JP7577791B2 - メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーｓｔａｍｐ－ｅｐ８及びその応用 - Google Patents
メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーｓｔａｍｐ－ｅｐ８及びその応用 Download PDFInfo
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Description
本発明は、疾患診断用マーカー分野に関わり、より具体的に、本発明は、メチル化修飾に基づく腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ）及びその応用に関わる。
腫瘍が遺伝病であるという考えは、何十年もの間当分野で根強く残っている。人々の数回の体系的な大規模シーケンスにより、癌組織における体細胞変異の数が、予想よりも大幅に少ないことが確認され、これらの結果は、癌が単純な遺伝病ではないことを示唆している。
腫瘍診断を達成するために、近年、多くの新しい腫瘍マーカーが発見され、臨床診断に使用されている。１９８０年以前は、腫瘍マーカーは主にホルモン、酵素、タンパク質などの細胞分泌物であり、例えば、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、アルファフェトプロテイン抗原（ＡＦＰ）などは、胃がんや肝臓がんなどの多くの腫瘍のマーカーであり、炭水化物抗原１２５（ＣＡ１２５）は子宮頸癌のマーカーとして使用でき、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は前立腺癌マーカーとして使用でき；このような腫瘍マーカーはまだ臨床で使用されているが、その感度と精度は臨床ニーズを満たすのが困難である。
ますます多くの証拠が、エピジェネティック調節の小さな変化が、腫瘍において重要な役割を果たすことを示している。エピジェネティクスとは、遺伝子のＤＮＡ配列を変更せずに、遺伝子機能における遺伝可能な変化、及び最終的にもたらされた表現型の変化を研究する学科である。エピジェネティクスには、主にＤＮＡメチル化（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ））、ヒストン修飾（ｈｉｓｔｏｎｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、マイクロＲＮＡレベルの変化などの生化学的プロセスが含まれる。エピジェネティクス機構の一つであるＤＮＡメチル化とは、生体内で、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ、ＤＭＴ）の触媒作用下で、Ｓ－アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）をメチルドナーとし、メチル基を特定の塩基に転移させるプロセスを指す。哺乳類では、ＤＮＡメチル化は主に５’－ＣｐＧ－３’のＣで発生し、５－メチルシトシン（５ｍＣ）を生成する。
リキッドバイオプシー技術は、血液中の循環腫瘍細胞または循環腫瘍ＤＮＡを検出標的として使用する腫瘍を診断および予測する技術である。当該技術は、多くの欠点がある：まず、感度と特異性は十分に高くない；腫瘍自体は非常に不均一で、複数のサブタイプの細胞集団が含まれている；臨床サンプル、特に血液サンプルでは、腫瘍ＤＮＡの割合は非常に小さく、既存の腫瘍マーカーが臨床ニーズの感度を満たすことが難しく、臨床で誤診を引き起こしやすい；次、一つのマーカーは一つまたは少数の腫瘍にしか効かなく、血液中のＤＮＡの由来は非常に複雑であるため、既存の腫瘍マーカーは複雑な腫瘍の発生源と転移に対処できない。これらの複雑な状況があるため、多くのＤＮＡメチル化腫瘍マーカーが臨床応用で使用される際に統一の基準を有し難くなり、マーカーの感度と精度にひどく影響を及す。
本発明者らの以前の研究では、メチル化修飾に基づくいくつかの腫瘍マーカーが発見されたが、腫瘍診断のためのより多くの手段を提供するために、より多くの新しい腫瘍マーカーを見つける必要がある。
本発明の目的としては、ＤＮＡメチル化修飾を腫瘍マーカーとして使用し、腫瘍の特異性サイトで異常な高メチル化を利用して腫瘍を検出する方法を提供することである。
本発明の第一の様態では、（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；（ｂ） （ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイト（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）が存在するもの；及び／又は（ｃ） 上記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸（例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド）を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。
一つの好ましい例では、上記の修飾が、５－メチル化修飾、５－ヒドロキシメチル化修飾、５－ホルミル化修飾又は５－カルボキシル化修飾を含む。
別の好ましい例では、（ｂ）には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントに中、以下のものが存在する：２０４～２２３位（０２１～０２４号メチル化サイトを含む）塩基；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１～４７８位塩基（００１～０４０号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の５１３～１０４０位塩基（０４１～０７７号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１０８２～１６０２位塩基（０７８～１１４号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１６２１～２１１７位塩基（１１５～１５３号メチル化サイトを含む）；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の２１６０～２７００位塩基（１５４～１９１号メチル化サイトを含む）。
本発明の第二の様態では、上記のポリヌクレオチドから転換される、前記の第一の様態の配列と対応する単離されたポリヌクレオチドを提供し、ただし、修飾されたＣｐＧサイトのシトシンＣが変化しなく、未修飾のシトシンがＴ又はＵに転換する。
一つの好ましい例では、それが、バイサルファイトで処理される前記第一の様態と対応するポリヌクレオチドから転換されてなる。もう一つの好ましい例では、上記のポリヌクレオチドが、（ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチド；（ｅ） 上記（ｄ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつその中に少なくとも１個の修飾されたＣｐＧサイト（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）が存在するものを含む。
