JP7578490B2 - 拡張アンチコドンループを有する合成転移ｒｎａ - Google Patents
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Description
本発明は拡張アンチコドンループを有する合成転移ＲＮＡに関する。
転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）は生細胞のタンパク質合成機構に不可欠な部分であり、伝令ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のヌクレオチド配列をタンパク質のアミノ酸配列に翻訳するのに必要な要素である。自然発生ｔＲＮＡは、アミノ酸に共有結合できるアミノ酸結合ステム、および「アンチコドン」と呼ばれる塩基のトリプレットを含むアンチコドンループを有し、アンチコドンはｍＲＮＡ上にある「コドン」と呼ばれる対応する塩基のトリプレットと非共有結合できる。タンパク質はｍＲＮＡ上のコドン配列をテンプレートとして使用し、とりわけリボソームやいくつかの補助酵素を含む多成分系の助けを借りて、ｔＲＮＡが運ぶアミノ酸をつなげることによって合成される。
遺伝性疾患群に属する疾患の一部は、遺伝情報の変化、例えば、遺伝子をコードするＤＮＡの変異に起因する。この場合、変異遺伝子から転写されたｍＲＮＡは、変化した遺伝情報も運び、異常な、場合によっては非機能性のタンパク質が形成される。変異により、例えばコード領域内に終止コドンが導入され、タンパク質合成の早期終了や短縮タンパク質の産生に至ることがある。一例として、嚢胞性線維症（ＣＦ）は膜タンパク質「嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子」（ＣＦＴＲ）をコードする遺伝子の変異に起因することがある。この場合、変異により、ＣＦＴＲ遺伝子の読み枠（リーディングフレーム）内に早期終結コドン（ＰＴＣ）または終止コドンが導入される（非特許文献１～３）。
ＰＴＣを有するＣＦでは、機能性ＣＦＴＲを正常化する翻訳の読み飛ばしを促進するアミノグリコシドのような終止コドン抑制剤が、科学文献で説明されている（例えば、非特許文献４、５参照）。しかしながら、そのような抑制剤は、効果的でなく忍容性も良好でないことが少なくない。
まだ始まったばかりながら、患者の細胞に矯正遺伝物質を導入する遺伝子治療は、遺伝性疾患の治療においてますます重要となっている。現在、遺伝子治療法では、主にｍＲＮＡの使用に基づいて、変異した「欠損」ｍＲＮＡを置換し、補完している。しかしながらｍＲＮＡは短命で、ｍＲＮＡ配列の長さは治療への応用に問題がある。例えば特定のｍＲＮＡは、遺伝子送達や遺伝子治療に現在利用できるベクターの積載能力よりも長いことがある。
ｍＲＮＡと比べてｔＲＮＡ分子は安定性が著しく高く、平均で１０分の１の短さであるため、標的組織への導入における問題が軽減される。このため、早期終止コドンを持つｍＲＮＡにより短縮タンパク質が形成されるのを防ぎ、代わりに正しいアミノ酸を導入しようと、遺伝子治療でｔＲＮＡの使用が試みられている（例えば、特許文献１、２、非特許文献６参照）。
例えば非特許文献７は、全長野生型タンパク質を修復するために、ＣＦＴＲ遺伝子でインフレーム終止コドンを自然発生アミノ酸に変換できるコドン編集ｔＲＮＡを説明している。
非特許文献８は、トランスフェクションにより細胞に導入されるサプレッサーｔＲＮＡを用いたＰＴＣ含有ｍＲＮＡを読み飛ばす方法を説明している。ナンセンストリプレットコドンが抑制され、４塩基コドンが、ヒトｔＲＮＡ（Ｓｅｒ）に由来する対応するサプレッサーｔＲＮＡによって解読された。
４塩基または５塩基アンチコドンを含む拡張アンチコドンループを有するｔＲＮＡも、非天然アミノ酸のタンパク質への取り込みについて説明されている（特許文献３、４、非特許文献９、１０）。非特許文献１１は、そのアンチコドンループに６～１０ｎｔを含むｔＲＮＡを用いた２、３、４、５、および６塩基コドンの抑制について説明している。
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Ｋａｔｏｈ，Ｋ．ａｎｄ Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．（２０１３）ＭＡＦＦＴ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｖｅｒｓｉｏｎ ７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，３０，７７２－７８０，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０９３／ｍｏｌｂｅｖ／ｍｓｔ０１０
Ｍａｉｎｉ Ｒ，Ｄｅｄｋｏｖａ ＬＭ，Ｐａｕｌ Ｒ，Ｍａｄａｔｈｉｌ ＭＭ，Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ ＳＲ，Ｃｈｅｎ Ｓ、Ｈｅｃｈｔ ＳＭ，２０１５，Ｒｉｂｏｓｏｍｅ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｉｎｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３７，１１２０６－１１２０９，ｄｏｉ １０．１０２１／ｊａｃｓ．５ｂ０３１３５
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ナンセンス変異の影響に対抗する、および／またはナンセンス変異を抑制することがなおも求められている。したがって本発明の目的は、そのような手段、特にナンセンス変異と関連する嚢胞性線維症のような遺伝性疾患を治療するためのナンセンス変異サプレッサーを提供することである。
一態様において、本発明は、合成転移リボ核酸（ｔＲＮＡ）、つまりｍＲＮＡ上の２つの連続する３塩基コドン（ｃｏｄｏｎ ｂａｓｅ ｔｒｉｐｌｅｔ）に塩基対合するよう構成された２つの連続する３塩基アンチコドン（ａｎｔｉｃｏｄｏｎ ｂａｓｅ ｔｒｉｐｌｅｔ）を含む拡張アンチコドンループを有する合成転移ＲＮＡであって、第１の３塩基アンチコドンまたは第２の３塩基アンチコドンが、ｍＲＮＡ上の３塩基終止コドンに塩基対合するよう構成されている合成転移ＲＮＡを提供する。
本発明は、例えば、翻訳の早期停止を引き起こし、短縮タンパク質を産生してしまうような変異をコード配列に有するｍＲＮＡから機能タンパク質を合成する細胞の能力を修復するために、ナンセンス変異を抑制するのに使用できる新規のサプレッサーｔＲＮＡを提供する。本発明の合成ｔＲＮＡは、２つの連続する３塩基アンチコドンを含む拡張アンチコドンループを有し、このうち少なくとも１つが、ｍＲＮＡ上の３塩基終止コドンと塩基対合できる。したがって本発明の合成ｔＲＮＡは、２つの３塩基アンチコドンと相補的であるｍＲＮＡ上の隣接する２つのコドン（１つが早期終結コドン（ＰＴＣ）である）と結合できる。本発明の合成ｔＲＮＡは、ＰＴＣだけでなく、ｍＲＮＡ上の手前または次のコドンと塩基対合するため、タンパク質合成が早期終了せずに、ｔＲＮＡが運ぶアミノ酸を、成長するアミノ酸鎖に取り込む。本発明の合成ｔＲＮＡは、ジペプチドで（事前に）アミノアシル化されていない限り、得られたタンパク質は、野生型タンパク質、すなわちＰＴＣを持たない野生型ｍＲＮＡから合成されたタンパク質よりもアミノ酸が１つ少ないが、それにもかかわらず、機能タンパク質になる可能性が高い。有利には、本発明の合成ｔＲＮＡと、ｍＲＮＡ上の隣接する２つのコドン（一方がＰＴＣで、他方がＰＴＣに隣接する特定のコドン）との塩基対合は、単一のコドン、すなわち終止コドンのみと結合するサプレッサーｔＲＮＡと比べて特異性が高い。その結果、本発明の合成ｔＲＮＡは、ＰＴＣとその隣接するコドンの１つとの特定の組み合わせのみに結合するようデザインでき、非標的ｍＲＮＡ上のＰＴＣまたは「通常の」終止コドンと望ましくない対合に至るリスクが大幅に低減する。
用語「転移リボ核酸」または「ｔＲＮＡ」は、伝令ＲＮＡのヌクレオチド配列をタンパク質のアミノ酸配列に翻訳するのを仲介する、長さが通常７３～９０ヌクレオチドのＲＮＡ分子を指す。ｔＲＮＡは、受容ステムの端部にある３’ＣＣＡ末端で特定のアミノ酸に共有結合することができ、また、アンチコドンアームのアンチコドンループにある３ヌクレオチドのアンチコドンを介して、伝令ＲＮＡの３ヌクレオチド配列（コドン）と塩基対合できる。ゆらぎ塩基対合として知られる現象により、いくつかのアンチコドンは複数のコドンと対合することができる。ｔＲＮＡの二次「クローバーリーフ」構造は、アミノ酸と結合する受容ステム、および先端がループ（Ｄループ、ＴΨＣループ、アンチコドンループ）になった３つのアーム（「Ｄアーム」、「Ｔアーム」、および「アンチコドンアーム」）、すなわち、対合していないヌクレオチドを含む部分を有する。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、特定のアミノ酸でｔＲＮＡを荷電（アミノアシル化する）する。ｔＲＮＡはそれぞれ、アミノ酸の１つまたは複数のコドンに塩基対合できる異なるアンチコドントリプレット配列を含む。慣例的にｔＲＮＡのヌクレオチドは、７６ヌクレオチドからなる「コンセンサス」ｔＲＮＡ分子に基づいて、５’－Ｐ末端から始めて、ｔＲＮＡにおけるヌクレオチドの実際の数にかかわらず１～７６の番号が付けられることが多いが、ｔＲＮＡの可変部分、例えばＤループのために数が７６でないことがある（図３参照）。この慣例（以下「ｔＲＮＡ番号付け規則」ともいう）に従って、自然発生ｔＲＮＡのヌクレオチド位置３４～３６はアンチコドンの３ヌクレオチドを指し、位置７４～７６は終わりのＣＣＡ末端を指す。「余分な」ヌクレオチドは、例えば、コンセンサスｔＲＮＡの一部であり、かつ慣例に従って番号付けされている手前のヌクレオチドの番号に英字を追加して番号付けする（例えば、２０ａ、２０ｂなど）、またはヌクレオチドに独立的に番号付けし、可変ループの場合にはｅ１１、ｅ１２などのように頭文字を追加することによって番号付けできる（例えば、非特許文献１２参照）。
用語「合成転移リボ核酸」または「合成ｔＲＮＡ」は、非自然発生ｔＲＮＡを指す。この用語は、自然発生ｔＲＮＡのアナログ、すなわち自然発生ｔＲＮＡに構造的に似ているが、ｔＲＮＡを構成する１つまたは複数のヌクレオチドの塩基部分、糖部分、および／またはリン酸部分が修飾されているｔＲＮＡも含む。修飾されたｔＲＮＡは、例えば、ホスホジエステル結合がホスホロチオエート、ホスホロアミダート、またはメチルホスホネート結合に置き換えられて修飾されたホスホジエステル主鎖を有する。糖部分は、例えばデヒドロキシル化してデオキシリボヌクレオチドにすることによって、または、メトキシ基、メトキシエトキシ基、もしくはアミノエトキシ基に置き換えることによって、例えば２’－ＯＨ基で修飾し得る。合成転移リボ核酸は、例えば化学的および／または酵素的にｉｎ ｖｉｔｒｏで、または細胞ベース系で、例えば細菌細胞のｉｎ ｖｉｖｏで合成できる。
用語「コドン」は、特定のアミノ酸、またはタンパク質合成時の終止シグナルに対応するヌクレオチドトリプレットの配列、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡの３ヌクレオチドを指す。（ｍＲＮＡレベルの）コドンおよびコード化アミノ酸の一覧を以下に示す。
アミノ酸 １文字コード コドン
Ａｌａ Ａ ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ
Ａｒｇ Ｒ ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ
Ａｓｎ Ｎ ＡＡＵ、ＡＡＣ
Ａｓｐ Ｄ ＧＡＵ、ＧＡＣ
Ｃｙｓ Ｃ ＵＧＵ、ＵＧＣ
Ｇｌｎ Ｑ ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｇｌｕ Ｅ ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｇｌｙ Ｇ ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ
Ｈｉｓ Ｈ ＣＡＵ、ＣＡＣ
Ｉｌｅ Ｉ ＡＵＵ、ＡＵＣ、ＡＵＡ
Ｌｅｕ Ｌ ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ
Ｌｙｓ Ｋ ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｍｅｔ Ｍ ＡＵＧ
