JP7621666B2 - 血中のアンチトロンビンｉｉｉを定量するためのアプタマーベースのシステム - Google Patents

血中のアンチトロンビンｉｉｉを定量するためのアプタマーベースのシステム Download PDF

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１０月１５日出願の米国仮特許出願第６２／９１５，１０７号の利益を主張する。
配列表
ファイル ６９４９７８＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ中に書かれている配列表（サイズは５キロバイト、作成日：２０２０年９月３０日）は、本明細書に援用される。
緒言
アンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）は、炎症および凝固の調節因子／緩衝因子として機能する、肝臓によって生成される循環性セルピン（セリンプロテアーゼインヒビター）タンパク質である。ＡＴＩＩＩは、トロンビンに結合し、かつ阻害することによって、炎症および凝固を阻害する。ヒトが＜２０％ ＡＴＩＩＩ活性をもって産まれる場合、彼らは、重篤な凝固亢進性を示し、大部分は、生まれて数日以内に死亡する。３０～６０％の間のレベルは、慢性の、およびときおり急性の生命を脅かす状態と関連する。ＡＴＩＩＩ欠乏症は、深部静脈血栓症および自然肺塞栓症の最も一般的な原因のうちの１つである。
ヘパリンは、今日、病院で抗凝固のために最も一般的に利用される静脈内用薬剤（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｇｅｎｔ）である。ヘパリンは、ＡＴＩＩＩとのその相互作用を通じて抗凝固剤として作用する。ＡＴＩＩＩのアンチトロンビン活性は、ヘパリンを結合することによって、２０００～４０００倍増大される。入院している全患者のうちのおよそ１５％は、彼らが入院している間に、ある時点でヘパリンを受容する。それは、人工心肺を使用する間に必要とされる。心臓および血管手術では、ヘパリンは、中程度から大投与量（２５０～６００ｕ／Ｋｇのヘパリン）において与えられる。より小さい投与量は、心カテーテル法、腎透析、および多くの他の血液濾過または放射線手順のような手順のために慣用的に利用される。
ヘパリンへの患者応答は、集団における多型が原因で、および種々の疾患、傷害、状態、または薬物療法が循環性ＡＴＩＩＩを減少させ得ることから、非常に変動性である。特に、ヘパリン処置は、循環性ＡＴＩＩＩの減少を生じる。心臓手術において、ヘパリンへのヒト応答の変動性は、大きな問題である。低ＡＴＩＩＩを有する患者では、ヘパリンは、抗凝固剤として適切に機能しない。このような患者は、外因性ＡＴＩＩＩの投与を必要とする。アンチトロンビン補充は、心臓手術患者においてより良好な生存を生じる。しかし、過剰なアンチトロンビンは、有害な出血事象をもたらし得る。理想的には、被験体におけるＡＴＩＩＩのレベルは、ヘパリンまたはＡＴＩＩＩの投与の前に決定される。現在では、被験体におけるＡＴＩＩＩレベルを予測する、または迅速に測定するための信頼に足る手段は存在しない。既存のＡＴＩＩＩの試験は、ヘパリンの存在下もしくは非存在下で抗Ｘａ活性を間接的に評価するか、または複雑および／または頻度の低い病院状況で実行される酵素アッセイもしくはイムノアッセイを利用する。
要旨
サンプル中のアンチトロンビンＩＩＩ（ＡＴＩＩＩ）のレベルを決定するために有用な化合物、組成物、およびキットが、記載される。上記化合物、組成物、およびキットは、トロンビンに結合し、ＡＴＩＩＩの存在下で検出可能なシグナルを生じるシグナル伝達アプタマーを含む。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーは、蛍光標識を含む第１のトロンビン特異的アプタマーおよびクエンチャーを含む第２のトロンビン特異的アプタマーを含む。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーは、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体において、トロンビンに結合されて提供される。トロンビンに結合される場合、上記シグナル伝達アプタマーの各々に存在するハイブリダイズする配列は、二重鎖領域を形成するためにハイブリダイズする。その二重鎖の形成は、上記蛍光標識をクエンチャーに対して近位に置き、上記蛍光標識の蛍光の減少を生じる。ＡＴＩＩＩの存在下では、上記ＡＴＩＩＩは、トロンビンに結合し、上記第１のシグナル伝達アプタマー、上記第２のシグナル伝達アプタマー、または両方のシグナル伝達アプタマーを移動させる（ｄｉｓｐｌａｃｅ）。上記シグナル伝達アプタマーの移動は、蛍光シグナルの増大を生じる。蛍光シグナルの増大が測定され得、サンプル中のＡＴＩＩＩを検出および／または定量するために使用され得る。
記載される化合物、組成物、およびキットを使用して、サンプル中のＡＴＩＩＩを検出および／またはその量を定量する方法がまた、記載される。いくつかの実施形態において、上記方法は、トロンビン、第１のシグナル伝達アプタマー、および第２のシグナル伝達アプタマーを含むトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を形成する工程、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体と、ＡＴＩＩＩを含むかまたは含むと疑われるサンプルとを接触させる工程、および上記蛍光標識によって発せられる蛍光を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体と、ＡＴＩＩＩを含むかまたは含むと疑われるサンプルとを接触させる工程、および上記蛍光標識によって発せられる蛍光シグナルの増大を検出または測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの増大は、上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する。
いくつかの実施形態において、記載される化合物、組成物、キット、および方法は、医学的手順の前に、医学的手順と同時に、または医学的手順の後に、被験体に投与するためのヘパリンおよび／または外因性ＡＴＩＩＩの投与量を決定するために使用され得る。
図１は、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体へのＡＴＩＩＩ（アンチトロンビン）結合および第１の（ＴＢＡ１５）および第２の（ＴＢＡ２９）シグナル伝達アプタマーの両方の移動を図示する。いくつかのシグナル伝達アプタマー対に関して、トロンビンへのＡＴＩＩＩ結合は、第１の（例えば、ＴＢＡ１５）シグナル伝達アプタマーの解離を生じる。
図２． ＡＴＩＩＩの濃度の増大に伴う蛍光の増大を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図３． １００ｎＭ シグナル伝達アプタマー濃度に関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図４． ２００ｎＭ シグナル伝達アプタマー濃度に関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図５． ３００ｎＭ シグナル伝達アプタマー濃度に関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図６． ４００ｎＭ シグナル伝達アプタマー濃度に関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図７． トロンビン 対 シグナル伝達アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ６およびＴＢＡ２９－Ｄ６の比を増大させることに関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。ＴＢＡ１５－Ｆ６およびＴＢＡ２９－Ｄ６を、２００ｎＭの濃度として使用した。トロンビンを、２０ｎＭ～１００ｎＭで使用した。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図８． トロンビン 対 シグナル伝達アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ７およびＴＢＡ２９－Ｄ７の比を増大させることに関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。ＴＢＡ１５－Ｄ７およびＴＢＡ２９－Ｄ７を、２００ｎＭの濃度として使用した。トロンビンを、７５ｎＭ～３００ｎＭで使用した。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図９． トロンビン 対 シグナル伝達アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ８およびＴＢＡ２９－Ｄ８の比を増大させることに関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。ＴＢＡ１５－Ｄ８およびＴＢＡ２９－Ｄ８を、２００ｎＭの濃度として使用した。トロンビンを、７５ｎＭ～３００ｎＭで使用した。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図１０． トロンビン 対 シグナル伝達アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ９およびＴＢＡ２９－Ｄ９の比を増大させることに関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。ＴＢＡ１５－Ｄ９およびＴＢＡ２９－Ｄ９を、２００ｎＭの濃度として使用した。トロンビンを、７５ｎＭ～３００ｎＭで使用した。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図１１． トロンビン 対 シグナル伝達アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ１０およびＴＢＡ２９－Ｄ１０の比を増大させることに関して種々の波長での蛍光強度を図示するグラフ。ＴＢＡ１５－Ｄ１０およびＴＢＡ２９－Ｄ１０を、２００ｎＭの濃度として使用した。トロンビンを、７５ｎＭ～３００ｎＭで使用した。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図１２． 各構成要素に関して、２００ｎＭでのＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９＋トロンビン（１：１：１）複合体の形成の動態を図示するグラフ。
図１３． １９４０ｎＭ ＡＴＩＩＩの存在下でＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９＋トロンビン（１：１：１）複合体の解離の動態を図示するグラフ。上記複合体は、２００ｎＭの濃度で存在した。
図１４． ヘパリンの漸増濃度（０．２５ｇ／Ｌ～２．００ｇ／Ｌ）での２００ｎＭ 複合体の蛍光滴定を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図１５． ＨＢＡの漸増濃度（１ｇ／Ｌ～４ｇ／Ｌ）での２００ｎＭ 複合体の蛍光滴定を図示するグラフ。図の凡例中の複合体は、最大強度の順になっている（最高の最大強度～最低の最大強度）。
図１６． ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびＡＴＩＩＩの漸増濃度での２００ｎＭ トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の蛍光滴定を図示するグラフ。
図１７． ヘパリンおよびＡＴＩＩＩの漸増濃度での２００ｎＭ トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の蛍光滴定を図示するグラフ。
詳細な説明
Ａ．定義
本技術を詳細に記載する前に、本開示が、特定の組成物またはプロセス工程に限定されず、よって、変動し得ることは理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」とは、文脈が明らかに別のことを指し示すのでなければ、複数形への言及を包含することが注記されるべきである。従って、例えば、「１つのオリゴマー（ａｎ ｏｌｉｇｏｍｅｒ）」への言及は、複数のオリゴマーを含むなど。接続詞「または（ｏｒ）」とは、包括的な意味において、すなわち、その包括的な意味が文脈において非合理的でないのであれば、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」に等しいと解釈されるべきである。
