検出可能なアレルゲン、微生物またはウイルスの種類は特に限定されるものではない。また、被検出物質が重金属である場合には、重金属イオンを捕集可能な物質をホスト分子として利用できる。
ホスト分子は、ホスト分子と微粒子との間の相互作用により微粒子の表面に固定される。ホスト分子を微粒子表面に固定するのに用いられる相互作用の種類は微粒子の種類に応じて定まる。相互作用は、共有結合、イオン結合、金属結合、ファンデルワールス力、静電的相互作用、疎水性相互作用、分子間力（たとえば水素結合）および吸着力などを含む。
本開示およびその実施の形態において、「マイクロ流路」とは、液体を流通させる流路の断面がマイクロメートルオーダーである流路を意味する。たとえば流路断面が長方形である場合には、長方形の短辺および長辺のうちの少なくとも一方の長さがマイクロメートルオーダーであればよい。流路断面が円形である場合には、直径の長さがマイクロメートルオーダーであればよい。
本開示およびその実施の形態において、「光誘起力」とは、散逸力、勾配力および物質間光誘起力の総称として用いられる。散逸力とは、光散乱あるいは光吸収といった散逸的過程において、光の運動量が物質に与えられることによって発生する力である。勾配力は、光誘起分極が生じた物質が不均一な電磁場の中に置かれた場合に、電磁気学的なポテンシャルの安定点に物質を移動させる力である。物質間光誘起力とは、光励起された複数の物質中の誘起分極から生じる縦電場による力と横電場（輻射場）による力との和である。
本開示およびその実施の形態において、「共鳴光」とは、微粒子への入射によって微粒子に電子励起由来の大きな光誘起分極を生じさせる光を意味する。光誘起分極とは、物質内部の電子が光によって励起されることにより生じる電気分極である。「微粒子の電子的共鳴の波長域」とは、たとえば微粒子が金属ナノ粒子である場合には、局在表面プラズモン共鳴のピークの半値全幅に対応する波長域である。この波長域は、微粒子のサイズに応じて定まり、微粒子が金属ナノ粒子である場合、典型的には４００ｎｍ～７００ｎｍの可視光の波長域に含まれる。微粒子が半導体微粒子または有機微粒子（ポリスチレンなどの有機材料からなる微粒子）である場合には、バンド間遷移または励起子共鳴（電子－正孔対の共鳴）などの電子的共鳴の波長域が共鳴光の波長域となる。微粒子が有機微粒子である場合、「微粒子の電子的共鳴の波長域」は、典型的には４００ｎｍよりも短波長側の波長域に含まれる。
一方、「非共鳴光」とは、微粒子への入射によって微粒子に生じる光誘起分極が小さな光を意味する。たとえば微粒子が金属微粒子である場合には、「微粒子の電子的共鳴の波長域外」とは、局在表面プラズモン共鳴のピークの半値全幅の外の波長域である。この波長域は、微粒子のサイズに応じて定まり、微粒子が金属ナノ粒子である場合、典型的には赤外の波長域に含まれる。「赤外の波長域」とは、７００ｎｍ～１０，０００μｍ（＝１ｍｍ）の波長域を指し、好ましくは７００ｎｍ～２，５００ｎｍの波長域を指し、より好ましくは７００ｎｍ～１，４００ｎｍの波長域を指す。なお、「微粒子の局在表面プラズモン共鳴の波長域外」が紫外の波長域（１０ｎｍ～４００ｎｍの波長域）に含まれる場合もある。微粒子が有機微粒子である場合、「微粒子の電子的共鳴の波長域外」は、バンド間遷移または励起子共鳴（電子－正孔対の共鳴）などの電子的共鳴の波長域外の波長域である。この波長域は、４００ｎｍよりも長波長側の波長域に含まれる。
本開示およびその実施の形態において、「白色光」とは、紫外域～近赤外域の波長範囲（たとえば２００ｎｍ～１１００ｎｍの波長範囲）を有する光を意味する。白色光は、連続光であってもよいしパルス光であってもよい。
［実施の形態１］
＜被検出物質の検出原理＞
図１は、ある被検出物質の検出原理を説明するための概念図である。実施の形態１では、いわゆるラテックス（Latex）凝集法を用いて被検出物質が検出される。より詳細には、図１に示す例では、２種類のビーズＢ１，Ｂ２が準備される。
ビーズＢ１，Ｂ２の各々は、共通のビーズ本体Ｂ０を含む。ビーズ本体Ｂ０は、ポリスチレンからなる樹脂ビーズ（ラテックスビーズ）である。ビーズ本体Ｂ０は、一般的なラテックスビーズと同様に、マイクロメートルオーダーのサイズ（典型的には直径１μｍ～５μｍ程度のサイズ）を有する。ビーズ本体Ｂ０の材料は、アクリル、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン等の他の樹脂であってもよい。
ビーズＢ１において、ビーズ本体Ｂ０は、第１抗体Ｂ１１により修飾されている。第１抗体Ｂ１１の修飾には、アビジンＢ１２とビオチンＢ１３とが用いられている。アビジンＢ１２は、アビジンＢ１２とビーズ本体Ｂ０との間の相互作用により、ビーズ本体Ｂ０の表面に固定されている。ビオチンＢ１３は、第１抗体Ｂ１１と結合することで第１抗体Ｂ１１を標識する。第１抗体Ｂ１１は、アビジンＢ１２とビオチンＢ１３との間の強い親和性により、ビーズ本体Ｂ０の表面に修飾されている。
ビーズＢ２において、ビーズ本体Ｂ０は、第２抗体Ｂ２１により修飾されている。第２抗体Ｂ２１も第１抗体Ｂ１１と同様に、アビジンＢ２２とビオチンＢ２３とによってビーズ本体Ｂ０の表面に修飾されている。
図１に示す例における被検出物質Ｘは抗原である。具体的には、ＣＤ８０などを被検出物質Ｘとすることができる。ＣＤ８０はＢ７－１と呼ばれることもある。被検出物質Ｘは、抗体が抗原に結合する部位を意味する「エピトープ」が設けられた、抗原以外の物質であってもよい。また、被検出物質Ｘは、複数のエピトープを含む物質であってもよい。そのような物質としては、ＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープが挙げられる。
被検出物質Ｘは、第１抗体Ｂ１１との間で抗原抗体反応を起こすとともに、第２抗体Ｂ２１との間で抗原抗体反応を起こす。そのため、被検出物質Ｘの存在下において、ビーズＢ１とビーズＢ２とは、被検出物質Ｘを介して結合する。図１では、ビーズＢ１が１つの第１抗体Ｂ１１のみで修飾されている例を示す。しかし、実際のビーズＢ１は、より多くの第１抗体Ｂ１１により修飾されている。ビーズＢ２についても同様である。そのため、被検出物質Ｘを含む試料に複数のビーズＢ１，Ｂ２が導入されると、複数のビーズＢ１，Ｂ２が抗原抗体反応により凝集することでビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成される。
図２は、被検出物質Ｘの他の一例を示す図である。被検出物質Ｘは、表面に様々な膜タンパク質を有する細胞外ナノ粒子であってもよい。具体的には、細胞から分泌されるエクソソーム（細胞外小胞）を被検出物質Ｘとすることができる。大腸がん細胞、肺がん細胞、子宮頸がん細胞などのがん細胞由来のエクソソームが知られている。エクソソームは、バイオマーカーとして診断に利用するなど各種応用に向けた研究が進められている。図３には、４回膜貫通型の膜タンパク質（具体的にはテトラスパニン）を表面に有するエクソソームが模式的に例示されている。エクソソームの典型的なサイズは、直径３０ｎｍ～１５０ｎｍ程度である。
図３は、他の被検出物質の検出原理を説明するための概念図である。被検出物質の種類によっては２種類のビーズは必ずしも必要ではない。図３に示す例では、１種類のビーズＢ３のみが準備される。ビーズＢ３は、ビーズ本体Ｂ０と、ビーズ本体Ｂ０を修飾する抗体Ｂ３１とを含む。
この例における被検出物質Ｙも抗原であり、具体的には、たとえばフィブリノゲン・フィブリン分解産物（ＦＤＰ：Fibrin/fibrinogen Degradation Products）である。複数のビーズＢ３と被検出物質Ｙとを組み合わせた場合にも、複数のビーズＢ３が被検出物質Ｙとの抗原抗体反応により凝集し、ビーズＢ３の凝集体が形成される。
＜検出システムの全体構成＞
図４は、実施の形態１に係る抗原検出システムの全体構成を概略的に示す図である。以下では、ＣＤ８０（図１参照）、エクソソーム（図２参照）等の被検出物質Ｘを検出するための構成について代表的に説明する。ｘ方向およびｙ方向は水平方向を表す。ｘ方向とｙ方向とは互いに直交する。ｚ方向は鉛直方向を表す。重力の向きはｚ方向下方である。
図４を参照して、実施の形態１に係る抗原検出システム１００は、ＸＹＺ軸ステージ１０と、調整機構２０と、シリンジポンプ３０と、レーザ光源４１と、照明光源４２と、ダイクロイックミラー４３と、対物レンズ５０と、カメラ６０と、コントローラ７０とを備える。
ＸＹＺ軸ステージ１０は、検出キット９０を保持するように構成されている。検出キット９０は、サンプルＳＰが流通するマイクロ流路９２が基材９１上に設けられたマイクロ流路チップである。サンプルＳＰとは、被検出物質Ｘを含む可能性がある液体試料である。検出キット９０の詳細な構成については図５および図６にて説明する。検出キット９０には、マイクロ流路９２にサンプルＳＰを導入するための毛細管３１と、マイクロ流路９２からサンプルＳＰを排出するための毛細管３２とが接続されている。なお、ＸＹＺ軸ステージ１０は、本開示に係る「ホルダ」に相当する。
調整機構２０は、コントローラ７０からの指令に応じて、検出キット９０が設置されたＸＹＺ軸ステージ１０のｘ方向、ｙ方向およびｚ方向の位置を調整する。本実施の形態では対物レンズ５０の位置が固定されている。そのため、ＸＹＺ軸ステージ１０の位置を調整することにより、検出キット９０と対物レンズ５０との相対的な位置関係が調整される。調整機構２０としては、たとえば、顕微鏡に付属のサーボモータおよび焦準ハンドルなどの駆動機構を用いることができるが、調整機構２０の具体的な構成は特に限定されるものではない。調整機構２０は、固定された検出キット９０に対して対物レンズ５０の位置を調整してもよい。
図示しないが、抗原検出システム１００にレーザ変位計を設けてもよい。レーザ変位計は、レーザ変位計のレーザ出射口と検出キット９０との間の鉛直方向の距離を測定するとともに、検出キット９０の水平方向の変位を測定する。調整機構２０は、レーザ変位計の測定結果に基づいてＸＹＺ軸ステージ１０の位置を調整し、それによりレーザ光源４１から出射されるレーザ光Ｌ１のビームウエストの位置（後述）を調整できる。
シリンジポンプ３０は、マイクロ流路９２の上流側に設けられた毛細管３１に接続されている。シリンジポンプ３０は、コントローラ７０からの指令に応じて圧力駆動流を調節して毛細管３１にサンプルＳＰを吐出することで、検出キット９０にサンプルＳＰを流通させる。さらに、シリンジポンプ３０は、圧力駆動流によるサンプルＳＰの流れの速さ（以下、「流速Ｖ」と記載する）を調整可能に構成されている。
シリンジポンプ３０は、本開示に係る「ポンプ」に相当する。「ポンプ」は、圧力、遠心力または回転力などの作用によりサンプルＳＰを送り出すことが可能に構成されていればよい。「ポンプ」が電動式であることは必須ではなく、手動式であってもよい。そのため、シリンジポンプ３０に代えて、たとえばディスペンサまたはマイクロピペットを採用してもよい。