Ｐｈｅ Ｆ ＵＵＵ、ＵＵＣ
Ｐｒｏ Ｐ ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ
Ｓｅｒ Ｓ ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、ＡＧＣ
Ｔｈｒ Ｔ ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ
Ｔｒｐ Ｗ ＵＧＧ
Ｔｙｒ Ｙ ＵＡＵ、ＵＡＣ
Ｖａｌ Ｖ ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ
開始：ＡＵＧ
終止：ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ、「Ｘ」と略す
Ａｌａ Ａ ＧＣＵ、ＧＣＣ、ＧＣＡ、ＧＣＧ
Ａｒｇ Ｒ ＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、ＡＧＧ
Ａｓｎ Ｎ ＡＡＵ、ＡＡＣ
Ａｓｐ Ｄ ＧＡＵ、ＧＡＣ
Ｃｙｓ Ｃ ＵＧＵ、ＵＧＣ
Ｇｌｎ Ｑ ＣＡＡ、ＣＡＧ
Ｇｌｕ Ｅ ＧＡＡ、ＧＡＧ
Ｇｌｙ Ｇ ＧＧＵ、ＧＧＣ、ＧＧＡ、ＧＧＧ
Ｈｉｓ Ｈ ＣＡＵ、ＣＡＣ
Ｉｌｅ Ｉ ＡＵＵ、ＡＵＣ、ＡＵＡ
Ｌｅｕ Ｌ ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡ、ＣＵＧ
Ｌｙｓ Ｋ ＡＡＡ、ＡＡＧ
Ｍｅｔ Ｍ ＡＵＧ
Ｐｈｅ Ｆ ＵＵＵ、ＵＵＣ
Ｐｒｏ Ｐ ＣＣＵ、ＣＣＣ、ＣＣＡ、ＣＣＧ
Ｓｅｒ Ｓ ＵＣＵ、ＵＣＣ、ＵＣＡ、ＵＣＧ、ＡＧＵ、ＡＧＣ
Ｔｈｒ Ｔ ＡＣＵ、ＡＣＣ、ＡＣＡ、ＡＣＧ
Ｔｒｐ Ｗ ＵＧＧ
Ｔｙｒ Ｙ ＵＡＵ、ＵＡＣ
Ｖａｌ Ｖ ＧＵＵ、ＧＵＣ、ＧＵＡ、ＧＵＧ
開始：ＡＵＧ
終止：ＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧ、「Ｘ」と略す
本明細書で使用する用語「センスコドン」は、アミノ酸をコードするコドンを指す。用語「終止コドン」または「ナンセンスコドン」は、通常タンパク質に存在する２０種類のアミノ酸の１つをコードせず、伝令ＲＮＡの翻訳停止を指令する遺伝暗号のコドン、すなわちヌクレオチドトリプレットを指す。（ｍＲＮＡレベルの）終止コドンは、ＵＡＡ（「オーカー」）、ＵＡＧ（「アンバー」）、またはＵＧＡ（「オパール」）である。タンパク質の配列を記述する際、終止コドンは「Ｘ」（１文字コード）または「Ｔｅｒ」（３文字コード）を用いて表記する。タンパク質のナンセンス変異は、多くの場合、野生型アミノ酸、続いてタンパク質におけるアミノ酸の位置、それから「Ｘ」で表される。一例として、「Ｒ５５３Ｘ」は、タンパク質の位置５５３におけるアルギニン（１文字コードＲ）をコードするコドンの終止コドン（Ｘ）への変異を表す（ＣＦＴＲ）。オープンリーディングフレーム内でｍＲＮＡに終止コドンがあると、ほとんどの場合、非活性の短縮タンパク質断片が産生される。
用語「アンチコドン」は、ｍＲＮＡ上のコドンの３個の塩基に相補的である（すなわち、結合または塩基対合する）３個のヌクレオチドの配列を指す。本明細書で使用する場合、用語「対応するアンチコドン」または「対応するコドン」は、それぞれ相補的なコドンまたはアンチコドンと塩基対合するアンチコドンまたはコドンに関する。アンチコドンは、修飾塩基を有するヌクレオチドも含み得る。
用語「アンチコドンループ」は、アンチコドンを含むアンチコドンアームの不対ヌクレオチドを指す。自然発生ｔＲＮＡにおいて、アンチコドンループは、通常、７個のヌクレオチドからなり、そのうちの３個がｍＲＮＡのコドンに対合する。
用語「拡張アンチコドンループ」は、自然発生ｔＲＮＡよりもループにおけるヌクレオチドの数が多いアンチコドンループを指す。拡張アンチコドンループは、例えば、７ヌクレオチドよりも多い、例えば８、９、１０、または１１ヌクレオチドを含み得る。
用語「３塩基コドン（ｃｏｄｏｎ ｂａｓｅ ｔｒｉｐｌｅｔ）」または「３塩基アンチコドン（ａｎｔｉｃｏｄｏｎ ｂａｓｅ ｔｒｉｐｌｅｔ）」は、コドンまたはアンチコドンを表す連続する３個のヌクレオチドの配列を指す。この用語は、本発明に関連して本明細書で使用する用語「コドン」または「アンチコドン」が、例えば、ヌクレオチドクアドルプレット（「４塩基コドン」）などの４個以上のヌクレオチドの配列ではなく、ヌクレオチドトリプレットを指すことを明確にするために使用する。しかしながら、本発明の合成ｔＲＮＡのアンチコドンループにおける２つの連続する３塩基アンチコドンは「アンチコドンペア」、「アンチコドンダブル」、「アンチコドンデュプレックス」、「２×３ｎｔアンチコドン」、または「アンチコドンタンデム」と呼ぶこともあり、同様に、ｍＲＮＡにおける２つの連続する３塩基コドンは「コドンペア」、「コドンダブル」、「コドンデュプレックス」、「２×３ｎｔコドン」、または「コドンタンデム」と呼ぶこともある。
用語「塩基対」は、水素結合によってつながった塩基の対を指す。塩基対の塩基の１つは通常プリンであり、もう１つの塩基は通常ピリミジンである。ＲＮＡでは、塩基のアデニンとウラシルが塩基対を形成し、塩基のグアニンとシトシンが塩基対を形成することができる。しかしながら、他の塩基対（「ゆらぎ塩基対」）、例えば、グアニン－ウラシル（Ｇ－Ｕ）、ヒポキサンチン－ウラシル（Ｉ－Ｕ）、ヒポキサンチン－アデニン（Ｉ－Ａ）、およびヒポキサンチン－シトシン（Ｉ－Ｃ）の塩基対の形成も可能である。用語「塩基対合できる」は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドの配列が、相補的なヌクレオチドまたはヌクレオチド配列と水素結合安定化構造を形成できることを指す。
用語「ＰＴＣ」は早期終結コドン、すなわち、ナンセンス変異（すなわち、標準的な遺伝暗号によって指定される２０種類のタンパク質性アミノ酸の１つをコードするセンスコドンが鎖終結コドンに変わる変異）によって、コードする核酸配列に導入された終止コドンを指す。したがってこの用語は、ｍＲＮＡに含まれる遺伝暗号の翻訳における早期終止シグナルを指す。ＰＴＣは、さまざまな遺伝性疾患、例えば嚢胞性線維症（ＤＦ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、神経線維腫症１型（ＮＦ１）、またはハーラー症候群（ＭＰＳ Ｉ）に関与している。用語「早期終止コドン」（「ＰＳＣ」）が、早期終結コドン（ＰＴＣ）と同義に用いられることもある。
用語「嚢胞性線維症」は、常染色体潜性（劣性）様式で遺伝する遺伝性疾患を指す。これは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子の両方のコピーにおける変異に起因する。用語「ナンセンス変異嚢胞性線維症」（ｎｍＣＦ）は、ナンセンス変異に起因するＣＦに使用されることがある。ＣＦＴＲにおけるナンセンス変異の例に、Ｗ１２８２Ｘ（Ｘ＝終止コドン）、Ｇ５４２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、またはＲ１１６２Ｘがある。
用語「デュシェンヌ型筋ジストロフィー」（ＤＭＤ）（「ベッカー型筋ジストロフィー」、ＢＭＤともいう）は、機能性ジストロフィンタンパク質の欠如に起因する進行性の筋肉変性および筋力低下を特徴とするＸ連鎖潜性遺伝性疾患を指す。ジストロフィンの欠如は、ジストロフィン遺伝子におけるナンセンス変異によって生じ得る。
用語「神経線維腫症１型」（ＮＦ１またはＮＦ－１）（「レックリングハウゼン病」ともいう）は、ニューロフィブロミンをコードする１７番染色体にあるＮＦ１遺伝子の変異によって生じる常染色体顕性（優性）遺伝性疾患である。ＮＦ１は神経系に沿って腫瘍を形成する。
用語「ハーラー症候群」（「ムコ多糖症Ｉ型」、ＭＰＳ Ｉともいう）は、α－Ｌ－イズロニダーゼの欠損により、ムコ多糖類（グリコサミノグリカン、ＧＡＧ）の蓄積を生じる遺伝性疾患に関する。ハーラー症候群でもっともよく見られるＰＴＣ変異は、Ｗ４０２ＸおよびＱ７０Ｘ（非特許文献１３、１４）である。
用語「ナンセンス抑制」または「ナンセンス変異抑制」は、ナンセンス変異の影響をマスクし、野生型表現型を少なくとも部分的に修復する機序を指す。
用語「サプレッサーｔＲＮＡ」は、所定の翻訳系における伝令ＲＮＡの読み取りを変化させるｔＲＮＡに関する。サプレッサーｔＲＮＡの一例が、アミノ酸を運び、終止コドンに塩基対合できるｔＲＮＡであり、それにより翻訳系は終止コドンを読み飛ばすことができる。終止コドンを認識できるｔＲＮＡは、ナンセンスサプレッサーｔＲＮＡまたはＮＳＴとして知られる。
核酸に関連する用語「相同性」は、核酸のヌクレオチド配列と別の核酸のヌクレオチド配列との類似性または同一性の程度を指す。相同性は、第１の配列における位置と、第２の配列で対応する位置を比較し、同一のヌクレオチドがその位置に存在するかを確認することによって判定する。最良のアラインメントになるよう、配列のギャップを考慮することが必要な場合がある。２つの核酸間での類似性または同一性の程度を判定するには、好ましくは、比較する核酸の最小長、例えば、各配列におけるヌクレオチドの少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．２％、または９９．５％を考慮に入れる。好ましくは、各核酸の全長を比較に用いる。２つの配列の類似性または同一性の程度は、ｍｕｓｃｌｅ（非特許文献１５）またはｍａｆｆｔ（非特許文献１６）などのコンピュータープログラムを用いて判定できる。「～とｘ％相同」または「ｘ％の相同性」といった用語を用いる場合、２つの核酸配列がｘ％、例えば５０％の配列同一性または類似性を有することを意味する。
用語「アミノアシル化」は、アミノ酸でｔＲＮＡを荷電する酵素反応に関する。アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）は、特定の同族アミノ酸またはその前駆体を、適合性のある同族ｔＲＮＡにエステル結合させて、アミノアシルｔＲＮＡを形成するのを触媒する。したがって、用語「アミノアシルｔＲＮＡ」はアミノ酸が付着したｔＲＮＡに関する。各アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは、所定のアミノ酸に極めて特異的であり、同じアミノ酸に対し複数のｔＲＮＡが存在したとしても、２０種類のタンパク質性アミノ酸のそれぞれに対し、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼは１種類しか存在しない。用語「荷電する」または「負荷する」が、「アミノアシル化する」と同義に用いられることもある。本発明の合成ｔＲＮＡに関連した用語「アミノアシル化された」は、ｔＲＮＡが標的細胞に入るときにはすでにアシル化されているように、アミノ酸またはジペプチドですでに荷電（事前荷電）された合成ｔＲＮＡに関する。用語「事前にアミノアシル化された」が、この文脈で同義に用いられることがある。