概して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」とは、組成物の活性または安定性に対していかなる顕著な影響をも有しない組成物の構成要素の量の実質的でない変動を示す。本明細書が、パラメーターの具体的値を開示する場合、本明細書は、代わりに、その値「あたり（ａｂｏｕｔ）」でパラメーターを開示するとも理解されるべきである。全ての範囲は、「端点を含まない（ｎｏｔ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｅ ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ）」のような明確な排除がない場合に、その端点を包含すると解釈されるべきである；従って、例えば、「１０～１５以内（ｗｉｔｈｉｎ １０－１５）」とは、１０および１５という値を包含する。また、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む、包含する、が挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定であるとは意図されない。前述の一般的な説明および詳細な説明の両方が、例示でありかつ説明に過ぎず、教示の限定ではないことは、理解されるべきである。援用される任意の資料は、本開示の明示的な内容と不一致である程度までは、その明示的な内容が優先する。
具体的に注記されなければ、種々の構成要素を「含む」、を記載する本明細書中の実施形態は、その記載される構成要素「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」とも企図される。種々の構成要素「から本質的になる」を記載する本明細書中の実施形態は、「からなる」としても企図される。「から本質的になる」は、本明細書で記載される組成物および方法の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させないさらなる構成要素、組成物、または方法が、それら組成物または方法の中に包含され得ることを意味する。
「アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）」とは、特定の分子標的（例えば、タンパク質またはタンパク質エピトープ）に選択的に結合する短い（しばしば、長さが４０個の核酸塩基未満の）１本鎖ポリヌクレオチド分子である。アプタマーは、化学合成によって容易に生成される。アプタマーは、所望の貯蔵特性を有し得る。いくつかの実施形態において、上記アプタマーは、治療適用においてほとんどまたは全く免疫原性を誘発しない。
「シグナル伝達アプタマー（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｐｔａｍｅｒ）」は、ハイブリダイズする配列および標識に連結されたアプタマーである。上記ハイブリダイズする配列は、上記アプタマーの５’末端または３’末端に連結され得る。いくつかの実施形態において、上記ハイブリダイズする配列は、リンカーを介して上記アプタマーに連結される。いくつかの実施形態において、上記標識は、ハイブリダイズする配列に連結される。
「ハイブリダイズする配列（ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」は、相補的なハイブリダイズする配列と塩基対合し得る短い（概して長さが６～１２ヌクレオチドの）１本鎖ポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、第１のシグナル伝達アプタマーは、第２のシグナル伝達アプタマーに連結された第２のハイブリダイズする配列に相補的な第１のハイブリダイズする配列に連結される。上記第１のおよび第２のハイブリダイズする配列は、塩基対合して（ハイブリダイズして）、二重鎖領域を形成し得る。
「標識」とは、検出可能な分子および／またはクエンチャーである。検出可能な分子としては、蛍光標識が挙げられるが、これに限定されない。蛍光標識（フルオロフォア）は、光で励起する際に再発光し得る蛍光性化合物である。蛍光標識は、特異的波長の光エネルギーを吸収し、より長い波長の光を再発光する。クエンチャーは、蛍光標識の蛍光強度を減少させる化合物である。クエンチャーは、蛍光分子から発せられた励起エネルギーを吸収し得、熱としてまたはより長い波長の光としてエネルギーを散逸し得る。蛍光標識およびクエンチャーが十分近位にある場合、その蛍光標識の発光は抑制される。
蛍光標識としては、キサンテン、ＦＩＴＣ、ＦＡＭＴＭ、ＴＥＴＴＭ、ＣＡＬ ＦＬＵＯＲＴＭ（ＯｒａｎｇｅまたはＲｅｄ）、ＡＬＥＸＡ ＦＬＵＯＲＴＭ、ＱＵＡＳＡＲＴＭ、フルオレセイン、ヘキサクロロ－フルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ルシファーイエロー、エオシン、エリスロシン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、シアニン、またはＣＹ色素（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５）であり得るが、これらに限定されない。
クエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲＴＭ（ＢＨＱＴＭ、例えば、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－０、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ６５０）、またはＴＡＭＲＡＴＭ化合物であり得るが、これらに限定されない。
例示的な蛍光標識／クエンチャー対としては、フルオレセインおよびｄａｂｃｙｌ、フルオレセインおよびｂｌａｃｋ ｈｏｌｅ ｑｕｅｎｃｈｅｒ、エオシンおよびＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５およびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、ＣＹ５およびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２、ＣＹ３およびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、ＣＹ３およびＢｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２が挙げられるが、これらに限定されない。
「リンカー」または連結基とは、目的の１つの化学基またはセグメント（例えば、アプタマー）を、目的の別の化学基またはセグメント（例えば、ハイブリダイズする配列）へと、１またはこれより多くの共有結合を介して連結する、２つの原子間の接続である。いくつかの実施形態において、リンカーは、その２つの原子間の距離を増大させる。いくつかの実施形態において、リンカーは、上記連結に可撓性を付加する可撓性リンカーである。リンカーとしては、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基（これらの各々は、１またはこれより多くのヘテロ原子を含み得る）、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、サッカリド、およびポリマー基が挙げられるが、これらに限定されない。ポリマー基としては、ポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、リンカーは、ＰＥＧｎを含み、ここでｎは、１～５０の整数である。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＰＥＧ１、ＰＥＧ２、ＰＥＧ３、ＰＥＧ４、ＰＥＧ５、ＰＥＧ６、ＰＥＧ７、ＰＥＧ８、ＰＥＧ９、またはＰＥＧ１０を含む。上記リンカーは、上記アプタマーのその分子標的（例えば、トロンビン）への結合に干渉しない。上記リンカーは、相補的なハイブリダイゼーション配列を含む２つのアプタマーが標的分子に結合される場合、相補的なハイブリダイズする配列による二重鎖形成を促進し得る。
上記「サンプル」は、被験体に由来する任意の生理学的液体を含む。サンプルとしては、血液、血清、血漿、およびその画分が挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、使用前に予備処理され得る（例えば、血漿を血液から調製する）。サンプルは、サンプルは、上記被験体から得られるとおりに直接的に、または上記サンプルの特徴を改変するために予備処理の後に使用され得る。予備処理としては、濾過、希釈、および上記サンプルを調製もしくは分析するにあたって有用な１もしくはこれより多くの試薬の添加が挙げられるが、これらに限定されない。サンプルは、その元々のサンプル、または１もしくはこれより多くの予備処理を受けている元々のサンプルを含む。サンプルは、任意の適切なサイズまたは容積のものであり得る。いくつかの実施形態において、上記サンプル容積は、１ｍＬ未満もしくはこれに等しい、５００μＬ未満もしくはこれに等しい、２５０μＬ未満もしくはこれに等しい、１００μＬ未満もしくはこれに等しい、７５μＬ未満もしくはこれに等しい、５０μＬ未満もしくはこれに等しい、３５μＬ未満もしくはこれに等しい、２５μＬ未満もしくはこれに等しい、または２０μＬ未満もしくはこれに等しい。
「トロンビン」とは、セリンプロテアーゼである。ヒトにおいて、トロンビンは、Ｆ２遺伝子によってコードされる。プロトロンビン（凝固因子ＩＩ）は、タンパク質分解的に切断されて、凝固プロセスにおいてトロンビンが形成される。トロンビンは、次に、可溶性のフィブリノゲンを不溶性のフィブリン鎖へと変換するセリンプロテアーゼとして作用し、同様に、他の凝固関連反応を触媒する。トロンビンは、アンチトロンビンＩＩＩによって不活性化される。
Ｂ．シグナル伝達アプタマー
サンプル中のＡＴＩＩＩを検出および／またはそのレベルを定量するための化合物、組成物、キット、および方法が、記載される。
いくつかの実施形態において、上記化合物および組成物は、トロンビンに結合し、ＡＴＩＩＩの存在下で検出可能なシグナルを生成する１またはこれより多くのシグナル伝達アプタマーを含む。いくつかの実施形態において、上記化合物、組成物、およびキットは、第１のシグナル伝達アプタマーおよび第２のシグナル伝達アプタマーを含み、これらは各々、トロンビンに結合する。上記第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマーは、トロンビン上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、上記第１のアプタマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含み、上記第２のアプタマーは、上記蛍光標識の蛍光を低減または変化させるクエンチャーを含む。いくつかの実施形態において、上記第２のアプタマーは、検出可能な標識（例えば、蛍光標識）を含み、上記第１のアプタマーは、上記蛍光標識の蛍光を低減または変化させるクエンチャーを含む。上記第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマーは、上記クエンチャーが、両方のシグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合される場合に、上記蛍光標識からのシグナルをクエンチするように構成される。上記第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマーは、トロンビンへのＡＴＩＩＩ結合が、上記アプタマーのうちの少なくとも一方を上記トロンビンから解離することを生じるように、さらに設計される。シグナル伝達アプタマーの、トロンビンからの解離は、蛍光標識の脱クエンチ（ｄｅｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）および検出可能なシグナル（すなわち、蛍光）の増大を生じる。