別の好ましい例では、（ｅ）には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントに、以下のものが存在する：２０４～２２３位（０２１～０２４号メチル化サイトを含む）塩基；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１～４７８位塩基（００１～０４０号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の５１３～１０４０位塩基（０４１～０７７号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１０８２～１６０２位塩基（０７８～１１４号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の１６２１～２１１７位塩基（１１５～１５３号メチル化サイトを含む）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又は２の２１６０～２７００位塩基（１５４～１９１号メチル化サイトを含む）；２４７８～２４９７位（０２１～０２４号メチル化サイトと対応する）塩基；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の２２２３～２７００位塩基（００１～０４０号メチル化サイトと対応する）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の１６６１～２１８８位塩基（０４１～０７７号メチル化サイトと対応する）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の１０９９～１６１９位塩基（０７８～１１４号メチル化サイトと対応する）；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の５８４～１０８０位塩基（１１５～１５３号メチル化サイトと対応する）；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４又は３の１～５４１位塩基（１５４～１９１号メチル化サイトと対応する）。
本発明の第三の様態では、腫瘍検出用の試薬又はキットを調製するための、前記の第一の様態又は第二の様態に記載されたポリヌクレオチドの用途を提供する。
一つの好ましい例では、上記の腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むが、これらに限定されない。
もう一つの好ましい例では、上記の腫瘍のサンプルが、組織サンプル、パラフィン包埋サンプル、血液サンプル、胸水サンプル、肺胞洗浄液サンプル、腹水および洗浄液サンプル、胆汁サンプル、便サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、喀痰サンプル、脳脊髄液サンプル、細胞塗抹サンプル、子宮頸部塗抹サンプルまたはブラシサンプル、組織および細胞生検サンプルを含むが、これらに限定されない。
本発明の第四の様態では、腫瘍検出試薬を調製する方法を提供し、上記の方法が、以下を含む：前記第一の様態又は第二の様態に記載されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出する検出試薬をデザインする；ただし、上記の標的配列には、少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在する；好ましくに、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含むが、これらに限定されない。
本発明の第五の様態では、標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出する試薬又は組み合わせた試薬を提供し、ただし、上記の標的配列とは、前記第一の様態又は第二の様態のいずれか一つに記載されたポリヌクレオチドの全長又はフラグメントであり、少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）の修飾されたＣｐＧサイトが存在する。
一つの好ましい例では、上記の試薬又は組み合わせた試薬が、上記の標的配列を含む遺伝子配列を標的とし（上記の遺伝子配列に基づきデザインされ）、上記の遺伝子配列が、遺伝子パネル又は遺伝子グループを含む。
もう一つの好ましい例では、上記の検出試薬が、プライマー、プローブを含む。
もう一つの好ましい例では、上記のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と４に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７と８に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と１０に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と１２に示されたプライマー；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３と１４に示されたプライマー；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５と１６に示されたプライマーである。
本発明の第六の様態では、腫瘍検出用のキットを調製するための、前記の第五の様態に記載された試薬又は組み合わせた試薬の用途を提供する；好ましくに、上記の腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などの血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんなどの婦人科および生殖器系の腫瘍；食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんなどの消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫などの呼吸器系腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫などの神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんなどの頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんなどの泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんなどの皮膚および他のシステム腫瘍を含むが、これらに限定されない。
本発明の第七の様態では、容器、及び容器に位置する前記の試薬又は試薬の組み合わせを含む検出キットを提供する；好ましくに、各試薬は別々の容器に位置する。
一つの好ましい例では、上記のキットは、さらに、バイサルファイト、ＤＮＡ精製試薬、ＤＮＡ抽出試薬、ＰＣＲ増幅試薬及び／又はユーザーマニュアル（検出操作ステップと結果判定標準を表示するもの）を含む。
本発明の第八の様態では、（ｉ）試料を提供し、核酸を抽出すること；（ｉｉ）（ｉ）の核酸における標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を検出し、上記の標的配列は、前記の第一の様態に記載されたポリヌクレオチド又はこれから転換されてなる前記の第二の様態に記載されたポリヌクレオチドであることを含む、生体外で試料のメチル化プロファイルを検出する方法を提供する。
一つの好ましい例では、ステップ（３）には、分析する方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化チップ法、ｑＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンス法、３世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、又はそれらの組み合わせ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示された配列における一部又は全部のメチル化サイトの組み合わせた遺伝子グループの生体外での検出方法及び生体内トレーサー検出方法を含む。また、他のメチル化検出方法及び将来の新たに開発されるメチル化検出方法も本発明に適用できる。
もう一つの好ましい例では、ステップ（ｉｉ）が、（１）その中の未修飾のシトシンがウラシルに転化するように（ｉ）の産物を処理する；好ましくに、上記の修飾が、５－メチル化修飾、５－ヒドロキシメチル化修飾、５－ホルミル化修飾又は５－カルボキシル化修飾を含む；好ましくに、バイサルファイトでステップ（ｉ）に記載された核酸を処理すること；（２）（１）で処理された核酸における上記の標的配列の修飾状況を分析すること；を含む。
もう一つの好ましい例では、上記のメチル化プロファイル異常とは、当該ポリヌクレオチドＣｐＧにおけるＣが、高度にメチル化されることを意味する。
もう一つの好ましい例では、上記のメチル化プロファイルの方法は、疾患の診断結果を直接取得することを目的としたものではなく、診断的な方法ではない。