ｔＲＮＡに関連する用語「修飾ヌクレオチド」（または「異常ヌクレオチド」）は、修飾または異常ヌクレオチド塩基（すなわち通常の塩基アデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）、およびシトシン（Ｃ）以外）を有するヌクレオチドに関する。修飾ヌクレオチドの例に、４－アセチルシチジン（ａｃ４ｃ）、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン（ｃｈｍ５ｕ）、２’－Ｏ－メチルシチジン（ｃｍ）、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン（ｃｍｎｍ５ｓ２ｕ）、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン（ｃｍｎｍ５ｕ）、ジヒドロウリジン（ｄ）、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン（ｆｍ）、β、Ｄ－ガラクトシルキューオシン（ｇａｌ ｑ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（ｇｍ）、イノシン（ｉ）、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｉ６ａ）、１－メチルアデノシン（ｍ１ａ）、１－メチルプソイドウリジン（ｍ１ｆ）、１－メチルグアノシン（ｍ１ｇ）、１－メチルイノシン（ｍ１ｉ）、２，２－ジメチルグアノシン（ｍ２２ｇ）、２’－Ｏ－メチルアデノシン（ａｍ）、２－メチルアデノシン（ｍ２ａ）、２－メチルグアノシン（ｍ２ｇ）、３－メチルシチジン（ｍ３ｃ）、５－メチルシチジン（ｍ５ｃ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６ａ）、７－メチルグアノシン（ｍ７ｇ）、５－メチルアミノメチルウリジン（ｍａｍ５ｕ）、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン（ｍａｍ５ｓ２ｕ）、β、Ｄ－マンノシルキューオシン（ｍａｎ ｑ）、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン（ｍｃｍ５ｓ２ｕ）、５－メトキシカルボニルメチルウリジン（ｍｃｍ５ｕ）、５－カルバモイルメチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕ）、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン（ｎｃｍ５Ｕｍ）、５－メトキシウリジン（ｍｏ５ｕ）、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン（ｍｓ２ｉ６ａ）、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）トレオニン（ｍｓ２ｔ６ａ）、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチルカルバモイル）トレオニン（ｍｔ６ａ）、ウリジン－５－オキシ酢酸－メチルエステル（ｍｖ）、ウリジン－５－オキシ酢酸（ｏ５ｕ）、ワイブトキソシン（ｏｓｙｗ）、プソイドウリジン（ｐ、Ψ）、キューオシン（ｑ）、２－チオシチジン（ｓ２ｃ）、５－メチル－２－チオウリジン（ｓ２ｔ）、２－チオウリジン（ｓ２ｕ）、４－チオウリジン（ｓ４ｕ）、５－メチルウリジン（ｔ）、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）－カルバモイル）トレオニン（ｔ６ａ）、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン（ｔｍ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（ｕｍ）、ワイブトシン（ｙｗ）、３－（３－アミノ－３－カルボキシ－プロピル）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ（ｘ）などがある。
用語「対応する修飾ヌクレオチド」は、配列の所定の位置にある修飾ヌクレオチドに関し、その塩基が、修飾ヌクレオチドを含む配列と比較される元の配列の同じ位置にあるヌクレオチドの通常の、すなわち未修飾の塩基に基づいて修飾されている。したがって、対応する修飾ヌクレオチドは、細胞内で、大抵は通常のヌクレオチドを修飾することによって通常のヌクレオチドから生成される任意のヌクレオチドである。したがって、例えばウリジンに対応する修飾ヌクレオチドは、ウリジンの修飾によって得られる任意のヌクレオチドである。一例として、配列の特定の位置にある５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン（ｃｈｍ５ｕ）は、元の配列の同じ位置にあるウリジンに対応する修飾ヌクレオチドであり得る。ウリジンに対応する修飾ヌクレオチドには、この他に、例えば５－メチルウリジン（ｔ）、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン（ｔｍ）、２’－Ｏ－メチルウリジン（ｕｍ）、または５－メトキシウリジン（ｍｏ５ｕ）がある。別の例として、イノシンはアデノシンから生成されることから、アデノシンに対応する修飾ヌクレオチドである。
本発明の合成転移ＲＮＡは、自然発生ｔＲＮＡに基づいて合成し得る。ただし、本発明のｔＲＮＡは、好ましくはコンピューターで（「ｉｎ ｓｉｌｉｃｏ」）設計し、化学的および／または酵素的に合成する。本発明による合成ｔＲＮＡをコンピューターで設計することにより、細胞に存在する他のｔＲＮＡと干渉しないｔＲＮＡの設計および合成が可能となる。本発明の合成ｔＲＮＡは、生細胞、好ましくは哺乳類細胞、例えばヒト細胞で自然に発生するアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが、特定のアミノ酸でｔＲＮＡを荷電できるように選択または設計する。好ましくは、ｔＲＮＡは細胞内の条件下で、標的ｍＲＮＡにおいて早期終止コドンの隣にあるコドンによって、または早期終止コドンに変異した野生型コドンによってコードされるアミノ酸がｔＲＮＡに酵素的に付着するよう選択または設計する。
当業者は、ｔＲＮＡが、特定のアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ａａＲＳ）によって特定のアミノ酸でアミノアシル化され、ａａＲＳが、ｔＲＮＡの受容ステムおよび／またはアンチコドンループにある独自の同一性要素を介して、その同族ｔＲＮＡを認識できるという事実を承知している。当業者は、ｉｎ ｖｉｖｏでその同族アミノ酸で負荷されるｔＲＮＡを提供するために、好適な独自の同一性要素を有する本発明の合成ｔＲＮＡを設計するであろう。
本発明のｔＲＮＡは、好ましくは、任意の自然発生ｔＲＮＡに対する配列同一性が低く、好ましくは、配列同一性が５０％未満であり、特に好ましくは、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、または４３％未満である。
本発明による合成転移ＲＮＡでは、アンチコドンループは、アンチコドンペアを収容し、かつｍＲＮＡとの塩基対合を可能にするのに十分な数のヌクレオチドによって拡張されている。本発明の合成転移ＲＮＡのアンチコドンループは、例えば、８～１２、好ましくは９～１１、さらに好ましくは、９または１０ヌクレオチドからなり得る。９ヌクレオチドからなるアンチコドンループが特に好ましい。
本発明の合成ｔＲＮＡの拡張アンチコドンループは、ｍＲＮＡ上の２つの連続する３塩基コドンに塩基対合するよう構成された２つの連続する３塩基アンチコドンを含み、このｍＲＮＡは、好ましくは、早期終結コドン（ＰＴＣ）を運ぶ標的ｍＲＮＡである。３塩基アンチコドンのうちの１つは、ｍＲＮＡ上の３塩基終止コドンに塩基対合するよう構成されているのに対し、隣接する３塩基アンチコドンは、好ましくは、ｍＲＮＡ上の３塩基終止コドンに対して手前または次の、すなわち５’または３’側のセンスコドンに塩基対合するよう構成されている。用語「手前の」または「次の」は、ｍＲＮＡの翻訳の方向、すなわち５’－３’方向に関する。
本発明の合成ｔＲＮＡの拡張アンチコドンループにおけるアンチコドンペアの一例がＵＧＣＵＣＡ（５’－３’方向；３’－５’方向ならＡＣＵＣＧＵ）で、ｍＲＮＡのＵＧＡＧＣＡ（５’－３’）と一致しており、このときＵＣＡは終止コドンＵＧＡと塩基対合でき、ＵＧＣは、アラニンをコードするコドンＧＣＡと塩基対合できる。
２つの連続する３塩基アンチコドンが、転移ＲＮＡの拡張アンチコドンループに非対称に配置されていると好ましい。本文脈における「非対称に配置されている」とは、２つの連続する３塩基アンチコドン（「アンチコドンタンデム」）からなる６ｎｔ配列が、アンチコドンアームの二次元的表現において、アンチコドンアームのステムを長手方向に走り、かつアンチコドンループの方向に延びた仮想対称軸からずれて配置されていることを意味する（図２も参照）。例えばアンチコドンタンデムは、アンチコドンタンデムを形成する６個のヌクレオチドのうち４個が軸の片側にあり、残りの２個のヌクレオチドが軸の反対側にあるようにアンチコドンループ内に配置され得る。つまり、アンチコドンループ内で、ｔＲＮＡの３’末端側と５’末端側でアンチコドンタンデムに隣接するヌクレオチドの数は同じではない。３’末端側でアンチコドンタンデムに隣接するアンチコドンループ内のヌクレオチドの数が、５’末端側で隣接する数よりも多いことも、逆のこともあり得る。この文脈で注意すべきは、アンチコドンループにおけるアンチコドンタンデムの非対称配置では、アンチコドンタンデムの半分以上が軸の片側にあることのみが求められており、必ずしもヌクレオチド全体である必要はない。対称配置では、アンチコドンタンデムは軸の片側に３個のヌクレオチドが、軸の反対側にもう３個がくるように配置される。
本発明の合成転移ＲＮＡの好ましい実施形態では、２つの連続する３塩基アンチコドンは合成転移ＲＮＡの３’末端側にずれている。すなわちアンチコドンループ内では、５’末端側でアンチコドンタンデムに隣接するヌクレオチドの方が多い。
本発明の好ましい実施形態では、合成転移ＲＮＡは、翻訳の読み飛ばしを促進するようさらに最適化、すなわち構造的に修飾されている。したがって本発明のｔＲＮＡは、構造的に、つまりそのヌクレオチド配列に関して、ｔＲＮＡ本体が、ｉｎ ｖｉｖｏで最大限に読み飛ばすために用いる特定のアンチコドンタンデムおよび／またはアンチコドンループに合うよう設計されていると好ましい。例えばｔＲＮＡは、アンチコドンアーム以外の部分、例えばＴアーム、Ｄアーム、または可変ループのヌクレオチド組成に関してさらに修飾され得る。用語「翻訳の読み飛ばし」は、その配列内に早期終止コドン（ＰＴＣ）を有するｍＲＮＡから完全タンパク質を合成することに関する。すなわち、野生型タンパク質と比べてアミノ酸が不足していても、完全な機能タンパク質が得られるように、ＰＴＣを有するｍＲＮＡを、ＰＴＣを越えて翻訳することに関する。「翻訳の読み飛ばしを促進する」という表現は、さらに修飾されたｔＲＮＡの存在下では、さらに修飾されていないｔＲＮＡが関与する翻訳と比べて、ＰＴＣを有するｍＲＮＡから完全タンパク質が合成される割合が高いことに関する。
好ましい実施形態では、Ｔステムは、第１の５ヌクレオチドであるＴステム配列ＡＧＧＧＧ、および第２の５ヌクレオチドであるＴステム配列ＣＣＣＣＵからなるよう修飾され、第２のＴステム配列は、第１のＴステム配列に相補的であり、かつＴループの後ろにｔＲＮＡに関して５’-３’方向に配列されている。したがってＴアームは、５’－ＡＧＧＧＧ－（Ｔループ）－ＣＣＣＣＵ－３’の構造を有する。典型的なｔＲＮＡ（図３参照）では、配列ＡＧＧＧＧはｔＲＮＡの標準的なコンセンサス番号付けによる位置４９～５３を、対応する（５’－３’方向の）ヌクレオチド配列ＣＣＣＣＵは位置６１～６５を占める。
さらに本発明のｔＲＮＡは、追加的または代替的に、Ｄアームの配列が修飾され得る。例えば本発明のｔＲＮＡは、配列ＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ番号：３１）を含むＤアームを有するよう修飾され得る。好ましい実施形態では、本発明のｔＲＮＡは、前述のＴステム配列およびＳＥＱ ＩＤ番号：３１のＤアーム配列を有する。
また本発明のｔＲＮＡの可変ループは、翻訳の読み飛ばしを促進するために修飾され得る。可変ループは単独で、またはＴステムおよび／またはＤアームとともに修飾され得る。例えば、ＳＥＱ ＩＤ番号：５４（ＵＵＧＧＧＧＣＣＧＣＧＣＧＧＵＣＣＣＧＧ）で示される天然ｔＲＮＡSec（セレノシステインｔＲＮＡ）の可変ループ、またはその修飾された変異体を組み入れ得る。ｔＲＮＡSecＶループの修飾された変異体は、短縮または拡張された配列、または１つもしくは複数のヌクレオチドが他のヌクレオチドに置き換えられた配列を含み得る。
本発明による合成転移ＲＮＡは、アミノアシル化され得る。すなわち、その受容ステムの末端でアミノ酸またはジペプチドを運ぶ。好ましくは、ｔＲＮＡは、アンチコドンペアの１つと塩基対合するセンスコドンによってコード化されているアミノ酸、または早期終結コドンに変異し、かつもう１つのアンチコドンペアと塩基対合するコドンによってコード化されているアミノ酸でアミノアシル化されている。本発明の合成ｔＲＮＡは、単一のアミノ酸またはジペプチドで、化学的および／または酵素的にアミノアシル化できる。ジペプチドでのｔＲＮＡの負荷は、当業者に既知の方法（例えば、非特許文献１７参照）で実現できる。例えば、遺伝子組み換え細菌のｔＲＮＡシンテターゼまたはＲＮＡベースの触媒を、ジペプチドでｔＲＮＡをアミノアシル化するのに使用し得る。ジペプチドは、好ましくは、合成ｔＲＮＡに存在するアンチコドンペアに対応するコドンペアによってコード化されたアミノ酸からなる。そのようなジペプチドでアミノアシル化された合成ｔＲＮＡを使用することで、ＰＴＣを意図的に抑制し、非短縮タンパク質を産生できるだけでなく、野生型タンパク質のアミノ酸配列を有するタンパク質を産生できる。