上記第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマーは、上記シグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合される場合に、二重鎖領域を形成し得るハイブリダイゼーション配列を含む。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマー上の標識は、上記ハイブリダイゼーション配列に連結される。いくつかの実施形態において、上記ハイブリダイゼーション配列は、上記ハイブリダイゼーション配列が塩基対合して二重鎖を形成する場合に、上記蛍光標識を上記クエンチャーと近位に位置づけるように設計される。上記ハイブリダイゼーション配列は、上記シグナル伝達アプタマーがＡＴＩＩＩの非存在下でトロンビンに結合される場合に、上記蛍光標識がクエンチされるように、十分に安定な二重鎖を形成する。いくつかの実施形態において、上記ハイブリダイゼーション配列は、トロンビンへのＡＴＩＩＩの結合が、脱クエンチおよび蛍光の増大を生じるようにさらに設計される。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーは、上記アプタマー配列と上記ハイブリダイゼーション配列との間にリンカーを含む。上記リンカーは、上記アプタマー配列と上記ハイブリダイゼーション配列との間の間隔を増大させるために、および／または上記アプタマー配列と上記ハイブリダイゼーション配列との間に可撓性を付加するために、使用され得る。上記リンカーは、上記シグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合される場合に、ハイブリダイゼーション配列の間での二重鎖形成を促進するように設計される。
いくつかの実施形態において、第１のシグナル伝達アプタマーは、トロンビンアプタマーＴＢＡ１５のアプタマーヌクレオチド配列を含む。ＴＢＡ１５は、配列５’－ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ－３’（配列番号１）を有する１５マーの１本鎖ＤＮＡである。上記ＴＢＡ１５アプタマーは、トロンビンのエキソサイトＩエピトープに約１００ｎＭのＫｄで結合する。エキソサイトＩは、トロンビン上のフィブリノゲンの結合部位である。他の実施形態において、上記第１のシグナル伝達アプタマーは、トロンビンアプタマーＴＢＡ２９のアプタマーヌクレオチド配列（以下でより詳細に記載される）を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のシグナル伝達アプタマーは、上記アプタマーの３’末端に連結された第１のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のハイブリダイズする配列は、リンカーを介して上記アプタマーの３’末端に連結される。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、ＰＥＧ１－１０（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１－１０－）を含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、ＰＥＧ６を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のシグナル伝達アプタマーは、上記第１のハイブリダイズする配列に連結された蛍光分子を含む。いくつかの実施形態において、上記第１のシグナル伝達アプタマーは、上記第１のハイブリダイズする配列の３’末端に連結された蛍光分子を含む。
いくつかの実施形態において、第２のシグナル伝達アプタマーは、トロンビンアプタマーＴＢＡ２９のアプタマーヌクレオチド配列を含む。ＴＢＡ２９は、配列５’－ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ－３’（配列番号２）を有する２９マーの１本鎖ＤＮＡである。上記ＴＢＡ２９アプタマーは、トロンビンのエキソサイトＩＩエピトープに約０．５ｎＭのＫｄで結合する。上記エキソサイトＩＩエピトープは、第Ｖ／ＶＩＩＩ因子の活性化に関与し、ヘパリン結合を媒介する。他の実施形態において、上記第２のシグナル伝達アプタマーは、トロンビンアプタマーＴＢＡ１５のアプタマーヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のシグナル伝達アプタマーは、上記アプタマーの５’末端に連結された第２のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のハイブリダイズする配列は、リンカーを介して上記アプタマーの５’末端に連結される。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＰＥＧを含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、ＰＥＧ１－１０（例えば、－（ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ）１－１０－）を含む。いくつかの実施形態において、上記ＰＥＧは、ＰＥＧ６を含む。いくつかの実施形態において、上記第２のシグナル伝達アプタマーは、上記第２のハイブリダイズする配列に連結されたクエンチャーを含む。いくつかの実施形態において、上記第２のシグナル伝達アプタマーは、上記第２のハイブリダイズする配列の５’末端に連結されたクエンチャーを含む。
他のトロンビン結合アプタマーは、当該分野で公知の方法を使用して同定され得る。このような方法としては、指数関数的富化によるリガンドの体系的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）（ＳＥＬＥＸ）法および自動化インビトロ選択が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、長さが５～２０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、長さが６～１０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、長さが６、７、８、９、または１０個の核酸塩基である。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、長さが９個の核酸塩基である。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、ハイブリダイズして、長さが６～１０個の塩基対の二重鎖を形成する。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、ハイブリダイズして、長さが６、７、８、９、または１０個の塩基対の二重鎖を形成する。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、ハイブリダイズして、長さが９個の塩基対の二重鎖を形成する。
いくつかの実施形態において、第１のシグナル伝達アプタマーは、５’－Ｎｎ－３’の第１のハイブリダイズする配列を含み、ここで各Ｎは、独立して、任意の核酸塩基であり、ｎは、６～１０の整数であり、第２のシグナル伝達アプタマーは、上記第１のハイブリダイズする配列に相補的な第２のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ハイブリダイズした二重鎖は、４個のＧ：Ｃ塩基対および５個のＡ：Ｔ塩基対を含む。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’（配列番号３）または５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号４）を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーの第１のおよび第２のハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’（配列番号３）および５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号４）を含むかまたはからなる。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＴ－３’（配列番号５）または５’－ＡＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号６）を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーの第１のおよび第２のハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＴ－３’（配列番号５）および５’－ＡＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号６）を含むかまたはからなる。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＧＴ－３’（配列番号７）または５’－ＡＣＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号８）を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーの第１のおよび第２のハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＧＴ－３’（配列番号７）および５’－ＡＣＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号８）を含むかまたはからなる。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）または５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーの第１のおよび第２のハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）および５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）を含むかまたはからなる。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＣＴ－３’（配列番号１１）または５’－ＡＧＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１２）を含むかまたはからなる。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーの第１のおよび第２のハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＣＴ－３’（配列番号１１）および５’－ＡＧＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１２）を含むかまたはからなる。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーのハイブリダイズする配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）または５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）からなる。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーは、５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）からなる３’のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーは、５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）からなる３’のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーは、５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）からなる５’のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーは、５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）からなる５’のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーは、５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）からなる３’のハイブリダイズする配列を含み、上記ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーは、５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）からなる５’のハイブリダイズする配列を含む。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーは、５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’（配列番号１０）からなる３’のハイブリダイズする配列を含み、上記ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーは、５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’（配列番号９）からなる５’のハイブリダイズする配列を含む。