レーザ光源４１は、コントローラ７０からの指令に応じてレーザ光Ｌ１を発する。レーザ光Ｌ１は、光誘起力を発生させることでサンプルＳＰ中の微粒子を捕捉するために用いられる。レーザ光Ｌ１は、ビーズＢ１，Ｂ２の電子的共鳴の波長域から外れた波長を有する「非共鳴光」である。電子的共鳴の波長域は、ビーズＢ１，Ｂ２のサイズ（直径）によって異なる。実施の形態１におけるビーズＢ１，Ｂ２の直径は２μｍである。この場合、ビーズＢ１，Ｂ２の電子的共鳴の波長域は、４００ｎｍ未満の波長域である。一方、レーザ光Ｌ１の波長は、電子的共鳴の波長域外の波長であり、たとえば近赤外域に含まれる波長（実施の形態１では１０６４ｎｍ）である。このように、ビーズＢ１，Ｂ２の直径とレーザ光Ｌ１の波長との適切な組み合わせを採用することにより、レーザ光Ｌ１をビーズＢ１，Ｂ２に照射した場合にレーザ光Ｌ１がミー（Mie）散乱を起こす条件を満たすことができる。ミー散乱については図１１にて詳細に説明する。なお、レーザ光源４１は、本開示に係る「光源」に相当する。
照明光源４２は、コントローラ７０からの指令に応じて、検出キット９０内のサンプルＳＰを照らすための白色光Ｌ２を発する。一例として、ハロゲンランプを照明光源４２として用いることができる。
ダイクロイックミラー４３は、レーザ光源４１からのレーザ光Ｌ１を反射する一方で、照明光源４２からの白色光Ｌ２を透過する。なお、ダイクロイックミラー４３および対物レンズ５０は、たとえば倒立型顕微鏡本体または正立型顕微鏡本体に組み込むことができる。
対物レンズ５０は、レーザ光源４１から発せられ、ダイクロイックミラー４３で反射したレーザ光Ｌ１を集光する。対物レンズ５０により集光された光は、検出キット９０（より詳細にはマイクロ流路９２（図５参照））に照射される。対物レンズ５０は、照明光源４２から検出キット９０に照射された白色光Ｌ２を取り込むためにも用いられる。対物レンズ５０により取り込まれた白色光Ｌ２は、ダイクロイックミラー４３によりカメラ６０へと導かれる。
カメラ６０は、コントローラ７０からの指令に応じて、白色光Ｌ２が照射された検出キット９０内のサンプルＳＰを撮影し、撮影された画像をコントローラ７０に出力する。カメラ６０は、静止画を撮影するスチールカメラであってもよいし、動画を撮影するビデオカメラであってもよい。なお、カメラ６０は、本開示に係る「受光器」に相当する。本開示に係る「受光器」は、画像データを出力する機器に限られず、フォトダイオード、光電子増倍管（ＰＭＴ：Photomultiplier）などを含み得る。
コントローラ７０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）などのプロセッサ７１と、ＲＯＭ（Read Only Memory）およびＲＡＭ（Random Access Memory）などのメモリ７２と、入出力ポート７３とを含むマイクロコンピュータである。コントローラ７０は、抗原検出システム１００内の各機器（調整機構２０、シリンジポンプ３０、レーザ光源４１、照明光源４２およびカメラ６０）を制御する。また、コントローラ７０は、カメラ６０により撮影された画像に所定の画像処理を施すことで抗原を検出する「抗原検出処理」を実行する。コントローラ７０による抗原検出処理については後に詳細に説明する。コントローラ７０は、本開示に係る「演算装置」に相当する。
なお、抗原検出システム１００の光学系は、レーザ光源４１からのレーザ光Ｌ１を検出キット９０に照射することが可能であるととともに、検出キット９０からの白色光Ｌ２をカメラ６０に取り込むことが可能であれば、図４に示した構成に限定されるものではない。たとえば、後に図７にて説明するように、検出キット９０に対するレーザ光Ｌ１の照射方向を適宜変更できる。抗原検出システム１００の光学系は、ダイクロイックミラー４３に代えてまたは加えて他の光学部品（ミラー、ビームスプリッタ、プリズム、光ファイバ等）を含んでもよい。抗原検出システム１００において、調整機構２０および照明光源４２は必須の構成要素ではない。
＜検出キットの構成＞
図５は、レーザ光Ｌ１の照射時における検出キット９０の様子を示す模式図である。前述のように、検出キット９０の基材９１にはマイクロ流路９２が形成されている。図５に示す例では、マイクロ流路９２は、１つのインレット９２１に対して１つのアウトレット９２２が形成された非分岐型の流路である。以下では、マイクロ流路９２におけるサンプルＳＰの流通方向をｘ方向とする。
検出キット９０は、レーザ光Ｌ１および白色光Ｌ２に対して透明な材料で作成できる。好ましくは、検出キット９０に用いられる材料は、たとえばガラスまたは石英のように、偏光であるレーザ光Ｌ１に対して異方性を示さない材料である。
図６は、図５のＶＩ－ＶＩ線に沿う検出キット９０の断面図である。図６に示すように、マイクロ流路９２の断面は、たとえば長方形形状を有する。一例として、長方形の横幅（流路幅、ｙ方向の長さ）は３５０μｍであり、長方形の高さ（ｚ方向の長さ）は１００μｍである。サンプルＳＰは、マイクロ流路９２を充填した状態（すなわち空気を含まない状態）でマイクロ流路９２内を流通する。
図７は、レーザ光Ｌ１の照射時における検出キット９０を撮影した画像である。マイクロ流路９２中の微小な黒点の各々がビーズＢ１またはビーズＢ２である。サンプルＳＰの流通方向は、画像右側から左側に向かう方向（ｘ方向）である。ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が画像中央付近に形成されていることを確認できる。
＜上方照射および下方照射＞
図８は、検出キット９０へのレーザ光Ｌ１の照射態様を説明するための図である。本実施の形態においては、レーザ光Ｌ１が２通りの照射態様のうちのいずれかの態様により検出キット９０に照射されるように、抗原検出システム１００の光学系が構成されている。以下では、対物レンズ５０を検出キット９０の上方に配置し、検出キット９０の上方から下方に向けてレーザ光Ｌ１を照射するレーザ光Ｌ１の照射態様を「下方照射」とも称する。反対に、対物レンズ５０を検出キット９０の下方に配置し、検出キット９０の下方から上方に向けてレーザ光Ｌ１を照射するレーザ光Ｌ１の照射態様を「上方照射」とも称する。
対物レンズ５０の焦点にレーザ光Ｌ１のビームウエストが形成される。ビームウエストにおけるビーム直径（最小スポット径φ０）は、たとえば数μｍ～数十μｍ程度である。最小スポット径φ０が大きいほど、マイクロ流路９２を流れるサンプルＳＰに対するレーザ光Ｌ１の照射面積が大きくなる。よって、レーザ光Ｌ１の強度が十分高ければ、より多くのビーズＢ１，Ｂ２を集積できる可能性がある。また、最小スポット径φ０が大きいほど、レーザ光Ｌ１の照射を受けずにマイクロ流路９２を通過してしまうビーズＢ１，Ｂ２の量を減らすことができる。
後述する一部の測定例（図１５、図１７、図１８など）では、下方照射および上方照射のいずれにおいても、ビームウエストがマイクロ流路９２の内部に位置するように、検出キット９０と対物レンズ５０との間の相対的な位置関係が調整される（フォーカス条件）。ビームウエストの高さは、レーザ光Ｌ１の波長および対物レンズ５０の仕様（倍率等）から既知である。よって、調整機構２０を用いてＸＹＺ軸ステージ１０の鉛直方向の位置を調整することで、狙った高さにビームウエストを調整できる。
下方照射において、マイクロ流路９２の底面を基準（ｚ＝０）とした、レーザ光Ｌ１のビームウエストの鉛直方向の位置（ｚ座標）をｚｂｔｍと記載する。たとえば、ｚｂｔｍ＝０である場合、レーザ光Ｌ１のビームウエストがマイクロ流路９２の底面に位置する。ｚｂｔｍ＝５０μｍである場合、レーザ光Ｌ１のビームウエストがマイクロ流路９２の底面よりも５０μｍだけ上方に位置する。一方、上方照射において、マイクロ流路９２の上面を基準（ｚ＝０）とした、レーザ光Ｌ１のビームウエストの鉛直方向の位置（ｚ座標）をｚｔｏｐと記載する。
なお、レーザ光Ｌ１の最小スポット径φ０は、対物レンズ５０の倍率に加えて、ビームウエストの位置ｚｂｔｍ（またはｚｔｏｐ）によっても異なり得る。ある測定例では、対物レンズ５０の倍率が１０倍であり、かつ、ｚｂｔｍ＝０である場合に、最小スポット径φ０＝４．６６μｍであった。対物レンズ５０の倍率が１０倍であり、かつ、ｚｂｔｍ＝５０μｍである場合、最小スポット径φ０＝１９．７μｍであった。
＜凝集メカニズム＞
図９は、検出キット９０へのレーザ光Ｌ１の照射時におけるビーズＢ１，Ｂ２の凝集メカニズムを説明するための図である。レーザ光Ｌ１のビームウエストがサンプルＳＰ中に位置するように調整した上でレーザ光Ｌ１を検出キット９０に照射することで、光誘起力（より詳細には物質間光誘起力および勾配力）によりビーズＢ１，Ｂ２がビームウエストの近傍に集まる。これにより、ビームウエスト近傍におけるビーズＢ１，Ｂ２の密度が他の位置（ビームウエストから十分に離れた位置）におけるビーズＢ１，Ｂ２の密度と比べて局所的に高くなる。
被検出物質Ｘがビームウエストの周囲に存在する場合、図１にて説明したように、ビーズＢ１の表面に修飾された第１抗体Ｂ１１と被検出物質Ｘとの間、および、ビーズＢ２の表面に修飾された第２抗体Ｂ２１と被検出物質Ｘとの間で抗原抗体反応が起こり、ビーズＢ１とビーズＢ２とが被検出物質Ｘを介して結合する。抗原検出システム１００では、シリンジポンプ３０を用いてサンプルＳＰを流通させることで新たな被検出物質Ｘがビームウエストの周囲に次々に供給されるので、静止した液体中と比べて、抗原抗体反応が起こり易い。抗原抗体反応が繰り返されることでビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成される。
ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体のサイズが増大するに従って、凝集体の周囲に存在する被検出物質Ｘが凝集体に遭遇する確率が高まるので、抗原抗体反応が起こる頻度が増加する。言い換えると、実施の形態１に係る抗原検出システム１００によれば、レーザ光Ｌ１の照射によってビーズＢ１，Ｂ２の凝集を加速させる「光誘導加速」を実現できる。その結果、ビーズＢ１，Ｂ２が高密度に凝集した凝集体が短時間で形成される。そして、形成した凝集体を光学的に検出することで、サンプルＳＰが被検出物質Ｘを含むと迅速に判定できる。
ビーズＢ１，Ｂ２には、物質間光誘起力および勾配力に加えて、散逸力がレーザ光Ｌ１の照射方向と同方向に作用する。上方照射の場合、ビーズＢ１，Ｂ２は、下方から上方への散逸力が作用することでマイクロ流路９２の上面に押し付けられる。一方、下方照射の場合、ビーズＢ１，Ｂ２は、上方から下方への散逸力が作用することでマイクロ流路９２の底面に押し付けられる。
ラテックスビーズの比重が１．０４［ｇ／ｃｍ３］程度と水の比重と同程度であるのに対し、磁性ビーズの比重は約１．６［ｇ／ｃｍ３］である。磁性ビーズのように微粒子の比重（質量密度）が周囲の分散媒の比重（この例では純水）よりも十分に大きい場合、微粒子は、攪拌・静置後のサンプルＳＰ中で沈降してマイクロ流路９２の底面に近い位置に分散する傾向がある。そのため、マイクロ流路９２の底面で凝集体を形成する下方照射の方が、マイクロ流路９２の上面で凝集体を形成する上方照射よりも効果的であり、より効率良く微粒子の凝集体を形成できる。