好ましい実施形態では、本発明の合成転移ＲＮＡは、ａ）ＳＥＱ ＩＤ番号：０３～０７、０９～１７、１９～２３、２５～３０、４６～５０、もしくは５５～５７に従った配列のうちの１つ、またはｂ）ＳＥＱ ＩＤ番号：０３～０７、０９～１７、１９～２３、２５～３０、４６～５０、もしくは５５～５７に従った配列のうちの１つと少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列、またはｃ）上記ａ）もしくはｂ）の配列であって、ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている配列を有する、または含む。用語「対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている」は、配列、例えばＳＥＱ ＩＤ番号：０３の所定の位置にある非修飾ヌクレオチド、例えばシチジンヌクレオチド（Ｃ）が、対応する修飾ヌクレオチド、例えば２’－Ｏ－メチルシチジン（ｃｍ）、３－メチルシチジン（ｍ３ｃ）、または５－メチルシチジン（ｍ５ｃ）で置き換えられていることを意味する。本発明の合成転移ＲＮＡは、例えば、１０、２０、または３０個より多い修飾ヌクレオチドを含む配列を有し得る、または含み得る。
好ましい実施形態では、合成転移ＲＮＡは、ａ）ＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５１）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５２）、ＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５３）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＧ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＵ、ＡＵＣＡＧＵＵＡＧ、およびＡＣＵＣＡＧＵＵＡからなる配列の群から選択される配列を含むアンチコドンループ、またはｂ）ＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５１）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５２）、ＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５３）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＧ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＵ、ＡＵＣＡＧＵＵＡＧ、およびＡＣＵＣＡＧＵＵＡからなる配列の群から選択される配列を含むアンチコドンループであって、ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられているアンチコドンループを有する。配列ＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５１）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５２）、ＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５３）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＧ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＵ、ＡＵＣＡＧＵＵＡＧ、およびＡＣＵＣＡＧＵＵＡはそれぞれ、１０（ＳＥＱ ＩＤ番号：５１～５３）または９ヌクレオチドを含む拡張アンチコドンループの配列（以下の表３参照）を含む。各アンチコドンループはアンチコドンタンデムＣＡＧＵＵＡを含み、これらの実施形態に従った転移ＲＮＡは、嚢胞性線維症で使用するための、例えばＣＦＴＲにおけるＹ１０９２Ｘ変異を修正するための薬剤として特に有用である。
特に好ましくは、Ｇ－ＣまたはＣ－Ｇ対が、アンチコドンループの方向でアンチコドンステムの末端に配置されている、すなわち、アンチコドンループに隣接するアンチコドンステムのヌクレオチドが、Ｇ－ＣまたはＣ－Ｇ対を形成する。
明確にするために、本発明の合成転移ＲＮＡは、任意の修飾ヌクレオチドを含むよう合成されていてもいなくてもよいことに注意する必要がある。したがって、本発明の合成転移ＲＮＡは任意の修飾ヌクレオチドを含んでいなくてもよい。とはいえ、細胞に入った後、その合成ｔＲＮＡの１つまたは複数のヌクレオチドは、細胞酵素機構により細胞内で修飾され得る。その結果、修飾ヌクレオチドなしに設計、合成、および投与された本発明の合成ｔＲＮＡは、生細胞で、細胞が行った修飾により、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。つまり、本発明の合成ｔＲＮＡが、何らかの修飾ヌクレオチドを含まずに合成および投与され、修飾を細胞に委ねると好ましい。
本発明の合成ｔＲＮＡは、投与前にすでに修飾ヌクレオチドを含んでいるように修飾ヌクレオチドで合成される場合、好ましくは、以下の修飾ヌクレオチド（表１）の１つまたは複数を含む。
ｍ１ｇ、１－メチルグアノシン；ａｍ、２’－Ｏ－メチルアデノシン；ｃｍ、２’－Ｏ－メチルシチジン；ｇｍ、２’－Ｏ－メチルグアノシン；Ψ、プソイドウリジン；ｍ２ｇ、Ｎ２－メチルグアノシン；ａｃ４ｃ、Ｎ４－アセチルシチジン；ｄ、ジヒドロウリジン；ｍ２２ｇ、Ｎ２、Ｎ２－ジメチルグアノシン；ｍ２ｇ、Ｎ２－メチルグアノシン；Ｉ、イノシン；ｍ５ｃ、５－メチルシチジン；ｍｃｍ５ｕ、５－メトキシカルボニルメチルウリジン；ｍｃｍ５ｓ２ｕ、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン；ｎｃｍ５ｕ、５－カルバモイルメチルウリジン；ｎｃｍ５ｕｍ、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン；ｑ、キューオシン；ｍ５ｃ、５－メチルシチジン。
さらなる態様では、本発明は、薬剤として使用するための、本発明の第１の態様に従った合成転移ＲＮＡに関する。本発明の転移ＲＮＡは、タンパク質の欠如または機能障害を引き起こすＰＴＣと関連する疾患、特に、ｍＲＮＡの翻訳を早期停止させるナンセンス変異に少なくとも部分的に起因する疾患を有する患者の治療にとりわけ有用である。本発明のｔＲＮＡを有利に適用し得る疾患の例に、嚢胞性線維症、神経線維腫症１型、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、またはハーラー症候群がある。ｔＲＮＡを細胞に送達するのに好適な組成または手段は既知であり、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとするウイルスベクターなどのウイルスベクター、ナノ粒子への封入、またはナノ粒子への結合などがある。
好ましい実施形態では、本発明による合成転移ＲＮＡは、嚢胞性線維症を治療する薬剤として使用するよう設計されており、拡張アンチコドンループの２つの連続する３塩基アンチコドンが配列ＣＡＧＵＵＡを含む。合成転移ＲＮＡは、例えば、ａ）ＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５１）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５２）、ＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５３）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＧ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＵ、ＡＵＣＡＧＵＵＡＧ、およびＡＣＵＣＡＧＵＵＡからなる配列の群から選択される配列、またはｂ）ＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５１）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５２）、ＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ番号：５３）、ＣＵＣＡＧＵＵＡＧ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＡ、ＣＵＣＡＧＵＵＡＵ、ＡＵＣＡＧＵＵＡＧ、およびＡＣＵＣＡＧＵＵＡからなる配列の群から選択される配列であって、ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている配列を含むアンチコドンループを有し得る。特に好ましくは、合成転移ＲＮＡは、９ヌクレオチドからなる拡張アンチコドンループを有する。アンチコドンタンデムＣＡＧＵＵＡを含む拡張９ｎｔヌクレオチドアンチコドンを有する好適なｔＲＮＡの一例は、ＳＥＱ ＩＤ番号：６の配列を含む転移ＲＮＡ、またはＳＥＱ ＩＤ番号：６の配列で、ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている。
以下に、例示のみを目的とした実施例および添付の図面によって本発明を説明する。
図１は、本発明の合成ｔＲＮＡおよび標的ｍＲＮＡの概略図を示す。本発明の合成ｔＲＮＡ １はｔＲＮＡヌクレオチド１１からなり、ＣＣＡ末端１０を有する受容ステム２、ＴΨＣループ６を有するＴアーム３、Ｄループ７を有するＤアーム４、ならびに５ヌクレオチドのステム部分８およびアンチコドンループ９を有するアンチコドンアーム５を備える天然ｔＲＮＡの一般的なクローバーリーフ構造を有する。アミノ酸１４は、受容ステム２のＣＣＡ末端１０に結合している。９ヌクレオチド１１からなる拡張アンチコドンループ９は、２つの連続する３塩基アンチコドン１２、１３を含む。第１の３塩基アンチコドン１２（斜線入りの円）は、ｍＲＮＡヌクレオチド１６からなる標的ｍＲＮＡ１５上の第１の３塩基コドン１７（同様に斜線入り）に塩基対合することができる。第２の３塩基アンチコドン１３（黒塗りの円）は、ｍＲＮＡ１５上の第２の３塩基コドン１８（同様に黒塗り）に塩基対合することができる。第１の３塩基コドン１７は早期終結コドン（ＰＴＣ）であり得、第２の３塩基コドン１８はアミノ酸、例えば、アラニンをコードし得、またはその逆もあり得る。自然発生ｔＲＮＡにおいてＴアームとアンチコドンアームの間に存在することの多い可変ループは、ここでは省略している。
本発明の合成ｔＲＮＡのｉｎ ｓｉｌｉｃｏ設計。
別段の指示がない限り、配列はすべて５’－３’方向に記述する。すべての配列において、マイナス記号（ハイフン「－」）を使用する場合は明確性のみを目的としており、物理的なヌクレオチドを指してはいない。ページ上で配列を整える印刷の体裁上の慣例にすぎない。また、明示的に別段の定めをしない限り、塩基には、前述のｔＲＮＡ規則に従わず、単に連続的に番号を付けている。
別段の指示がない限り、配列はすべて５’－３’方向に記述する。すべての配列において、マイナス記号（ハイフン「－」）を使用する場合は明確性のみを目的としており、物理的なヌクレオチドを指してはいない。ページ上で配列を整える印刷の体裁上の慣例にすぎない。また、明示的に別段の定めをしない限り、塩基には、前述のｔＲＮＡ規則に従わず、単に連続的に番号を付けている。
まず、自然発生ヒトＬｅｕ ｔＲＮＡをそのアンチコドンループのみ修飾した。
元のヒトｔＲＮＡ－Ｌｅｕ（Ｍ２ＧＡＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０４７００．１；下線はアンチコドン）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０１：
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＮＡＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
元のヒトｔＲＮＡ－Ｌｅｕ（Ｍ２ＧＡＡ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｘ０４７００．１；下線はアンチコドン）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０１：
