JP7502858B2 - Polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity and use thereof - Google Patents
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Description
本発明は４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド及びその利用に関する。 The present invention relates to a polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity and its use.
ポリベンズオキサゾール（ＰＢＯ）は耐熱性や力学強度に優れたエンジニアリングプラスチックとして知られており、繊維材料及び半導体素子の絶縁膜等に利用される（非特許文献１）。 Polybenzoxazole (PBO) is known as an engineering plastic with excellent heat resistance and mechanical strength, and is used in textile materials and insulating films for semiconductor elements (Non-Patent Document 1).
ベンズオキサゾール骨格はｏ－アミノフェノール骨格とカルボン酸との縮合により生成される。そのため、これらの官能基を分子内に有する４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（４，３－ＡＨＢＡ）類はＰＢＯモノマーとして有用であると期待される。実際に、４，３－ＡＨＢＡを用いたポリベンズオキサゾールの合成と物性評価が検討されている（非特許文献２）。 The benzoxazole skeleton is produced by condensation of an o-aminophenol skeleton with a carboxylic acid. Therefore, 4-amino-3-hydroxybenzoic acids (4,3-AHBA) containing these functional groups in the molecule are expected to be useful as PBO monomers. In fact, the synthesis and property evaluation of polybenzoxazole using 4,3-AHBA has been investigated (Non-Patent Document 2).
近年、地球環境負荷軽減等に向けて再生可能資源を原料とした微生物発酵による化合物の製造方法が注目されている。例えば、４，３－ＡＨＢＡと類似した構造を有する３－アミノ－４－ヒドロキシ安息香酸（３，４－ＡＨＢＡ）の微生物による生産とポリマー化の検討が行われている（特許文献１）。 In recent years, methods for producing compounds by microbial fermentation using renewable resources as raw materials have been attracting attention in an effort to reduce the burden on the global environment. For example, the microbial production and polymerization of 3-amino-4-hydroxybenzoic acid (3,4-AHBA), which has a structure similar to 4,3-AHBA, has been investigated (Patent Document 1).
４，３－ＡＨＢＡの製造に関してはこれまで化学的にニトロ芳香族を還元し合成する方法等が知られている（特許文献２）。微生物法による４，３－ＡＨＢＡ発酵生産を可能にする方策としては、微生物内での生合成が可能な４－アミノ安息香酸（４－ＡＢＡ）の３位を水酸化することが考えられるが、このような反応に関しては、一部の４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素がわずかに活性を有することが報告されているのみであった（非特許文献３，４）。 Methods for producing 4,3-AHBA that have been known up until now include chemical synthesis through reduction of nitroaromatics (Patent Document 2). One possible way to enable fermentative production of 4,3-AHBA using a microbial method is to hydroxylate the 3-position of 4-aminobenzoic acid (4-ABA), which can be biosynthesized in microorganisms, but it has only been reported that some 4-hydroxybenzoate hydroxylases have slight activity in this type of reaction (Non-Patent Documents 3 and 4).
本発明は、優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供することに関する。 The present invention relates to providing a polypeptide having excellent 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity and a method for using the same.
本発明者らは、特定のアミノ酸配列を有する４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素の変異体が、優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有し、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造に有用であることを見出した。 The present inventors have discovered that a mutant of 4-hydroxybenzoate hydroxylase having a specific amino acid sequence has excellent 4-aminobenzoate hydroxylation activity and is useful for producing 4-amino-3-hydroxybenzoic acids.
すなわち、本発明は以下の１）～７）に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンである、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
３）配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
４）１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
５）４）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）６）の形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
That is, the present invention relates to the following 1) to 7).
1) A polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto, the amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, is phenylalanine.
2) A method for producing a mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, which comprises substituting an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, with phenylalanine, in a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity.
3) A method for improving 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, comprising substituting an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with phenylalanine.
4) A polynucleotide encoding the polypeptide of 1).
5) A vector or DNA fragment containing the polynucleotide of 4).
6) A transformed cell containing the vector or DNA fragment of 5).
7) A method for producing 4-amino-3-hydroxybenzoic acids, comprising the step of culturing the transformed cell of 6).
本発明の４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドは優れた４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することから、これを用いることにより、４－アミノ安息香酸類から効率よく４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を製造することができる。 The polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity of the present invention has excellent 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity, and therefore, by using it, 4-amino-3-hydroxybenzoic acids can be efficiently produced from 4-aminobenzoic acids.
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In this specification, the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis using the Search homology program of the genetic information processing software GENETYX Ver. 12 with a unit size to compare (ktup) of 2.
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。 In this specification, the "corresponding position" on an amino acid sequence or a nucleotide sequence can be determined by aligning a target sequence with a reference sequence (e.g., the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) to maximize homology. Alignment of amino acid sequences or nucleotide sequences can be performed using known algorithms, and the procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J.D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which are revised versions of Clustal W, can be used. Clustal W, Clustal W2, and Clustal omega are available, for example, on the websites of the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]) operated by the National Institute of Genetics. The position of the target sequence aligned to any position of the reference sequence by the above-mentioned alignment is considered to be a "position corresponding to" that any position.
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。 Those skilled in the art can further fine-tune the alignment of the amino acid sequences obtained above to optimize it. Such an optimal alignment is preferably determined taking into consideration the similarity of the amino acid sequences, the frequency of gaps to be inserted, and the like. Here, the similarity of the amino acid sequences refers to the percentage (%) of the number of positions at which identical or similar amino acid residues exist in both sequences when the two amino acid sequences are aligned, relative to the total number of amino acid residues. Similar amino acid residues refer to amino acid residues that have similar properties in terms of polarity and charge among the 20 types of amino acids that make up proteins, and that cause so-called conservative substitutions. Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art, and examples thereof include, but are not limited to, arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; leucine and isoleucine.
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。 In this specification, "amino acid residue" refers to the 20 types of amino acid residues that make up proteins: alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W), tyrosine (Tyr or Y), and valine (Val or V).
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。 As used herein, "operably linked" between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked in such a way that the gene can be expressed under the control of the control region. The procedure for "operably linked" between a gene and a control region is well known to those skilled in the art.
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。 In this specification, "upstream" and "downstream" in relation to a gene refer to the upstream and downstream in the transcription direction of the gene. For example, "a gene located downstream of a promoter" means that the gene is present on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand, and "upstream" of a gene means the region on the 5' side of the gene in the DNA sense strand.
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。 As used herein, the term "native" when referring to a function, property, or trait of a cell is used to indicate that the function, property, or trait is inherently present in the cell. In contrast, the term "exogenous" is used to indicate a function, property, or trait that is not inherently present in the cell, but is introduced from outside. For example, a "exogenous" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that is introduced into a cell from outside. An exogenous gene or polynucleotide may be from the same organism as the cell into which it is introduced, or from a different organism (i.e., a heterologous gene or polynucleotide).
＜４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド＞
本発明の４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド（「本発明のポリペプチド」と称す）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンであるポリペプチドである。
斯かるポリペプチドは、基準となるポリペプチド、すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドである。
<Polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity>
The polypeptide of the present invention having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity (referred to as the "polypeptide of the present invention") is a polypeptide which, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto, has a phenylalanine amino acid residue at position 201 or 222, or at a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2.
Such a polypeptide is a mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence of SEQ ID NO:2, which is a reference polypeptide, i.e., a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto, is substituted with phenylalanine.