図１０は、ビーズＢ１，Ｂ２のサイズとレーザ光Ｌ１の波長との間の関係を説明するための概念図である。前述のように、ビーズＢ１，Ｂ２の典型的な直径は１μｍ～５μｍ程度（後述の実施例では約２μｍ）である。ビーズＢ１，Ｂ２の電子的共鳴の波長域は、ビーズＢ１，Ｂ２の直径に応じて定まり、上記の直径に対しては４００ｎｍよりも短波長側の波長域である。
レーザ光Ｌ１がビーズＢ１，Ｂ２の直径と比べて十分に長い波長（たとえば１０倍以上の波長）を有する場合、レーザ光Ｌ１のほとんどはビーズＢ１，Ｂ２を素通りしてしまう。より詳細には、ビーズＢ１，Ｂ２に照射されたレーザ光Ｌ１は、レイリー（Rayleigh）散乱を起こす。レイリー散乱により生じる散逸力は、ビーズＢ１，Ｂ２の直径の６乗に比例する。そのため、レイリー散乱では弱い光誘起力しか発生しない。
これに対し、実施の形態１において、レーザ光Ｌ１は、電子的共鳴の波長域から外れた波長を有する非共鳴光である。具体的には、レーザ光Ｌ１は、１０６４ｎｍの波長、すなわち、ビーズＢ１，Ｂ２の直径と同程度の波長を有する。
図１１は、ビーズＢ１，Ｂ２の消衰スペクトルの測定結果の一例を示す図である。図１１には、上から順に、ビーズＢ１，Ｂ２の直径が５μｍである場合、ビーズＢ１，Ｂ２の直径が２μｍである場合、ビーズＢ１，Ｂ２の直径が１μｍである場合の消衰スペクトルが示されている。なお、消衰スペクトルとは、散乱スペクトルと吸収スペクトルとを足し合わせたものである。
図１１より、ビーズＢ１，Ｂ２の直径が５μｍまたは２μｍである場合に、波長１０６４ｎｍ付近で特に大きな消衰が起こることが分かる。これは、レーザ光Ｌ１がビーズＢ１，Ｂ２の直径と同程度の波長を有する場合、レーザ光Ｌ１がビーズＢ１，Ｂ２に閉じ込められた後にミー散乱を起こすためである（図１０参照）。
ミー散乱により生じる散逸力は、ビーズＢ１，Ｂ２の直径の２乗に比例するため、強い光誘起力が発生する。この強い光誘起力によって、より強力にマイクロ流路９２の上面（上方照射の場合）または底面（下方照射の場合）にビーズＢ１，Ｂ２を押し付けることができる。その結果、より効率良くビーズＢ１，Ｂ２の凝集体を形成できる。
このように、ビーズＢ１，Ｂ２の直径とレーザ光Ｌ１の波長との組み合わせは、ビーズＢ１，Ｂ２への照射時にレーザ光Ｌ１がミー散乱を起こすように選定することが望ましい。なお、ここでは、始めにビーズＢ１，Ｂ２の直径が決定され、その後、ビーズＢ１，Ｂ２の直径に応じてレーザ光Ｌ１の波長が選定されるように説明した。しかし、レーザ光Ｌ１の波長に応じて、使用するビーズＢ１，Ｂ２の直径を選定してもよい。
＜抗原検出フロー＞
続いて、実施の形態１における２通りの抗原検出処理について説明する。第１の抗原検出処理は、サンプルＳＰ中に被検出物質Ｘが含有されているかどうかを検出する処理である。第２の抗原検出処理は、サンプルＳＰ中における被検出物質Ｘの含有濃度を定量する処理である。
図１２は、実施の形態１における第１の抗原検出処理を示すフローチャートである。図１２および後述する図１３に示すフローチャートは、所定条件の成立時（たとえばユーザが図示しない開始ボタンを操作したとき）に実行される。これらのフローチャートに含まれる各ステップは、基本的にはコントローラ７０によるソフトウェア処理によって実現されるが、その一部または全部がコントローラ７０内に作製されたハードウェア（電気回路）によって実現されてもよい。以下、ステップを「Ｓ」と略す。
なお、レーザ光Ｌ１のビームウエストの位置（マイクロ流路９２の底面を基準（ｚ＝０）とした場合のｚ座標であるｚｂｔｍ、または、マイクロ流路９２の上面を基準（ｚ＝０）とした場合のｚ座標であるｚｔｏｐ）は、所望の値に予め設定されているものとする。
図１２を参照して、Ｓ１０１において、コントローラ７０は、検出キット９０をＸＹＺ軸ステージ１０上に設置する。この処理は、たとえば、検出キット９０の送り機構（図示せず）により実現できる。ただし、ユーザが手作業で検出キット９０を設置してもよい。
Ｓ１０２において、コントローラ７０は、検出キット９０へのサンプルＳＰの流通を開始するようにシリンジポンプ３０を制御する。この際、コントローラ７０は、サンプルＳＰの流速Ｖが事前に実験的に求められた適切な流速となるようにシリンジポンプ３０を制御することが好ましい。ここでの流速Ｖとは、サンプルＳＰの流速開始時から流通終了時までの流速の時間平均である。
Ｓ１０３において、コントローラ７０は、検出キット９０へのレーザ光Ｌ１の照射を開始（または継続）するようにレーザ光源４１を制御する。これにより、被検出物質ＸがサンプルＳＰに含まれていた場合、光誘起力により捕捉されたビーズＢ１，Ｂ２に被検出物質Ｘが遭遇して両者が結合することでビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成される。ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体は、レーザ光Ｌ１の照射時間が長くなるにつれて成長する。
Ｓ１０４において、コントローラ７０は、レーザ光Ｌ１の照射開始時からの経過時間が規定時間（後述する例では３分間または４分間）に達したか否かを判定する。コントローラ７０は、光照射時間が規定時間に達していない場合（Ｓ４においてＮＯ）には処理をＳ１０３に戻す。これにより、レーザ光Ｌ１の照射が継続される。光照射時間が規定時間に達すると（Ｓ１０４においてＹＥＳ）、コントローラ７０は、処理をＳ１０５に進める。
Ｓ１０５において、コントローラ７０は、検出キット９０への白色光Ｌ２の照射を開始するように照明光源４２を制御する。そして、コントローラ７０は、レーザ光Ｌ１の照射位置における検出キット９０の画像を撮影するようにカメラ６０を制御する（Ｓ１０６）。
Ｓ１０７において、コントローラ７０は、Ｓ１０６にて撮影された画像に所定の画像処理を施すことで、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が画像中に確認されたかどうかを判定する。この画像処理には、種々の公知の画像処理技術を用いることができる。たとえば、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成された領域では、白色光Ｌ２の透過光が減少して画像の色が濃くなる（後述する図１７等を参照）。そのため、画像の色が濃くなった領域の有無（または領域の面積の大小）に基づいて、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成されたかどうかを判定できる。あるいは、パターン認識の技術を用いてビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の形状の特徴を抽出することで、凝集体が形成されたかどうかを判定することも可能である。
また、カメラに代えて他の受光器（フォトダイオードなど）を用いる場合には、受光器からの信号強度に基づいてビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の有無を判定できる。より具体的には、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成されると、白色光Ｌ２がビーズＢ１，Ｂ２の凝集体により遮られる。そのため、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成された場合には、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が形成されていない場合と比べて、受光器からの信号強度が低下する。したがって、レーザ光Ｌ１の照射継続中に受光器からの信号強度が低下したか否かによって、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の有無を判定できる。
ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が確認された場合（Ｓ１０７においてＹＥＳ）、コントローラ７０は、被検出物質ＸがサンプルＳＰに含まれていると判定する（Ｓ１０８）。一方、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が確認されなかった場合（Ｓ１０７においてＮＯ）、コントローラ７０は、被検出物質Ｘは非検出である（サンプルＳＰに含まれていない）と判定する（Ｓ１０９）。
その後、コントローラ７０は、サンプルＳＰの流通を停止するようにシリンジポンプ３０を制御する（Ｓ１１０）。また、コントローラ７０は、レーザ光Ｌ１の照射を停止するようにレーザ光源４１を制御するとともに、白色光Ｌ２の照射を停止するように照明光源４２を制御する（Ｓ１１１）。これにより、一連の処理が終了する。
なお、サンプルＳＰの流通を開始する処理（Ｓ１０２の処理）と、レーザ光Ｌ１の照射を開始する処理（Ｓ１０３の処理）と、白色光Ｌ２の照射を開始する処理（Ｓ１０５の処理）との順序は、適宜入れ替えることができる。たとえば、白色光Ｌ２の照射下で検出キット９０の画像（ここでは動画）を撮影しながらサンプルＳＰの流通を開始し、その後にレーザ光Ｌ１の照射を開始してもよい。逆に、動画撮影中にレーザ光Ｌ１の照射を開始し、その後にサンプルＳＰの流通を開始してもよい。
図１３は、実施の形態１における第２の抗原検出処理を示すフローチャートである。図１３を参照して、Ｓ２０１～Ｓ２０４の処理は、第１の抗原検出処理におけるＳ１０１～Ｓ１０４の処理（図１２参照）とそれぞれ同様であるため、説明は繰り返さない。
Ｓ２０５において、コントローラ７０は、レーザ光Ｌ１の照射を停止するようにレーザ光源４１を制御する。さらに、コントローラ７０は、レーザ光Ｌ１の照射停止後、所定時間（後述する例では１０秒間）だけ待機する。
Ｓ２０６において、コントローラ７０は、検出キット９０への白色光Ｌ２の照射を開始するように照明光源４２を制御する。そして、コントローラ７０は、レーザ光Ｌ１の照射位置における検出キット９０の画像を撮影するようにカメラ６０を制御する（Ｓ２０７）。
Ｓ２０８において、コントローラ７０は、Ｓ２０７にて撮影された画像に画像処理を施し、ビーズＢ１，Ｂ２が凝集することで画像の色が濃くなった領域の面積を算出する。以下、当該領域の面積を「凝集面積Ａ」と記載する。凝集面積Ａは、本開示に係る「凝集体のサイズを表す指標」の一例である。
Ｓ２０９において、予め準備された検量線を用いることによって、Ｓ２０７にて算出された凝集面積Ａから被検出物質Ｘの濃度を決定する。以下、被検出物質Ｘの濃度を「ターゲット濃度」と略す場合がある。
図１４は、被検出物質Ｘの濃度を算出するための検量線の一例を示す概念図である。図１４および後述する図１５等において、横軸は被検出物質Ｘの濃度（ターゲット濃度）を表す。縦軸は、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａを表す。