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＮＡＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
上記の自然発生ｔＲＮＡは、細胞から単離すると、その配列に修飾塩基を含み、これは上記配列においてＮまたは対応する非修飾塩基で表される。一例として、位置３５（前述の特定のｔＲＮＡ番号付け規則では位置３４に相当）のＮはｍ２２ｇ（２，２－ジメチルグアノシン）を表す。
ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）をコードするコドンの隣が終止コドン（Ｘ）となるＣＦＴＲにおける変異を修正するために、以下のようにｔＲＮＡを設計した。
５’－ＣＡＧＵＵＡ－３’ 次のコドンに相補的な６ｎｔアンチコドンペア：
３’－ＧＵＣＡＡＵ－５’ ｍＲＮＡ配列（５’－終止－ｌｅｕ－３’）が認識されることになる。
５’－ＣＡＧＵＵＡ－３’ 次のコドンに相補的な６ｎｔアンチコドンペア：
３’－ＧＵＣＡＡＵ－５’ ｍＲＮＡ配列（５’－終止－ｌｅｕ－３’）が認識されることになる。
通常のアンチコドンの１塩基のみが修飾された天然ｔＲＮＡに基づくｔＲＮＡに加えて、拡張アンチコドンループを有する５個のｔＲＮＡを設計した（設計１．１～１．５）。上述のように、修飾ヌクレオチドは、修飾された配列に存在してもしなくてもよい。すなわち、設計したｔＲＮＡについて以下に示した配列は、非修飾塩基の代わりに１つまたは複数の対応する修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドの数と種類は、天然ｔＲＮＡテンプレートと同じでも異なっていてもよい。したがって、本発明の合成ｔＲＮＡの配列における任意の非修飾ヌクレオチドは、対応する修飾ヌクレオチドと置き換え得る。ゆえに、設計したｔＲＮＡの以下の配列における記号Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＵは、非修飾塩基または任意の対応する修飾塩基を表す。配列におけるＡは、例えば、アデニンヌクレオチド（Ａ）または対応する修飾ヌクレオチド、例えば、１－メチルアデノシン（ｍ１ａ）を表し得る。ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成すると、ｔＲＮＡは好ましくは修飾されないが、その後にｉｎ ｖｉｔｒｏで化学的および／または酵素的に修飾され得る。細胞に導入または組み入れられると、ｔＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで非修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれで合成されたかにかかわらず、細胞によって修飾され得る。
塩基Ｕが位置３５（ｔＲＮＡ番号付け規則では３４）で置換されたｔＲＮＡ－Ｌｅｕ（ＵＡＡ）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０２
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＵＡＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＵＡＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
設計１．１：ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ ＣＡＧＵＵＡアンチコドンペア（下線）、１０ｎｔアンチコドンループ、ＳＥＱ ＩＤ番号：０３
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
設計１．２：ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＧＵＵＡアンチコドン、９ｎｔアンチコドンループ（設計１．１と比べてＣ３３を削除）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０４
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
設計１．３：ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＧＵＵＡアンチコドン、９ｎｔアンチコドンループ（設計１．１と比べてＵ３４を削除）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０５
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
設計１．４：ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＧＵＵＡアンチコドン、９ｎｔアンチコドンループ（設計１．１と比べてＧ４１を削除）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０６
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
設計１．５：ｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＧＵＵＡアンチコドン、９ｎｔアンチコドンループ（設計１．１と比べてＵ４２を削除）、ＳＥＱ ＩＤ番号：０７
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
最適なアンチコドンループの長さは９ｎｔであった。
設計１．４（ＣＡＧＵＵＡアンチコドン、９ｎｔアンチコドンループ（Ｇ４１を削除））から開始し、サーマス・サーモフィルスのｔＲＮＡ－Ｌｅｕの結晶構造に基づいて、自然発生ｔＲＮＡとの類似性が少ないさらなるＬｅｕ ｔＲＮＡ（６ｎｔアンチコドンペアを有する）を設計した。
サーマス・サーモフィルスのｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＧ（３ｎｔアンチコドン、配列はＲＣＳＢタンパク質構造データバンク識別名２ｂｔｅ．ｂによる；配列に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、それぞれの非修飾ヌクレオチドによって表される）．
ＳＥＱ ＩＤ番号：０８
ＧＣＣＧＧＧＧＵＧＧＣＧＧＡＡＵＧＧＧＵＡＧＡＣＧＣＧＣＡＵＧＡＣＵＣＡＧＧＡＵＣＡＵＧＵＧＣＧＣＡＡＧＣＧＵＧＣＧＧＧＵＵＣＡＡＧＵＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＧＧＧＧＵＧＧＣＧＧＡＡＵＧＧＧＵＡＧＡＣＧＣＧＣＡＵＧＡＣＵＣＡＧＧＡＵＣＡＵＧＵＧＣＧＣＡＡＧＣＧＵＧＣＧＧＧＵＵＣＡＡＧＵＣＣＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＡＣＣＡ
これにより、上記の設計１．４（９ｎｔアンチコドンループ）に基づく６ｎｔアンチコドンペアを有する以下のｔＲＮＡ－Ｌｅｕ－ＣＡＧＵＵＡ（Ｌｅｕ－終止）の設計に至った。
設計２．１（ＳＥＱ ＩＤ番号：０９）：
ＧＧＣＡＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＣＡＧＣＵＣＡＧＵＵＡＧＣＵＧＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＣＣＵＧＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＣＡＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＣＡＧＣＵＣＡＧＵＵＡＧＣＵＧＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＣＣＵＧＣＣＡＣＣＡ
設計２．２（ＳＥＱ ＩＤ番号：１０）：
ＧＡＣＡＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＵＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＣＣＵＧＵＣＡＣＣＡ
ＧＡＣＡＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＵＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＣＣＵＧＵＣＡＣＣＡ
設計２．３（ＳＥＱ ＩＤ番号：１１）：
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＣＡＧＣＵＣＡＧＵＵＡＧＣＵＧＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＣＡＧＣＵＣＡＧＵＵＡＧＣＵＧＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
設計２．４（ＳＥＱ ＩＤ番号：１２）：
ＧＧＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＵＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＡＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＵＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＣＣＡＣＣＡ
設計２．５（ＳＥＱ ＩＤ番号：１３）：
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＧＵＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＡＣＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＧＵＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＡＣＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
設計２．６（ＳＥＱ ＩＤ番号：１４）：
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＣＣＡＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＣＵＧＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＣＣＡＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
設計２．７（ＳＥＱ ＩＤ番号：１５）：
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＣＣＧＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＣＣＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＣＣＧＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＣＣＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
設計２．８（ＳＥＱ ＩＤ番号：１６）：
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＣＣＵＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＡＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＣＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＣＣＵＧＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＣＡＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＧＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
設計２．９（ＳＥＱ ＩＤ番号：１７）：
ＧＣＣＡＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＵＣＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＧＡＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＣＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ＧＣＣＡＧＧＣＵＧＡＧＧＧＡＧＡＵＧＧＵＣＡＡＣＣＵＡＧＣＵＣＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＧＡＧＣＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＣＵＵＣＧＡＡＵＧＣＣＡＣＧＣＣＵＧＧＣＡＣＣＡ
ここでも、合成ｔＲＮＡの設計用テンプレートとして用いられた天然配列に存在する任意の修飾ヌクレオチドは、設計した配列に存在してもしなくてもよい。したがって、上記で設計したｔＲＮＡは、非修飾塩基の代わりに１つまたは複数の対応する修飾ヌクレオチドを含んでも含まなくてもよい。
ＣＦＴＲ遺伝子（Ｒ５５３Ｘ）でさらなる終止変異（位置５５３）を修正するために、グルタミン（Ｑ）およびアラニン（Ａ）をコードするコドンが両側にあり、アルギニン（Ｒ）をコードする野生型コドンＣＧＡを終止コドン（遺伝子レベルでＴＧＡ）に変異させる。
ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＣＡ （野生型ヌクレオチド配列）
Ｑ Ｒ Ａ （野生型アミノ酸配列）
ＣＡＡ ＴＧＡ ＧＣＡ （変異ヌクレオチド配列）
Ｑ Ｘ Ａ （変異ヌクレオチド配列）
ｔＲＮＡは、６ｎｔアンチコドンペア（ＵＧＣＵＣＡ）を有し、アラニン（Ａｌａ、Ａ）でアミノアシル化されるよう、すなわち、Ａｌａ－ｔＲＮＡと同一性を持つよう設計した（ｍＲＮＡの３’方向）。
ＣＡＡ ＣＧＡ ＧＣＡ （野生型ヌクレオチド配列）
Ｑ Ｒ Ａ （野生型アミノ酸配列）
ＣＡＡ ＴＧＡ ＧＣＡ （変異ヌクレオチド配列）
Ｑ Ｘ Ａ （変異ヌクレオチド配列）
ｔＲＮＡは、６ｎｔアンチコドンペア（ＵＧＣＵＣＡ）を有し、アラニン（Ａｌａ、Ａ）でアミノアシル化されるよう、すなわち、Ａｌａ－ｔＲＮＡと同一性を持つよう設計した（ｍＲＮＡの３’方向）。
終止コドンを読み飛ばし、翻訳するタンパク質にＡｌａを送達できるｔＲＮＡを設計することを目的とした（短縮タンパク質の産生に至る変異によって生じた早期終止コドンを読み飛ばす）。
５’－ＵＧＣＵＣＡ－３’ 以下の２つのコドンに相補的な６ｎｔアンチコドンペア
３’－ＡＣＧＡＧＵ－５’ ｍＲＮＡ配列（５－終止－Ａｌａ－３’；ＸＡ）が認識される。
５’－ＵＧＣＵＣＡ－３’ 以下の２つのコドンに相補的な６ｎｔアンチコドンペア
３’－ＡＣＧＡＧＵ－５’ ｍＲＮＡ配列（５－終止－Ａｌａ－３’；ＸＡ）が認識される。
Ｌｅｕ－ｔＲＮＡと同様に、まず天然ヒトＡｌａ－ｔＲＮＡを最小限に、すなわちアンチコドンループのみ変化させた。ここでも、配列における任意の修飾ヌクレオチドはその非修飾同等物で表され、天然ｔＲＮＡに基づいて設計した合成ｔＲＮＡは、天然配列の修飾ヌクレオチドの全部または一部を含んでも含まなくてもよい。また設計したｔＲＮＡは、天然配列および／または別の位置に存在するものよりも多い、またはそれ以外の修飾ヌクレオチドを含み得る。
ｔＲＮＡ－Ａｌａ－ＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ番号：１８）、自由３’末端ＡＣＣＡを持たない：
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＡＧＣＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣ
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＡＧＣＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣ
設計３．１（１０ｎｔアンチコドンループ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：１９）
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
設計３．２（９ｎｔアンチコドンループ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：２０）
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＧＣＵＣＡＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＧＣＵＣＡＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
設計３．３（９ｎｔアンチコドンループ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：２１）
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＵＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
設計３．４（９ｎｔアンチコドンループ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：２２）
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
実験から、１０ｎｔおよび９ｎｔアンチコドンループを有するｔＲＮＡのいずれも、自然発生ｔＲＮＡに対応する二次構造を形成し、一本鎖のＣＣＡ末端は無傷だった。ｔＲＮＡはすべてアミノアシル化できた。
Ａｌａ－ｔＲＮＡの設計１．４から開始し、ｔＲＮＡ本体が天然ヒトｔＲＮＡに対応しないように、さらなるＡｌａ－ｔＲＮＡを設計した。
ｔＲＮＡ－Ａｌａ－ＵＧＣＵＣＡ－設計３．４（ＳＥＱ ＩＤ番号：２２）
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＡＡＵＵＡＧＣＵＣＡＡＡＵＧＧＵＡＧＡＧＣＧＣＵＣＧＣＵＵＵＧＣＵＣＡＡＧＣＧＡＧＡＧＧＵＡＧＣＧＧＧＡＵＣＧＡＵＧＣＣＣＧＣＡＵＵＣＵＣＣＡＣＣＡ
設計したｔＲＮＡの一般化した二次構造を図２に表す（図に示す配列はＳＥＱ ＩＤ番号：２４で示される）。参照番号は、図１に使用する番号に対応する。ＣＣＡ末端部分を含む自由３’末端は示されていない。図２でも、拡張アンチコドンループ９における２つの連続する３塩基アンチコドン（「アンチコドンタンデム」）１３が、アンチコドンアーム５のステム８を長手方向に走り、かつアンチコドンループ９の方向に延びた仮想対称軸１９に対して非対称配置であることが示されている。アンチコドンタンデム１３はｔＲＮＡの３’末端に対してずれて配置されている。
Ａｌａ－ｔＲＮＡに基づき、２×３ｎｔアンチコドンを含む９ｎｔアンチコドンループを有し（図２）、３’末端部分を含むｔＲＮＡの配列は以下のとおりである（ＳＥＱ ＩＤ番号：２３）。
ＧＧＧＧＮＮＮＵＡＧＣＵＣＡＧＮＮＧＧＵＡＧＡＧＣＧＮＮＮＮＮＣＵＵＧＣＵＣＡＡＮＮＮＮＮＡＮＧＮＣＮＮＮＮＧＵＵＣＧＡＵＣＣＮＮＮＮＮＮＮＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＮＮＮＵＡＧＣＵＣＡＧＮＮＧＧＵＡＧＡＧＣＧＮＮＮＮＮＣＵＵＧＣＵＣＡＡＮＮＮＮＮＡＮＧＮＣＮＮＮＮＧＵＵＣＧＡＵＣＣＮＮＮＮＮＮＮＣＵＣＣＡＣＣＡ
本発明の他の合成ｔＲＮＡに関連して既に述べたように、記号Ｇ、Ｃ、Ａ、またはＵは、非修飾塩基または任意の対応する修飾塩基を表し得る。したがって、上記で設計したｔＲＮＡは１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。
塩基が、図２に示す塩基対合に反しないとすると、Ｎは塩基Ａ、Ｃ、Ｇ、もしくはＵ、または任意の修飾塩基を表す。許容される塩基対は、Ｇ－Ｃ、Ｃ－Ｇ、Ａ－Ｕ、Ｕ－Ａ、ならびにＧ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｉ－Ｕ、Ｕ－Ｉ、Ｉ－Ａ、Ａ－Ｉ、およびＩ－Ｃ、Ｃ－Ｉのようなゆらぎ塩基対である。
図３は、５’末端の１で始まり、３’末端の７６で終わる一般化された「コンセンサス」ｔＲＮＡに適用される慣例的な番号付けに従って番号付けされたｔＲＮＡの一例を表す。そのような「コンセンサス」ｔＲＮＡにおいて、天然アンチコドントリプレットのヌクレオチドは、手前のヌクレオチドの実際の番号にかかわらず、常に位置３４、３５、および３６にある。ここに示すｔＲＮＡ以外に、ｔＲＮＡは、例えば、Ｄループの位置１と３４の間に追加的なヌクレオチドも含み得る。追加的なヌクレオチドは、英字を追加して、例えば２０ａ、２０ｂなどのように番号付けし得る。例えば上記の表１に示す修飾ヌクレオチドが、配列に存在し得る。
効率的に読み飛ばすためにｔＲＮＡ本体配列を最適化する。
天然ヒトｔＲＮＡAlaに基づく異なるｔＲＮＡ（ｎ１～ｎ６、ＳＥＱ ＩＤ番号：３３～３８）をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した。すべてのｔＲＮＡが、アンチ終止コドン（すなわち、終止コドンに相補的なアンチコドン）を含む同じ非拡張アンチコドンループを有していた。このために、ｔＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＴ７プロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：３２）とライゲーションさせ、Ｔ７をベースとするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系でｔＲＮＡを生成させた。次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いてｔＲＮＡを精製した。
天然ヒトｔＲＮＡAlaに基づく異なるｔＲＮＡ（ｎ１～ｎ６、ＳＥＱ ＩＤ番号：３３～３８）をｉｎ ｖｉｔｒｏで合成した。すべてのｔＲＮＡが、アンチ終止コドン（すなわち、終止コドンに相補的なアンチコドン）を含む同じ非拡張アンチコドンループを有していた。このために、ｔＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＴ７プロモーター配列（ＳＥＱ ＩＤ番号：３２）とライゲーションさせ、Ｔ７をベースとするｉｎ ｖｉｔｒｏ転写系でｔＲＮＡを生成させた。次いで、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を用いてｔＲＮＡを精製した。
設計したｔＲＮＡのＴ７プロモーター促進転写用テンプレートを、Ｔ７プロモーター配列（５’－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡ－３’、ＳＥＱ ＩＤ番号：３２）を含む各ｔＲＮＡの全長をカバーする２つの重複するＤＮＡオリゴヌクレオチド（市販品）でアニーリングおよびプライマー伸長を行って作成した。いずれのオリゴヌクレオチドも９５℃で２分間変性させ、その部分的な重複領域を、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で、室温で３分間インキュベートしてアニーリングした。ＤＮＡテンプレートを満たすために、すなわちヌクレオチド鎖を延長させ、完全に二本鎖のＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を生成するために、０．４ｍＭ ｄＮＴＰ、４Ｕ／μＬ ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、および１×ＲＴ緩衝液を、アニーリングしたオリゴヌクレオチドに添加し、反応物を３７℃で４０分間インキュベートした。ＤＮＡテンプレートはフェノール／クロロホルムで精製した。