本発明の第九の様態では、本発明の第一の様態又は第二の様態に示された配列に基づきデザインされたプライマーペアと、当該配列を含む遺伝子パネル又は遺伝子グループとを含み、ＤＮＡメチル化状態の検出によって、正常細胞と腫瘍細胞の特徴を得る腫瘍診断キットを提供する。
本文に開示された内容に基づき、当業者にとって、本発明の他の面は自明なものである。
本発明者らが、腫瘍マーカーの研究に取り組んだ結果として、広範な研究とスクリーニングによって、汎用なＤＮＡメチル化腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ（Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔｕｍｏｒ Ａｌｉｇｎｅｄ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ）を提供し、ＳＴＡＭＰは、正常組織では低メチル化状態にあり、腫瘍組織では高メチル化状態にあり、臨床腫瘍の検出や腫瘍診断試薬のデザインの基礎として使用できる。
用語
本明細書で使用される場合、「単離」とは、物質をその元の環境から単離することを指す（天然物質である場合、元の環境は自然環境である）。例えば、生細胞において、自然状態にあるポリヌクレオチドとポリペプチドは、単離・精製されないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然状態で共存する他の物質から単離される場合、それは単離・精製されるものである。
本明細書で使用される場合、「単離」とは、物質をその元の環境から単離することを指す（天然物質である場合、元の環境は自然環境である）。例えば、生細胞において、自然状態にあるポリヌクレオチドとポリペプチドは、単離・精製されないが、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドが自然状態で共存する他の物質から単離される場合、それは単離・精製されるものである。
本明細書で使用される場合、「サンプル」または「試料」は、任意の個体または単離された組織、細胞、または体液（血漿など）から得られる、ＤＮＡメチル化状態の検出に適した物質を含む。例えば、示されたサンプルが、組織サンプル、パラフィン包埋サンプル、血液サンプル、胸水サンプル、肺胞洗浄液サンプル、腹水および洗浄液サンプル、胆汁サンプル、便サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、脳脊髄液サンプル、細胞塗抹サンプル、子宮頸部塗抹サンプルまたはブラシサンプル、組織および細胞生検サンプルを含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「高（度）メチル化」は、遺伝子配列におけるＣｐＧの高度的なメチル化、ヒドロキシメチル化、ホルミル化またはカルボキシル化修飾の存在を指す。たとえば、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）分析法の観点から、メチル化特異的プライマーを使用したＰＣＲ反応では、陽性のＰＣＲ結果が得られると、テスト対象のＤＮＡ（遺伝子）領域が高メチル化状態にあることを意味する。例えば、リアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲの場合、高メチル化状態の判定は、コントロール試料のメチル化状態の相対値に基づく統計的差異について分析することができる。
遺伝子マーカー
腫瘍を診断するために有用な標的を見つけるために、本発明者らは、広範囲で詳細な研究を行い、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８という標的を確定した。ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８遺伝子配列領域のメチル化状態が、腫瘍組織と非腫瘍組織では有意差があるので、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８遺伝子配列領域には異常な高メチル化状態の存在を検出すると、当該受検者が、がんのハイリスクグループであることを判定できる。さらに、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８によって提示される腫瘍組織と非腫瘍組織の間の有意差が、固形腫瘍と非固形腫瘍を含むさまざまな種類の腫瘍に広範に存在する。
腫瘍を診断するために有用な標的を見つけるために、本発明者らは、広範囲で詳細な研究を行い、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８という標的を確定した。ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８遺伝子配列領域のメチル化状態が、腫瘍組織と非腫瘍組織では有意差があるので、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８遺伝子配列領域には異常な高メチル化状態の存在を検出すると、当該受検者が、がんのハイリスクグループであることを判定できる。さらに、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８によって提示される腫瘍組織と非腫瘍組織の間の有意差が、固形腫瘍と非固形腫瘍を含むさまざまな種類の腫瘍に広範に存在する。
そして、本発明が、単離されたポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １と逆相補する配列）に示されたヌクレオチド配列を有し、腫瘍細胞において、当該ポリヌクレオチド配列の複数箇所の５’－ＣｐＧ－３’の塩基Ｃポジションに、５－メチルシトシン（５ｍＣ）が生成される。本発明が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドのフラグメントであって、かつ少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）のメチル化ＣｐＧサイトが存在するものも含む。上記のポリヌクレオチド又はフラグメントは、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。
本発明のいくつかの具体的な実施例には、上記のポリヌクレオチドのフラグメントは、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２８１～３０９位塩基を含むフラグメント（０１７～０２０号ＣｐＧサイトを含有するもの）である。上記のフラグメントのアンチセンス鎖も使用することができる。これらのフラグメントは、本発明の好ましい実施形態の例である；本発明によって提供される情報によれば、他のフラグメントも選択することができる。
なお、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２に示されたヌクレオチド配列又は配列フラグメントを含む遺伝子パネル又は遺伝子グループも本発明に含まれる。上記の遺伝子パネル又は遺伝子グループに対して、ＤＮＡメチル化状態の検出によって、正常細胞と腫瘍細胞の特徴も得る。
上記のポリヌクレオチドは、メチル化状態を分析するためのゲノムの重要な領域として使用することができ、それらのメチル化状態は、当技術分野で既知された様々な技術によって分析することができる。メチル化状態を分析するために使用することができる任意の技術を本発明に適用することができる。
上記のポリヌクレオチドをバイサルファイトで処理した後に、メチル化されないシトシンは、ウラシルに転化され、メチル化されたシトシンは、変化しない。
そして、本発明が、上記ポリヌクレオチド（それと相補する鎖（アンチセンス鎖）を含む）をバイサルファイトで処理して得るポリヌクレオチドも提供し、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されたヌクレオチド配列のポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、検出試薬又は検出キットのデザインに用いられても良い。