いくつかの実施形態において、シグナル伝達アプタマーは、タンパク質結合領域（アプタマー）と上記ハイブリダイズする配列との間にリンカーを含む。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、可撓性リンカーである。上記リンカーは、核酸塩基リンカーまたは非核酸塩基リンカーであり得る。非核酸塩基リンカーは、ＰＥＧまたは脂肪族鎖であり得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記リンカーは、ＰＥＧ基である。上記ＰＥＧ基は、（ＰＥＧ）ｎであり得、ここでｎは、１～２０の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの実施形態において、ｎは、６である。
いくつかの実施形態において、第１のハイブリダイズする配列および蛍光標識を含む第１のシグナル伝達アプタマーは、上記第１のハイブリダイズする配列に相補的な第２のハイブリダイズする配列および上記蛍光標識によって発せられた蛍光を低減または変化させるクエンチャーを含む第２のシグナル伝達アプタマーと対形成される。
Ｃ．組成物
いくつかの実施形態において、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体が記載される。トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、記載される第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマーによって結合されたトロンビンを含む。いくつかの実施形態において、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、組成物中に存在する。上記組成物は、蛍光の検出または測定を促進する１またはこれより多く構成要素を含み得る。
トロンビンは、当該分野で公知の種々の方法によって調製され得、用語「トロンビン」は、特定の生成方法を含意することは意図されない。上記トロンビンは、天然に存在する供給源から、組換えの、合成のものから精製され得るか、または培養物中で細胞（例えば、細菌、昆虫、酵母または哺乳動物細胞）から合成され得る。トロンビンは、血漿から精製され得る。ヒトおよび非ヒト両方のトロンビンが、本発明内で使用され得る。いくつかの実施形態において、上記トロンビンは、ヒトトロンビンである。
上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、溶液中に、または凍結乾燥粉末もしくはケークにおいて提供され得る。上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体はまた、固体支持体（例えば、試験ストリップ）上に提供され得る。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーは、約１００ｎＭ～約４００ｎＭの濃度において溶液中に提供され得る。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーは、約１００ｎｍ、約２００ｎＭ、約３００ｎｍ、または約４００ｎＭの濃度で溶液中に提供され得る。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーは、約２００ｎＭの濃度で溶液中に提供され得る。いくつかの実施形態において、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、約１００ｎＭ～約４００ｎＭの濃度で溶液中に提供され得る。いくつかの実施形態において、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、約１００ｎｍ、約２００ｎＭ、約３００ｎｍ、または約４００ｎＭの濃度で溶液中に提供され得る。いくつかの実施形態において、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、約２００ｎＭの濃度で溶液中に提供され得る。
いくつかの実施形態において、上記第１のシグナル伝達アプタマー 対 上記第２のシグナル伝達アプタマーのモル比は、約１：１である。いくつかの実施形態において、第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマー 対 トロンビンのモル比は、約１：１：２～２：２：１（第１のシグナル伝達アプタマー：第２のシグナル伝達アプタマー：トロンビン）である。いくつかの実施形態において、第１のおよび第２のシグナル伝達アプタマー 対 トロンビンのモル比は、約１：１：１（第１のシグナル伝達アプタマー：第２のシグナル伝達アプタマー：トロンビン）である。いくつかの実施形態において、ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー 対 ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーのモル比は、約１：１である。いくつかの実施形態において、上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーおよびＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマー 対 トロンビンのモル比は、約１：１：２～２：２：１（ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー：ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマー：トロンビン）である。いくつかの実施形態において、ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーおよびＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマー 対 トロンビンのモル比は、約１：１：１（ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー：ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマー：トロンビン）である。
ＡＴＩＩＩを含むサンプルが、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体、または上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を含む組成物に添加される場合、上記ＡＴＩＩＩは、上記トロンビンに結合し、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の解離、および上記シグナル伝達アプタマーのうちの一方に存在する蛍光標識からの蛍光の増大をもたらす。蛍光の増大は、上記サンプル中のＡＴＩＩＩの量に比例する。トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の解離は、上記トロンビンからの上記第１のシグナル伝達アプタマー、上記第２のシグナル伝達アプタマー、または両方のシグナル伝達アプタマーの解離を含む。いくつかの実施形態において、トロンビンへのＡＴＩＩＩ結合は、上記第１のシグナル伝達アプタマーを解離する。
いくつかの実施形態において、上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルは、蛍光の増大と標準曲線とを比較することによって決定することである。同じ条件下で測定される場合に、ＡＴＩＩＩの種々の既知の濃度に関して蛍光の増大のレベルを決定することによって、標準曲線が得られ得る。
Ｄ．キット
本明細書で開示される方法を行うにあたって利用される１もしくはこれより多くの試薬を含むキット、または本明細書で開示される１もしくはこれより多くの化合物もしくは組成物を含むキットがまた、提供される。このようなキットは、本質的に診断用であり得る。
キットは、一般に、適切な容器または入れ物中にシグナル伝達アプタマーまたはトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の記載される対を含む。上記キットはまた、サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定するにあたって有用なさらなる試薬またはデバイスを含み得る。このようなさらなる試薬またはデバイスは、緩衝液、ＡＴＩＩＩ、シリンジ、および皮下注射針のうちの１つまたはこれより多くであり得るが、これらに限定されない。上記キットは、１またはこれより多くのサンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを定量するために使用され得る。上記容器は、種々の材料（ガラスおよび薬学的に適合性のプラスチックが挙げられるが、これらに限定されない）から形成され得る。
いくつかの実施形態において、キットは、記載されるシグナル伝達アプタマーまたは複合体のうちのいずれかの１つまたはこれより多くを含む１またはこれより多くの容器を含む。いくつかの実施形態において、キットは、記載されるシグナル伝達アプタマーまたは複合体のうちのいずれかの１つまたはこれより多くを含む１つまたはこれより多くの試験ストリップを含む。いくつかの実施形態において、キットは、単位投与量（すなわち、例えば、必要に応じて、１またはこれより多くの試薬とともに、サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定するために適切な記載されるシグナル伝達アプタマーまたは複合体のうちのいずれかを含む、組成物の所定の量を意味する）を含む。いくつかの実施形態において、上記キットは、１またはこれより多くのコントロールサンプルを含む。
いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーまたはトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体が、液体中に提供される。上記液体は、滅菌されていてもよいし、滅菌されていなくてもよい。いくつかの実施形態において、上記シグナル伝達アプタマーまたはトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体は、適切な溶媒を添加した際に再構成され得る、凍結乾燥した形態において提供される。再構成のために使用される溶媒は、別個の容器中に提供され得る。
いくつかの実施形態において、キットは、標識、マーカー、パッケージ挿入物、バーコードおよび／または上記キットの内容物が、サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定するために使用され得ることを示すリーダー（reader）を含む。いくつかの実施形態において、キットは、サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを測定するために、上記キットの使用を記載する説明資料を含み得る。
Ｅ． 方法。