追跡実験に合わせて、ｔＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ７促進転写を２種類の規模で実施した。ｔＲＮＡ完全性のｉｎ ｖｉｔｒｏ解析のために、３７℃で一晩、４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０、６ｍＭ ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭスペルミジン、２ｍＭ ＮＴＰ、１．２５～５ｍＭ ＧＭＰを含有）中の１μｇテンプレートＤＮＡおよび３０ Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いた。ｔＲＮＡはエタノールで沈殿させ、１０％変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、５０ｍＭ酢酸カリウム（ＫＯＡｃ）、２００ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ７．０を用い、一定の振とう（１０００ｒｐｍ）下で、４℃で一晩溶出した。ｔＲＮＡはエタノール沈殿で回収し、ＤＥＰＣ－Ｈ2Ｏ（ＤＥＰＣ＝ピロ炭酸ジエチル）中で再懸濁した。
真核細胞へのトランスフェクションでは多めの量が必要となるため、２０μｇテンプレートを、１×転写緩衝液中で、１００ｍＭの各ＮＴＰ、１００ｍＭ ＧＭＰ、１．２ Ｕ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と混合し、３７℃で一晩インキュベートした。ｔＲＮＡは前述のように精製し、ＤＥＰＣ－Ｈ2Ｏ中で再懸濁したのち、その後の使用のために－８０℃で保管した。
ＣＣＡ末端の折り畳みと完全性を確認するために、ｔＲＮＡは、フルオロフォア標識オリゴヌクレオチドを１：１の割合で用いて、２５℃で１時間インキュベートし、次いでＰＡＧＥで分離した。蛍光標識は、Ｃｙ３標識ＲＮＡ／ＤＮＡステムループオリゴヌクレオチドを、前述したｔＲＮＡ（非特許文献１８）の一般的な３’－ＮＣＣＡ末端にライゲーションさせて行った。蛍光オリゴヌクレオチドで標識したｔＲＮＡは蛍光撮像装置で可視化し、非標識ｔＲＮＡよりもゆっくりと移動させることができた。設計したｔＲＮＡ ｎ１～ｎ５を対照と比較した：天然ｔＲＮＡAla（ＧＧＣ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：４１）、天然ｔＲＮＡAla（ＵＧＣ）（ＳＥＱ ＩＤ番号：４２）、アンチコドンをアンチ終止コドンｔＲＮＡAla（ＵＣＡ）と置き換えただけの天然ｔＲＮＡAla、ＳＥＱ ＩＤ番号：４１、およびｎ６（設計における三次相互作用なし）、ＳＥＱ ＩＤ番号：３８。標識（ライゲーションされた）ｔＲＮＡと非標識（ライゲーションされていない）ｔＲＮＡの比はライゲーション効率を示す（表２）。
設計したｔＲＮＡを、折り畳みとアミノアシル化の正確さについて試験した。ｔＲＮＡの折り畳み反応およびアミノアシル化反応を、１ｍＭアラニンおよび１μＭの大腸菌アラニルｔＲＮＡシンテターゼを用いて行った。アミノアシル化したｔＲＮＡをエタノールで沈殿させ、２×酸性ＲＮＡローディングダイ（０．１Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．８、８Ｍ尿素、５％グリセロール、０．０２５％ブロモフェノールブルー、０．０２５％キシレンシアノールＦＦ含有）に直接溶解した。荷電および非荷電ｔＲＮＡ断片を、変性酸性ＰＡＧＥ（６．５％、８Ｍ尿素、０．１Ｍ ＮａＯＡｃ ｐＨ５．０）で４℃で分離した。ｔＲＮＡはＳＹＢＲ（登録商標）ゴールド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染色で可視化した。
アシル化させなかったｎ２を除いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで設計したｔＲＮＡはすべて、天然ｔＲＮＡAlaと同程度までアミノアシル化させた。
ＧＦＰリードスルー（読み飛ばし）アッセイを用いて、非拡張アンチコドンループに終止コドンを含む設計したｔＲＮＡが、翻訳的に活性であるかどうかを試験した。このために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のコード配列を含む翻訳系を用いた。ＧＦＰで２８番目のアミノ酸をコードするコドンを終止コドンに置き換えた。終止コドンがあると、ＧＦＰは通常は発現しない。ただし、終止コドンに相補的なアンチコドンを有する設計したサプレッサーｔＲＮＡがこのコドンに対合する場合、ＧＦＰは発現する。この発現は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）装置またはウェスタンブロットで検出できる。
このアッセイでは、緑色蛍光タンパク質が折り畳まれないように、ＧＦＰコード配列において１つのコドン（トリプレット）のみ終止コドンと置き換えられていること注意する必要がある。とはいえ、この方法は迅速であり、ｔＲＮＡ本体への修飾の効果を判定するのに使用できる（以下参照）。その後の実験のために、ｔＲＮＡのアンチコドンループは変化させなかった。Ａｌａ－ｔＲＮＡの天然アンチコドンのみ、アンチ終止コドンに変化させた。
ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系、およびｂ）大腸菌発現系の２つの系を使用した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系の場合、発現はウェスタンブロットで、大腸菌を使用した場合はウェスタンブロット、および時にはＦＡＣＳを用いて測定した。設計したｔＲＮＡは、翻訳と負荷に関して同じアーキテクチャを共有し、その翻訳能力は系とは無関係で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現、および原核生物または真核生物におけるｉｎ ｖｉｖｏ発現で使用できる。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳では、市販の系を使用した（Ｐｒｏｍｅｇａ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系では、まずｔＲＮＡをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写し、１：１０でプラスミドＤＮＡ（ＰＴＣ、すなわち終止コドンを有するＧＦＰ）に添加した。３０℃で１時間経過した後、反応混合物をＰＡＧＥで分離し、アリコートをＧＦＰ抗体で検出した。
ｉｎ ｖｉｖｏ発現系では、設計したｔＲＮＡを、ｌｐｐプロモーター下でｐＢＳＴ ＮＡＶ２ベクターにクローン化した（非特許文献１９）。ＸＬ１－青色細胞を、野生型ＧＦＰまたはＰＴＣ ＧＦＰ変異体およびｔＲＮＡ発現ｐＢＳＴ ＮＡＶ２ベクターを有するｐＢＡＤ３３プラスミドで同時形質転換し、ＬＢ培地で３７℃で増殖させた。増殖曲線をＯＤ６００ｎｍで記録した。ＯＤ600nm＝０．４で０．０５％Ｌ－アラビノースを用いてＧＦＰ変異体の発現を誘導した。ＯＤ600nm＝１．０で細胞を収集し、ＧＦＰ発現を、抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫ブロットで観察した。発現はハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子と比較した。並行して、細胞を収集、洗浄し、ＰＢＳ緩衝液で再懸濁したのち、マイクロタイタープレートリーダー（Ｔｅｃａｎ ＧＥＮｉｏｓ）を用いて、４８５ｎｍ励起および５３５ｎｍ放出フィルターでまとめて蛍光測定を行うか、またはＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーを行った。
リードスルーアッセイには、ＴＧＡ終止コドンに対合するために、その非拡張アンチコドンループにアンチ終止コドンを有するｎ１ ｔＲＮＡAla変異体の設計した変異体を用い、翻訳の読み飛ばしを促進するＴステムおよびＤアームへの修飾の影響を判定するために、さらにそのＴステムのみ、またはＴステムとＤアームの両方を修飾した。このために、前述したｉｎ ｖｉｖｏ翻訳系を使用した。グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および野生型ＧＦＰ（ＰＴＣを持たない）の翻訳を対照として使用した。
Ｔステムを修飾したｔＲＮＡをＴＳ１（ＳＥＱ ＩＤ番号：４２）およびＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４３）と名付け、Ｔステムに加えてＤアームも修飾したｔＲＮＡをＤＴＳ１（ＳＥＱ ＩＤ番号：４４）およびＤＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４５）と名付けた。
ＴＳ１（ＳＥＱ ＩＤ番号：４２）；下線：アンチコドン；太字：Ｔステム
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＵＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵＧＣＣＣＵＵＣＧＡＵＵＧＧＧＣＡＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＵＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵＧＣＣＣＵＵＣＧＡＵＵＧＧＧＣＡＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４３）；下線：アンチコドン；太字：Ｔステム
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＵＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＵＵＣＣＣＣＵＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＵＣＡＧＡＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＵＵＣＣＣＣＵＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＤＴＳ１（ＳＥＱ ＩＤ番号：４４）；下線：アンチコドン；太字：Ｔステム；イタリック：Ｄアーム
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵＧＣＣＣＵＵＣＧＡＵＵＧＧＧＣＡＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＵＧＣＣＣＵＵＣＧＡＵＵＧＧＧＣＡＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＤＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４５）；下線：アンチコドン；太字：Ｔステム；イタリック：Ｄアーム
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＵＵＣＣＣＣＵＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＧＧＧＧＣＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＵＵＣＡＧＡＧＣＣＧＣＧＡＧＡＣＡＧＧＧＧＵＵＣＧＡＵＵＣＣＣＣＵＣＣＧＣＵＣＣＡＣＣＡ
ＴステムがＡＧＧＧＧ（位置４９～５３、ｔＲＮＡ規則に従って番号付け）およびＣＣＣＣＵ（位置６１～６５、ｔＲＮＡ規則に従って番号付け）のヌクレオチド配列、すなわち以下のＴステム構造
３’－ＵＣＣＣＣ－５’
５’－ＡＧＧＧＧ－３’
を持つよう修飾したｔＲＮＡ ＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４３）は、読み飛ばしを示した（図４のＴＳ２参照）。ＡＧＧＧＧ配列の３’末端にあるＧとＵＣＣＣＣ配列の５’末端にあるＣとの間にＴループが存在することになる点に注意する必要がある。したがって、対応するＴアームは、構造５’－ＡＧＧＧＧ－（Ｔループ）－ＣＣＣＣＵ－３’を有することになる。
３’－ＵＣＣＣＣ－５’
５’－ＡＧＧＧＧ－３’
を持つよう修飾したｔＲＮＡ ＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４３）は、読み飛ばしを示した（図４のＴＳ２参照）。ＡＧＧＧＧ配列の３’末端にあるＧとＵＣＣＣＣ配列の５’末端にあるＣとの間にＴループが存在することになる点に注意する必要がある。したがって、対応するＴアームは、構造５’－ＡＧＧＧＧ－（Ｔループ）－ＣＣＣＣＵ－３’を有することになる。