ターゲット濃度とビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａとの間には対応関係が存在する。図１４に示すように、ターゲット濃度が高いほど、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａも大きくなる。このような対応関係が測定条件（レーザ光Ｌ１の強度および照射時間、対物レンズ５０の倍率、レーザ光Ｌ１のビームウエストの位置ｚｔｏｐまたはｚｂｔｍなどに関する条件）毎に事前実験により求められ、検量線としてコントローラ７０のメモリ７２に格納されている。したがって、コントローラ７０は、測定条件に応じた検量線をメモリ７２から読み出すことによって、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａからターゲット濃度を決定できる。
図１３に戻り、その後のＳ２１０，Ｓ２１１の処理は、図１２に示したフローチャートにおけるＳ１１０，Ｓ１１１の処理とそれぞれ同様である。Ｓ２１１の処理の終了に伴い、一連の処理が終了する。なお、検出キット９０の画像撮影に先立ってレーザ光Ｌ１の照射を停止して待機する処理（Ｓ２０６の処理）は必須ではない。この待機処理の効果については後述する。
以下の実施例１～４においては、抗原検出システム１００を用いた被検出物質の検出結果（被検出物質の濃度測定結果）について説明する。実施例１～４では、２種類のビーズＢ１，Ｂ２を用いて被検出物質Ｘの濃度を測定した。被検出物質ＸはＣＤ８０であり、ビーズＢ１，Ｂ２の表面を抗ＣＤ８０抗体により修飾した。
［実施例１］
＜ターゲット抗原の濃度依存性＞
図１５は、被検出物質ＸがＣＤ８０である場合のターゲット濃度とビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａとの間の関係の測定結果を示す図である。図１５には、下方照射におけるマイクロ流路９２の底面からのレーザ光Ｌ１のビームウエストの位置ｚｂｔｍを２通り（ｚｂｔｍ＝０μｍ，５０μｍ）に設定し、かつ、サンプルＳＰの流速Ｖを２通り（Ｖ＝４７．６［μｍ／ｓ］，４７６［μｍ／ｓ］）に設定した場合（つまり、位置ｚｂｔｍと流速Ｖとの組合せにより４通りの測定条件が存在する場合）の測定結果が示されている。
図１５および後述する図１８等において、エラーバーは、各ターゲット濃度において複数回の測定を行った結果の測定誤差、具体的にはビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａの標準偏差を表している。図１５では、流速Ｖ＝４７．６［μｍ／ｓ］である場合については４回の測定結果のエラーバーが示されており、流速Ｖ＝４７６［μｍ／ｓ］である場合については３回の測定結果のエラーバーが示されている。
０［ｐｇ／ｍＬ］～２５０［ｐｇ／ｍＬ］の濃度範囲で５通りのターゲット濃度（被検出物質Ｘの質量濃度）を準備した。いずれの濃度も極めて低濃度であり、サンプルＳＰに含まれる被検出物質Ｘの量は極微量である。対物レンズ５０の倍率は１０倍であった。
図１５を参照して、４通りの測定条件のいずれにおいても、基本的に、ターゲット濃度の増大とともにビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａが増加するという、図１４に示したような比例傾向を確認できた。これにより、凝集面積Ａからターゲット濃度を検出可能であることが裏付けられたと言える。その一方で、多くのターゲット濃度においてエラーバーが長いことから、測定条件の最適化に改善の余地があることが分かる。
［実施例２］
＜サンプルの流速の影響＞
図１６は、サンプルＳＰの流速ＶがビーズＢ１，Ｂ２の凝集に及ぼす影響を説明するための概念図である。ビーズＢ１，Ｂ２と被検出物質Ｘとが遭遇して結合するかどうかは確率的な事象である。しかし、流速Ｖが遅い場合（たとえばＶ＝４７．６［μｍ／ｓ］である場合）、レーザ光Ｌ１のビームウエストに対するビーズＢ１，Ｂ２および被検出物質Ｘの単位時間当たりの供給量が相対的に少ないため、ビーズＢ１，Ｂ２と被検出物質Ｘとの遭遇確率が低い。よって、数分間の光照射時間が経過するまでの間にビーズＢ１，Ｂ２が被検出物質Ｘを介して結合して凝集体の成長がある程度進む場合もあれば、ビーズＢ１，Ｂ２と被検出物質Ｘとが遭遇せずにビーズＢ１，Ｂ２があまり結合できず、凝集体の成長が進みにくい場合もある（上図参照）。したがって、流速Ｖが過度に低流速（Ｖ＝４７．６［μｍ／ｓ］）である場合にはエラーバーが大きくなると考えられる。
一方、流速Ｖが速い場合（たとえばＶ＝４７６［μｍ／ｓ］である場合）には、ビーズＢ１，Ｂ２および被検出物質Ｘの単位時間当たりの供給量が相対的に多い。そのため、３分間の光照射時間の間にビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の成長が進みやすい。しかしながら、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が高流速の流体から受ける抵抗も大きいので、一旦、形成されつつあった凝集体が分裂する（凝集体の一部が千切れる）可能性がある（下図参照）。分裂して流される凝集体のサイズがばらつくため、残る側の凝集体のサイズもばらつく。したがって、流速Ｖが過度に高流速（Ｖ＝４７６［μｍ／ｓ］）である場合にもエラーバーが大きくなると考えられる。
このような理由により、流速Ｖには、たとえば、マイクロ流路９２の特性（流路内壁の形状、親水性／疎水性など）、ビーズＢ１，Ｂ２の特性（形状、サイズ、濃度、親水性／疎水性、帯電など）、サンプルＳＰの特性（溶媒の粘度など）に応じて、適切な範囲が存在する。よって、抗原検出処理の実行開始に先立ち、流速Ｖを最適化しておくことが望ましい。シリンジポンプ３０からの流速Ｖは、サンプルＳＰの流通開始に先立ち、ビーズＢ１，Ｂ２と被検出物質Ｘとが特異的に結合して凝集体の成長が進む最適な流速に調整される。また、後に実施例１０（図４４参照）にて説明するように、流速Ｖを所望の値の付近で高精度に調整可能なシリンジポンプ３０を採用することが望ましい。
［実施例３］
＜レーザ光の照射方向の影響＞
次に、レーザ光Ｌ１を上方照射した場合の測定結果を、レーザ光Ｌ１を下方照射の場合の測定結果（図１５参照）と比較する。
図１７は、被検出物質がＣＤ８０であり、レーザ光Ｌ１を検出キット９０の下方から上方に向けて照射した場合（上方照射時）におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。この例においても倍率１０倍の対物レンズ５０を用いた。また、マイクロ流路９２の上面を基準としたビームウエストの位置ｚｔｏｐ＝０μｍに設定した。さらに、サンプルＳＰの流速Ｖを１１９［μｍ／ｓ］に設定した。サンプルＳＰの流通方向は、図中右側から左側に向かう方向であった。
上方照射においても、ターゲット濃度が高いほど、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａが大きくなる傾向が確認された。また、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の形状がサンプルＳＰの流通方向に伸びた形状となることも分かった。
図１８は、図１７に示す画像から求められた、被検出物質ＸがＣＤ８０である場合のターゲット濃度と凝集面積Ａとの間の関係を示す図である。図１８には４回の測定結果の平均およびエラーバーが示されている。図１８より、上方照射においても下方照射と同様に、ターゲット濃度と凝集面積Ａとの間の対応関係（検量線）を取得可能であることが理解される。
下方照射時には、レーザ光Ｌ１の散逸力がビーズＢ１，Ｂ２に対して上方から下方に向けて作用する。ビーズＢ１、２の比重は水の比重と同程度（０．９８～１．０４［ｇ／ｃｍ３］）であるものの、凝集体を形成したビーズＢ１，Ｂ２はマイクロ流路９２の底面に堆積または沈降しやすい。このことが凝集面積Ａの算出結果に誤差を生じさせる要因となり得る。そこで、ビーズＢ１，Ｂ２の堆積または沈降を防ぎ、この誤差要因を取り除くことを目的に、下方照射に代えて上方照射を採用することも考えられる。しかし、上方照射により得られた凝集面積Ａのエラーバーは、下方照射により得られた凝集面積Ａのエラーバー（図１５参照）と同程度の長さであった。
図１９は、上方照射時においても凝集面積Ａに誤差が生じる理由を説明するための概念図である。レーザ光Ｌ１のビームウエストの位置に形成されたビーズＢ１，Ｂ２の凝集体に、サンプルＳＰの流通とともに新たなビーズＢ１，Ｂ２が供給されて結合することで、凝集体が成長する。この際、重力の影響により、凝集体は、ビームウエストの上方には伸びにくく、ビームウエストの下方には伸びやすい。凝集体がビームウエストの下方に伸びると、凝集体を鉛直方向に観察したときに、凝集体を構成するビーズＢ１，Ｂ２が互いに重複することになる。この重複部分は、凝集面積Ａに反映されないので、実際の凝集体のサイズと凝集面積Ａとの間に誤差を生じさせ、凝集面積Ａの算出精度を低下させ得る（詳細については後述する図２５の説明も参照）。
［実施例４］
＜対物レンズの倍率の影響＞
続いて、対物レンズ５０の倍率がビーズＢ１，Ｂ２の凝集体に与える影響について説明する。以下では、倍率が１０倍の対物レンズ５０を「１０倍レンズ」とも記載し、倍率が４０倍の対物レンズ５０を「４０倍レンズ」とも記載する。
図２０は、被検出物質ＸがＣＤ８０であり、１０倍レンズを用いた場合におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。図２１は、被検出物質ＸがＣＤ８０であり、４０倍レンズを用いた場合におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。図２０および図２１には、ターゲット濃度を０［ｐｇ／ｍＬ］から２．５［ｎｇ／ｍＬ］（＝２５００［ｐｇ／ｍＬ］）までの濃度範囲で６通りに設定し、下方照射により取得された画像が示されている。また、図２０および図２１において、左側の画像は、レーザ光Ｌ１を３分間照射した後に取得された画像である。右側の画像は、３分間のレーザ光Ｌ１の照射後にレーザ光Ｌ１の照射を停止し、その後、１０秒間が経過したときに取得された画像である。
図２０および図２１に示すように、実施の形態１においては、光誘導加速によって３分間程度でビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が観察された。つまり、被検出物質Ｘ（ＣＤ８０）の検出に要する時間は、わずか３分程度であった。光誘導加速を行わない手法（たとえばＥＬＩＳＡ法）では検出時間が約２時間であることを考えると、実施の形態１によれば被検出物質Ｘの検出時間が大幅に短縮されていることが分かる。
また、ターゲット濃度が等しい条件下で比較すると、４０倍レンズを用いた場合には、１０倍レンズを用いた場合と比べて、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体のサイズが大きくなる様子が観察された。その理由は以下のように考えられる。４０倍レンズを用いた場合には、１０倍レンズを用いた場合と比べて、ビームウエストのサイズが小さい分だけビームウエストにおける電場強度および電場強度勾配が強くなる。そうすると、ビーズＢ１，Ｂ２に作用する光誘起力（物質間光誘起力および勾配力）が強くなるので、ビーズＢ１，Ｂ２が凝集しやすい。