本発明が、上記ポリヌクレオチド又はそのアンチセンス鎖をバイサルファイトで処理して得るポリヌクレオチドのフラグメントも含み、ただし、少なくとも１個（例えば２～１９１個、より具体的に３、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、９０、１１０、１３０、１５０、１７０、１８０、１９０個）のメチル化ＣｐＧサイトが存在する。センス鎖に対応するアンチセンス鎖の各ＣｐＧサイトの番号は、本発明によって提供される内容に従って容易に得られる。
検出試薬とキット
本発明の新たな発見に基づき、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するための、ポリヌクレオチド配列に基づいてデザインされた検出試薬も提供する。本分野に既知された確定なゲノムの配列、その変異とメチル化状態の検出方法と試薬は、いずれも本発明に適用できる。
本発明の新たな発見に基づき、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するための、ポリヌクレオチド配列に基づいてデザインされた検出試薬も提供する。本分野に既知された確定なゲノムの配列、その変異とメチル化状態の検出方法と試薬は、いずれも本発明に適用できる。
そして、本発明が、腫瘍検出試薬を調製する方法を提供し、以下を含む：上記のポリヌクレオチドを提供し、上記のポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列を特異的に検出する検出試薬をデザインする；ただし、上記の標的配列には、少なくとも１個のメチル化ＣｐＧサイトが存在する。
本発明に記載された検出試薬が、プライマー、プローブなどを含むが、これらに限定されない。
上記の試薬は、例えばプライマーペアであり、ポリヌクレオチドの配列を知っている場合、プライマーのデザインは当業者に既知されたものであり、２つのプライマーが、増幅される標的遺伝子の特定の配列の両側に隣接している（ＣｐＧ配列を含み、その中のＣｐＧと相補するのは、元のメチル化された遺伝子領域を標的とするものであり、その中のＴｐＧと相補するのは、元の脱メチル化された遺伝子領域を標的とするものである）。本発明の新たな発見によれば、上記の標的配列の異なる位置にあるＣｐＧサイトまたはそれらの組み合わせについて、当業者は、様々なプライマーまたはプローブまたは他のタイプの検出試薬をデザインすることができ、これらは、本発明の技術案に含まれることを理解すべきである。本発明の好ましい実施例では、上記のプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の００１～０４０号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５と６に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の０４１～０７７号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７と８に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の０７８～１１４号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ９と１０に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の１１５～１５３号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１と１２に示されたプライマー；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の１５４～１９１号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １３と１４に示されたプライマー；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の０２１－０２４号ＣｐＧサイトを含む増幅産物を得られるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １５と１６に示されたプライマー。
上記の試薬は、試薬の組み合わせ（プライマー組み合わせ）であっても良く、複数グループのプライマーを含み、複数の上記ポリヌクレオチドを別々に増幅することができる。
本発明が、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出するキットも提供し、当該キットが、容器、及び容器に位置する上記のプライマーペアを含む。
また、上記のキットには、さらに、ＤＮＡの抽出、ＤＮＡの精製、ＰＣＲ増幅などに必要な様々な試薬も含んでも良い。
さらに、上記のキットは、当業者の使用を便利にするための、検出操作ステップおよび結果判断基準を示すユーザーマニュアルを含むことができる。
検出方法
ポリヌクレオチドのメチル化プロファイルは、既存の技術（例えばメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）またはリアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲ、Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ）、または開発中と開発予定の他の技術によって測定することができる。
ポリヌクレオチドのメチル化プロファイルは、既存の技術（例えばメチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）またはリアルタイム定量的メチル化特異的ＰＣＲ、Ｍｅｔｈｙｌｉｇｈｔ）、または開発中と開発予定の他の技術によって測定することができる。
定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を使用して、メチル化レベルを検出することもできる。この方法は、ＭＳＰ法よりも感度の高い、蛍光ＰＣＲの連続光学モニタリングに基づくものである。それが高いスループットを有し、かつその結果を分析するための電気泳動の使用を避ける。
他の使用できる技術は、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、ｑＰＣＲ法、次世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、及び組み合わせた遺伝子グループ検出法などの、当技術分野の通常方法がある。本発明の新たな開示に基づいて、当技術分野で公知されたこれらの技術ならびに開発しようとする技術は、いずれも本発明に適用できることを理解すべきである。
本発明の好ましい様態として、生体外で試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出する方法も提供する。上記の方法は、以下の原理に基づくものである：バイサルファイトは、メチル化されていないシトシンをウラシルに変換でき、その後のＰＣＲ増幅プロセスでチミンに変換されるが、メチル化されたシトシンは変化しない；したがって、ポリヌクレオチドをバイサルファイトで処理した後、メチル化されたサイトには、Ｃ／Ｔのようなポリヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が生成される。上記の原理に基づいて試料におけるポリヌクレオチドのメチル化プロファイルを検出すると、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを効果的に区別できる。
本発明に記載された方法が、以下を含む：（ａ）試料を提供し、ゲノムＤＮＡを抽出する；（ｂ）バイサルファイトでステップ（ａ）のゲノムＤＮＡを処理し、ゲノムＤＮＡにおけるメチル化されていないシトシンをウラシルに転化する；（ｃ）ステップ（ｂ）で処理されたゲノムＤＮＡにメチル化プロファイル異常の存在の有無を分析する。
本発明の方法は、（ｉ）受験者の試料に検出を行い、受験者が腫瘍を罹患しているかどうかを分析すること；（ｉｉ）腫瘍のハイリスクグループを区別することに用いられても良い。上記の方法は、直接的な疾患診断結果を得ることを目的としない状況でもあり得る。
本発明の好ましい実施例において、ＤＮＡメチル化は、ＰＣＲ増幅およびパイロシーケンシングによって検出されるが、当業者は、実際の応用には、当該方法に限定されず、他のＤＮＡメチル化検出方法も可能であることを理解すべきである。ＰＣＲ増幅に使用されるプライマーは、実施例で提供されるものに限定されない。
