JP2024095297A - Polypeptide having 2-indole carboxylic acid decarboxylation activity and use thereof - Google Patents
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Abstract
【課題】２－インドールカルボン酸類の脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供する。
【解決手段】配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
【選択図】なし
The present invention provides a polypeptide having decarboxylation activity for 2-indole carboxylic acids and a method for using the same.
[Solution] A polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, in which the amino acid residue at position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the following amino acid, or in which the amino acid residue at the position corresponding to position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the following amino acid in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
[Selection diagram] None
Description
本発明は２－インドールカルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用に関する。 The present invention relates to a polypeptide having 2-indole carboxylic acid decarboxylation activity and its use.
インドールはベンゼン環とピロール環が縮合した構造をとる有機化合物であり、天然ジャスミン精油に約２．５％含まれ、合成インドールはオレンジやジャスミン系の香料や香水に使用されている。また、インドールはインディゴ色素の原料としても知られている。さらに、インドール環上に置換基を有するインドール類は、医薬品や各種化成品、それらの合成中間体としても重要である。 Indole is an organic compound with a structure in which a benzene ring and a pyrrole ring are condensed. It is contained in natural jasmine essential oil at about 2.5%, and synthetic indole is used in orange and jasmine flavors and perfumes. Indole is also known as a raw material for indigo dye. Furthermore, indoles with a substituent on the indole ring are important as pharmaceuticals, various chemical products, and synthetic intermediates for them.
インドール類の合成は、Ｒｅｉｓｓｅｒｔ法、Ｆｉｓｃｈｅｒ法、Ｒｅｅｓ－Ｍｏｏｄｙ法などの合成法が古くから知られている。しかし、歴史あるこれらの方法を用いたインドール環の形成反応においては、反応性の点から２－インドールカルボン酸等のインドールカルボン酸を合成した後に脱炭酸する手法が採用される。例えば、フェニルヒドラジンとピルビン酸を用いて２－インドールカルボン酸を製造し、その後脱炭酸反応に付して、インドールを合成することが行われている。ここで行われる脱炭酸反応は、主に加熱条件下（２００～３００℃）で行われるため、生成物の分解と精製時の追加的な分解を引き起こすという問題があった（非特許文献１）。 For the synthesis of indoles, synthesis methods such as the Reissert method, the Fischer method, and the Rees-Moody method have long been known. However, in the formation reaction of the indole ring using these long-established methods, a method is adopted in which an indole carboxylic acid such as 2-indole carboxylic acid is synthesized and then decarboxylated from the viewpoint of reactivity. For example, 2-indole carboxylic acid is produced using phenylhydrazine and pyruvic acid, and then subjected to a decarboxylation reaction to synthesize indole. The decarboxylation reaction carried out here is mainly carried out under heating conditions (200 to 300°C), which causes problems of decomposition of the product and additional decomposition during purification (Non-Patent Document 1).
一方、近年、常温常圧下で１段階かつ可逆的にヘテロ芳香族カルボン酸のカルボキシル基を脱離可能な酵素触媒として、ＰａＨｕｄＡ、ＣｂＨｍｆＦ、ＡｎＦＤＣ１等のプレニル化フラビン型デカルボキシラーゼ（ｐｒＦＭＮ－ＤＣ）が見出されている（非特許文献２）。このうち、代表的なｐｒＦＭＮ－ＤＣであるＡｎＦＤＣ１では多様な芳香族性基質への特異性改変が行われ、２－インドールカルボン酸に対して脱炭酸活性を有する変異体が見出されている（非特許文献３）。 On the other hand, in recent years, prenylated flavin decarboxylases (prFMN-DCs) such as PaHudA, CbHmfF, and AnFDC1 have been found as enzyme catalysts capable of decarboxylating heteroaromatic carboxylic acids in one step and reversibly at room temperature and pressure (Non-Patent Document 2). Among these, AnFDC1, a representative prFMN-DC, has been modified in terms of specificity for a variety of aromatic substrates, and mutants with decarboxylation activity for 2-indole carboxylic acid have been found (Non-Patent Document 3).
本発明は、２－インドールカルボン酸類の脱炭酸活性を有するポリペプチド及びその利用法を提供することに関する。 The present invention relates to providing a polypeptide having decarboxylation activity for 2-indole carboxylic acids and a method for using the same.