本発明において、「４－アミノ安息香酸水酸化活性」とは、４－アミノ安息香酸類の水酸化を触媒する活性、好ましくは４－アミノ安息香酸類の３位の水酸化を触媒する活性を意味する。
４－アミノ安息香酸水酸化活性は、後述する実施例に示すとおり、本発明のポリペプチドを産生する微生物を培養し、生成する４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸量をＨＰＬＣ等により測定することによって決定することができる。
In the present invention, the term "4-aminobenzoic acid hydroxylation activity" means the activity of catalyzing the hydroxylation of 4-aminobenzoic acids, preferably the activity of catalyzing the hydroxylation at the 3-position of 4-aminobenzoic acids.
As shown in the Examples below, the 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity can be determined by culturing a microorganism that produces the polypeptide of the present invention and measuring the amount of 4-amino-3-hydroxybenzoic acid produced by HPLC or the like.
斯かる本発明のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換することにより製造できる。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドは、本発明のポリペプチドの「親」ポリペプチドである。
「親」ポリペプチドは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、本発明のポリペプチドとなる基準ポリペプチドを指す。
The polypeptide of the present invention consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and has 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, and can be produced by substituting an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with phenylalanine.
Here, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity is the "parent" polypeptide of the polypeptide of the present invention.
A "parent" polypeptide refers to a reference polypeptide in which certain amino acid residues are made to result in a polypeptide of the invention.
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９２０２６２．１）からなるポリペプチドであるＨＦＭ１２２は、４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１３．２）として知られている。４－ヒドロキシ安息香酸－３－モノオキシゲナーゼは、４－ヒドロキシ安息香酸の３位を水酸化してプロトカテク酸を生成する反応とその逆反応のいずれかまたは両方を促進する触媒活性を有する酵素であり、４－ヒドロキシ安息香酸類の水酸化を触媒する酵素（４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素）の一種である。
斯かるＨＦＭ１２２は、本出願人により、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有することが見出されている（特願２０１８－１７１８４９）。
In the present invention, HFM122, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 (NCBI Reference Sequence: WP_010920262.1), is known as 4-hydroxybenzoate-3-monooxygenase (EC1.14.13.2). 4-Hydroxybenzoate-3-monooxygenase is an enzyme having catalytic activity to promote either or both of a reaction in which the 3-position of 4-hydroxybenzoic acid is hydroxylated to produce protocatechuic acid and a reverse reaction, and is a type of enzyme (4-hydroxybenzoate hydroxylase) that catalyzes the hydroxylation of 4-hydroxybenzoic acids.
The present applicant has found that HFM122 has 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity (Patent Application No. 2018-171849).
配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも５１％の同一性、具体的には、５１％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドが挙げられる。具体的には、例えば、ＨＦＭ３８８（配列番号４：配列番号２とのアミノ酸配列同一性は６２％、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿０１０９７６２８３．１）、ＨＦＭ３３９（配列番号６：配列番号２とのアミノ酸配列同一性は６１％、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＷＰ＿０１１１５７２８７．１）、ＨＦＭ７７（配列番号８：配列番号２とのアミノ酸配列同一性は５１％、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ： ＷＰ＿０１１０８９１６０．１）等が挙げられ、このうち、本発明のポリペプチドが有する４－アミノ安息香酸水酸化活性の点から、ＨＦＭ３８８、ＨＦＭ３３９が好ましい。
好適な「親」ポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列の他、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して、９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドが挙げられる。また、配列番号４、配列番号６若しくは配列番号８で示されるアミノ酸配列、又はこれらのそれぞれに対して９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドが挙げられる。
An example of a polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity and consisting of an amino acid sequence having at least 51% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is a polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity and consisting of an amino acid sequence having at least 51% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, specifically, 51% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more. Specific examples include HFM388 (SEQ ID NO:4: 62% amino acid sequence identity with SEQ ID NO:2, NCBI Reference Sequence: WP_010976283.1), HFM339 (SEQ ID NO:6: 61% amino acid sequence identity with SEQ ID NO:2, NCBI Reference Sequence: WP_011157287.1), and HFM77 (SEQ ID NO:8: 51% amino acid sequence identity with SEQ ID NO:2, NCBI Reference Sequence: WP_011089160.1), and among these, HFM388 and HFM339 are preferred in terms of the 4-aminobenzoate hydroxylation activity of the polypeptide of the present invention.
Suitable "parent" polypeptides include the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, as well as polypeptides having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity and consisting of an amino acid sequence having 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. Further examples include polypeptides having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity and consisting of an amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 8, or an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, more preferably 98% or more identity to each of these.
該親ポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置に何れもチロシン残基を有するものが好ましく、本発明のポリペプチドは当該２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異ポリペプチドがより好ましい。配列番号２の２０１位もしくは２２２位に相当する位置として、例えば、配列番号４の場合は２０１位と２２２位が、配列番号６の場合は２０１位と２２２位が、配列番号８の場合は２０３位と２２４位がそれらの位置に相当する。
従って、該親ポリペプチドは、配列番号４で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置に何れもチロシン残基を有するものが好ましく、本発明のポリペプチドは当該２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異ポリペプチドがより好ましい。
The parent polypeptide preferably has tyrosine residues at positions 201 or 222, or at positions corresponding to positions 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, and the polypeptide of the present invention is more preferably a mutant polypeptide in which tyrosine at positions 201 or 222, or at positions corresponding to positions 201 or 222, is replaced with phenylalanine. For example, positions corresponding to positions 201 or 222 of SEQ ID NO: 2 include positions 201 and 222 in SEQ ID NO: 4, positions 201 and 222 in SEQ ID NO: 6, and positions 203 and 224 in SEQ ID NO: 8.
Therefore, the parent polypeptide preferably has tyrosine residues at positions 201 or 222, or at positions corresponding to positions 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:4, and the polypeptide of the present invention is more preferably a mutant polypeptide in which the tyrosine at positions 201 or 222, or at positions corresponding to positions 201 or 222, is replaced with phenylalanine.
また該親ポリペプチドは、配列番号６で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置に何れもチロシン残基を有するものが好ましく、本発明のポリペプチドは当該２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異ポリペプチドがより好ましい。 The parent polypeptide preferably has tyrosine residues at positions 201 and 222, or at positions corresponding to positions 201 and 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:6, and the polypeptide of the present invention is more preferably a mutant polypeptide in which the tyrosine at positions 201 and 222, or at positions corresponding to positions 201 and 222, is replaced with phenylalanine.
また該親ポリペプチドは、配列番号８で示されるアミノ酸配列の２０３位若しくは２２４位、又は２０３位若しくは２２４位に相当する位置に何れもチロシン残基を有するものが好ましく、本発明のポリペプチドは当該２０３位若しくは２２４位、又は２０３位若しくは２２４位に相当する位置のチロシンをフェニルアラニンに置換した変異ポリペプチドがより好ましい。 The parent polypeptide preferably has tyrosine residues at positions 203 and 224, or at positions corresponding to positions 203 and 224, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:8, and the polypeptide of the present invention is more preferably a mutant polypeptide in which the tyrosine at positions 203 and 224, or at positions corresponding to positions 203 and 224, is replaced with phenylalanine.
＜本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド＞
本発明において、親ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
<Polynucleotides encoding the polypeptides of the present invention>
In the present invention, various mutagenesis techniques known in the art can be used as a means for mutating amino acid residues in a parent polypeptide. For example, in a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a parent polypeptide (hereinafter also referred to as a parent gene), a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be mutated is mutated to a nucleotide sequence encoding the amino acid residue after mutation, thereby obtaining a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。 The introduction of the desired mutation into the parent gene can basically be carried out using various site-specific mutagenesis methods well known to those skilled in the art. Site-specific mutagenesis can be carried out by any method, such as inverse PCR or annealing. Commercially available site-specific mutagenesis kits (e.g., QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit and QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene, etc.) can also be used.