ｔＲＮＡ本体の他の構造を修飾した場合の、翻訳の読み飛ばしに対する影響を試験するために、Ｔステムを修飾した前述のｔＲＮＡ（ＴＳ１およびＴＳ２）をさらに修飾し、Ｄアームを大腸菌ｔＲＮＡProのＤ領域と置き換えた。修飾したｔＲＮＡは、ＤＴＳ１（ＳＥＱ ＩＤ番号：４４）およびＤＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４５）と名付けた。ＴステムとＤアームを修飾したｔＲＮＡ ＤＴＳ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４５）は、Ｔステムのみを修飾したｔＲＮＡよりも高い読み飛ばしを促進した（図４のＤＴＳ２参照）。
ＣＦＴＲにおけるＹ１０９２Ｘ変異を修正するためにｔＲＮＡLeuを使用。
ＣＦＴＲ遺伝子の位置３２７６にあるＣをＡまたはＧに変化させて得た、修飾したｔＲＮＡLeuを使用して、ＣＦＴＲにおけるＹ１０９２Ｘ変異を修正した。
天然ＣＦＴＲ配列：ＴＴＧＴＡＣＣＴＧ
変異配列（Ｃ３２７６Ａ）：ＴＴＧＴＡＡＣＴＧ
ＣＦＴＲ遺伝子の位置３２７６にあるＣをＡまたはＧに変化させて得た、修飾したｔＲＮＡLeuを使用して、ＣＦＴＲにおけるＹ１０９２Ｘ変異を修正した。
天然ＣＦＴＲ配列：ＴＴＧＴＡＣＣＴＧ
変異配列（Ｃ３２７６Ａ）：ＴＴＧＴＡＡＣＴＧ
アンチコドンループに配列ＣＡＧＵＵＡのアンチコドンタンデムを有する修飾したｔＲＮＡを設計するために、天然ｔＲＮＡLeu（ＳＥＱ ＩＤ番号：１参照）をテンプレートとして使用した。設計したｔＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでロイシン（Ｌｅｕ）でアミノアシル化できた。ロイシル－ｔＲＮＡシンテターゼの同一性要素は変化しなかった。
設計したｔＲＮＡが翻訳系で機能するかを試験するために、２つの蛍光タンパク質、すなわち黄色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）とｍＣｈｅｒｒｙで挟んだ変異ＣＦＴＲ配列（ＵＵＧＵＡＡＣＵＧ）を含む短配列を有するサンドイッチ構造を使用した。終止コドンを含まないＣＦＰを、修復する遺伝子の一部（ここでは変異Ｙ１０２９Ｘ近くのＣＦＴＲ）であり、かつ終止コドンを含む１１ヌクレオチド長を挿入して拡張した。ｔＲＮＡアンチコドンループは、６個の連続するヌクレオチドに対合するために、相応に拡張した。終止コドンを含む挿入の後、（アミノ酸Ｍｅｔをコードする）最初のコドンなしにｍＣｈｅｒｒｙをクローン化し、それにより、ｍＣｈｅｒｒｙの非依存的翻訳が起こり得ないようにした。バイシストロニックレポーター系では、ＣＦＰは常に変異の終止コドンまで発現されるのに対し、ｍＣｈｅｒｒｙは読み飛ばしが行われたときのみ発現される。この発現は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）装置またはウェスタンブロットで検出できる。挿入のないプラスミドを対照として使用した。
ＨｅＬａ細胞におけるｔＲＮＡ抑制を調べるために、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）および１％グルタミン（ＧＩＢＣＯ）を補充したＤＭＥＭ培地で、３７℃、５％ＣＯ2でＨｅＬａ細胞を維持した。コトランスフェクションの前日に、６ウェルプレートに約２００，０００個の細胞を播種した。トランスフェクション混合物は、ｐＥＣＧＦＰ－Ｃ１主鎖でクローン化したＣＦＰ－ＰＴＣ－ｍＣｈｅｒｒｙをコード化する６００ｎｇレポータープラスミド、１５０ｎｇサプレッサーｔＲＮＡ、２００μＬ ＯｐｔｉＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）の５μＬ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ６７９ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を含んでいた。細胞はトランスフェクション混合物を用いて６時間インキュベートした。その後、培地を新鮮培地と交換した。２４時間後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ Ｃａｌｉｂｕｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で解析した。解析は、５００００イベントをカウントし、ＦＳＣ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｅ００および１．６０ Ａｍｐ Ｇａｉｎで、ＣＦＰの検出には波長４００ｎｍ、ｍＣｈｅｒｒｙの検出には５２０ｎｍを用いて実施した。
以下のｔＲＮＡ変異体（下線はアンチコドンタンデム）を試験した（表３も参照）。
ｔＲ－Ｌ１（ＳＥＱ ＩＤ番号：４６）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４７）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＡＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ３＝ｔＲＮＡ Ｌｅｕ 設計１．１（ＳＥＱ ＩＤ番号：３）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ４（ＳＥＱ ＩＤ番号：４８）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＧＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ５（ＳＥＱ ＩＤ番号：４９）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＡＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ６（ＳＥＱ ＩＤ番号：５０）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＵＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＣＣＵＣＡＧＵＵＡＵＧＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ８＝ｔＲＮＡ Ｌｅｕ 設計１．２（ＳＥＱ ＩＤ番号：４）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＵＣＡＧＵＵＡＧＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲ－Ｌ９＝ｔＲＮＡ Ｌｅｕ 設計１．４（ＳＥＱ ＩＤ番号：６）
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ＧＵＣＡＧＧＡＵＧＧＣＣＧＡＧＵＧＧＵＣＵＡＡＧＧＣＧＣＣＡＧＡＣＵＣＡＧＵＵＡＵＵＣＵＧＧＵＣＵＣＣＧＧＡＵＧＧＡＧＣＧＵＧＧＧＵＵＣＧＡＡＵＣＣＣＡＣＵＵＣＵＧＡＣＡＣＣＡ
ｔＲＮＡ変異体の配列はＳＥＱ ＩＤ番号：３、４、６、４６～５０で示され、表３の１０ｎｔアンチコドンループの配列はＳＥＱ ＩＤ番号：５１～５３で表される。
修飾したｔＲＮＡはすべて、読み飛ばしについて試験した（図５参照）。もっとも有望なｔＲＮＡは、大幅に読み飛ばし、ｍＣｈｅｒｒｙを検出するｔＲＬ９（Ｔ９、図５Ｄ、下のグラフ、ＳＥＱ ＩＤ番号：６）であった。さらに、アンチコドンループの全長が９ｎｔで、アンチコドンタンデムの位置が非対称のとき、もっとも効果的であった。
Claims (14)
- ｍＲＮＡ上の２つの連続する３塩基コドンに塩基対合するよう構成された２つの連続する３塩基アンチコドンを含む拡張アンチコドンループを有する合成転移ＲＮＡであって、
２つの連続する３塩基アンチコドン塩基のうちの一方が、ｍＲＮＡ上の３塩基終止コドンに塩基対合するよう構成され、前記２つの連続する３塩基アンチコドンのうちの他方が、前記ｍＲＮＡ上の３塩基終止コドンに隣接する３塩基コドン塩基に塩基対合するよう構成され、
前記合成転移ＲＮＡは、翻訳系におけるｍＲＮＡの読み取りを変化させるサプレッサーｔＲＮＡであり、
前記アンチコドンループが９ヌクレオチドからなり、
前記アンチコドンループの３’末端の６塩基が２つの連続する３塩基アンチコドン塩基である
ことを特徴とする合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡがアミノアシル化されている
請求項１に記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡがジペプチドでアミノアシル化されている
請求項２に記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡに関して５’－３’方向に、第１のＴステム配列、Ｔループ、および第２のＴステム配列からなるＴアームを有し、前記第２のＴステム配列が前記第１のＴステム配列に相補的である合成転移ＲＮＡにおいて、前記第１のＴステム配列がヌクレオチド配列ＡＧＧＧＧを有し、かつ第２のＴステム配列がヌクレオチド配列ＣＣＣＣＵを有する
請求項１ないし３のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記合成転移ＲＮＡは、ＳＥＱ ＩＤ番号：３１の配列ＧＣＧＣＡＧＣＣＵＧＧＵＡＧＣＧＣを有するＤアームを含む
請求項１ないし４のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記合成転移ＲＮＡが、
ａ）ＳＥＱ ＩＤ番号：０６、もしくは０９～１７に従った配列のうちの１つ、またはｂ）ＳＥＱ ＩＤ番号：０６、もしくは０９～１７に従った配列のうちの１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、またはｃ）上記ａ）もしくはｂ）の配列であって、前記ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている配列を有する、または含む
請求項１ないし５のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡが、ａ）ＡＣＵＣＡＧＵＵＡからなる配列、またはｂ）上記ａ）の配列であって、前記ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている配列を含むアンチコドンループを有する
請求項１ないし６のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記アンチコドンループに隣接するアンチコドンステムのヌクレオチドが、Ｇ－ＣまたはＣ－Ｇ対を形成する
請求項１ないし７のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 薬剤として使用するための
請求項１ないし８のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - ｍＲＮＡの翻訳を早期停止させるナンセンス変異に少なくとも部分的に起因する疾患における薬剤として使用するための
請求項１ないし８のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、神経線維腫症１型、またはハーラー症候群を治療する薬剤として使用するための
請求項１ないし８のいずれかに記載の合成転移ＲＮＡ。 - 嚢胞性線維症を治療する薬剤として使用するための、請求項１１に記載の合成転移ＲＮＡであって、前記拡張アンチコドンループの前記２つの連続する３塩基アンチコドンが配列ＣＡＧＵＵＡを有する
ことを特徴とする合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡが、ａ）ＡＣＵＣＡＧＵＵＡからなる配列を含むアンチコドンループ、またはｂ）上記ａ）の配列のうちの１つを含むアンチコドンループであって、前記ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられているアンチコドンループを有する
請求項１２に記載の合成転移ＲＮＡ。 - 前記転移ＲＮＡが、ａ）ＳＥＱ ＩＤ番号：６の配列、またはｂ）ＳＥＱ ＩＤ番号：６の配列であって、前記ヌクレオチドの少なくとも１つが、対応する修飾ヌクレオチドに置き換えられている配列を含む
請求項１３に記載の合成転移ＲＮＡ。
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