本発明者らは、ピロール－２－カルボン酸に対して脱炭酸活性を有するプレニル化フラビン型デカルボキシラーゼであるＰａＨｕｄＡの特定の変異体が、２－インドールカルボン酸に対して優れた脱炭酸活性を有し、インドール酸類の製造に有用であることを見出した。 The present inventors have found that a specific mutant of PaHudA, a prenylated flavin-type decarboxylase that has decarboxylation activity against pyrrole-2-carboxylic acid, has excellent decarboxylation activity against 2-indole carboxylic acid and is useful for producing indole acids.
本発明は以下の１）～７）に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
２）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有する変異ポリペプチドの製造方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
３）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸に対する脱炭酸活性の付与方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。
４）１）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
５）４）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
６）５）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
７）下記の一般式（１）：
The present invention relates to the following 1) to 7).
1) A polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, in which the amino acid residue at position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the following amino acid, or in which the amino acid residue at the position corresponding to position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the following amino acid in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
2) A method for producing a mutant polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, comprising substituting the amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the amino acid shown below, or substituting the amino acid residue at the position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the amino acid shown below in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
3) A method for imparting decarboxylation activity to indole-2-carboxylic acid, comprising substituting the amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the amino acid shown below, or substituting the amino acid residue at the position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the amino acid shown below in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
4) A polynucleotide encoding the polypeptide of 1).
5) A vector or DNA fragment containing the polynucleotide of 4).
6) A transformed cell containing the vector or DNA fragment of 5).
7) The following general formula (1):
で表されるインドール－２－カルボン酸類を、１）のポリペプチド又は６）の形質転換細胞と接触させる工程を含む、下記の一般式（２）： The method includes a step of contacting an indole-2-carboxylic acid represented by the following general formula (2):
で示されるインドール類の製造方法。 A method for producing indoles represented by the formula:
本発明のポリペプチドは優れたインドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有することから、これを用いることにより、常温常圧下でインドール－２－カルボン酸類から効率よくインドール類を製造することができる。 The polypeptide of the present invention has excellent indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, and by using it, indoles can be efficiently produced from indole-2-carboxylic acids at room temperature and normal pressure.
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 In this specification, the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis using the Search homology program of the genetic information processing software GENETYX Ver. 12 with a unit size to compare (ktup) of 2.
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。 In this specification, the "corresponding position" on an amino acid sequence or a nucleotide sequence can be determined by aligning a target sequence with a reference sequence (e.g., the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) to maximize homology. Alignment of amino acid sequences or nucleotide sequences can be performed using known algorithms, and the procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J.D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which are revised versions of Clustal W, can be used. Clustal W, Clustal W2, and Clustal omega are available, for example, on the websites of the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]) operated by the National Institute of Genetics. The position of the target sequence aligned to any position of the reference sequence by the above-mentioned alignment is considered to be a "position corresponding to" that any position.
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。 Those skilled in the art can further fine-tune the alignment of the amino acid sequences obtained above to optimize it. Such an optimal alignment is preferably determined taking into consideration the similarity of the amino acid sequences, the frequency of gaps to be inserted, and the like. Here, the similarity of the amino acid sequences refers to the percentage (%) of the number of positions at which identical or similar amino acid residues exist in both sequences when the two amino acid sequences are aligned, relative to the total number of amino acid residues. Similar amino acid residues refer to amino acid residues that have similar properties in terms of polarity and charge among the 20 types of amino acids that make up proteins, and that cause so-called conservative substitutions. Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art, and examples thereof include, but are not limited to, arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; leucine and isoleucine.
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。 In this specification, "amino acid residue" refers to the 20 types of amino acid residues that make up proteins: alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W), tyrosine (Tyr or Y), and valine (Val or V).
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。 As used herein, "operably linked" between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked in such a way that the gene can be expressed under the control of the control region. The procedure for "operably linked" between a gene and a control region is well known to those skilled in the art.
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。 As used herein, "upstream" and "downstream" in relation to a gene refer to the upstream and downstream of the transcription direction of the gene. For example, "a gene located downstream of a promoter" means that the gene is present on the 3' side of the promoter on the DNA sense strand, and "upstream" of a gene means the region on the 5' side of the gene on the DNA sense strand.