サンプル中のＡＴＩＩIを検出および／またはその量を定量するために、記載される化合物および組成物を使用する方法が、記載される。いくつかの実施形態において、上記方法は、トロンビン、第１のシグナル伝達アプタマー、および第２のシグナル伝達アプタマーを含むトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を形成する工程、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体と、ＡＴＩＩＩを含むかまたは含むと疑われるサンプルとを接触させる工程、および上記蛍光標識によって発せられた蛍光を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体と、ＡＴＩＩＩを含むかまたは含むと疑われるサンプルとを接触させる工程、および前記蛍光標識によって発せられた蛍光シグナルを検出するかまたは蛍光シグナルの増大を測定する工程を包含する。いくつかの実施形態において、蛍光シグナルの増大は、上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する。
サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定するための記載される方法は、迅速で、単純、かつ正確である。上記方法は、医学的手順の前に、医学的手順と同時に、および／または医学的手順の後に行われ得る。医学的手順としては、心臓手術、血管手術、人工心肺バイパス、心カテーテル法、透析、体外式膜型人工肺、濾過手順、および放射線手順が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、記載される化合物、組成物、および方法は、約１０％以内、約９％以内、約８％以内、約７％以内、約６％以内、約５％以内、約４％以内、約３％以内、約２％以内、または約１％以内の、被験体におけるＡＴＩＩＩのレベルを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、記載される化合物、組成物、および方法は、約５％以内の、被験体におけるＡＴＩＩＩのレベルを決定するために使用され得る。いくつかの実施形態において、上記方法は、３０分未満またはこれに等しい時間で、２５分未満またはこれに等しい時間で、２０分未満またはこれに等しい時間で、１５分未満またはこれに等しい時間で、または１０分未満またはこれに等しい時間で、サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを測定するために使用され得る。
いくつかの実施形態において、記載される方法は、被験体がＡＴＩＩＩ欠乏であるか否かを決定するために使用される。いくつかの実施形態において、記載される方法は、ヘパリンおよび／または外因性ＡＴＩＩＩの投与量を決定して、患者に投与するために使用される。
いくつかの実施形態において、サンプル中のＡＴＩＩＩ尺度のレベルは、所定のコントロールまたはレベルと比較される。上記所定のコントロールまたはレベルは、ヘパリンに応答することが既知および／またはＡＴＩＩＩが欠乏していることが既知の被験体の集団から得られ得る。いくつかの実施形態において、所定のコントロール未満の値は、上記被験体はＡＴＩＩＩを欠乏しており、外因性ＡＴＩＩＩの投与から利益を得ると思われることを示す。いくつかの実施形態において、上記サンプル中のＡＴＩＩIのレベルが所定のレベルより低い場合、外因性ＡＴＩＩＩが上記被験体に投与される。いくつかの実施形態において、所定のコントロールより高い値は、上記被験体はＡＴＩＩＩを欠乏しておらず、ヘパリン処置に応答する可能性が高いことを示す。いくつかの実施形態において、上記サンプル中のＡＴＩＩIのレベルが所定のコントロールより高い場合、ヘパリンが上記被験体に投与される。
抗凝固剤で患者を処置する方法であって、上記方法は、血清、血漿、または血液サンプルを上記患者から得る工程；上記サンプルと、記載されるトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体とを接触させる工程；蛍光の増大を測定する工程；および上記蛍光の増大に基づいて、上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定する工程；ならびに上記サンプル中のＡＴＩＩＩの決定されたレベルに基づいて、上記患者にヘパリンおよび／または外因性ＡＴＩＩＩを投与する工程を包含する方法が記載される。
Ｆ．実施形態の列挙
１．被験体におけるアンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）のレベルを決定するためのキットであって、上記キットは、
（ａ）第１のトロンビン特異的アプタマー、第１のハイブリダイゼーション配列、および蛍光標識を含む第１のシグナル伝達アプタマー；ならびに
（ｂ）第２のトロンビン特異的アプタマー、第２のハイブリダイゼーション配列、およびクエンチャーを含む第２のシグナル伝達アプタマー、
を含み、ここで上記第１のおよび第２のハイブリダイゼーション配列は、互いに対して相補的であり、上記蛍光標識の蛍光は、上記第１のおよび第２のトロンビン特異的シグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合される場合にクエンチされる、キット。
２．上記第１のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ１５を含む、実施形態１に記載のキット。
３． 上記第２のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ２９を含む、実施形態１または２に記載のキット。
４． 上記第１のおよび第２のハイブリダイゼーション配列は、長さが６～１０個の核酸塩基である、実施形態１～３のいずれか１つに記載のキット。
５． 上記第１のおよび第２のハイブリダイゼーション配列は、長さが９個の核酸塩基である、実施形態４に記載のキット。
６． 上記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’を含み、上記第２のハイブリダイゼーション配列は５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または上記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、上記第２のハイブリダイゼーション配列は５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’を含む、実施形態１～５のいずれか１つに記載のキット。
７． 上記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含み、上記第２のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または上記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、上記第２のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含む、実施形態６に記載のキット。
８． 上記第１のおよび／または第２のシグナル伝達アプタマーは、リンカーを含み、上記リンカーは、上記トロンビン特異的アプタマーを上記ハイブリダイゼーション配列に接続する、実施形態１～７のいずれか１つに記載のキット。
９． 上記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、実施形態８に記載のキット。
１０． 上記ＰＥＧは、ＰＥＧ６である、実施形態９に記載のキット。
１１． 上記蛍光標識は、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン、テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ルシファーイエロー、エオシン、エリスロシン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、またはシアニンを含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載のキット。
１２． 上記クエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ、またはＴＡＭＲＡ化合物を含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載のキット。
１３． トロンビンをさらに含む、実施形態１～１２のいずれか１つに記載のキット。
１４． 上記トロンビン、第１のシグナル伝達アプタマー、および第２のシグナル伝達アプタマーは、複合体を形成する、実施形態１３に記載のキット。
１５． トロンビン；第１のトロンビン特異的アプタマー、第１のハイブリダイゼーション配列、および蛍光標識を含む第１のシグナル伝達アプタマー；ならびに第２のトロンビン特異的アプタマー、第２のハイブリダイゼーション配列、およびクエンチャーを含む第２のシグナル伝達アプタマーを含む複合体であって、ここで上記第１のおよび第２のハイブリダイゼーション配列は、互いに対して相補的であり、二重鎖を形成し、上記蛍光標識の蛍光はクエンチされる、複合体。
１６． トロンビンをさらに含む、実施形態１５に記載の複合体。
１７． 被験体に由来するサンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定する方法であって、上記方法は、
（ａ）上記サンプルを上記被験体から得る工程；
（ｂ）実施形態１５に記載の複合体を含む組成物と、上記サンプルとを接触させる工程；および
（ｃ）上記組成物の蛍光の増大を測定する工程、
を包含し、ここで上記蛍光の増大は、上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する、方法。
１８． 上記サンプルは、血清サンプル、血液サンプル、または血漿サンプルを含む、実施形態１７に記載の方法。
１９． 上記蛍光の増大は、１５分未満で測定される、実施形態１７または１８に記載の方法。
２０． 抗凝固剤で患者を処置する方法であって、上記方法は、
（ａ）上記患者におけるＡＴＩＩＩのレベルを決定する工程であって、ここで上記決定する工程は、
（ｉ）血清、血漿、または血液サンプルを上記患者から得る工程；
（ｉｉ）実施形態１５または１６に記載の複合体を含む組成物と、上記サンプルとを接触させる工程；および
（ｉｉｉ）上記組成物の蛍光の増大を測定する工程であって、ここで上記蛍光の増大は、上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する、工程、
を包含する、工程；ならびに
（ｂ）工程（ｉｉｉ）において決定された上記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに基づいて、上記患者に、ヘパリンおよび／または外因性ＡＴＩＩＩを投与する工程、
を包含する、方法。
実施例１． 例示的シグナル伝達アプタマー
ＴＢＡ１５－Ｆ６（５’－ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ－（ＰＥＧ）６－ＧＴＣＧＴＡ－ＦＩＴＣ－３’）（配列番号１３）、
ＴＢＡ２９－Ｄ６（５’－ＤＡＢＣＹＬ－ＴＡＣＧＡＣ－（ＰＥＧ）６－ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ－３’）（配列番号１４）、

ＴＢＡ１５－Ｆ７（５’－ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ－（ＰＥＧ）６－ＧＴＣＧＴＡＴ－ＦＩＴＣ－３’）（配列番号１５）、
ＴＢＡ２９－Ｄ７（５’－Ｄａｂｃｙｌ－ＡＴＡＣＧＡＣ－（ＰＥＧ）６－ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ）（配列番号１６）、

ＴＢＡ１５－Ｆ８（５’－ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ－（ＰＥＧ）６－ＧＴＣＧＴＡＧＴ－ＦＩＴＣ－３’）（配列番号１７）、
ＴＢＡ２９－Ｄ８（５’－Ｄａｂｃｙｌ－ＡＣＴＡＣＧＡＣ－（ＰＥＧ）６－ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ）（配列番号１８）