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。 Site-specific mutagenesis in a parent gene can be most commonly performed using a mutagenesis primer containing the nucleotide mutation to be introduced. The mutagenesis primer can be designed to anneal to a region containing a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and to contain a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding the mutated amino acid residue instead of the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated. A person skilled in the art can appropriately recognize and select the nucleotide sequences (codons) encoding the amino acid residues before and after the mutation based on a typical textbook or the like. Alternatively, site-specific mutagenesis can be performed by a method in which DNA fragments obtained by amplifying the upstream and downstream sides of the mutation site using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced separately are linked together by SOE (splicing by overlap extension)-PCR (Gene, 1989, 77(1): pp. 61-68).
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述した４－ヒドロキシ安息香酸水酸化酵素を産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドとして既述したＨＦＭ１２２、ＨＦＭ３８８、ＨＦＭ３３９、ＨＦＭ７７をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号１、配列番号３、配列番号５及び配列番号７に示した。 Template DNA containing the parent gene can be prepared by extracting genomic DNA from the above-mentioned microorganism that produces 4-hydroxybenzoate hydroxylase in a conventional manner, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription. Alternatively, a corresponding nucleotide sequence can be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the parent polypeptide and used as template DNA. DNA sequences containing base sequences encoding HFM122, HFM388, HFM339, and HFM77, which have already been described as polypeptides having 4-aminobenzoate hydroxylation activity, are shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7, respectively.
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。 The mutation primer can be prepared by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4 research, 1989, 17: 7059-7071). Such primer synthesis can also be performed using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (such as that manufactured by ABI). A primer set including the mutation primer can be used to perform site-specific mutagenesis as described above using a parent gene as template DNA to obtain a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having the desired mutation.
当該本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。 The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention may comprise single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA, or other artificial nucleic acid. The DNA, cDNA, and RNA may be chemically synthesized. The polynucleotide may also comprise a nucleotide sequence of an untranslated region (UTR) in addition to an open reading frame (ORF). The polynucleotide may also be codon-optimized for the species of the transformant used to produce the mutant polypeptide of the present invention. Information on codons used by various organisms is available from the Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
<Vector or DNA fragment>
The obtained polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be incorporated into a vector. The vector containing the polynucleotide is an expression vector. Also preferably, the vector is an expression vector capable of introducing the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into a host microorganism and expressing the polynucleotide in the host microorganism. Preferably, the vector comprises the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and a control region operably linked thereto. The vector may be a vector capable of autonomously replicating and replicating outside a chromosome, such as a plasmid, or may be a vector that is integrated into a chromosome.
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。 Specific examples of vectors include pBluescript II SK(-) (Stratagene), pUC vectors such as pUC18/19 and pUC118/119 (Takara Bio), pET vectors (Takara Bio), pGEX vectors (GE Healthcare), pCold vectors (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), and pUB110 (Mckenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15(2):93-103), pBR322 (Takara Bio), pRS403 (Stratagene), pMW218/219 (Nippon Gene), pRI-based vectors such as pRI909/910 (Takara Bio), pBI-based vectors (Clontech), IN3-based vectors (Implanta Innovations), pPTR1/2 (Takara Bio), pDJB2 (D.J.Ballance et al., Gene, 36, 321-331, 1985), pAB4-1 (van Hartingsveldt W et al., Mol Gen Genet, 206, 71-75, 1987), pLeu4 (M.I.G.Roncero et al., al., Gene, 84, 335-343, 1989), pPyr225 (C.D.Skory et al., Mol Genet Genomics, 268, 397-406, 2002), pFG1 (Gruber, F. et al., Curr Genet, 18, 447-451, 1990), etc.
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、これを含むＤＮＡ断片として構築されていてもよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。 The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention may be constructed as a DNA fragment containing the polynucleotide. Examples of the DNA fragment include a PCR-amplified DNA fragment and a restriction enzyme-cleaved DNA fragment. Preferably, the DNA fragment may be an expression cassette containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and a control region operably linked thereto.
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカー（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）を有していてもよい。
上記ベクター又はＤＮＡ断片には、４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が含まれていてもよい。４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドとしては、例えば、４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ(4-amino-4-deoxychorismate synthase, pabAB)や４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼ(4-amino-4-deoxychorismate lyase, pabC)等が挙げられる。
The control region contained in the vector or DNA fragment is a sequence for expressing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention in a host cell into which the vector or DNA fragment has been introduced, and examples of such control regions include expression regulatory regions such as promoters and terminators, and replication origins. The type of the control region can be appropriately selected depending on the type of host microorganism into which the vector or DNA fragment is introduced. If necessary, the vector or DNA fragment may further have a selection marker such as an antibiotic resistance gene or an amino acid synthesis-related gene (e.g., a drug resistance gene such as ampicillin, neomycin, kanamycin, or chloramphenicol).
The vector or DNA fragment may contain a polynucleotide sequence encoding a polypeptide required for the biosynthesis of 4-aminobenzoic acids, such as 4-amino-4-deoxychorismate synthase (pabAB) or 4-amino-4-deoxychorismate lyase (pabC).
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと上記制御領域や、マーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ－ＰＣＲ法などの方法によって行うことができる。ベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御領域の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。 The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be linked to the above-mentioned control region or marker gene sequence by the above-mentioned SOE-PCR method or other method. The procedure for introducing a gene sequence into a vector is well known in the art. There are no particular limitations on the types of control regions such as promoter regions, terminators, and secretion signal regions, and promoters and secretion signal sequences that are commonly used can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
該制御領域の好適な例としては、野生型に比較して発現を強化できる強制御領域、例えば公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。 Suitable examples of the control region include strong control regions that can enhance expression compared to the wild type, such as well-known high expression promoters such as the T7 promoter, lac promoter, tac promoter, and trp promoter, but are not limited to these.
＜形質転換細胞＞
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
斯かる形質転換細胞は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞であり、当該ポリヌクレオチドの発現が強化された細胞、ひいては本発明のポリペプチドの発現が強化された細胞であると言える。
<Transformed cells>
The transformed cell of the present invention can be obtained by introducing a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into a host, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into the genome of the host.
Such transformed cells are cells into which a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention has been introduced so as to be expressible, and can be said to be cells in which expression of the polynucleotide has been enhanced, and ultimately cells in which expression of the polypeptide of the present invention has been enhanced.
宿主細胞としては、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌等、いずれを用いてもよいが、大腸菌、放線菌が好ましい。放線菌としては、コリネバクテリウム属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、プロピオニバクテリウム属菌等が挙げられ、好ましくはコリネバクテリウム属菌であり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである。
中でも、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となる４－アミノ安息香酸類を供給できる微生物が好ましく、４－アミノ安息香酸類の供給能が強化された微生物がより好ましい。微生物の４－アミノ安息香酸類の供給能を強化する方法としては、例えば、４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチド及びこれと作動可能に連結された制御領域を含むベクターを微生物に導入する方法や、微生物が本来有する４－アミノ安息香酸類を生合成するために必要なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの制御領域を強発現プロモーターに置換する方法などが挙げられる。
As the host cell, any of fungi, yeast, actinomycetes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc. may be used, but Escherichia coli and actinomycetes are preferred. Examples of actinomycetes include bacteria of the genus Corynebacterium, Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, and Propionibacterium, and are preferably bacteria of the genus Corynebacterium, and more preferably Corynebacterium glutamicum.