図２２は、図２０および図２１に示す画像から求められた、被検出物質ＸがＣＤ８０である場合のターゲット濃度とビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａとの間の関係を示す図である。図２２には４回の測定結果の平均およびエラーバーが示されている。マイクロ流路９２の底面を基準としたビームウエストの位置ｚｂｔｍ＝０μｍに設定した。サンプルＳＰの流速Ｖは１１９［μｍ／ｓ］に設定した。
図２２を参照して、１０倍レンズを用いた場合には、ターゲット濃度が高いほど、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａが大きくなる傾向が確認された。ただし、ターゲット濃度が２５０［ｐｇ／ｍＬ］から２５００［ｐｇ／ｍＬ］に増大しても、それに伴う凝集面積Ａの増加は比較的小さかった。そのため、ターゲット濃度をより高濃度にしても凝集面積Ａが単調には増加しなくなる可能性がある。
また、有意差検定を行うと、ターゲット濃度２５［ｐｇ／ｍＬ］の群の両側確率は０．０１１となった。両側確率が０．０５（＝５％）以内であることから、２５［ｐｇ／ｍＬ］の群と２．５［ｐｇ／ｍＬ］の群との間に有意な差があることが確認された。したがって、この実施例における被検出物質Ｘ（ＣＤ８０）の検出限界は２．５［ｐｇ／ｍＬ］と見積もられた。光誘導加速を行わないＥＬＩＳＡ法の検出限界が約２０［ｐｇ／ｍＬ］であるので、本実施例における被検出物質Ｘの検出限界が１桁程度低濃度である（すなわち、検出感度が１桁高い）ことが分かる。
一方、４０倍レンズを用いた場合、ターゲット濃度が２５００［ｐｇ／ｍＬ］のときの凝集面積Ａが、ターゲット濃度が２５０［ｐｇ／ｍＬ］のときの凝集面積Ａよりも小さくなった。また、ターゲット濃度が２５０［ｐｇ／ｍＬ］または２５００［ｐｇ／ｍＬ］である場合のエラーバーが非常に大きくなった。これは、４０倍レンズの使用によりビーズＢ１，Ｂ２の凝集体が過度に大きく成長する結果、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の一部が分裂してサンプルＳＰの流通方向に流されてしまったためと考えられる。
［実施例５］
＜ＦＤＰの濃度依存性＞
実施例５～実施例７では、被検出物質Ｙがフィブリノゲン・フィブリン分解産物（ＦＤＰ）である場合の濃度測定結果について説明する。図３にて説明したように、被検出物質Ｙ（ＦＤＰ）の検出には、１種類の抗ＦＤＰ抗体により修飾されたビーズＢ３が用いられる。
図２３は、被検出物質ＹがＦＤＰである実施例２におけるレーザスポット近傍の画像を示す図である。図２３および後述する図２６には、被検出物質Ｙの濃度（ターゲット濃度）を０［ｎｇ／ｍＬ］～１２０［μｇ／ｍＬ］の濃度範囲で６通りに設定した場合に、各ターゲット濃度において取得された画像が示されている。また、図２３の左側は、レーザ光Ｌ１を３分間下方照射した後に取得された画像を示す。右側は、３分間のレーザ光Ｌ１の下方照射後にレーザ光Ｌ１の照射を停止し、さらに１０秒間が経過したときに取得された画像を示す。
図２３に示すように、被検出物質ＹがＦＤＰである場合にも、ビーズＢ３の凝集体が確認された。
図２４は、被検出物質ＹがＦＤＰである場合のターゲット濃度とビーズＢ３の凝集面積Ａとの間の関係を示す図である。この例では、下方照射において、サンプルＳＰの流速Ｖを２通り（Ｖ＝４７．６［μｍ／ｓ］，１１９［μｍ／ｓ］）に設定した。また、３分間のレーザ光Ｌ１の照射後に１０秒待機した場合としなかった場合とを比較した。エラーバーは、各測定条件下で４回測定した場合の測定誤差を表す。
図２４を参照して、いずれの測定条件においても、ターゲット濃度が１２［μｇ／ｍＬ］である場合の凝集面積Ａは、ターゲット濃度が０．１２［μｇ／ｍＬ］（＝１２０［ｎｇ／ｍＬ］）以下である場合の凝集面積Ａと異なる。よって、ターゲット濃度が１２［μｇ／ｍＬ］である場合には測定条件にかかわらず被検出物質Ｙを検出可能であることが分かる。
その中でも右下図に示すように、流速Ｖを１１９［μｍ／ｓ］に設定し、かつ、３分間のレーザ光Ｌ１の照射後に１０秒間待機した場合には、ターゲット濃度が１．２［μｇ／ｍＬ］である場合にも被検出物質Ｙを検出できている可能性がある。このように、レーザ光Ｌ１の照射停止後に１０秒間の待機時間を設けることで、待機時間を設けない場合（左下図参照）と比べて、被検出物質Ｙの検出精度が向上し、検出可能な被検出物質Ｙの濃度の範囲が広くなっている（検出限界がより低濃度になっている）可能性がある。
［実施例６］
＜待機時間の設定＞
図２５は、レーザ光Ｌ１の照射停止後に待機時間を設ける意味を説明するための概念図である。待機時間を設けることで被検出物質Ｙの検出精度が向上する理由としては以下の２点が考えられる。
第１に、レーザ光Ｌ１の照射開始後、時間の経過に伴い、ビーズＢ３の凝集体の成長が進む。レーザ光Ｌ１の照射開始後に３分間が経過した時点では、レーザ光Ｌ１の光誘起力によりビームウエスト近傍に捕捉されているもののビーズＢ３の凝集体には結合していないビーズＢ３が存在する。このような未結合のビーズＢ３の量には測定毎のばらつきが大きい。よって、未結合のビーズＢ３は、凝集面積Ａを算出する上で誤差要因となり得る。レーザ光Ｌ１の照射停止後に待機時間を設けることで、未結合のビーズＢ３がサンプルＳＰの流通方向に流されるので、誤差要因が低減される。
第２に、ターゲット濃度と直接的に相関するパラメータは、ビーズＢ３の凝集体の３次元的なサイズ（体積）である。しかし、１台のカメラ６０で凝集体の３次元形状を撮影するのは困難である。そのため、ターゲット濃度の定量に、ビーズＢ３の凝集体のサイズに代えて、その凝集体を水平面上に射影した面積である凝集面積Ａを用いている。ここで、ビーズＢ３の凝集体には、鉛直方向（ｚ方向）に互いに重複する部分が存在するが、このような重複部分はカメラ６０では撮影されない。したがって、重複部分の大小は凝集面積Ａに反映されず、凝集体のサイズと凝集面積Ａとの対応が悪化する可能性がある。待機期間中には、レーザ光Ｌ１の照射停止直後と比べて、重複部分がサンプルＳＰの流通方向（ｘ方向）に伸びることで、重複部分が小さくなる。その結果、ビーズＢ３の凝集体のサイズと凝集面積Ａとの対応を改善できる。
以上の２つの理由により、待機時間を設けることで、ビーズＢ３の凝集面積Ａからターゲット濃度をより正確に定量することが可能になる。
［実施例７］
＜照射方向依存性および光照射時間の影響＞
図２６は、被検出物質ＹがＦＤＰである場合の上方照射時におけるターゲット濃度とビーズＢ３の凝集面積Ａとの間の関係を示す図である。図２６の左側は、レーザ光Ｌ１を４分間照射した後に取得された画像を示す。右側は、４分間のレーザ光Ｌ１の照射後にレーザ光Ｌ１の照射を停止し、その後、１０秒間が経過したときに取得された画像を示す。
図２７は、図２６に示す画像から求められた、被検出物質ＹがＦＤＰである場合のターゲット濃度とビーズＢ３の凝集面積Ａとの間の関係を示す図である。図２７を参照して、上方照射においては、レーザ光Ｌ１の照射後に待機時間を設けた場合（下図参照）のエラーバーの長さは、待機時間を設けなかった場合（上図参照）のエラーバーの長さと同程度であった。これより、上方照射時には下方照射時（図２４参照）とは異なり、待機時間を設ける効果が小さいことが分かる。
また、図２４と図２７とを比較すると、レーザ光Ｌ１の照射時間を３分間から４分間に長くしたことで、各ターゲット濃度におけるエラーバーが短くなった。これにより、測定条件最適化の一環としてレーザ光Ｌ１の照射時間の最適化が重要であることが分かる。
［実施例８］
＜デフォーカス条件＞
実施例８，９では、被検出物質ＸがＣＤ８０またはＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープである場合において、レーザ光Ｌ１のビームウエストがマイクロ流路９２を外れた条件下で光誘導加速を実施した結果について説明する。以下、この条件を「デフォーカス条件」とも呼ぶ。
図２８は、デフォーカス条件を説明するための図である。図２８を参照して、デフォーカス条件とは、より詳細には、レーザ光Ｌ１のビームウエストがマイクロ流路９２よりもレーザ光Ｌ１の照射方向後方に位置するとの条件である。図２８には、下方照射において、ビームウエストがマイクロ流路９２の底面よりも下方に位置する条件が図示されている。この条件は、マイクロ流路９２の底面を基準（ｚ＝０）に設定した場合のビームウエストの位置ｚｂｔｍが負になる条件とも言い換えられる。
図２９は、被検出物質ＸがＣＤ８０である場合にデフォーカス条件下でマイクロ流路９２の底面に生じた凝集体の画像を示す図である。ビームウエストをマイクロ流路９２の底面よりも６５μｍだけ下方に調整した（ｚｂｔｍ＝－６５μｍ）。４０倍レンズ透過後のレーザ出力は０．５３Ｗであった。サンプルＳＰの流速Ｖ＝１１９［μｍ／ｓ］に設定した。
図２９に示すように、ターゲット濃度が比較的高い場合（特にターゲット濃度が２５［ｐｇ／ｍＬ］以上である場合）、画像の色が相対的に薄い領域（以下、「薄色領域」とも呼ぶ）を輪郭とし、その中に画像の色が相対的に濃い領域（以下、「濃色領域」とも呼ぶ）の存在を確認できた。一方で、ターゲット濃度が極めて低濃度である場合（ターゲット濃度が２．５［ｐｇ／ｍＬ］以下である場合）にも薄色領域を確認できた。これは、ターゲット濃度が低濃度であってもビーズＢ１，Ｂ２の凝集が生じていることを意味している。
図３０は、デフォーカス条件下におけるターゲット濃度と凝集面積Ａとの間の関係を示す図である。デフォーカス条件下では、前述のフォーカス条件下（レーザ光Ｌ１のビームウエストがマイクロ流路９２内に位置する条件）での各測定結果とは異なり、ターゲット濃度の増大とともにビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａが増加するとの比例傾向は確認されなかった。これはデフォーカス条件に特有のビーズＢ１，Ｂ２の凝集メカニズムに起因すると考えられる。
図３１は、デフォーカス条件下におけるビーズＢ１，Ｂ２の凝集メカニズムを説明するための図である。図３１では、マイクロ流路９２の底面におけるレーザ光Ｌ１（レーザスポット）を黒い円で示している。
レーザ光Ｌ１の照射を受けたビーズＢ１，Ｂ２は、レーザ光Ｌ１の光誘起力（特に散逸力）によってマイクロ流路９２の底面に押し付けられる。これにより、マイクロ流路９２の底面上にビーズＢ１，Ｂ２が単層状に並ぶ（上図参照）。その単層の上に他のビーズＢ１，Ｂ２がさらに押し付けられることで、ビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が形成される（中段の図参照）。ただし、被検出物質Ｘを介して結合されていないビーズＢ１，Ｂ２は、サンプルＳＰの流通方向に押し流される（下図参照）。このような、いわば「洗浄効果」の結果、被検出物質Ｘを介して結合したビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が形成された領域が残る。図２９に示した濃色領域は、抗原抗体反応の結果、ビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が維持された領域であると考えられる。