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。 As used herein, the term "native" when referring to a function, property, or trait of a cell is used to indicate that the function, property, or trait is inherently present in the cell. In contrast, the term "exogenous" is used to indicate a function, property, or trait that is not inherently present in the cell, but is introduced from outside. For example, a "exogenous" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that is introduced into a cell from outside. An exogenous gene or polynucleotide may be from the same organism as the cell into which it is introduced, or from a different organism (i.e., a heterologous gene or polynucleotide).
＜インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド＞
本発明のインドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド（「本発明のポリペプチド」と称す）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシンであり、好ましくはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン又はスレオニンであるポリペプチドである。
<Polypeptides having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity>
The polypeptide of the present invention having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity (referred to as "the polypeptide of the present invention") is a polypeptide in which the amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, or the amino acid residue at the position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 in an amino acid sequence having at least 90% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, is alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine, and is preferably alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, leucine, methionine, asparagine, serine, or threonine.
当該ポリペプチドは、基準となるポリペプチド、すなわち配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基がアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン、好ましくはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン又はスレオニンに置換された、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有する変異ポリペプチドである。 The polypeptide is a mutant polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, in which the amino acid residue at position 322 of a reference polypeptide, i.e., a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, or the amino acid residue at the position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 in a polypeptide having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, is replaced with alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine, preferably alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, leucine, methionine, asparagine, serine, or threonine.
本発明において、「インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性」とは、インドール－２－カルボン酸の脱炭酸反応を触媒する活性を意味する。
インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性は、後述する実施例に示すとおり、インドール－２－カルボン酸を、本発明のポリペプチド又はこれを産生する微生物と接触させ、生成するインドール量をＨＰＬＣ等により測定することによって決定することができる。
In the present invention, the term "indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity" means the activity of catalyzing the decarboxylation reaction of indole-2-carboxylic acid.
As shown in the Examples below, the indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity can be determined by contacting indole-2-carboxylic acid with the polypeptide of the present invention or a microorganism producing the polypeptide and measuring the amount of indole produced by HPLC or the like.
斯かる本発明のポリペプチドは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置のアミノ酸残基をアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン、好ましくはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン又はスレオニンに置換することにより製造できる。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明のポリペプチドの「親」ポリペプチドである。
当該親ポリペプチドは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、本発明のポリペプチドとなる基準ポリペプチドを指す。
Such a polypeptide of the present invention can be produced by substituting the amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, or the amino acid residue at a position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 in an amino acid sequence having at least 90% identity to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, with alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine, preferably alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, leucine, methionine, asparagine, serine, or threonine.
Here, a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto is the "parent" polypeptide of the polypeptide of the present invention.
The parent polypeptide refers to a reference polypeptide in which predetermined mutations are made to amino acid residues to result in a polypeptide of the invention.
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドは、プレニル化フラビン型デカルボキシラーゼ（ｐｒＦＭＮ－ＤＣ）の一種であるＰａＨｕｄＡ（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＷＰ＿００３１１５７２２．１）として知られている。ＰａＨｕｄＡは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のプレニル化フラビン型デカルボキシラーゼであり、活性中心にプレニル化フラビンモノヌクレオチド（ｐｒＦＭＮ）を保持し、ピロール－２－カルボン酸の脱炭酸反応を促進する触媒活性を有する。 The polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is known as PaHudA (NCBI Reference Sequence: WP_003115722.1), a type of prenylated flavin decarboxylase (prFMN-DC). PaHudA is a prenylated flavin decarboxylase derived from Pseudomonas aeruginosa, which holds prenylated flavin mononucleotide (prFMN) in the active center and has catalytic activity to promote the decarboxylation of pyrrole-2-carboxylic acid.
したがって、本発明のポリペプチドの親ポリペプチドである、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ピロール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチドが挙げられる。 Therefore, examples of the parent polypeptide of the polypeptide of the present invention, which is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, include polypeptides consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2, more preferably 95% identity or more, more preferably 96% identity or more, even more preferably 97% identity or more, even more preferably 98% identity or more, and even more preferably 99% identity or more, and which have pyrrole-2-carboxylic acid decarboxylation activity.