Among them, a microorganism capable of supplying 4-aminobenzoic acids serving as substrates for the biosynthesis of 4-amino-3-hydroxybenzoic acids is preferred, and a microorganism having enhanced ability to supply 4-aminobenzoic acids is more preferred. Examples of methods for enhancing a microorganism's ability to supply 4-aminobenzoic acids include a method of introducing into a microorganism a vector containing a polynucleotide encoding a polypeptide necessary for the biosynthesis of 4-aminobenzoic acids and a control region operably linked thereto, and a method of replacing the control region of a polynucleotide encoding a polypeptide necessary for the biosynthesis of 4-aminobenzoic acids that the microorganism originally possesses with a strong expression promoter.
宿主へのベクター又はＤＮＡ断片の導入の方法としては、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。 Methods for introducing a vector or DNA fragment into a host include, for example, electroporation, transformation, transfection, conjugation, protoplast, particle gun, and Agrobacterium methods.
また、ポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。該ＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め該ＤＮＡ断片と上述した制御領域とを作動可能に連結した断片を作製し、当該連結断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチドが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。 The method of introducing a polynucleotide into the genome of a host is not particularly limited, but may be, for example, a double crossover method using a DNA fragment containing the polynucleotide. The DNA fragment may be introduced downstream of the promoter sequence of a gene that is highly expressed in the host cell described above, or a fragment in which the DNA fragment and the above-mentioned control region are operably linked in advance may be prepared, and the linked fragment may be introduced into the genome of the host. Furthermore, the DNA fragment may be linked in advance to a marker (such as a drug resistance gene or an auxotrophy complementing gene) for selecting cells into which the polynucleotide of the present invention has been appropriately introduced.
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主微生物に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転換細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。 Transformed cells into which a vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected using a selection marker. For example, if the selection marker is an antibiotic resistance gene, transformed cells into which a vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected by culturing the transformed cells in a medium containing the antibiotic. For example, if the selection marker is an amino acid synthesis-related gene, transformed cells into which a vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected using the presence or absence of the amino acid requirement as an indicator after gene introduction into a host microorganism that requires the amino acid. Alternatively, introduction of the vector or DNA fragment of interest can be confirmed by examining the DNA sequence of the transformed cells using PCR or the like.
斯くして得られた形質転換細胞は、これを適切な培地で培養すれば、当該細胞に導入されたポリヌクレオチドが発現して、本発明のポリペプチドが生成される。すなわち、当該形質転換細胞は、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド産生菌となり得る。そして、後述する実施例に示すとおり、本発明の形質転換細胞を培養した場合、親ポリペプチドを産生する形質転換細胞を用いた場合に比べて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産性が向上する。
すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換する変異は、４－アミノ安息香酸水酸化活性向上に有用であり、ひいては４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産性の向上に有用である。
そして、本発明の形質転換細胞は、４－アミノ安息香酸水酸化活性が向上されたポリペプチドの産生菌であり、有用な４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産株である。
When the transformed cells thus obtained are cultured in an appropriate medium, the polynucleotide introduced into the cells is expressed, producing the polypeptide of the present invention. That is, the transformed cells can become bacteria that produce a polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity. As shown in the Examples below, when the transformed cells of the present invention are cultured, the productivity of 4-amino-3-hydroxybenzoic acid is improved compared to when a transformed cell that produces a parent polypeptide is used.
That is, in a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, a mutation in which an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substituted with phenylalanine is useful for improving 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity and, ultimately, for improving the productivity of 4-amino-3-hydroxybenzoic acids.
The transformed cell of the present invention is a bacterium capable of producing a polypeptide having improved 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity, and is a useful strain capable of producing 4-amino-3-hydroxybenzoic acids.
＜４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造＞
本発明の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法は、本発明の形質転換細胞を培養する工程を含み、培地中から４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を回収することにより４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を取得できる。
本発明において、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類としては、具体的には下記の一般式（１）：
<Production of 4-amino-3-hydroxybenzoic acids>
The method for producing 4-amino-3-hydroxybenzoic acids of the present invention comprises a step of culturing the transformed cell of the present invention, and 4-amino-3-hydroxybenzoic acids can be obtained by recovering the 4-amino-3-hydroxybenzoic acids from the medium.
In the present invention, the 4-amino-3-hydroxybenzoic acid is specifically represented by the following general formula (1):
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、臭素原子（－Ｂｒ）、ヨウ素原子（－Ｉ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、メチル基（－ＣＨ３）、エチル基（－ＣＨ２ＣＨ３）を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、アミノ基（－ＮＨ２）、フッ素原子（－Ｆ）、塩素原子（－Ｃｌ）、臭素原子（－Ｂｒ）、ヨウ素原子（－Ｉ）、カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）、メチル基（－ＣＨ３）又はエチル基（－ＣＨ２ＣＨ３）を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はヒドロキシ基であって少なくとも一方はヒドロキシ基を示す。〕
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体が挙げられる。
[In the formula, R 1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group (-OH), a methoxy group (-OCH 3 ), an amino group (-NH 2 ), a fluorine atom (-F), a chlorine atom (-Cl), a bromine atom (-Br), an iodine atom (-I), a carboxy group (-COOH), a methyl group (-CH 3 ), or an ethyl group (-CH 2 CH 3 ); R 2 represents a hydrogen atom, a hydroxy group (-OH), a methoxy group (-OCH 3 ), an amino group (-NH 2 ), a fluorine atom (-F), a chlorine atom (-Cl), a bromine atom (-Br), an iodine atom (-I), a carboxy group (-COOH), a methyl group (-CH 3 ), or an ethyl group (-CH 2 CH 3 ); and X 1 and X 2 represent a hydrogen atom or a hydroxy group, with at least one of them representing a hydroxy group.]
Examples of such a compound include 4-amino-3-hydroxybenzoic acid derivatives represented by the following formula:
Ｒ１で示される官能基としては、水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ２で示される官能基としては、水素原子、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、メトキシ基（－ＯＣＨ３）、フッ素原子（－Ｆ）又はメチル基（－ＣＨ３）が好ましい。
Ｒ１及びＲ２は、共に水素原子であるのがより好ましい。
また、Ｘ１及びＸ２は、共にヒドロキシ基であってもよいが、Ｘ１又はＸ２の何れか一方がヒドロキシ基であるのが好ましい。
The functional group represented by R 1 is preferably a hydrogen atom, a hydroxy group (-OH), a methoxy group (-OCH 3 ), a fluorine atom (-F) or a methyl group (-CH 3 ).
The functional group represented by R2 is preferably a hydrogen atom, a hydroxy group (-OH), a methoxy group (-OCH 3 ), a fluorine atom (-F) or a methyl group (-CH 3 ).
It is more preferable that R 1 and R 2 are both hydrogen atoms.
In addition, both X1 and X2 may be a hydroxy group, but it is preferable that either one of X1 or X2 is a hydroxy group.
なお、当該培地には、必要に応じて、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生合成の基質となる４－アミノ安息香酸類を存在させることができる。
ここで、４－アミノ安息香酸類としては、下記一般式（２）：
If necessary, 4-aminobenzoic acids, which serve as substrates for the biosynthesis of 4-amino-3-hydroxybenzoic acids, can be present in the medium.
Here, the 4-aminobenzoic acids include those represented by the following general formula (2):
〔式中、Ｒ１及びＲ２は前記と同じものを示す。〕
で示される４－アミノ安息香酸誘導体が挙げられる。
(In the formula, R1 and R2 are the same as defined above.)