このように、濃色領域は、被検出物質Ｘを介して結合したビーズＢ１，Ｂ２の量に依存する領域である。これに対し、薄色領域は、ビーズＢ１，Ｂ２が被検出物質Ｘを介して結合しているか否かにかかわらず、基本的にはレーザスポットの大きさに応じて定まる領域である。したがって、デフォーカス条件下では、画像の濃淡を区別しない凝集面積Ａに代えて濃色領域の面積を用いることで、ターゲット濃度を高精度に定量することが可能になる。
本実施例では便宜のため、濃色領域の面積を規格化する。具体的には、薄色領域の面積（画像の色が薄い輪郭内の全面積）に対する濃色領域の面積の割合を「多層割合」と定義する。
多層割合＝濃色領域の面積／全面積
図３２は、デフォーカス条件下におけるターゲット濃度と多層割合との間の関係を示す図である。図３２において、横軸はターゲット濃度を表し、縦軸は多層割合を表す。後述する図３３等においても同様である。
図３２の上部に示すように、ターゲット濃度２．５［ｐｇ／ｍＬ］と２５［ｐｇ／ｍＬ］との間に明確な差異が確認された。そこで、ターゲット濃度２．５［ｐｇ／ｍＬ］と２５［ｐｇ／ｍＬ］との間をより詳細に５［ｐｇ／ｍＬ］間隔で測定した結果を図３２の下部に示す。図３２の下部に示されるように、デフォーカス条件下では、ターゲット濃度の増大とともに多層割合が増大するとの比例傾向が１[ｐｇ／ｍＬ]～１０[ｐｇ／ｍＬ]の濃度範囲で確認された。この結果は、ＥＬＩＳＡ法等の従来の検出法と比べてターゲット濃度が１桁低い数［ｐｇ／ｍＬ］オーダーであっても検出できる可能性を示唆するものである。
図３３は、被検出物質ＸがＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープである場合のデフォーカス条件下におけるターゲット濃度と多層割合との間の関係を示す図である。測定条件は、図２９にて説明した被検出物質ＸがＣＤ８０である場合と共通の条件とした。
図３３を参照して、広範囲のターゲット濃度において、ターゲット濃度と多層割合との間の比例関係を確認できた。しかしながら、ターゲット濃度が極めて低濃度である場合には、大きなエラーバーに表されているように測定誤差が大きかった。これは、ＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープとビーズＢ１，Ｂ２との間の結合力（親和性）が、ＣＤ８０とビーズＢ１，Ｂ２との間の結合力と比べて弱いためと考察される。
［実施例９］
＜流路幅と照射スポット径との関係＞
ターゲット濃度が極めて低濃度である場合の測定誤差を低減すべく、マイクロ流路９２の幅とマイクロ流路９２におけるレーザスポットの直径との間の関係を最適化した。なお、以下ではマイクロ流路９２の幅を「流路幅Ｗ」と略す場合がある。また、マイクロ流路９２の底面におけるレーザスポットの直径を「照射スポット径φ」と記載することで、ビームウエストにおけるレーザスポットの直径である「最小スポット径φ０」と区別する。本実施例では、流路幅Ｗが互いに異なる３種類の検出キット９０を準備し、光誘導加速の測定を下方照射条件下で実施した。３種類のマイクロ流路９２を第１～第３のマイクロ流路と記載する。
図３４は、３種類の検出キット９０を撮影した画像である。図３４には上から順に第１～第３のマイクロ流路が示されている。各マイクロ流路は、長方形（正方形を含む）形状を有する。第１のマイクロ流路の流路幅Ｗ＝３５０μｍであった。第２のマイクロ流路の流路幅Ｗ＝５０μｍであった。第３のマイクロ流路の流路幅Ｗ＝１００μｍであった。各画像の中央に記載された円は、マイクロ流路９２の底面におけるレーザスポットの大きさ（照射スポット径φ）を表している。
図３５は、３種類の検出キット９０の断面図である。図３６は、第１～第３のマイクロ流路の各々について、流路幅Ｗと照射スポット径φとの間の関係を説明するための断面拡大図である。図３５および図３６を参照して、第１のマイクロ流路においては、流路幅Ｗ＝３５０μｍに対して、照射スポット径φ＝６８．３μｍであった。この場合、流路幅Ｗが照射スポット径φよりも著しく大きいため、第１のマイクロ流路の断面の一部のみ（詳細には断面積の約３４％）にレーザ光Ｌ１が照射される。
第２のマイクロ流路においては、流路幅Ｗ＝５０μｍに対して、照射スポット径φ＝５０μｍであった。したがって、第２のマイクロ流路では、その断面全体にレーザ光Ｌ１が照射される。
第３のマイクロ流路においては、流路幅Ｗ＝１００μｍに対して、照射スポット径φ＝６８．３μｍであった。この測定は、レーザスポットが下方ほど小さくなる下方照射条件で実施され、マイクロ流路９２の上面では全体にレーザ光Ｌ１が照射される。その点を考慮すると、流路幅Ｗとレーザスポットの大きさとは同程度であると言える。第３のマイクロ流路の断面のほとんど全部（詳細には断面積の約９５％）にレーザ光Ｌ１が照射されるものの、レーザ光Ｌ１が照射されない領域もわずかに存在する（残りの約５％）。
本発明者らによる検討の結果、高効率な凝集かつ高精度な定量を実現できるのは、第３のマイクロ流路のようにレーザ光Ｌ１が照射されない領域が局所的に残った場合であることが明らかになった。その理由は以下のように説明できる。まず、第１のマイクロ流路では、流路幅Ｗがレーザスポットの大きさよりも著しく大きい。そのため、レーザ光Ｌ１の照射を受けることなくレーザスポットを素通りするビーズＢ１，Ｂ２の割合が高い。よって、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集効率を向上させる余地がある。一方、第２または第３のマイクロ流路においては、断面の全体またはほぼ全体にレーザ光Ｌ１が照射されるため、ビーズＢ１，Ｂ２が凝集しやすい。第２および第３のマイクロ流路のなかでも特に第３のマイクロ流路を用いることで高い定量精度を実現できることを本発明者らは見出した。
図３７は、第２のマイクロ流路と第３のマイクロ流路との間のメカニズムの違いを説明するための図である。第２のマイクロ流路では断面全体にレーザ光Ｌ１が照射される。そうすると、ビーズＢ１，Ｂ２が凝集し、ビーズＢ１，Ｂ２の多層構造が形成される。本来であれば図３１にて説明したように、サンプルＳＰの流通方向に洗浄効果が生じ、被検出物質Ｘを介して結合されていないビーズＢ１，Ｂ２は、サンプルＳＰの流通方向に押し流される。しかし、第２のマイクロ流路では、サンプルＳＰの流れがビーズＢ１，Ｂ２により閉塞しやすく、洗浄効果が得られにくい。つまり、被検出物質Ｘを介して結合されていないビーズＢ１，Ｂ２もサンプルＳＰの流通方向に押し流されずに残りやすい。そうすると、多層構造が形成された領域と、被検出物質Ｘを介して結合したビーズＢ１，Ｂ２が存在する領域とが必ずしも一致しないので、多層割合からターゲット濃度を高精度には定量しにくい。なお、図３８は、第２のマイクロ流路よりもさらに流路幅Ｗが狭い（Ｗ＝２０μｍ）場合においてビーズＢ１，Ｂ２が閉塞している様子を撮影した画像を示す。
これに対し、第３のマイクロ流路においては、レーザ光Ｌ１が照射されない領域が流路側面付近に局所的に存在する。この領域は、サンプルＳＰの流れのいわば「逃げ道」または「抜け穴」として機能する。したがって、第３のマイクロ流路においてはビーズＢ１，Ｂ２による閉塞が生じにくく、洗浄効果が得られやすい。その結果、多層構造が形成された領域と、被検出物質Ｘを介して結合したビーズＢ１，Ｂ２が存在する領域とがよく一致する。よって、多層割合からターゲット濃度を高精度に定量することが可能になる。
図３９は、第３のマイクロ流路の底面に生じた凝集体の画像を示す図である。この測定では、ビームウエストをマイクロ流路９２の底面よりも６５μｍだけ下方に調整した（Ｄｂｔｍ＝－６５μｍ）。４０倍レンズ透過後のレーザ出力は０．２７Ｗであった。この場合、第３のマイクロ流路の流路壁面における散逸力は、３．３７ｐＮと算出される。被検出物質ＸにはＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープを用いた。サンプルＳＰの流速Ｖ＝１１９［μｍ／ｓ］に設定した。
図３９をよく観察すると、ターゲット濃度が高くなるに従って、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の輪郭内で濃色領域が増大していく様子を確認できる。
図４０は、ＥＬＩＳＡ法により得られた検量線を比較例として示す図である。図３９と同様に、被検出物質ＸにはＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープを用いた。図４０（および後述する図４２）の縦軸は、波長４５０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ値）を表す。図４１は、第３のマイクロ流路を用いて得られた検量線を示す図である。
図４０に示すように、ＥＬＩＳＡ法によっても高い直線線を示す検量線を得ることができた（決定係数Ｒ２＝０．９９９３）。ただし、ＥＬＩＳＡ法によって測定可能なターゲット濃度の範囲は、３．１［ｐｇ／ｍＬ］～２００［ｐｇ／ｍＬ］であった。ターゲット濃度が当該濃度範囲の下限値よりも低い場合にはエラーバーが大きく、十分に高い定量精度を得ることはできなかった。サンプル量は１００μＬであった。また、測定にはサンプル調製等の前処理を含めて約５時間を要した。
一方、本実施例においては図４１に示すように、ＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープを被検出物質Ｘとした場合に、０．３１［ｐｇ／ｍＬ］～５．０［ｐｇ／ｍＬ］の濃度範囲において、すなわち、ＥＬＩＳＡ法を適用可能な濃度範囲の下限と同等か１桁低い濃度において、高い直線線を示す検量線を得ることができた（Ｒ２＝０．９３７１）。サンプル量は１μＬ以下でよく、測定の所要時間も５分以内であった。
続いて、肺がん細胞（具体的には市販の肺がん細胞株Ａ５４９）由来のエクソソームを被検出物質Ｘとして用いた測定結果について説明する。光学系の測定条件は、図３９にて説明した条件と共通である。濃度１０００［μｇ／ｍＬ］のエクソソーム原液をリン酸バッファ（リン酸二水素ナトリウムとリン酸水素二ナトリウムとの混合水溶液）で希釈してサンプルＳＰとした。リン酸バッファの濃度は１０［ｍＭ］であり、リン酸バッファのｐＨは７．０であった。まず、ＥＬＩＳＡ法での測定結果について説明する。
図４２は、被検出物質Ｘがエクソソームである場合にＥＬＩＳＡ法により得られた検量線を比較例として示す図である。ＥＬＩＳＡ法によれば、ターゲット濃度が１．０［μｇ／ｍＬ］～５０［μｇ／ｍＬ］の濃度範囲内である場合には、高い直線線を示す検量線が得られた（Ｒ２＝０．９９８６）（上図参照）。しかしながら、ターゲット濃度が１．０［μｇ／ｍＬ］以下である場合には定量精度が大きく低下した（Ｒ２＝０．７２０８）（下図参照）。測定には約５時間を要した。