ゲノムＤＮＡはバイサルファイトで処理された後に、メチル化されていないシトシンはウラシルに変換され、その後のＰＣＲプロセスでチミンに変換されることが、ゲノムの配列の複雑さを軽減するので、ＰＣＲによる特定の標的フラグメントの増幅がより困難になる。したがって、好ましくに、ネステッドＰＣＲ増幅を採用し、外周と内周に２ペアのプライマーをデザインし、２回のＰＣＲ増幅反応を行ってもよく、１回目の増幅産物を２回目の増幅のテンプレートとして使用し、増幅の効率と特異性を効果的に改善することができる。しかしながら、本発明で利用可能な検出方法はこれに限定されないことを理解すべきである。
臨床サンプルに関する研究および検証によって、本発明の方法は、臨床腫瘍の診断に使用される場合、非常に高い精度を有する。本発明は、腫瘍補助診断、治療効果判断、予後モニタリングなどの分野に適用することができ、高い臨床応用価値を有する。
以下、具体的な実施例を参照して、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の単なる例示であることが理解されるべく。以下の実施例における特定の条件を特定しない実験方法は、通常に、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ、２００２に記載された通常条件に従って実施され、或いはメーカーが推奨する条件に従って実施される。
実施例１：ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８の検出に関わる核酸配列
本発明者らは、研究とスクリーニングを繰り返した後に、腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ－ＥＰ８を得、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １（ｃｈｒ８：２３５６２４７６－２３５６５１７５，Ｈｕｍａｎ／ｈｇ１９）に示された；ただし、下線が引かれた塩基はメチル化されたＣｐＧサイトであり、下線が引かれた数字はそのサイトの番号を示す。
本発明者らは、研究とスクリーニングを繰り返した後に、腫瘍マーカーＳＴＡＭＰ－ＥＰ８を得、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １（ｃｈｒ８：２３５６２４７６－２３５６５１７５，Ｈｕｍａｎ／ｈｇ１９）に示された；ただし、下線が引かれた塩基はメチル化されたＣｐＧサイトであり、下線が引かれた数字はそのサイトの番号を示す。
バイサルファイトで処理された上記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の通りである（ただし、ＹはＣまたはＵを表す）：
上記ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列の逆相補配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の通りである：
バイサルファイトで処理された上記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３配列は以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の通りである（ただし、ＹはＣまたはＵを表す）：
実施例２：腫瘍細胞株と非腫瘍細胞株の間のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８ ＣｐＧサイトのメチル化の違いーＢＳＰ－バイサルファイトシーケンシングＰＣＲ（ＢＳＰ－Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＰＣＲ）
当該バイサルファイトシーケンシングＰＣＲのステップは、以下に示された：
１． 肺がん細胞株Ａ５４９および正常な肺細胞株ＭＲＣ５からゲノムＤＮＡを抽出した；
２． 肺がん細胞株Ａ５４９及び正常な肺細胞株ＭＲＣ５から抽出されたゲノムＤＮＡをそれぞれバイサルファイトで処理し、その後のＰＣＲ増幅のテンプレートとした；
３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の配列に従って増幅プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～１４）を表１に示されるようにデザインし、増幅を行った。
４． ＰＣＲ増幅後、２％アガロースゲル電気泳動でＰＣＲフラグメントの特異性を検出し、ゲルを切断して標的フラグメントを回収し、Ｔベクターをライゲートして挿入し、コンピテント大腸菌を形質転換し、プレートに塗り広げ、２日目に、シーケンスのためにクローンを選択し、サンガーシーケンスのために各フラグメントから１０個を超えるクローンを選択した。
当該バイサルファイトシーケンシングＰＣＲのステップは、以下に示された：
１． 肺がん細胞株Ａ５４９および正常な肺細胞株ＭＲＣ５からゲノムＤＮＡを抽出した；
２． 肺がん細胞株Ａ５４９及び正常な肺細胞株ＭＲＣ５から抽出されたゲノムＤＮＡをそれぞれバイサルファイトで処理し、その後のＰＣＲ増幅のテンプレートとした；
３． ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の配列に従って増幅プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～１４）を表１に示されるようにデザインし、増幅を行った。
４． ＰＣＲ増幅後、２％アガロースゲル電気泳動でＰＣＲフラグメントの特異性を検出し、ゲルを切断して標的フラグメントを回収し、Ｔベクターをライゲートして挿入し、コンピテント大腸菌を形質転換し、プレートに塗り広げ、２日目に、シーケンスのためにクローンを選択し、サンガーシーケンスのために各フラグメントから１０個を超えるクローンを選択した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における００１－０４０メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図１に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における０４１－０７７メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図２に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における０７８－１１４メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図３に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における１１５－１５３メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図４に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の区域における１５４－１９１メチル化サイトの肺がん細胞と正常肺細胞とのメチル化レベルのＢＳＰ検証結果は、図５に示され、肺がん細胞のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルは、著しく正常肝細胞より高いことを示した。
実施例３：腫瘍細胞株と非腫瘍細胞株の間のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８ ＣｐＧサイトのメチル化の違い－パイロシーケンス法（ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
当該パイロシーケンス法のステップは、以下に示された：
１． 臨床サンプルの入手：臨床からパラガングリオーマ／非癌性－癌組織サンプルを得、パラガングリオーマ／非癌性サンプルをコントロールグループとし、癌組織サンプルを腫瘍検出実験グループとした；
２． ＤＮＡの抽出：それぞれに実験グループとコントロールグループのＤＮＡを抽出した；この実験では、フェノール－クロロホルム抽出法を使用したが、この方法に限定されない；