Examples of such 4-aminobenzoic acid derivatives include those represented by the following formula:
形質転換細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の形質転換細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース等の糖類、グリセリン等のポリオール類、エタノール等のアルコール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、またはアンモニアもしくはその塩等を使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤等も必要に応じて使用してもよい。 The medium for culturing the transformed cells may be either a natural medium or a synthetic medium, as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and can efficiently culture the transformed cells of the present invention. Examples of carbon sources that can be used include sugars such as glucose, polyols such as glycerin, alcohols such as ethanol, and organic acids such as pyruvic acid, succinic acid, and citric acid. Examples of nitrogen sources that can be used include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolysate, alkaline extract of soybean meal, alkylamines such as methylamine, and ammonia or a salt thereof. Other salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and antifoaming agents may also be used as necessary.
培養は、通常、１０℃～４０℃で、６時間～７２時間、好ましくは９時間～６０時間、より好ましくは１２時間～４８時間、必要に応じ撹拌または振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 The culture is usually carried out at 10°C to 40°C for 6 to 72 hours, preferably 9 to 60 hours, and more preferably 12 to 48 hours, with stirring or shaking as necessary. During the culture, antibiotics such as ampicillin or kanamycin may be added to the medium as necessary.
培養物からの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。例えば、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すれば４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を取得することができる。培養物中に蓄積された４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類は、そのまま単離することなく用いてもよい。 The method for recovering and purifying 4-amino-3-hydroxybenzoic acids from the culture is not particularly limited. In other words, it can be carried out by combining well-known ion exchange resin methods, precipitation methods, crystallization methods, recrystallization methods, concentration methods, and other methods. For example, 4-amino-3-hydroxybenzoic acids can be obtained by removing the bacterial cells by centrifugation or the like, removing ionic substances with cation and anion exchange resins, and concentrating the mixture. The 4-amino-3-hydroxybenzoic acids accumulated in the culture may be used as is without isolation.
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンである、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
＜２＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチド。
＜３＞アミノ酸残基の置換がチロシンからフェニルアラニンへの置換である、＜２＞の変異ポリペプチド。
＜４＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
＜５＞アミノ酸残基の置換がチロシンからフェニルアラニンへの置換である、＜４＞の方法。
＜６＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換することを含む、４－アミノ安息香酸水酸化活性の向上方法。
＜７＞アミノ酸残基の置換がチロシンからフェニルアラニンへの置換である、＜６＞の方法。
＜８＞配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも５１％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドを用いて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を製造する場合において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換することを含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の生産性向上方法。
＜９＞アミノ酸残基の置換がチロシンからフェニルアラニンへの置換である、＜８＞の方法。
＜１０＞＜１＞～＜３＞のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜１１＞＜１０＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜１２＞＜１１＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜１３＞大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、＜１２＞記載の形質転換細胞。
＜１４＞４－アミノ安息香酸類を供給可能な微生物である、＜１２＞又は＜１３＞の形質転換細胞。
＜１５＞４－アミノ安息香酸類の供給能が向上した、＜１２＞又は＜１３＞の形質転換細胞。
＜１６＞＜１２＞～＜１５＞のいずれかの形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
＜１７＞炭素源として糖類を含む培地で培養される、＜１６＞の方法。
＜１８＞４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類を培地から回収する工程を含む、＜１６＞又は＜１７＞の方法。
＜１９＞培養が４－アミノ安息香酸類の存在下で行われる、＜１６＞～＜１８＞のいずれかの方法。
＜２０＞４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類が、下記の一般式（１）：
The present invention also includes the following substances, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments, but the present invention is not limited to these embodiments.
<1> A polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto, the amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, is phenylalanine.
<2> A mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto, is substituted with phenylalanine.
<3> The mutant polypeptide of <2>, wherein the amino acid residue substitution is a substitution of tyrosine with phenylalanine.
<4> A method for producing a mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, comprising substituting an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with phenylalanine, in a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity.
<5> The method according to <4>, wherein the amino acid residue substitution is a substitution of tyrosine with phenylalanine.
<6> A method for improving 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity of a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, the method comprising substituting an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with phenylalanine.
<7> The method according to <6>, wherein the amino acid residue substitution is a substitution of tyrosine with phenylalanine.
<8> A method for improving productivity of 4-amino-3-hydroxybenzoic acids, comprising substituting an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222, of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 with phenylalanine, when 4-amino-3-hydroxybenzoic acids are produced using a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 51% identity thereto and having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity.
<9> The method according to <8>, wherein the amino acid residue substitution is a substitution of tyrosine with phenylalanine.
<10> A polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of <1> to <3>.
<11> A vector or a DNA fragment comprising the polynucleotide of <10>.
<12> A transformed cell containing the vector or DNA fragment of <11>.
<13> The transformed cell according to <12>, which is Escherichia coli or a bacterium of the genus Corynebacterium.
<14> The transformed cell according to <12> or <13>, which is a microorganism capable of supplying 4-aminobenzoic acids.
<15> The transformed cell according to <12> or <13>, which has an improved ability to supply 4-aminobenzoic acids.
<16> A method for producing a 4-amino-3-hydroxybenzoic acid, comprising a step of culturing the transformed cell according to any one of <12> to <15>.
<17> The method according to <16>, wherein the culture is carried out in a medium containing a sugar as a carbon source.
<18> The method according to <16> or <17>, comprising a step of recovering 4-amino-3-hydroxybenzoic acids from the medium.
<19> The method according to any one of <16> to <18>, wherein the culture is carried out in the presence of a 4-aminobenzoic acid.
<20> 4-amino-3-hydroxybenzoic acids are represented by the following general formula (1):
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、又はエチル基を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はヒドロキシ基であって少なくとも一方はヒドロキシ基を示す。〕
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体である＜１６＞～＜１９＞のいずれかの方法。
＜２１＞４－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（２）：
[In the formula, R1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group; R2 represents a hydrogen atom or a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group; and X1 and X2 represent a hydrogen atom or a hydroxy group, with at least one of them representing a hydroxy group.]
The method according to any one of <16> to <19>, wherein the compound is a 4-amino-3-hydroxybenzoic acid derivative represented by the formula:
<21> 4-aminobenzoic acids are represented by the following general formula (2):
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子又はヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、又はエチル基を示す。〕
で示される４－アミノ安息香酸誘導体である＜１９＞又は＜２０＞の方法。
＜２２＞配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンである、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
＜２３＞配列番号４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチド。
＜２４＞配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号６で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンである、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
＜２５＞配列番号６で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号６で示されるアミノ酸配列の２０１位若しくは２２２位、又は２０１位若しくは２２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチド。
＜２６＞配列番号８で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号８で示されるアミノ酸配列の２０３位若しくは２２４位、又は２０３位若しくは２２４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンである、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチド。
＜２７＞配列番号８で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号８で示されるアミノ酸配列の２０３位若しくは２２４位、又は２０３位若しくは２２４位に相当する位置におけるアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する変異ポリペプチド。
＜２８＞変異ポリペプチドがアミノ酸残基の置換がチロシンからフェニルアラニンへの置換である、＜２２＞～＜２７＞の何れかに記載の変異ポリペプチド。
＜２９＞＜２２＞～＜２８＞のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜３０＞＜２９＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜３１＞＜３０＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜３２＞大腸菌又はコリネバクテリム属菌である、＜３０＞記載の形質転換細胞。
＜３３＞４－アミノ安息香酸類を供給可能な微生物である、＜３１＞又は＜３２＞の形質転換細胞。
＜３４＞４－アミノ安息香酸類の供給能が向上した、＜３１＞又は＜３２＞の形質転換細胞。
＜３５＞＜３１＞～＜３４＞のいずれかの形質転換細胞を培養する工程を含む、４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸類の製造方法。
[In the formula, R1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group, and R2 represents a hydrogen atom or a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group.]