＜本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド＞
本発明において、親ポリペプチドのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
<Polynucleotides encoding the polypeptides of the present invention>
In the present invention, various mutagenesis techniques known in the art can be used as a means for mutating amino acid residues in a parent polypeptide. For example, in a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a parent polypeptide (hereinafter also referred to as a parent gene), a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be mutated is mutated to a nucleotide sequence encoding the amino acid residue after mutation, thereby obtaining a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、アジレント・テクノロジー社のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。 The introduction of the desired mutation into the parent gene can basically be carried out using various site-directed mutagenesis methods well known to those skilled in the art. Site-directed mutagenesis can be carried out by any method, such as inverse PCR or annealing. Commercially available site-directed mutagenesis kits (e.g., QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit and QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit, both from Agilent Technologies) can also be used.
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。 Site-specific mutagenesis in a parent gene can be most commonly performed using a mutagenesis primer containing the nucleotide mutation to be introduced. The mutagenesis primer can be designed to anneal to a region containing a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and to contain a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding the mutated amino acid residue instead of the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated. A person skilled in the art can appropriately recognize and select the nucleotide sequences (codons) encoding the amino acid residues before and after the mutation based on a typical textbook or the like. Alternatively, site-specific mutagenesis can be performed by a method in which DNA fragments obtained by amplifying the upstream and downstream sides of the mutation site using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced separately are linked together by SOE (splicing by overlap extension)-PCR (Gene, 1989, 77(1): pp. 61-68).
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したＰａＨｕｄＡを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。ピロール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチドとして既述したＰａＨｕｄＡをコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１に示した。 The template DNA containing the parent gene can be prepared by extracting genomic DNA from the above-mentioned microorganism that produces PaHudA using a standard method, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription. Alternatively, a corresponding nucleotide sequence can be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the parent polypeptide and used as the template DNA. The DNA sequence containing the base sequence encoding PaHudA, which has already been described as a polypeptide having pyrrole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, is shown in SEQ ID NO:1.
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。 The mutation primer can be prepared by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4search, 1989, 17:7059-7071). Such primer synthesis can also be performed using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (such as that manufactured by ABI). A primer set including the mutation primer can be used to perform site-specific mutagenesis as described above using a parent gene as template DNA to obtain a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention having the desired mutation.
当該本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。 The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention may comprise single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA, or other artificial nucleic acid. The DNA, cDNA, and RNA may be chemically synthesized. The polynucleotide may also comprise a nucleotide sequence of an untranslated region (UTR) in addition to an open reading frame (ORF). The polynucleotide may also be codon-optimized for the species of the transformant used to produce the mutant polypeptide of the present invention. Information on codons used by various organisms is available from the Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]).
＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターは、発現ベクターである。また好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを宿主微生物に導入することができ、かつ宿主微生物内で該ポリヌクレオチドを発現することができる発現ベクターである。好ましくは、該ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む。該ベクターは、プラスミド等の染色体外で自立増殖及び複製可能なベクターであってもよく、又は染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
<Vector or DNA fragment>
The obtained polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be incorporated into a vector. The vector containing the polynucleotide is an expression vector. Also preferably, the vector is an expression vector capable of introducing the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into a host microorganism and expressing the polynucleotide in the host microorganism. Preferably, the vector comprises the polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and a control region operably linked thereto. The vector may be a vector capable of autonomously replicating and replicating outside a chromosome, such as a plasmid, or may be a vector that is integrated into a chromosome.