図４３は、本実施例において被検出物質Ｘがエクソソームである場合に得られた検量線を示す図である。本実施例においては、０．０１［μｇ／ｍＬ］～０．５［μｇ／ｍＬ］の濃度範囲において、すなわち、ＥＬＩＳＡ法を適用可能な濃度範囲の下限よりも２桁以上低い濃度においても、高い直線線を示す検量線を得ることができた（Ｒ２＝０．９５９５）。測定の所要時間も５分程度であり、２桁の時間短縮を達成できた。
なお、図２にて説明したように、エクソソームは、その表面に膜タンパク質を有する、直径３０ｎｍ～１５０ｎｍ程度の球形物質である。一方、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）も、その表面にＳ（スパイク）タンパク質を有する直径約１００ｎｍの球形物質である。したがって、エクソームを高感度かつ迅速に検出可能であることを示す上記図４３の測定結果は、SARS-CoV-2も検出可能であることを示唆している。すなわち、本実施例の新型コロナウイルス感染症（COVID-19）の検査への応用可能性が示唆されている。
［実施例１０］
＜シリンジポンプの影響＞
実施例１０では、異なる２機種のシリンジポンプ３０を用いた測定結果を比較する。第１および第２のシリンジポンプの流速Ｖは、各シリンジポンプの仕様値に基づく計算上、互いに等しい値になるように調整した。具体的は、マイクロ流路の断面の幅×高さが１００μｍ×１００μｍである場合に流速Ｖ＝１６７［μｍ／ｓ］に調整した。
なお、シリンジポンプ３０以外の測定条件は、図３９、図４１および図４３にて説明した条件と共通である。被検出物質Ｘとしては大腸がん細胞（具体的には市販の大腸がん細胞株ＨＣＴ１１６）由来のエクソソームを用いた。濃度１０００μｇ／ｍＬのエクソソーム原液をリン酸バッファで希釈してサンプルＳＰとした。リン酸バッファの濃度は１０［ｍＭ］であり、リン酸バッファのｐＨは７．０であった。
図４４は、２種類のシリンジポンプを用いて得られた検量線を示す図である。図４４の上部に第１のシリンジポンプを用いて得られた検量線を示し、下部に第２のシリンジポンプを用いて得られた検量線を示す。第１のシリンジポンプと比べて、第２のシリンジポンプの方が流速が安定していることを確認している。
第１および第２のシリンジポンプのどちらを用いた場合であっても、大腸がん細胞由来のエクソソームに関して高い直線性を示す検量線を得られることを確認できた。ただし、特に１［μｇ／ｍＬ］未満の低濃度範囲で比較すると、より安定した流速の流れを発生可能な第２のシリンジポンプを用いた場合の方が第１のシリンジポンプを用いた場合と比べて、検量線の直線性が一層向上するとともに測定誤差が低減されることが読み取れる。実施例２（図１６参照）にて説明したように、サンプルＳＰの流速Ｖは、ビーズＢ１，Ｂ２と被検出物質Ｘとの凝集体の成長が進みやすい最適な流速に調整することが望ましい。その最適な流速の実現に適した安定した圧力駆動流を発生できるシリンジポンプ３０を選定することで、より理想的な検量線を作成できる。
以上のように、実施の形態１においては、被検出物質Ｘ（ＣＤ８０、エクソソーム等）とビーズＢ１，Ｂ２とを含有し、マイクロ流路９２を流れるサンプルＳＰに対して、ビーズＢ１，Ｂ２に非共鳴光であるレーザ光Ｌ１を照射する。レーザ光Ｌ１の光誘起力を利用した「光誘導加速」を実現することで、被検出物質Ｘの存在下では、被検出物質Ｘがたとえ極微量（たとえばサブ～数［ｐｇ／ｍＬ］）であってもビーズＢ１，Ｂ２が短時間（たとえば数分間）で凝集する。カメラ６０により撮影された画像に基づき、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の存在の有無を判定することで、被検出物質Ｘの有無を検出できる（第１の抗原検出処理）。特に、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の面積（凝集面積Ａ）と被検出物質Ｘの濃度（ターゲット濃度）との間の対応関係を検量線として予め準備しておくことで、凝集面積Ａからターゲット濃度を算出できる（第２の抗原検出処理）。よって、実施の形態１によれば、被検出物質Ｘを迅速かつ高感度に検出できる。被検出物質Ｙ（ＦＤＰ等）とビーズＢ３との組合せについても同様である。
［実施の形態２］
実施の形態２においては、光誘導加速を３次元蛍光観察に適用する構成について説明する。
図４５は、実施の形態２に係る抗原検出システムの全体構成を概略的に示す図である。実施の形態２に係る抗原検出システム２００は、共焦点レーザ顕微鏡の光学系である共焦点光学系８０を備える点において、実施の形態１に係る抗原検出システム１００（図４参照）と異なる。共焦点光学系８０は、励起光源８１と、ビームスプリッタ８２と、走査装置８３と、焦準機構８４と、対物レンズ８５と、結像レンズ８６と、ピンホール（共焦点絞り）８７と、受光器８８とを含む。
励起光源８１は、サンプルＳＰを観察するためのレーザ光Ｌ３を発する。レーザ光Ｌ３は、サンプルＳＰに含まれる蛍光色素を励起可能な波長を有する。以下、サンプルＳＰから発せられ、観察しようとする蛍光を「蛍光Ｌ４」とも記載する。
ビームスプリッタ８２は、励起光源８１からのレーザ光Ｌ３を透過する一方で、サンプルＳＰからの蛍光Ｌ４を反射するように構成されている。
走査装置８３は、コントローラ７０からの指令に応じて、励起光源８１からのレーザ光Ｌ３を光軸と直交する方向（ｘｙ方向）に走査する。走査装置８３としては、たとえば、ガルバノミラー、ポリゴンミラー、音響光学偏向素子（ＡＯＤ：Acousto-optic Deflector）を用いることできる。
焦準機構８４は、コントローラ７０からの指令に応じて、検出キット９０と対物レンズ８５の焦点位置との間の光軸方向（ｚ方向）の距離を変化させる。なお、図４５には、焦準機構８４が対物レンズ８５を移動させる例が図示されているが、焦準機構８４は、検出キット９０が配置されたＸＹＺ軸ステージ１０を光軸方向に移動させてもよい。すなわち、焦準機構８４は、検出キット９０と対物レンズ８５との光軸方向の相対的な位置関係を変化させることができればよい。また、焦準機構８４に代えて、空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）、デフォーマブルミラーなどを採用してもよい。
対物レンズ８５は、励起光源８１からのレーザ光Ｌ３をサンプルＳＰに照射するとともに、サンプルＳＰから発せられた蛍光Ｌ４を走査装置８３に向けて透過する。
結像レンズ８６は、ビームスプリッタ８２にて反射した蛍光Ｌ４をピンホール８７上に集光させる。
ピンホール８７は、結像レンズ８６と受光器８８との間において、対物レンズ８５の焦点位置と共役な位置に配置されている。
受光器８８は、ピンホール８７を通過した蛍光Ｌ４を検出し、その検出結果をコントローラ７０に出力する。受光器８８は、フォトダイオード、アバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ：Avalanche Photodiode）、光電子増倍管などの受光素子を含む。
なお、抗原検出システム２００の上記以外の構成は、抗原検出システム１００の対応する構成と共通である。よって、詳細な説明は繰り返さない。また、図面の煩雑さを避けるため図示しないが、以下に測定結果を示すように、抗原検出システム２００は、光学顕顕微鏡像を撮影することも可能に構成されている。
図４６は、実施の形態２における第１の抗原検出処理を示すフローチャートである。図４７は、実施の形態２における第２の抗原検出処理を示すフローチャートである。図４６および図４７を参照して、実施の形態２における第１または第２の抗原検出処理は、白色光Ｌ２を照射する処理（Ｓ１０５，Ｓ２０６）に代えてレーザ光Ｌ３を照射する処理（Ｓ３０５，Ｓ４０６）を含む点、および、画像（光学顕微鏡像）を撮影する処理（Ｓ１０６，Ｓ２０７）に代えて蛍光像を撮影する処理（Ｓ３０６，Ｓ４０７）を含む点において、実施の形態１における処理（図１２または図１３参照）と異なる。これら以外の処理は同等であるため、説明は繰り返さない。
［実施例１１］
実施例１１では、被検出物質ＸとしてＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープを用いた。ＣＤ９／ＣＤ６３複合エピトープは蛍光色素を含まないため、ビーズＢ１，Ｂ２（ビーズ本体Ｂ０）に蛍光ビーズを採用した。
図４８は、蛍光ビーズを用いた場合にマイクロ流路９２に形成された凝集体の光学顕微鏡像を示す図である。図４９は、蛍光ビーズを用いた場合にマイクロ流路９２に形成された凝集体の３次元蛍光像を示す図である。
図４８に示す光学顕微鏡像より、ターゲット濃度が高くなるに従ってビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａが大きくなることが確認できた。また、図４９に示す３次元蛍光像においても、ターゲット濃度が高くなるに従って高い蛍光強度を示す領域（体積）が広がる様子を確認できた。
ビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａに代えて、高い蛍光強度を示す領域の体積、いわばビーズＢ１，Ｂ２の凝集体積を用いてもよい。凝集体積とターゲット濃度との間の検量線を準備することにより、凝集体積からターゲット濃度を算出できる。凝集体積は、本開示に係る「凝集体のサイズを表す指標」の他の一例である。なお、凝集体積の算出に共焦点光学系８０は必須ではない。凝集体積は、一般的な光学顕微鏡の光学系を用いて凝集体を少なくとも２方向（たとえば鉛直方向および水平方向）から観察することでも算出できる。
さらに、対物レンズ５０として、凸レンズに代えてシリンドリカルレンズを用いることで、サンプルＳＰの流通方向に伸びる細長い形状の凝集体を形成することも可能である。この場合、ビーズＢ１，Ｂ２が凝集した領域の長さ（サンプルＳＰの流通方向の長さ）を「凝集体のサイズを表す指標」として用いることもできる。このように、「凝集体のサイズを表す指標」は、長さ（１次元パラメータ）、面積（２次元パラメータ）、体積（３次元パラメータ）のいずれであってもよい。
［実施例１２］
実施例１２では、被検出物質Ｘとして、肺がん細胞株Ａ５４９由来の非蛍光性エクソソームを用いた。非蛍光性エクソソームのタンパク濃度（ターゲット濃度）は０．１［μｇ／ｍＬ］、１［μｇ／ｍＬ］の２通りに設定した。リン酸バッファの濃度は１０［ｍＭ］であり、リン酸バッファのｐＨは７．０であった。ビーズＢ１，Ｂ２には蛍光ビーズを用いた。
図５０は、被検出物質Ｘが非蛍光性エクソソームであり、ビーズＢ１，Ｂ２が蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路９２に形成された凝集体の光学顕微鏡像を示す図である。図５１は、被検出物質Ｘが非蛍光性エクソソームであり、ビーズＢ１，Ｂ２が蛍光ビーズである場合に、マイクロ流路９２に形成された凝集体の３次元蛍光像を示す図である。
実施例１１と同様に、光学顕微鏡像（図５０）においてはターゲット濃度が高いほどビーズＢ１，Ｂ２の凝集面積Ａが大きくなった。また、３次元蛍光像（図５１）においても、ターゲット濃度の上昇に伴って蛍光強度が高い領域の体積が増加した。
［実施例１３］