The method according to <19> or <20>, wherein the compound is a 4-aminobenzoic acid derivative represented by the formula:
<22> A polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, wherein in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, the amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, is phenylalanine.
<23> A mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, is substituted with phenylalanine.
<24> A polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, wherein in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, the amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, is phenylalanine.
<25> A mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which an amino acid residue at position 201 or 222, or a position corresponding to position 201 or 222 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, is substituted with phenylalanine.
<26> A polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, wherein in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, the amino acid residue at position 203 or 224, or a position corresponding to position 203 or 224, of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is phenylalanine.
<27> A mutant polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylating activity, in which an amino acid residue at position 203 or 224, or a position corresponding to position 203 or 224 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, is substituted with phenylalanine.
<28> The mutant polypeptide according to any one of <22> to <27>, wherein the substitution of an amino acid residue in the mutant polypeptide is a substitution of tyrosine with phenylalanine.
<29> A polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of <22> to <28>.
<30> A vector or a DNA fragment comprising the polynucleotide of <29>.
<31> A transformed cell containing the vector or DNA fragment of <30>.
<32> The transformed cell according to <30>, which is Escherichia coli or a bacterium of the genus Corynebacterium.
<33> A transformed cell according to <31> or <32>, which is a microorganism capable of supplying 4-aminobenzoic acids.
<34> The transformed cell according to <31> or <32>, which has an improved ability to supply 4-aminobenzoic acids.
<35> A method for producing a 4-amino-3-hydroxybenzoic acid, comprising a step of culturing the transformed cell according to any one of <31> to <34>.
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these.
実施例１ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産
以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。
（１）野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
（ａ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣの作製
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２株から常法によって抽出されたゲノムを鋳型に、プライマーＧＮ１４＿１２７（配列番号９、TATTAATTAAATGCGCGTTTTAATTATTGATAATTATGATTC）とＧＮ１４＿１３３（配列番号１０、TTGCGGCCGCTTGTTTAAACCTCCTTACAGAAAAATGGTTGGGCG）を用いたＰＣＲにて４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が含まれたＤＮＡ断片を増幅し、これをプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ（特願２０１５－２５４９１参照）のＰａｃＩ部位とＮｏｔＩ部位の間に挿入することで、プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを得た。
Example 1 Production of 4-amino-3-hydroxybenzoic acid In the following examples, PCR was carried out using PrimeSTAR Max Premix (Takara Bio).
(1) Preparation of a plasmid containing a gene encoding a wild-type enzyme (a) Preparation of plasmid pECsf_gapS_pabABC Corynebacterium glutamicum A DNA fragment containing genes encoding 4-amino-4-deoxychorismate synthase and 4-amino-4-deoxychorismate lyase was amplified by PCR using primers GN14_127 (SEQ ID NO: 9, TATTAATTAAATGCGCGTTTTAATTATTGATAATTATGATTC) and GN14_133 (SEQ ID NO: 10, TTGCGGCCGCTTGTTTAAACCTCCTTACAGAAAAATGGTTGGGCG) with a genome extracted from C. glutamicum ATCC13032 strain by a conventional method as a template, and inserted between the PacI site and NotI site of plasmid pECsf_gapS (see Patent Application No. 2015-25491) to obtain plasmid pECsf_gapS_pabABC.
（ｂ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣを鋳型に、プライマーｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｒ（配列番号１１、AAATTTAAACCTCCTTTACAGAAAAATGGTTGG）とｐａｂＡＢＣｃｏｒｙ ｖｅｃ Ｆ（配列番号１２、GGAGGTTTAAACAAGCGGCCGCGATATC）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて４－アミノ安息香酸水酸化活性を有するポリペプチドＨＦＭ１２２をコードする遺伝子（配列番号１）を含むプラスミドを人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号１３、AGGAGGTTTAAATTTATGCGCACTCAGGTGGCTAT）とｐＥＣｓｆＤ ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号１４、CTTGTTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｆ （配列番号１５，GCTATCAAAACATTCGGCACATTGGTTTTCC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地（Ｂａｃｔｏ Ｔｒｙｐｔｏｎ １％、Ｙｅａｓｔ Ｅｘｔｒａｃｔ ０．５％、ＮａＣｌ １％，カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬ）２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
(b) Preparation of plasmid pECsf_gapS_pabABC_HFM122 Using the plasmid pECsf_gapS_pabABC obtained above as a template, a DNA fragment for vector was synthesized by PCR using primers pabABCcory vec R (SEQ ID NO: 11, AAATTTAAACCTCCTTTACAGAAAAATGGTTGG) and pabABCcory vec F (SEQ ID NO: 12, GGAGGTTTAAACAAGCGGCCGCGATATC). Next, a plasmid containing a gene (SEQ ID NO: 1) encoding a polypeptide HFM122 having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity was prepared by artificial gene synthesis, and this was used as a template to synthesize a DNA fragment for insert by PCR using primers pECsfD HFM122 F (SEQ ID NO: 13, AGGAGTTTAAATTTATGCGCACTCAGGTGGCTAT) and pECsfD HFM122 R (SEQ ID NO: 14, CTTGTTAAACCTCCTTATACGAGTGGCAGTCCTA). After treating these PCR products with DpnI (Takara Bio), each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio), and ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to construct the plasmid pECsf_gapS_pabABC_HFM122. The obtained plasmid solution was used to transform ECOS Competent E. coli DH5α strain (Nippon Gene), and the cell solution was applied to LBKm agar medium (Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, kanamycin sulfate 50 μg / mL, agar 1.5%) and left to stand overnight at 37 ° C., and the obtained colonies were subjected to PCR reaction using Sapphire Amp (Takara Bio) and primers pabABC + pobA for CPCR F (SEQ ID NO: 15, GCTATCAAAACATTCGGCACATTGGTTTTCC) and pabABC + pobA for CPCR R (SEQ ID NO: 16, GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC), and a transformant in which the introduction of the target DNA fragment was confirmed was selected. The resulting transformant was inoculated into 2 mL of LBKm liquid medium (Bacto Trypton 1%, Yeast Extract 0.5%, NaCl 1%, kanamycin sulfate 50 μg/mL) and cultured overnight at 37° C. Plasmids were purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio).