ＴＢＡ１５－Ｆ９（５’－ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ－（ＰＥＧ）６－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－ＦＩＴＣ－３’）（配列番号１９）、
ＴＢＡ２９－Ｄ９（５’－Ｄａｂｃｙｌ－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－（ＰＥＧ）６－ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ－３’）（配列番号２０）

ＴＢＡ１５－Ｆ１０（５’－ＧＧＴＴＧＧＴＧＴＧＧＴＴＧＧ－（ＰＥＧ）６－ＧＴＣＧＴＡＡＧＣＴ－ＦＩＴＣ－３’）（配列番号２１）、
ＴＢＡ２９－Ｄ１０（５’－Ｄａｂｃｙｌ－ＡＧＣＴＴＡＣＧＡＣ－（ＰＥＧ）６－ＡＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＧＧＣＡＧＧＴＴＧＧＧＧＴＧＡＣＴ）（配列番号２２）
実施例２． 試薬
全てのＤＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、－２０℃においてＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（Ｔｒｉｓ－アセテート ２０ｍＭ、ＫＣｌ ５ｍＭ、ＮａＣｌ １４０ｍＭ、ＭｇＣｌ２ １ｍＭ、ＣａＣｌ２ １ｍＭ、ｐＨ＝７．５）を用いて貯蔵した。
ヒトα－トロンビン（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．）を、５０％ グリセロール／水（ｖ／ｖ）中に溶解し、－２０℃で貯蔵した。
アンチトロンビン（Ｇｒｉｆｏｌｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）を、粉末として購入し、１０ｍＬ 脱イオン水と混合し、１０本のバイアルに分け、それを全て４℃において貯蔵した。その濃度は、正常ヒトアンチトロンビン濃度の＞５０倍であった。
ヘパリンナトリウム塩（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、４℃において貯蔵した。
ヒト血清由来アルブミン（Ｓｉｇｍａ）を、４℃において貯蔵した。
実施例３． トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の形成
トロンビンを、２００ｎＭの濃度において調製した。上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーと上記ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーとの間の比は、１：１であった。上記シグナル伝達アプタマーを、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭおよび４００ｎＭの濃度で調製した。トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を、上記トロンビンと、異なる濃度のシグナル伝達アプタマーとを合わせることによって形成した。各々に関して、上記トロンビンおよびシグナル伝達アプタマー溶液を、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、全容積１００μＬで室温において３０分間、一緒にインキュベートした。コントロールに関しては、ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー単独（コントロール１）、またはＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー＋ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマー（コントロール２）を使用した。蛍光分光法を、検出のために使用した。
図３に示されるように、１００ｎＭ濃度において、ピーク蛍光強度は、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体に関して３．８０×１０５であり、ＩＦＤＴＨＲとして設定した。ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー単独に関してのピーク蛍光強度は、１．０２９×１０６であり、Ｉ０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＡＢ２９－Ｄ９シグナル伝達アプタマーに関してのピーク蛍光強度は、１．０１１×１０６であり、ＩＦＤとして設定した。上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー単独の蛍光強度を、１００％として正規化した。ＩＦＤ／Ｉ０は、９８．２５％であった。上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の相対的蛍光強度（ＩＦＤＴＨＲ／Ｉ０）は、３６．９２％であった。
図４に示されるように、２００ｎＭ 濃度では、ＴＢＡ１５－Ｆ９単独に関してのピーク蛍光強度は、１．３１×１０６であった。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９に関してのピーク蛍光強度は１．２３Ｈ１０６であり、２．６６×１０５であった。ＴＢＡ１５－Ｆ９単独に関しての蛍光強度を１００％として正規化し、Ｉ０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９に関しての蛍光強度を、ＩＦＤとして設定した。次いで、ＩＦＤ／Ｉ０は、９３．８９％であった。上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の相対的蛍光強度（ＩＦＤＴＨＲ／Ｉ０）は、２０．２３％であった。
図５に示されるように、３００ｎＭ濃度では、ＴＢＡ１５－Ｆ９単独に関してのピーク蛍光強度は、２．３６×１０６であった。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９に関してのピーク蛍光強度は、２．０６×１０６であった。トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体に関してのピーク蛍光強度は、３．１１×１０５であった。ＴＢＡ１５－Ｆ９単独の蛍光強度を、１００％として正規化し、Ｉ０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９に関しての蛍光強度を、ＩＦＤとして設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄに関しての相対的蛍光強度（ＩＦＤ／Ｉ０）は、８７．２９％であった。上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の相対的蛍光強度（ＩＦＤＴＨＲ／Ｉ０）は、１３．１７％であった。
図６に示されるように、４００ｎＭ濃度では、ＴＢＡ１５－Ｆ９単独に関してのピーク蛍光強度は、２．９０×１０６であった。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９に関してのピーク蛍光強度は、２．０６×１０６であった。トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体に関してのピーク蛍光強度は、３．３６×１０５であった。ＴＢＡ１５－Ｆ９単独の蛍光強度を、１００％として正規化し、Ｉ０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９に関しての蛍光強度を、ＩＦＤとして設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄに関しての相対的蛍光強度（ＩＦＤ／Ｉ０）は、７１．０３％であった。上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体に関しての相対的蛍光強度（ＩＦＤＴＨＲ／Ｉ０）は、１１．５８％であった。
これらの実験に基づいて、トロンビン 対 ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー 対 ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーの１：１：１比を、さらなる実験のために選択した（図３～６）。
実施例４． ハイブリダイゼーション配列
５つのハイブリダイゼーション配列（と相補的なハイブリダイゼーション配列）を、上記シグナル伝達アプタマーに伴う使用に関して試験した。上記ハイブリダイゼーション配列は、ＴＢＡ１５－Ｆ６＋ＴＢＡ２９－Ｄ６、ＴＢＡ１５－Ｆ７＋ＴＢＡ２９－Ｄ７、ＴＢＡ１５－Ｆ８＋ＴＢＡ２９－Ｄ８、ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９、およびＴＢＡ１５－Ｆ１０＋ＴＢＡ２９－Ｄ１０に関して記載されるとおりのものであった。コントロールは、上記のとおりであった。
上記ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマーおよび上記ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーを、２００ｎＭの濃度において調製し、１：１の比で合わせた。トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を、上記シグナル伝達アプタマーと、種々の濃度のトロンビンとを合わせることによって形成した。アプタマー 対 トロンビンの比は、（１：１：０．１～１：１：１．５）であった。各々に関して、上記トロンビンおよびシグナル伝達アプタマー溶液を、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液中、全容積１００μＬで室温において３０分間インキュベートした。コントロールに関しては、ＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー単独またはＴＢＡ１５シグナル伝達アプタマー＋ＴＢＡ２９シグナル伝達アプタマーを使用した。蛍光分光法を、検出のために使用した。
アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ６およびＴＢＡ２９－Ｄ６に関しては、異なるトロンビン濃度に関して特異的傾向は観察されなかった（図７）。異なるトロンビン濃度に関して特異的傾向は観察されなかった。データは、上記２つのアプタマーが、上記トロンビンに結合しなかった、および／または上記２つのシグナル伝達アプタマーのハイブリダイゼーション配列が、二重鎖を形成できなかったことを示唆する。
アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ７およびＴＢＡ２９－Ｄ７に関しては、蛍光強度は減少し、トロンビン濃度は増大した（図８）。ＴＢＡ１５－Ｄ７単独に関するピーク蛍光強度は、２．８０６×１０６であり、これを１００％で正規化し、Ｉ７０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ７＋ＴＢＡ２９－Ｄ７（１：１）に関するピーク蛍光強度は、２．７６８×１０６であり、これをＩＦＤ７として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ７＋ＴＢＡ２９－Ｄ７＋トロンビン（１：１：１）のピーク蛍光強度は、１．９５×１０６であり、これをＩＦＤＴＨＲ７として設定した。ＩＦＤ７／Ｉ７０＝９８．６４％であった。ＩＦＤＴＨＲ７／Ｉ７０＝６９．４９％。データは、上記２つのシグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合し、上記ハイブリダイゼーション配列が二重鎖を形成したことを示す。ＦＩＴＣの蛍光を、ｄａｂｃｙｌによってクエンチした。溶液中のＴＢＡ１５－Ｆ７＋ＴＢＡ２９－Ｄ７に関しては、蛍光は、クエンチされないようであった。これは、トロンビンへの結合が、ハイブリダイゼーション配列による二重鎖形成および蛍光のクエンチに必要であったことを示す。
アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ８およびＴＢＡ２９－Ｄ８に関しては、蛍光強度は減少し、トロンビン濃度は増大した（図９）。ＴＢＡ１５－Ｄ８単独に関するピーク蛍光強度は２．７６×１０６であり、これを１００％で正規化し、Ｉ８０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ８＋ＴＢＡ２９－Ｄ８（１：１）に関するピーク蛍光強度は、２．５４×１０６であり、これをＩＦＤ８として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ８＋ＴＢＡ２９－Ｄ８＋トロンビン（１：１：１）のピーク蛍光強度は１．７９×１０６であり、これをＩＦＤＴＨＲ８として設定した。ＩＦＤ８／Ｉ８０＝９２．０３％であった。ＩＦＤＴＨＲ８／Ｉ８０＝６４．８６％。データは、上記２つのシグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合し、上記ハイブリダイゼーション配列が二重鎖を形成したことを示す。ＦＩＴＣの蛍光を、ｄａｂｃｙｌによってクエンチした。上記ＴＢＡ１５－Ｆ６およびＴＢＡ１５－Ｆ７と比較すると、トロンビンの存在下では、ＴＢＡ１５－Ｆ８およびＴＢＡ２９－Ｆ８でクエンチの改善が観察された。ＩＦＤ８／Ｉ８０におけるわずかな減少は、トロンビンの非存在下では、ＴＢＡ１５－Ｆ８およびＴＢＡ２９－Ｆ８が相互作用し得るが、弱いことを示す。
アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ９およびＴＢＡ２９－Ｄ９に関しては、蛍光強度は減少し、トロンビン濃度は増大した（図１０）。ＴＢＡ１５－Ｄ９単独に関するピーク蛍光強度は２．８１×１０６であり、これを１００％で正規化し、Ｉ９０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９（１：１）に関するピーク蛍光強度は２．３５×１０６であり、これをＩＦＤ９として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９＋トロンビン（１：１：１）のピーク蛍光強度は０．８５×１０６であり、これをＩＦＤＴＨＲ９として設定した。ＩＦＤ９／Ｉ９０＝８３．６３％であった。ＩＦＤＴＨＲ９／Ｉ９０＝３０．２５％。データは、上記２つのシグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合し、上記ハイブリダイゼーション配列が二重鎖を形成したことを示す。ＦＩＴＣの蛍光を、ｄａｂｃｙｌによってクエンチした。ＴＢＡ１５－Ｆ９およびＴＢＡ２９－Ｆ９は、８塩基のハイブリダイゼーション配列を有するシグナル伝達アプタマーと比較すると、改善されたクエンチを示した。ＴＢＡ１５－Ｆ８およびＴＢＡ２９－Ｆ８と同様に、ＴＢＡ１５－Ｆ９およびＴＢＡ２９－Ｆ９は、トロンビンの非存在下である程度のクエンチを示した。
アプタマーＴＢＡ１５－Ｆ１０およびＴＢＡ２９－Ｄ１０に関しては、蛍光強度は減少し、トロンビン濃度は増大した（図１１）。ＴＢＡ１５－Ｄ１０単独に関するピーク蛍光強度は２．３０×１０６であり、これを１００％で正規化し、Ｉ１００として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ１０＋ＴＢＡ２９－Ｄ１０（１：１）に関するピーク蛍光強度は０．７７５×１０６であり、これをＩＦＤ１０として設定した。ＴＢＡ１５－Ｆ１０＋ＴＢＡ２９－Ｄ１０＋トロンビン（１：１：１）のピーク蛍光強度は０．１６×１０６であり、これをＩＦＤＴＨＲ１０として設定した。ＩＦＤ１０／Ｉ１００＝３３．６９％であった。ＩＦＤＴＨＲ１０／Ｉ１００＝６．９５％。データは、上記２つのシグナル伝達アプタマーが上記トロンビンに結合し、上記ハイブリダイゼーション配列が二重鎖を形成したことを示す。ＦＩＴＣの蛍光を、ｄａｂｃｙｌによってクエンチした。ＴＢＡ１５－Ｆ１０およびＴＢＡ２９－Ｆ１０は、９塩基のハイブリダイゼーション配列を有するシグナル伝達アプタマーと比較すると、より大きなクエンチを示した。ＴＢＡ１５－Ｆ１０およびＴＢＡ２９－Ｆ１０はまた、トロンビンの非存在下で顕著なクエンチを示した。
上記結果に基づいて、ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９を、さらなる実験に使用した。
実施例５． ヘパリン選択性
上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体がヘパリンおよびヒト血清タンパク質の存在下でＡＴＩＩＩを正確に検出できる能力を試験した。２００ｎＭ ＴＢＡ１５－Ｆ９のみまたは２００ ｎＭ ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９＋トロンビン（１：１：１）を、コントロールとして使用した。複合体形成後、ヘパリンの漸増濃度（０．２５ｇ／Ｌから２．００ｇ／Ｌ）を添加して、３０分間、室温でインキュベートした。ヒト血漿中のヘパリンの正常濃度は、１．５～３．０ ｇ／Ｌである。次いで、１９４０ ｎＭ ＡＴＩＩＩを添加し、蛍光分光法を検出のために使用した。１９４０ｎＭ ＡＴＩＩＩ単独での蛍光強度を、１００％に正規化した。蛍光強度は、ヘパリンの存在によって影響を及ぼされなかった（図１４および１７）。データは、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体がヘパリンと反応しないこと、ヘパリンの存在がＡＴＩＩＩ検出に悪影響を及ぼさなかったことを示す。
実施例６． ヘパリン結合抗原（ＨＢＡ）選択性
ヘパリンと同様に、ＡＴＩＩＩアッセイによっても、ＨＢＡ感度を分析した。ＨＢＡは、ヘパリン活性およびヘパリンアッセイに干渉し得る、ある特定の細菌によって作製されるタンパク質である。２００ ｎＭ ＴＢＡ１５－Ｆ９、ＴＢＡ２９－Ｄ９およびトロンビン（１：１：１）を、室温において３０分間インキュベートして、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を形成した。次いで、種々の濃度のＨＢＡを上記複合体に添加し、３０分間、室温でインキュベートした。次いで、ＡＴＩＩＩを上記反応物に添加し、蛍光分光法によって検出した。蛍光強度は、ヘパリン結合抗原の存在によって影響を及ぼされなかった。これは、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体がヘパリンと反応せず、ＨＢＡの存在がＡＴＩＩＩ検出に悪影響を及ぼさないことを示す（図１５）。
同様に、ＡＴＩＩＩアッセイによっても、ヒト血清アルブミン感度を分析した。アルブミンは、血漿中で循環している最も遍在するタンパク質であり、内皮細胞上のグリコカリックスの表面活性に影響を及ぼす。アルブミンは、グルコース－アミノグリカン、具体的にはヘパリンと相互作用する。ＨＳＡに対する感度を、ＨＢＡに対する感度と同じ様式で試験した。複合体形成後に、１９４０ｎＭ ＡＴＩＩＩおよび漸増濃度のＨＳＡを添加した。１９４０ｎＭ ＡＴＩＩＩ単独での蛍光強度を、１００％に正規化した。ＨＳＡの存在は、蛍光強度に影響を及ぼさなかった。これは、ＨＢＡが反応に悪影響を及ぼさず、ＨＳＡの存在がＡＴＩＩＩ検出に悪影響を及ぼさないことを示す（図１６）。
実施例７． アンチトロンビン応答曲線
種々の濃度のＡＴＩＩＩを使用して、ＡＴＩＩＩを定量するにあたって、上記トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体の有用性を試験した。ＡＴＩＩＩの漸増濃度をトロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体に添加し、蛍光を蛍光分光法によって検出した。各サンプルにつき３回反復した（図２）。
アンチトロンビンを、ＴＢＡ１５－Ｆ９－ＴＢＡ２９－Ｄ９－トロンビン複合体へと滴定した。上記複合体濃度は、２００ｎＭであった。ＴＢＡ１５－Ｆ９：ＴＢＡ２９－Ｄ９：トロンビンの比は、１：１：１であった。アンチトロンビン濃度は、１０ｎＭから１９６０ｎＭへと増大した。ＴＢＡ１５－Ｆ９単独のコントロールの蛍光強度を、１００％として正規化し、Ｉ０として設定した。図のｙ軸に設定したＩ／Ｉ０は、溶液のみの中のＦＩＴＣの強度と比較した各サンプルの強度を意味する。各濃度を、３回反復した。データは、上記シグナル伝達アプタマー複合体が、サンプル中のＡＴＩＩＩを定量するために使用され得ることを示す。
実施例８． アンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）およびヘパリンの組み合わせ
ヘパリンがアンチトロンビンとヘパリンとの間の反応を促進する能力を、分析した。２００ｎＭ ＴＢＡ１５－Ｆ９、ＴＢＡ２９－Ｄ９およびトロンビン（１：１：１）を、３０分間、室温でインキュベートして、トロンビン－シグナル伝達アプタマー複合体を形成した。漸増濃度のアンチトロンビンを上記複合体に添加し、室温で３０分間インキュベートし、蛍光を蛍光分光法によって検出した。各サンプルにつき３回反復した。
実施例９． 動力学試験
Ａ． ＴＢＡ１５－Ｆ９＋ＴＢＡ２９－Ｄ９＋トロンビン動力学。 １０μＬの２μＭ ＴＢＡ１５－Ｆ９および１０μＬの２μＭ トロンビンを調製し、７８μＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中で合わせた。１０μＬの２μＭ ＴＢＡ２９－Ｄ９を、蛍光をモニターしながら上記溶液に添加した。その反応は、約１６０秒間で完了した（図１２）。
Ｂ． 複合体＋アンチトロンビン動力学
１２μＬの２μＭ ＴＢＡ１５－Ｆ９、１２μＬの２μＭ ＴＢＡ２９－Ｄ９および１２μＬの２μＭ トロンビンを、７６μＬ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中で、３０分間、室温において合わせた。次いで、８μＬの２８．４７μＭ ＡＴＩＩＩを、蛍光をモニターしながら上記溶液へと滴定した。その反応は、約６００秒間で完了した（図１３）。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
被験体におけるアンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）のレベルを決定するためのキットであって、前記キットは、
（ａ）第１のトロンビン特異的アプタマー、第１のハイブリダイゼーション配列、および蛍光標識を含む第１のシグナル伝達アプタマー；ならびに
（ｂ）第２のトロンビン特異的アプタマー、第２のハイブリダイゼーション配列、およびクエンチャーを含む第２のシグナル伝達アプタマー
を含み、ここで前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、互いに対して相補的であり、前記蛍光標識の蛍光は、第１のトロンビン特異的シグナル伝達アプタマーおよび第２のトロンビン特異的シグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合される場合にクエンチされる、キット。
(項目２)
前記第１のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ１５を含む、項目１に記載のキット。
(項目３)
前記第２のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ２９を含む、項目１または２に記載のキット。
(項目４)
前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、長さが６～１０個の核酸塩基である、項目１～３のいずれか１項に記載のキット。
(項目５)
前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、長さが９個の核酸塩基である、項目４に記載のキット。
(項目６)
前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’を含む、項目１～５のいずれか１項に記載のキット。
(項目７)
前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含む、項目６に記載のキット。
(項目８)
前記第１のシグナル伝達アプタマーおよび／または前記第２のシグナル伝達アプタマーは、リンカーを含み、ここで前記リンカーは、前記トロンビン特異的アプタマーを前記ハイブリダイゼーション配列に接続する、項目１～７のいずれか１項に記載のキット。
(項目９)
前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、項目８に記載のキット。
(項目１０)
前記ＰＥＧは、ＰＥＧ ６ である、項目９に記載のキット。
(項目１１)