３． バイサルファイトの処理：抽出されたＤＮＡサンプルをバイサルファイトで処理し、手順に厳密に従った；この実験では、ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＥＺＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ、アイテム番号Ｄ５００６を使用したが、このキットに限定されない；
４． プライマーのデザイン：ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８配列とするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の特徴に基づき、ＰＣＲ増幅プライマーとパイロシーケンスプライマーをデザインした；０２１－０２４号ＣｐＧサイトのメチル化値を検出し、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化値の代表として、ＰＣＲプライマー増幅配列、パイロシーケンスプライマー配列、パイロシーケンスマシン検出配列及び検出サイトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５～１８に示された（表２）；
５． ＰＣＲ増幅とアガロースゲル電気泳動：バイサルファイトで処理されたサンプルをＰＣＲのテンプレートとして使用し、ＰＣＲ増幅を行い、増幅産物は、ＰＣＲ増幅の特異性を特定するためにアガロースゲル電気泳動によって特定された；
６． パイロシーケンシング：ＱＩＡＧＥＮ会社のＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＩＤパイロシーケンサーで検出し、ユーザーマニュアルのステップに従って厳密に操作した；
７． ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値の計算：パイロシーケンシングは、標的領域の各ＣｐＧサイトのメチル化値を独立に検出することができる；サンプル中のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値として、すべてのＣｐＧサイトの平均メチル化値を計算した；
８． 結果の分析：パラガングリオーマ／非癌性コントロールグループと、腫瘍実験グループとのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化値を比較した。
当該パイロシーケンス法のステップは、以下に示された：
１． 臨床サンプルの入手：臨床からパラガングリオーマ／非癌性－癌組織サンプルを得、パラガングリオーマ／非癌性サンプルをコントロールグループとし、癌組織サンプルを腫瘍検出実験グループとした；
２． ＤＮＡの抽出：それぞれに実験グループとコントロールグループのＤＮＡを抽出した；この実験では、フェノール－クロロホルム抽出法を使用したが、この方法に限定されない；
３． バイサルファイトの処理：抽出されたＤＮＡサンプルをバイサルファイトで処理し、手順に厳密に従った；この実験では、ＺＹＭＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＥＺＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－Ｇｏｌｄ Ｋｉｔ、アイテム番号Ｄ５００６を使用したが、このキットに限定されない；
４． プライマーのデザイン：ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８配列とするＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の特徴に基づき、ＰＣＲ増幅プライマーとパイロシーケンスプライマーをデザインした；０２１－０２４号ＣｐＧサイトのメチル化値を検出し、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化値の代表として、ＰＣＲプライマー増幅配列、パイロシーケンスプライマー配列、パイロシーケンスマシン検出配列及び検出サイトは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ １５～１８に示された（表２）；
５． ＰＣＲ増幅とアガロースゲル電気泳動：バイサルファイトで処理されたサンプルをＰＣＲのテンプレートとして使用し、ＰＣＲ増幅を行い、増幅産物は、ＰＣＲ増幅の特異性を特定するためにアガロースゲル電気泳動によって特定された；
６． パイロシーケンシング：ＱＩＡＧＥＮ会社のＰｙｒｏＭａｒｋ Ｑ９６ ＩＤパイロシーケンサーで検出し、ユーザーマニュアルのステップに従って厳密に操作した；
７． ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値の計算：パイロシーケンシングは、標的領域の各ＣｐＧサイトのメチル化値を独立に検出することができる；サンプル中のＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値として、すべてのＣｐＧサイトの平均メチル化値を計算した；
８． 結果の分析：パラガングリオーマ／非癌性コントロールグループと、腫瘍実験グループとのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化値を比較した。
実施例４：白血病－臨床サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた８例の非白血病骨髄スミアサンプルをコントロールグループとし、８例の白血病骨髄スミアサンプルを実験グループとし、上記実施例３のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルを比較した。
臨床から得られた８例の非白血病骨髄スミアサンプルをコントロールグループとし、８例の白血病骨髄スミアサンプルを実験グループとし、上記実施例３のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルを比較した。
結果は、図６に示されたように、白血病臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しく非癌性組織より高い。
実施例５：乳がん－臨床サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた５例の乳がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、５例の乳がん組織サンプルを実験グループとし、上記実施例３のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルを比較した。
臨床から得られた５例の乳がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、５例の乳がん組織サンプルを実験グループとし、上記実施例３のパイロシーケンスステップによって、コントロールグループと実験グループのＳＴＡＭＰ－ＥＰ８メチル化レベルを比較した。
結果は図７に示されたように、乳がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。
実施例６：結腸直腸がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた８例の結腸直腸がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、８例の結腸直腸がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた８例の結腸直腸がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、８例の結腸直腸がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
結果は図８に示されたように、結腸直腸がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。