実施例１３では、被検出物質Ｘとして蛍光性エクソソーム（CD63-GFP-HeLa-exosome）を用いた。蛍光性エクソソームのタンパク濃度（ターゲット濃度）は２０［μｇ／ｍＬ］であった。リン酸バッファの濃度は１０［ｍＭ］であり、リン酸バッファのｐＨは７．０であった。ビーズＢ１，Ｂ２には非蛍光ビーズを用いた。
図５２は、被検出物質Ｘが蛍光性エクソソームである場合に、マイクロ流路９２に形成された凝集体の２次元蛍光像を示す図である。図５２を参照して、ビーズＢ１，Ｂ２が非蛍光性ビーズであっても、ビーズＢ１，Ｂ２に特異的に結合した蛍光性エクソソームからの蛍光を確認できた。
なお、実施例１１～１３では、被検出物質ＸおよびビーズＢ１，Ｂ２のうちの一方のみが蛍光色素を含む例について説明した。しかし、被検出物質ＸおよびビーズＢ１，Ｂ２の両方が蛍光色素を含む場合にも、高い蛍光強度を示す領域の広さ（≒凝集面積Ａ）がターゲット濃度に応じて定まることは上記測定結果から明らかである。
以上のように、実施の形態２においては、被検出物質ＸおよびビーズＢ１，Ｂ２のうちの少なくとも一方が蛍光色素を含み、かつ、抗原検出システム２００が蛍光観察可能な共焦点光学系８０を備える。２次元／３次元撮影された蛍光画像に蛍光を示す領域が観察されるかどうかに基づいて、ビーズＢ１，Ｂ２の凝集体の存在の有無を判定することで、被検出物質Ｘの有無を検出できる（第１の抗原検出処理）。また、蛍光が観察される領域の広さ（すなわち凝集面積Ａ）とターゲット濃度との間の対応関係を検量線として予め準備しておくことで、凝集面積Ａからターゲット濃度を算出できる（第２の抗原検出処理）。よって、実施の形態２によっても実施の形態１と同様に、被検出物質Ｘを迅速かつ高感度に検出できる。被検出物質ＹとビーズＢ３との組合せについても同様である。
なお、実施の形態１と実施の形態２とは適宜組み合わせることができる。実施の形態１にて説明した上方照射／下方照射、デフォーカス条件、流路幅Ｗと照射スポット径φとの関係、流速調整などを考慮して蛍光観察を行うことができる。
今回開示された実施の形態は、すべての点で例示であって制限的なものではないと考えられるべきである。本開示の範囲は、上記した実施の形態の説明ではなくて請求の範囲によって示され、請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。
Ｂ１～Ｂ３ ビーズ、Ｘ，Ｙ 被検出物質、Ｂ０ ビーズ本体、Ｂ１１ 第１抗体、Ｂ２１ 第２抗体、Ｂ１２，Ｂ２２ アビジン、Ｂ１３，Ｂ２３ ビオチン、Ｂ３１ 抗体、１０ ＸＹＺ軸ステージ、２０ 調整機構、３０ シリンジポンプ、３１，３２ 毛細管、４１ レーザ光源、４２ 照明光源、４３ ダイクロイックミラー、５０ 対物レンズ、６０ カメラ、７０ コントローラ、７１ プロセッサ、７２ メモリ、７３ 入出力ポート、８０ 共焦点光学系、８１ 励起光源、８２ ビームスプリッタ、８３ 走査装置、８４ 焦準機構、８５ 対物レンズ、８６ 結像レンズ、８７ ピンホール、８８ 受光器、９０ 検出キット、９１ 基材、９２ マイクロ流路、９２１ インレット、９２２ アウトレット、１００，２００ 抗原検出システム。

Claims (13)

  1. 被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料をポンプを用いて、上面および下面を有するマイクロ流路内が充填された状態で前記マイクロ流路に流通させるステップと、
    前記被検出物質と前記複数の微粒子との凝集体が形成されるように、前記複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を前記マイクロ流路を流通している前記液体試料に照射するステップと、
    前記液体試料からの光を受けた受光器からの信号に基づいて前記被検出物質を検出するステップとを含み、
    前記照射するステップは、前記非共鳴光の照射方向と同方向の散逸力を前記複数の微粒子に作用させることで、前記上面および前記下面のうち前記非共鳴光の照射方向下方の面に前記複数の微粒子を押し付けるステップを含む、被検出物質の検出方法。
  2. 被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料をポンプを用いて、マイクロ流路内が充填された状態で前記マイクロ流路に流通させるステップと、
    前記被検出物質と前記複数の微粒子との凝集体が形成されるように、前記複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を前記マイクロ流路を流通している前記液体試料に照射するステップと、
    前記液体試料からの光を受けたカメラからの信号に基づいて前記被検出物質を検出するステップとを含み、
    前記検出するステップは、
    前記液体試料を前記カメラにより撮影した画像に基づき、前記被検出物質と前記複数の微粒子とが凝集することで形成された凝集体のサイズを表す指標を算出するステップと、
    前記液体試料が前記マイクロ流路を流通している条件下において前記被検出物質の濃度と前記指標との間に予め求められた定量的な対応関係を参照することによって、算出された前記指標から前記液体試料に含まれる前記被検出物質の濃度を算出するステップとを含む、被検出物質の検出方法。
  3. 被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料をポンプを用いて、マイクロ流路内が充填された状態で前記マイクロ流路に流通させるステップと、
    前記被検出物質と前記複数の微粒子との凝集体が形成されるように、前記複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を前記マイクロ流路を流通している前記液体試料に照射するステップと、
    前記液体試料からの光を受けた受光器からの信号に基づいて前記被検出物質を検出するステップとを含み、
    前記照射するステップの後に前記非共鳴光の照射を停止するステップをさらに含み、
    前記検出するステップは、前記非共鳴光の照射が停止してから前記液体試料の流通により前記凝集体を洗浄するのに要する時間だけ待機した後に前記受光器から取得された信号に基づいて、前記被検出物質を検出するステップを含み、
    前記凝集体の洗浄は、前記複数の微粒子のうち前記凝集体に結合していない微粒子を前記液体試料の流通方向に押し流して前記凝集体から遠ざける作用である、被検出物質の検出方法。
  4. 前記検出するステップは、前記非共鳴光の照射継続中に前記受光器から取得した信号の強度変化に基づいて、前記液体試料に前記被検出物質が含まれているか否かを判定するステップを含む、請求項１に記載の被検出物質の検出方法。
  5. 前記複数の微粒子の各々の比重は、前記複数の微粒子の分散媒の比重よりも大きく、
    前記照射するステップは、前記非共鳴光を前記液体試料の上方から下方に向けて照射するステップを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の被検出物質の検出方法。
  6. 前記照射するステップは、前記非共鳴光の焦点が前記マイクロ流路よりも前記非共鳴光の照射方向後方に位置する条件下で前記非共鳴光を前記液体試料に照射するステップを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の被検出物質の検出方法。
  7. 前記照射するステップは、前記非共鳴光が照射されない領域が局所的に残った状態で、前記非共鳴光を前記液体試料に照射するステップを含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の被検出物質の検出方法。
  8. 前記流通させるステップに先立ち、前記液体試料の流速を、前記被検出物質と前記複数の微粒子とが結合して前記凝集体の成長が進み、かつ、成長した前記凝集体が分裂することを抑制可能な流速に調整するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の被検出物質の検出方法。
  9. 前記被検出物質および前記複数の微粒子のうちの少なくとも一方は、蛍光色素により修飾されている、請求項１～８のいずれか１項に記載の被検出物質の検出方法。
  10. 前記複数の微粒子の直径と前記非共鳴光の波長域との組み合わせは、前記非共鳴光を前記複数の微粒子に照射した場合に前記非共鳴光がミー散乱を起こすように定められる、請求項１～９のいずれか１項に記載の被検出物質の検出方法。
  11. 上面および下面を有するマイクロ流路が設けられた検出キットを保持するように構成されたホルダと、
    被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料を前記マイクロ流路内が充填された状態で前記マイクロ流路に流通させるポンプと、
    前記複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を前記マイクロ流路を流通している前記液体試料に照射する光源と、
    前記液体試料からの光を受ける受光器と、
    前記受光器からの信号に基づいて前記被検出物質の検出処理を実行する演算装置とを備え、
    前記光源は、前記上面および前記下面のうち前記非共鳴光の照射方向下方の面に前記複数の微粒子が押し付けられるように、前記非共鳴光の照射方向と同方向の散逸力を前記複数の微粒子に作用させるように構成されている、被検出物質の検出システム。
  12. マイクロ流路が設けられた検出キットを保持するように構成されたホルダと、
    被検出物質に特異的に結合するホスト分子で各々が修飾された複数の微粒子を含む液体試料を前記マイクロ流路内が充填された状態で前記マイクロ流路に流通させるポンプと、
    前記複数の微粒子の電子的共鳴の波長域外の光である非共鳴光を前記マイクロ流路を流通している前記液体試料に照射する光源と、
    前記液体試料を撮影するカメラと、
    前記カメラからの信号に基づいて前記被検出物質の検出処理を実行する演算装置とを備え、
    前記演算装置は、前記検出処理において、
    前記カメラにより撮影された画像から、前記被検出物質と前記複数の微粒子とが凝集することによって形成された凝集体のサイズを表す指標を算出し、
    前記液体試料が前記マイクロ流路を流通している条件下において前記被検出物質の濃度と前記指標との間に予め求められた定量的な対応関係を参照することによって、算出された前記指標から前記液体試料に含まれる前記被検出物質の濃度を算出する、被検出物質の検出システム。
  13. 前記光源からの前記非共鳴光を前記液体試料に照射し、かつ、前記液体試料からの光を前記カメラへと導く共焦点光学系をさらに備え、
    前記演算装置は、前記カメラにより撮影された３次元画像から前記凝集体の体積を前記指標として算出する、請求項１２に記載の被検出物質の検出システム。
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