前記蛍光標識は、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン、テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ルシファーイエロー、エオシン、エリスロシン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、またはシアニンを含む、項目１～１０のいずれか１項に記載のキット。
(項目１２)
前記クエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ、ＢＬＡＣＫ ＨＯＬＥ ＱＵＥＮＣＨＥＲ、またはＴＡＭＲＡ化合物を含む、項目１～１１のいずれか１項に記載のキット。
(項目１３)
トロンビンをさらに含む、項目１～１２のいずれか１項に記載のキット。
(項目１４)
前記トロンビン、前記第１のシグナル伝達アプタマー、および前記第２のシグナル伝達アプタマーは、複合体を形成する、項目１３に記載のキット。
(項目１５)
トロンビン；第１のトロンビン特異的アプタマー、第１のハイブリダイゼーション配列、および蛍光標識を含む第１のシグナル伝達アプタマー；ならびに第２のトロンビン特異的アプタマー、第２のハイブリダイゼーション配列、およびクエンチャーを含む第２のシグナル伝達アプタマーを含む複合体であって、ここで前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、互いに対して相補的でありかつ二重鎖を形成し、前記蛍光標識の蛍光がクエンチされる、複合体。
(項目１６)
トロンビンをさらに含む、項目１５に記載の複合体。
(項目１７)
被験体に由来するサンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記サンプルを前記被験体から得る工程；
（ｂ）項目１５または１６に記載の複合体を含む組成物と前記サンプルとを接触させる工程；および
（ｃ）前記組成物の蛍光の増大を測定する工程、
を包含し、ここで前記蛍光の増大は、前記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する、方法。
(項目１８)
前記サンプルは、血清サンプル、血液サンプル、または血漿サンプルを含む、項目１７に記載の方法。
(項目１９)
前記蛍光の増大は、１５分未満で測定される、項目１７または１８に記載の方法。
(項目２０)
抗凝固剤で患者を処置する方法であって、前記方法は、
（ａ）前記患者におけるＡＴＩＩＩのレベルを決定する工程であって、ここで前記決定する工程は、
（ｉ）血清、血漿、または血液サンプルを前記患者から得る工程；
（ｉｉ）項目１５または１６に記載の複合体を含む組成物と前記サンプルとを接触させる工程；および
（ｉｉｉ）前記組成物の蛍光の増大を測定する工程であって、ここで前記蛍光の増大は、前記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する、工程；
を包含する工程；ならびに
（ｂ）工程（ｉｉｉ）において決定された前記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに基づいて、前記患者に、ヘパリンおよび／または外因性ＡＴＩＩＩを投与する工程、
を包含する、方法。

Claims (20)

  1. 被験体におけるアンチトロンビン（ＡＴＩＩＩ）のレベルを決定するためのキットであって、前記キットは、
    （ａ）第１のトロンビン特異的アプタマー、第１のハイブリダイゼーション配列、および蛍光標識を含む第１のシグナル伝達アプタマー；ならびに
    （ｂ）第２のトロンビン特異的アプタマー、第２のハイブリダイゼーション配列、およびクエンチャーを含む第２のシグナル伝達アプタマー
    を含み、
    前記第１のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ１５を含み、かつ前記第２のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ２９を含むか、または前記第１のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ２９を含み、かつ前記第２のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ１５を含み、
    前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、互いに対して相補的であり、かつ
    前記蛍光標識の蛍光は、第１のトロンビン特異的シグナル伝達アプタマーおよび第２のトロンビン特異的シグナル伝達アプタマーがトロンビンに結合される場合にクエンチされる、キット。
  2. 前記第１のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ１５を含み、かつ前記第２のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ２９を含む、請求項１に記載のキット。
  3. 前記第１のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ２９を含み、かつ前記第１のトロンビン特異的アプタマーは、ＴＢＡ１５を含む、請求項１に記載のキット。
  4. 前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、長さが６～１０個の核酸塩基である、請求項１～３のいずれか１項に記載のキット。
  5. 前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、長さがそれぞれ９個の核酸塩基である、請求項４に記載のキット。
  6. 前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は５’－ＧＴＣＧＴＡ－３’を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載のキット。
  7. 前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、前記第２のハイブリダイゼーション配列は、配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含む、請求項６に記載のキット。
  8. 前記第１のシグナル伝達アプタマーおよび／または前記第２のシグナル伝達アプタマーは、リンカーを含み、ここで前記リンカーは、前記トロンビン特異的アプタマーを前記ハイブリダイゼーション配列に接続する、請求項１～７のいずれか１項に記載のキット。
  9. 前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む、請求項８に記載のキット。
  10. 前記ＰＥＧは、ＰＥＧ６である、請求項９に記載のキット。
  11. 前記蛍光標識は、ＦＩＴＣ、フルオレセイン、ヘキサクロロフルオレセイン、ローダミン、カルボキシ－Ｘ－ローダミン、テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、クマリン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ルシファーイエロー、エオシン、エリスロシン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、またはシアニンを含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載のキット。
  12. 前記クエンチャーは、ＤＡＢＣＹＬ、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ－０、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ １、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ２、Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ ３、またはＴＡＭＲＡ化合物を含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載のキット。
  13. トロンビンをさらに含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載のキット。
  14. 前記トロンビン、前記第１のシグナル伝達アプタマー、および前記第２のシグナル伝達アプタマーは、複合体を形成する、請求項１３に記載のキット。
  15. トロンビン；ＰＥＧ ６ リンカーを介して第１のハイブリダイゼーション配列に連結した第１のトロンビン特異的アプタマーを含む第１のシグナル伝達アプタマー；ならびにＰＥＧ ６ リンカーを介して第２のハイブリダイゼーション配列に連結した第２のトロンビン特異的アプタマーを含む第２のシグナル伝達アプタマーを含む複合体であって、
    （ａ）前記第１のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ１５を含み、かつ前記第２のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ２９を含むか、または前記第１のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ２９を含み、かつ前記第２のトロンビン特異的アプタマーがＴＢＡ１５を含み；
    （ｂ）前記第１のハイブリダイゼーション配列および前記第２のハイブリダイゼーション配列は、長さがそれぞれ９個の核酸塩基であり、互いに対して相補的であり、かつ二重鎖を形成し；および
    （ｃ）蛍光標識が前記第１のハイブリダイゼーション配列に連結し、かつクエンチャーが前記第２のハイブリダイゼーション配列に連結し、前記蛍光標識の蛍光がクエンチされる、複合体。
  16. 前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３’を含み、かつ前記第２のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含むか、または前記第１のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＡＣＴＴＡＣＧＡＣ－３’を含み、かつ前記第２のハイブリダイゼーション配列は配列５’－ＧＴＣＧＴＡＡＧＴ－３を含む、請求項１５に記載の複合体。
  17. 被験体に由来するサンプル中のＡＴＩＩＩのレベルを決定する方法における使用のための、請求項１５または１６に記載の複合体を含む組成物であって、前記方法は、
    （ａ）前記サンプルを前記被験体から得る工程；
    （ｂ）前記組成物と前記サンプルとを接触させる工程；および
    （ｃ）前記組成物の蛍光の増大を測定する工程、
    を包含し、ここで前記蛍光の増大は、前記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する、組成物。
  18. 前記サンプルは、血清サンプル、血液サンプル、または血漿サンプルを含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 前記蛍光の増大は、１５分未満で測定される、請求項１７または１８に記載の組成物。
  20. 抗凝固剤で患者を処置する方法おける使用のための、請求項１５または１６に記載の複合体を含む組成物であって、前記方法は、
    （ａ）前記患者におけるＡＴＩＩＩのレベルを決定する工程であって、ここで前記決定する工程は、
    （ｉ）血清、血漿、または血液サンプルを前記患者から得る工程；
    （ｉｉ）前記組成物と前記サンプルとを接触させる工程；および
    （ｉｉｉ）前記組成物の蛍光の増大を測定する工程であって、ここで前記蛍光の増大は、前記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに比例する、工程；
    を包含する工程；ならびに
    （ｂ）工程（ｉｉｉ）において決定された前記サンプル中のＡＴＩＩＩのレベルに基づいて、前記患者に、ヘパリンおよび／または外因性ＡＴＩＩＩを投与する工程、
    を包含する、組成物。
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