具体的なベクターの例としては、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ II ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＵＣ１８／１９、ｐＵＣ１１８／１１９等のｐＵＣ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＥＴ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケア）、ｐＣｏｌｄ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）、ｐＵＢ１１０（Ｍｃｋｅｎｚｉｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｌａｓｍｉｄ １５（２）：９３－１０３）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ）、ｐＲＳ４０３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＭＷ２１８／２１９（ニッポンジーン）、ｐＲＩ９０９／９１０等のｐＲＩ系ベクター（タカラバイオ）、ｐＢＩ系ベクター（クロンテック）、ＩＮ３系ベクター（インプランタイノベーションズ）、ｐＰＴＲ１／２（タカラバイオ）、ｐＤＪＢ２（Ｄ．Ｊ．Ｂａｌｌａｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３６，３２１－３３１，１９８５）、ｐＡＢ４－１（ｖａｎ Ｈａｒｔｉｎｇｓｖｅｌｄｔ Ｗ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，２０６，７１－７５，１９８７）、ｐＬｅｕ４（Ｍ．Ｉ．Ｇ．Ｒｏｎｃｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，８４，３３５－３４３，１９８９）、ｐＰｙｒ２２５（Ｃ．Ｄ．Ｓｋｏｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２６８，３９７－４０６，２００２）、ｐＦＧ１（Ｇｒｕｂｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１８，４４７－４５１，１９９０）等が挙げられる。 Specific examples of vectors include pBluescript II SK(-) (Stratagene), pUC vectors such as pUC18/19 and pUC118/119 (Takara Bio), pET vectors (Takara Bio), pGEX vectors (GE Healthcare), pCold vectors (Takara Bio), pHY300PLK (Takara Bio), and pUB110 (Mckenzie, T. et al., 1986, Plasmid 15(2):93-103), pBR322 (Takara Bio), pRS403 (Stratagene), pMW218/219 (Nippon Gene), pRI-based vectors such as pRI909/910 (Takara Bio), pBI-based vectors (Clontech), IN3-based vectors (Implanta Innovations), pPTR1/2 (Takara Bio), pDJB2 (D.J.Ballance et al., Gene,36,321-331,1985), pAB4-1 (van Hartingsveldt W et al., Mol Gen Genet,206,71-75,1987), pLeu4 (M.I.G.Roncero et al., al., Gene, 84, 335-343, 1989), pPyr225 (C.D.Skory et al., Mol Genet Genomics, 268, 397-406, 2002), pFG1 (Gruber, F. et al., Curr Genet, 18, 447-451, 1990), etc.
また、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、これを含むＤＮＡ断片として構築されていてもよい。該ＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片及び制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。好ましくは、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及びこれと作動可能に連結された制御領域を含む発現カセットであり得る。 The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention may be constructed as a DNA fragment containing the polynucleotide. Examples of the DNA fragment include a PCR-amplified DNA fragment and a restriction enzyme-cleaved DNA fragment. Preferably, the DNA fragment may be an expression cassette containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention and a control region operably linked thereto.
上記ベクター又はＤＮＡ断片に含まれる制御領域は、該ベクター又はＤＮＡ断片が導入された宿主細胞内で本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現させるための配列であり、例えばプロモーターやターミネーター等の発現調節領域、複製開始点等が挙げられる。該制御領域の種類は、ベクター又はＤＮＡ断片を導入する宿主微生物の種類に応じて適宜選択することができる。必要に応じて、該ベクター又はＤＮＡ断片はさらに、抗生物質耐性遺伝子、アミノ酸合成関連遺伝子等の選択マーカー（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）を有していてもよい。
上記ベクター又はＤＮＡ断片には、フラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．５．１．１２９）をコードするポリヌクレオチド配列が含まれていてもよい。フラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼは、ジメチルアリル一リン酸（ＤＭＡＰ）からジメチルアリル構造をフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のフラビン骨格へと結合し、プレニル化フラビン型デカルボキシラーゼの活性中心を構成するプレニル化フラビンモノヌクレオチド（ｐｒＦＭＮ）を合成する反応を触媒する酵素である。 本酵素を菌体内において十分に発現させることで、目的とするプレニル化フラビン型デカルボキシラーゼが活性を十分に保持することを補助することができる。
The control region contained in the vector or DNA fragment is a sequence for expressing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention in a host cell into which the vector or DNA fragment has been introduced, and examples of such control regions include expression regulatory regions such as promoters and terminators, and origins of replication. The type of control region can be appropriately selected depending on the type of host microorganism into which the vector or DNA fragment is introduced. If necessary, the vector or DNA fragment may further have a selection marker such as an antibiotic resistance gene or an amino acid synthesis-related gene (e.g., a drug resistance gene such as ampicillin, neomycin, kanamycin, or chloramphenicol).
The vector or DNA fragment may contain a polynucleotide sequence encoding flavin mononucleotide prenyltransferase (EC 2.5.1.129). Flavin mononucleotide prenyltransferase is an enzyme that catalyzes the reaction of binding a dimethylallyl structure from dimethylallyl monophosphate (DMAP) to the flavin backbone of flavin mononucleotide (FMN) to synthesize prenylated flavin mononucleotide (prFMN), which constitutes the active center of prenylated flavin-type decarboxylase. By sufficiently expressing this enzyme in a bacterial cell, it is possible to help the target prenylated flavin-type decarboxylase to sufficiently retain its activity.