（ｃ）プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２の作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーｐａｂＣ ｌａｓｔ Ｒ（配列番号１７、TTACAGAAAAATGGTTGGGCGCAA）とＨＦＭ１２２ Ｆ（配列番号１８、ATGCGCACTCAGGTGGCTATCG）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２株が有するｔｕｆ遺伝子（ｃｇ０５８７）のプロモーター（以下、ｔｕプロモーターと称する）を含むＤＮＡ断片（配列番号１９、TACGTACCTGCAGGTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAAAGGAGGATCTAAATTATGAATAATATAAAAGGAGGAATTAATTAA）を人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型としてプライマーｐａｂＣ－Ｐｔｕ Ｆ（配列番号２０、ACCATTTTTCTGTAATACGTACCTGCAGGTAGCGTG）とＰｔｕ－ＨＦＭ１２２ Ｒ（配列番号２１、CACCTGAGTGCGCATTTAATTAATTCCTCCTTTTA）を用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することでプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号２２，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
構築したプラスミドにおいては、ｇａｐプロモーターの制御下に４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が連結され、さらにｔｕプロモーターの制御下に野生型ＨＦＭ１２２をコードする遺伝子が連結されている。
(c) Preparation of Plasmid pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122 Using the plasmid pECsf_gapS_pabABC_HFM122 obtained above as a template, a DNA fragment for vector was synthesized by PCR using primers pabC last R (SEQ ID NO: 17, TTACAGAAAAATGGTTGGGCGCAA) and HFM122 F (SEQ ID NO: 18, ATGCGCACTCAGGTGGCTATCG). Next, a DNA fragment (SEQ ID NO: 19, TACGTACCTGCAGGTAGCGTGTCAGTAGGCGCGTAGGGTAAGTGGGGTAGCGGCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTCAACAGCATTGATTTCGATGTATTTAGCTGGCCGTTACCCTGCGAATGTCCACAGGGTAGCTGGTAGTTTGAAAATCAACGCCGTTGCCCTTAGGATTCAGTAACTGGCACATTTTGTAATGCGCTAGATCTGTGTGCTCAGTCTTCCAGGCTGCTTATCACAGTGAAAGCAAAACCAATTCGTGGCTGCGAAAGTCGTAGCCACCACGAAGTCCAAAGGAGGATCTAAATTATGAATAATATAAAAGGAGGAATTAATTAA) containing the promoter of the tuf gene (cg0587) of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain (hereinafter referred to as tu promoter) was prepared by artificial gene synthesis, and primer pabC-Ptu was synthesized using this as a template. A DNA fragment for insert was synthesized by PCR using Ptu-HFM122 F (SEQ ID NO: 20, ACCATTTTTCTGTAATACGTACCTGCAGGTAGCGTG) and Ptu-HFM122 R (SEQ ID NO: 21, CACCTGAGTGCGCATTTAATTAATTCCTCCTTTTA). After treating these PCR products with DpnI (Takara Bio), each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio), and ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to construct the plasmid pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122. The obtained plasmid solution was used to transform ECOS Competent E. E. coli DH5α strain (Nippon Gene) was transformed, the cell liquid was applied to LBKm agar medium and left to stand overnight at 37 ° C., and the resulting colonies were subjected to PCR reaction using Sapphire Amp (Takara Bio) and primers Ptu seq 1 (SEQ ID NO: 22, GCTTGTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC), pabABC + pobA for CPCR R (SEQ ID NO: 16, GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC), and a transformant in which the introduction of the target DNA fragment was confirmed was selected. The resulting transformant was inoculated into 2 mL of LBKm liquid medium and cultured overnight at 37 ° C. Plasmids were purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio).
In the constructed plasmid, genes encoding 4-amino-4-deoxychorismate synthase and 4-amino-4-deoxychorismate lyase are linked under the control of the gap promoter, and further, a gene encoding wild-type HFM122 is linked under the control of the tu promoter.
（ｄ）その他のプラスミドの作製
上記で得られたプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕＤ＿ＨＦＭ１２２を鋳型に、プライマーｐＧａｐＡＢＡ＿ｔｕ ｖｅｃ Ｆ（配列番号２３、GGAGGTTTAAACAAGCGG）とｐＧａｐＡＢＡ＿ｔｕ ｖｅｃ Ｒ（配列番号２４、AATTTAGATCCTCCTTTGGACTTCGTG）を用いたＰＣＲにてベクター用ＤＮＡ断片を合成した。続いて、４－アミノ安息香酸水酸化活性を有する各ポリペプチドをコードする遺伝子（配列番号３，５，７）を含むプラスミドを人工遺伝子合成により作製し、これを鋳型として表１の「プライマー」欄に示すプライマーを用いたＰＣＲにてインサート用ＤＮＡ断片を合成した。これらのＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いて各ＤＮＡ断片を精製し、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）により連結することで表１の「プラスミド」欄に示すプラスミドを構築した。得られたプラスミド溶液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーに対しＳａｐｐｈｉｒｅ Ａｍｐ（タカラバイオ）及びプライマーＰｔｕ ｓｅｑ １（配列番号２２，GCTTGTTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC）、ｐａｂＡＢＣ＋ｐｏｂＡ ｆｏｒ ＣＰＣＲ Ｒ（配列番号１６，GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC）を用いたＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡ断片の導入が確認された形質転換株を選抜した。得られた形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
構築したプラスミドにおいては、ｇａｐプロモーターの制御下に４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸シンターゼ及び４－アミノ－４－デオキシコリスミ酸リアーゼをコードする遺伝子が連結され、さらにｔｕプロモーターの制御下に野生型水酸化酵素をコードする遺伝子が連結されている。
(d) Preparation of other plasmids Using the plasmid pECsf_gapS_pabABC_tuD_HFM122 obtained above as a template, a DNA fragment for vector was synthesized by PCR using primers pGapABA_tu vec F (SEQ ID NO: 23, GGAGGTTAAACAAGCGG) and pGapABA_tu vec R (SEQ ID NO: 24, AATTTAGATCCTCCTTTGGACTTCGTG). Next, a plasmid containing a gene (SEQ ID NO: 3, 5, 7) encoding each polypeptide having 4-aminobenzoic acid hydroxylation activity was prepared by artificial gene synthesis, and a DNA fragment for insert was synthesized by PCR using the primers shown in the "Primer" column of Table 1 as a template. These PCR products were treated with DpnI (Takara Bio), and each DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio), and ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio) to construct the plasmids shown in the "Plasmid" column in Table 1. The obtained plasmid solutions were used to transform ECOS Competent E. E. coli DH5α strain (Nippon Gene) was transformed, the cell liquid was applied to LBKm agar medium and left to stand overnight at 37 ° C., and the resulting colonies were subjected to PCR reaction using Sapphire Amp (Takara Bio) and primers Ptu seq 1 (SEQ ID NO: 22, GCTTGTAGATATCTTGAAATCGGCTTTC), pabABC + pobA for CPCR R (SEQ ID NO: 16, GGAAGATGCGTGATCTGATCCTTCAACTC), and a transformant in which the introduction of the target DNA fragment was confirmed was selected. The resulting transformant was inoculated into 2 mL of LBKm liquid medium and cultured overnight at 37 ° C. Plasmids were purified from this culture using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio).
In the constructed plasmid, genes encoding 4-amino-4-deoxychorismate synthase and 4-amino-4-deoxychorismate lyase are linked under the control of the gap promoter, and further, a gene encoding a wild-type hydroxylase is linked under the control of the tu promoter.
（２）変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製について、ＨＦＭ７７の２０１位のチロシンがフェニルアラニンに置換された変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製を例として以下に示す。
プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ７７を鋳型として、相補的プライマーＨＦＭ７７ Ｙ２０１Ｆ Ｆ（配列番号３１、CTCATCTTCGCACATCACGACCGCGGA）、ＨＦＭ７７ Ｙ２０１Ｆ Ｒ（配列番号３２、ATGTGCGAAGATGAGCTCTTCGGATGA）を用いたＰＣＲにてプラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ７７＿Ｙ２０１Ｆを構築した。ＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）による処理を行い、処理後の液を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＤＨ５α株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーを形質転換株として選抜した。形質転換株をＬＢＫｍ液体培地２ｍＬに接種し、３７℃で一晩培養した。この培養液よりＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドの精製を行った。
同様に、プラスミドｐＥＣｓｆ＿ｇａｐＳ＿ｐａｂＡＢＣ＿ｔｕ＿ＨＦＭ７７に代えて表２の「鋳型」に示すプラスミドを用い、プライマーＨＦＭ７７ Ｙ２０１Ｆ Ｆ及びＨＦＭ７７ Ｙ２０１Ｆ Ｒに代えて表２の「プライマー」に示すプライマーを用いたＰＣＲにて各酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。
(2) Preparation of a Plasmid Containing a Gene Encoding a Mutant Enzyme Preparation of a plasmid containing a gene encoding a mutant enzyme is shown below as an example, in which tyrosine at position 201 of HFM77 is replaced with phenylalanine.