実施例７：食道がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた１０例の食道がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、１０例の食道がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた１０例の食道がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、１０例の食道がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
結果は図９に示されたように、食道がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。
実施例８：肝臓がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた８例の肝臓がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、８例の肝臓がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた８例の肝臓がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、８例の肝臓がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
結果は図１０に示されたように、肝臓がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。
実施例９：肺がん－臨床症例サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた４例の肺がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、４例の肺がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた４例の肺がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、４例の肺がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
結果は図１１に示されたように、肺がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。
実施例１０：膵臓がん－臨床サンプルの検証－パイロシーケンス法
臨床から得られた４例の膵臓がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、４例の膵臓がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
臨床から得られた４例の膵臓がんパラガングリオーマサンプルをコントロールグループとし、４例の膵臓がんサンプルを実験グループとし、実施例３のパイロシーケンスステップによって、ＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化レベルを分析した。
結果は図１２に示されたように、膵臓がん臨床サンプルにおいて、実験グループにおけるＳＴＡＭＰ－ＥＰ８のメチル化値は、著しくパラガングリオーマ組織より高い。
本出願に言及されている全ての参考文献は、参照として単独に引用されるように、本出願に引用されて、参照になる。理解すべきことは、本発明の上記の開示に基づき、当業者は、本発明を様々な変更または修正を行っても良い、これらの同等の形態も本出願に添付された請求の範囲に規定される範囲内に含まれる。
Claims (18)
- 腫瘍検出用の試薬を調製する方法であって、
単離されたポリヌクレオチドを提供するステップ（ｉ）であって、
前記単離されたポリヌクレオチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 前記（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメント；及び／又は
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸；
を含む、ステップ（ｉ）と、
前記ポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを標的配列とし、当該標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出する検出試薬をデザインし、前記標的配列には、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメントが存在するステップ（ｉｉ）と、
を含み、
前記修飾は、５－メチル化修飾であり、
前記腫瘍検出用の試薬は、複数の腫瘍を検出できる、
方法。 - 前記複数の腫瘍は、
食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんを含む消化器系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんを含む婦人科および生殖器系の腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む血液系腫瘍;肺がん、胸膜腫を含む呼吸器系腫瘍;神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫を含む神経系腫瘍;口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんを含む頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんを含む泌尿器系腫瘍;皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんを含む皮膚および他の系の腫瘍からなる群から選択される、
請求項１に記載の方法。 - 前記検出試薬が、プライマーを含み、
前記プライマーは、
SEQ ID NO:５に示されたプライマーとSEQ ID NO:６に示されたプライマー；
SEQ ID NO:７に示されたプライマーとSEQ ID NO:８に示されたプライマー；
SEQ ID NO:９に示されたプライマーとSEQ ID NO:１０に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１１に示されたプライマーとSEQ ID NO:１２に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１３に示されたプライマーとSEQ ID NO:１４に示されたプライマー；又は
SEQ ID NO:１５に示されたプライマーとSEQ ID NO:１６に示されたプライマーである、
請求項１または２に記載の方法。 - 前記ステップ（ｉ）において、修飾されたＣｐＧサイトのシトシンＣが変化せず、未修飾のシトシンがＴ又はＵに変換されるように、前記単離されたポリヌクレオチドを処理することをさらに含むことを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- （ｄ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｅ） 前記（ｄ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４若しくは３の２４７８～２４９７位、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４若しくは３の２２２３～２７００位に示される配列からなるフラグメント；
を含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。 - 腫瘍検出用の試薬又はキットの調製における、単離されたポリヌクレオチドのCpGサイトのメチル化プロファイルを検出する試薬の使用であって、
前記単離されたポリヌクレオチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されたヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 前記（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメント；及び／又は