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと上記制御領域や、マーカー遺伝子配列との連結は、上述したＳＯＥ－ＰＣＲ法などの方法によって行うことができる。ベクターへの遺伝子配列の導入手順は、当該分野で周知である。プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御領域の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。 The polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention can be linked to the above-mentioned control region or marker gene sequence by the above-mentioned SOE-PCR method or other method. The procedure for introducing a gene sequence into a vector is well known in the art. There are no particular limitations on the types of control regions such as promoter regions, terminators, and secretion signal regions, and promoters and secretion signal sequences that are commonly used can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
該制御領域の好適な例としては、野生型に比較して発現を強化できる強制御領域、例えば公知の高発現プロモーターであるＴ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター等が例示されるが、これらに特に限定されない。 Suitable examples of the control region include strong control regions that can enhance expression compared to the wild type, such as known high expression promoters such as the T7 promoter, lac promoter, tac promoter, and trp promoter, but are not limited to these.
＜形質転換細胞＞
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
斯かる形質転換細胞は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能なように導入された細胞であり、当該ポリヌクレオチドの発現が強化された細胞、ひいては本発明のポリペプチドの発現が強化された細胞であると言える。
<Transformed cells>
The transformed cell of the present invention can be obtained by introducing a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into a host, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention into the genome of the host.
Such transformed cells are cells into which a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention has been introduced so as to be expressible, and can be said to be cells in which expression of the polynucleotide has been enhanced, and ultimately cells in which expression of the polypeptide of the present invention has been enhanced.
宿主細胞としては、真菌、酵母、放線菌、大腸菌、枯草菌等、いずれを用いてもよいが、大腸菌、酵母、放線菌が好ましく、より好ましくは大腸菌及び放線菌のうちコリネ型細菌として定義されている一群の微生物（Bergey's Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974））が挙げられる。コリネ型細菌としては、具体的には、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、ロドコッカス属菌、ストレプトマイセス属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。このうち、好ましくはコリネバクテリウム属菌（例えば、コリネバクテリウム グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）、コリネバクテリウム クレナタム（Corynebacterium crenatum）、コリネバクテリウム クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム カルナエ（Corynebacterium callunae）等）であり、より好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカムである。 As the host cell, any of fungi, yeast, actinomycetes, Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc. may be used, but Escherichia coli, yeast, and actinomycetes are preferred, and more preferred are a group of microorganisms defined as coryneform bacteria among Escherichia coli and actinomycetes (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Vol. 8, 599 (1974)). Specific examples of coryneform bacteria include bacteria of the genus Corynebacterium, Brevibacterium, Arthrobacter, Mycobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, and Micrococcus. Among these, preferred are bacteria of the genus Corynebacterium (e.g., Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium halotolerance, Corynebacterium alkanolyticum, Corynebacterium crenatum, Corynebacterium crudilactis, Corynebacterium callunae, etc.), and more preferred is Corynebacterium glutamicum.
また、本発明の形質転換細胞又はその宿主細胞としては、フラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を保有しフラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼを発現する細胞、又は予めフラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼの発現が強化された細胞を用いてもよい。 In addition, the transformed cell of the present invention or its host cell may be a cell that has a gene encoding flavin mononucleotide prenyltransferase and expresses flavin mononucleotide prenyltransferase, or a cell in which expression of flavin mononucleotide prenyltransferase has already been enhanced.
宿主へのベクター又はＤＮＡ断片の導入の方法としては、例えばエレクトロポレーション法、トランスフォーメーション法、トランスフェクション法、接合法、プロトプラスト法、パーティクル・ガン法、アグロバクテリウム法等を用いることができる。 Methods for introducing a vector or DNA fragment into a host include, for example, electroporation, transformation, transfection, conjugation, protoplast, particle gun, and Agrobacterium methods.