Plasmid pECsf_gapS_pabABC_tu_HFM77 was used as a template, and the complementary primers HFM77 Y201F F (SEQ ID NO: 31, CTCATCTTCGCACATCACGACCGCGGA), HFM77 Y201F R (SEQ ID NO: 32, ATGTGCGAAGATGAGCTCTTCGGATGA) were used in PCR to construct the plasmid pECsf_gapS_pabABC_tu_HFM77_Y201F. The PCR product was treated with DpnI (Takara Bio), and the treated solution was used to transform ECOS Competent E. coli DH5α strain (Nippon Gene), and the cell solution was applied to LBKm agar medium and left to stand overnight at 37 ° C., and the resulting colonies were selected as transformed strains. The transformed strain was inoculated into 2 mL of LBKm liquid medium and cultured overnight at 37 ° C. Plasmids were purified from this culture medium using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio).
Similarly, a plasmid shown in the "Template" column in Table 2 was used instead of the plasmid pECsf_gapS_pabABC_tu_HFM77, and the primers shown in the "Primer" column in Table 2 were used instead of the primers HFM77 Y201F F and HFM77 Y201F R to perform PCR to obtain plasmids containing genes encoding each of the enzyme mutants.
（３）プラスミドの宿主細胞への導入
上記で得られた各プラスミドを用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＤＲＨＧ１４５株（特願２０１４－５２３７５７参照）をエレクトロポレーション法（Ｂｉｏ－ｒａｄ）により形質転換した。得られた形質転換細胞液をＬＢＫｍ寒天培地に塗布した後３０℃で２日間静置し、得られたコロニーを形質転換株とした。
(3) Introduction of plasmids into host cells Using each of the plasmids obtained above, Corynebacterium glutamicum DRHG145 strain (see Japanese Patent Application No. 2014-523757) was transformed by electroporation (Bio-rad). The obtained transformed cell solution was applied to LBKm agar medium and allowed to stand at 30°C for 2 days, and the obtained colonies were used as transformed strains.
（４）形質転換株の培養
上記で得られた形質転換株をそれぞれ表３に示すＣＧＹＥ培地（カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬを含む）１ｍＬに接種し、３０℃で一晩培養した。得られた培養液１００μＬを表４に示すＣＧＸＩＩ培地（カナマイシン硫酸塩５０μｇ／ｍＬを含む）１０ｍＬに接種し、３０℃で約４８時間培養した後、遠心分離により菌体を除去したものを培養上清とした。得られた培養上清中の４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸濃度を参考例１の方法に従って定量し、下記式に従い４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産能向上率を算出した。ここで、「ＷＴ」は「野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株」を示し、「ＭＴ」は「当該野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドから作製された変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドが導入された形質転換株」を示す。
(4) Cultivation of transformed strains The transformed strains obtained above were inoculated into 1 mL of CGYE medium (containing 50 μg/mL kanamycin sulfate) shown in Table 3, and cultured overnight at 30 ° C. 100 μL of the obtained culture solution was inoculated into 10 mL of CGXII medium (containing 50 μg/mL kanamycin sulfate) shown in Table 4, and cultured at 30 ° C. for about 48 hours, and the cells were removed by centrifugation to obtain the culture supernatant. The concentration of 4-amino-3-hydroxybenzoic acid in the obtained culture supernatant was quantified according to the method of Reference Example 1, and the productivity improvement rate of 4-amino-3-hydroxybenzoic acid was calculated according to the following formula. Here, "WT" indicates "a transformed strain into which a plasmid containing a gene encoding a wild-type enzyme has been introduced" and "MT" indicates "a transformed strain into which a plasmid containing a gene encoding a mutant enzyme prepared from a plasmid containing a gene encoding the wild-type enzyme has been introduced".
（数１）
生産能向上率＝ＭＴの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能／ＷＴの４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸生産能
(Equation 1)
Productivity improvement rate = 4-amino-3-hydroxybenzoic acid productivity of MT / 4-amino-3-hydroxybenzoic acid productivity of WT
（５）結果
表５に示す通り、各変異型酵素を導入した菌株は野生型酵素を導入した菌株よりも４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の生産能が向上した。
(5) Results As shown in Table 5, the strains into which each mutant enzyme was introduced had improved 4-amino-3-hydroxybenzoic acid productivity compared to the strain into which the wild-type enzyme was introduced.
参考例１ ４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量
４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量はＨＰＬＣにより行った。ＨＰＬＣ分析に供する反応液を０．１％リン酸にて適宜希釈した後、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍＧＨＰ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行なった。
ＨＰＬＣの装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用いた。標準試料〔４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸（販売元コードＡ１１９４、東京化成工業）〕を用いて濃度検量線を作成し、濃度検量線に基づいて４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸の定量を行なった。
Reference Example 1: Quantitative Determination of 4-amino-3-hydroxybenzoic Acid Quantitative determination of 4-amino-3-hydroxybenzoic acid was performed by HPLC. The reaction solution to be subjected to HPLC analysis was appropriately diluted with 0.1% phosphoric acid, and insoluble matters were removed using an AcroPrep 96 filter plate (0.2 μm GHP membrane, Nippon Pole).
The HPLC apparatus used was a Chromaster (Hitachi High-Tech Science). The analytical column used was an L-column ODS (4.6 mm ID x 150 mm, Chemicals Evaluation and Research Institute, Japan). Gradient elution was performed under conditions of a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 40°C, with eluent A being a 0.1% phosphoric acid solution of 0.1 M potassium dihydrogen phosphate and eluent B being 70% methanol. A UV detector (detection wavelength 280 nm) was used to detect 4-amino-3-hydroxybenzoic acid. A concentration calibration curve was created using a standard sample [4-amino-3-hydroxybenzoic acid (seller code A1194, Tokyo Chemical Industry)], and 4-amino-3-hydroxybenzoic acid was quantified based on the concentration calibration curve.
Claims (12)
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、又はエチル基を示し、Ｘ１及びＸ２は水素原子又はヒドロキシ基であって少なくとも一方はヒドロキシ基を示す。〕
で示される４－アミノ－３－ヒドロキシ安息香酸誘導体であり、
４－アミノ安息香酸類が、下記の一般式（２）：
〔式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、エチル基を示し、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシ基、メトキシ基、アミノ基、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、カルボキシ基、メチル基、又はエチル基を示す。〕
で示される４－アミノ安息香酸誘導体である請求項１０又は１１記載の方法。 The 4-amino-3-hydroxybenzoic acid is represented by the following general formula (1):
[In the formula, R1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group; R2 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group; and X1 and X2 represent a hydrogen atom or a hydroxy group, with at least one of them representing a hydroxy group.]
is a 4-amino-3-hydroxybenzoic acid derivative represented by the formula:
The 4-aminobenzoic acid is represented by the following general formula (2):
[In the formula, R1 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group, and R2 represents a hydrogen atom, a hydroxy group, a methoxy group, an amino group, a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, an iodine atom, a carboxy group, a methyl group, or an ethyl group.]
The method according to claim 10 or 11, wherein the 4-aminobenzoic acid derivative is represented by the following formula:
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| The Journal of Biological Chemistry，1987年，Vol.262, No.13，pp.6060-6068 |
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