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸；
を含み、
前記単離されたポリヌクレオチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメントが存在し、
前記腫瘍検出用の試薬は、複数の腫瘍を検出でき、前記複数の腫瘍は、
食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんを含む消化器系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんを含む婦人科および生殖器系の腫瘍；白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む血液系腫瘍;肺がん、胸膜腫を含む呼吸器系腫瘍;神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫を含む神経系腫瘍;口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんを含む頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんを含む泌尿器系腫瘍;皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんを含む皮膚および他の系の腫瘍からなる群から選択される、
使用。 - 前記検出用の試薬が、プライマーを含み、
前記プライマーは、
SEQ ID NO:５に示されたプライマーとSEQ ID NO:６に示されたプライマー；
SEQ ID NO:７に示されたプライマーとSEQ ID NO:８に示されたプライマー；
SEQ ID NO:９に示されたプライマーとSEQ ID NO:１０に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１１に示されたプライマーとSEQ ID NO:１２に示されたプライマー；
SEQ ID NO:１３に示されたプライマーとSEQ ID NO:１４に示されたプライマー；又は
SEQ ID NO:１５に示されたプライマーとSEQ ID NO:１６に示されたプライマーである、ことを特徴とする請求項６に記載の使用。 - 前記腫瘍のサンプルが、組織サンプル、パラフィン包埋サンプル、血液サンプル、胸水サンプル、肺胞洗浄液サンプル、腹水および洗浄液サンプル、胆汁サンプル、便サンプル、尿サンプル、唾液サンプル、喀痰サンプル、脳脊髄液サンプル、細胞塗抹サンプル、子宮頸部塗抹サンプルまたはブラシサンプル、組織および細胞生検サンプルを含むことを特徴とする請求項６又は７に記載の使用。
- 前記検出試薬が、プローブを含む、請求項１または２に記載の方法。
- 標的配列のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出し、前記標的配列において、ポリヌクレオチドの全長又はフラグメントを含むことを特徴とするＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬であって、
前記ポリヌクレオチドは、
（ａ） ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ） 前記（ａ）のポリヌクレオチドのフラグメントであって、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメント；及び／又は
（ｃ） 前記（ａ）又は（ｂ）のポリヌクレオチド又はフラグメントと相補する核酸；
を含み、
単離された前記ポリヌクレオチドには、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １の２０４～２２３位または１～４７８位に示される配列からなるフラグメントが存在し、
前記検出用の試薬が、プライマーを含み、
前記プライマーは、
SEQ ID NO:5に示されたプライマーとSEQ ID NO:6に示されたプライマー;
SEQ ID NO:7に示されたプライマーとSEQ ID NO:8に示されたプライマー;
SEQ ID NO:9に示されたプライマーとSEQ ID NO:10に示されたプライマー;
SEQ ID NO:11に示されたプライマーとSEQ ID NO:12に示されたプライマー;
SEQ ID NO:13に示されたプライマーとSEQ ID NO:14に示されたプライマー;又は
SEQ ID NO:15に示されたプライマーとSEQ ID NO:16に示されたプライマーであり、
前記修飾は、５－メチル化修飾である、
ＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬。 - 前記検出用の試薬又は組み合わせた試薬が、前記標的配列を含む遺伝子配列を標的とし、前記遺伝子配列が、遺伝子パネル又は遺伝子グループを含むことを特徴とする請求項１０に記載のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬。
- 前記検出用の試薬又は組み合わせた試薬が、プローブをさらに含むことを特徴とする請求項１０に記載のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬。
- 腫瘍検出用のキットを調製するための請求項１０～１２のいずれか一つに記載のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬の使用。
- 前記腫瘍が、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫を含む血液系腫瘍；乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、外陰がん、精巣がん、前立腺がん、陰茎がんを含む婦人科および生殖器系の腫瘍；食道がん、胃がん、結腸直腸がん、肝臓がん、膵臓がん、胆管がん、胆嚢がんを含む消化器系腫瘍；肺がん、胸膜腫を含む呼吸器系腫瘍；神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫を含む神経系腫瘍；口腔がん、舌がん、喉頭がん、鼻咽頭がんを含む頭頸部がん；腎臓がん、膀胱がんを含む泌尿器系腫瘍、皮膚がん、黒色腫、骨肉腫、脂肪肉腫、甲状腺がんを含む腫瘍、を含む、請求項１３に記載の使用。
- 容器、及び容器に収納される請求項１０～１２のいずれか一つに記載のＣｐＧサイトの修飾状況を特異的に検出するための腫瘍検出用の試薬又は組み合わせた試薬
を含むことを特徴とする検出キット。 - 前記CpGサイトの修飾状況を分析するステップ（ｉｉｉ）
をさらに含む、請求項１～５のいずれか一つに記載の方法。 - 前記ステップ（ｉｉｉ）において、前記CpGサイトの修飾状況がメチル化であり、前記メチル化の状況を分析し、
前記分析する方法が、パイロシーケンス法、バイサルファイトシーケンス法、メチル化チップ法、ｑＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンス法、３世代シーケンス法、全ゲノムメチル化シーケンス法、ＤＮＡ濃縮検出法、Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ＲＲＢＳ）技術、ＨＰＬＣ法、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、メチル化特異的ＰＣＲ、又はそれらの組み合わせ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示された配列における一部又は全部のメチル化サイトの組み合わせた遺伝子グループの生体外での検出方法及び生体内トレーサー検出方法を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。 - 前記ステップ（ｉｉ）が、
（１）ステップ（ｉ）の産物における未修飾のシトシンがウラシルに変換するようにバイサルファイトで前記ステップ（ｉ）の産物を処理すること；
（２）（１）で処理された核酸における前記標的配列の修飾状況を分析すること；
を含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
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