また、ポリヌクレオチドを宿主のゲノムに導入する方法としては、特に限定されないが、例えば、該ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を用いた２重交差法が挙げられる。該ＤＮＡ断片は、上述する宿主細胞において発現量の多い遺伝子のプロモーター配列の下流に導入されてもよく、あるいは、予め該ＤＮＡ断片と上述した制御領域とを作動可能に連結した断片を作製し、当該連結断片を宿主のゲノムに導入してもよい。さらに、該ＤＮＡ断片は、本発明のポリヌクレオチドが適切に導入された細胞を選択するためのマーカー（薬剤耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子など）と予め連結されていてもよい。 The method of introducing a polynucleotide into the genome of a host is not particularly limited, but may be, for example, a double crossover method using a DNA fragment containing the polynucleotide. The DNA fragment may be introduced downstream of the promoter sequence of a gene that is highly expressed in the host cell described above, or a fragment in which the DNA fragment and the above-mentioned control region are operably linked in advance may be prepared, and the linked fragment may be introduced into the genome of the host. Furthermore, the DNA fragment may be linked in advance to a marker (such as a drug resistance gene or an auxotrophy complementing gene) for selecting cells into which the polynucleotide of the present invention has been appropriately introduced.
目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞は、選択マーカーを利用して選択することができる。例えば、選択マーカーが抗生物質耐性遺伝子である場合、該抗生物質添加培地で培養することで、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。また例えば、選択マーカーがアミノ酸合成関連遺伝子である場合、該アミノ酸要求性の宿主微生物に遺伝子導入した後、該アミノ酸要求性の有無を指標に、目的のベクター又はＤＮＡ断片が導入された形質転換細胞を選択することができる。あるいは、ＰＣＲ等によって形質転換細胞のＤＮＡ配列を調べることで目的のベクター又はＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。 Transformed cells into which a vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected using a selection marker. For example, if the selection marker is an antibiotic resistance gene, transformed cells into which a vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected by culturing the transformed cells in a medium containing the antibiotic. For example, if the selection marker is an amino acid synthesis-related gene, transformed cells into which a vector or DNA fragment of interest has been introduced can be selected using the presence or absence of the amino acid requirement as an indicator after gene introduction into a host microorganism that requires the amino acid. Alternatively, introduction of the vector or DNA fragment of interest can be confirmed by examining the DNA sequence of the transformed cells using PCR or the like.
斯くして得られた形質転換細胞は、これを適切な培地で培養すれば、当該細胞に導入されたポリヌクレオチドが発現して、本発明のポリペプチドが生成される。すなわち、当該形質転換細胞は、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド産生菌となり得る。
そして、後述する実施例に示すとおり、インドール－２－カルボン酸の存在下で、本発明の形質転換細胞を培養した場合、親ポリペプチドを産生する形質転換細胞を用いた場合にはインドールが全く生産されないのに対し、インドールの生産が可能となる。
すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位若しくは３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基をアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシンに置換する変異は、インドール－２－カルボン酸に対する脱炭酸活性の付与に有用であり、次に示すように、当該変異ポリペプチドは、インドール－２－カルボン酸類からインドール類の生産に使用できる。
したがって、本発明の形質転換細胞は、インドール－２－カルボン酸類に対する脱炭酸活性が付与されたポリペプチドの産生菌であり、インドール－２－カルボン酸類からインドール類を生産するための有用なインドール類生産株であるといえる。
When the thus obtained transformed cells are cultured in an appropriate medium, the polynucleotide introduced into the cells is expressed to produce the polypeptide of the present invention. That is, the transformed cells can become bacteria capable of producing a polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity.
As shown in the Examples described later, when the transformed cell of the present invention is cultured in the presence of indole-2-carboxylic acid, indole production becomes possible, whereas no indole is produced at all when a transformed cell producing a parent polypeptide is used.
That is, in a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, a mutation in which the amino acid residue at position 322 or a position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is replaced with alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine is useful for imparting decarboxylation activity to indole-2-carboxylic acid, and as shown below, the mutant polypeptide can be used for producing indoles from indole-2-carboxylic acids.
Therefore, the transformed cell of the present invention is a bacterium that produces a polypeptide to which decarboxylation activity for indole-2-carboxylic acids has been imparted, and can be said to be a useful indole-producing strain for producing indoles from indole-2-carboxylic acids.
＜インドール類の製造＞
本発明のインドール類の製造方法は、下記の一般式（１）：
<Production of indoles>
The method for producing an indole of the present invention comprises reacting a compound represented by the following general formula (1):
〔式中、Ｒ1及びＲ2は同一又は異なっていてもよく、水素原子、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルキル基、炭素数１～３のアルコキシ基、カルボキシ基又はアミノ基を示す。〕
で表されるインドール－２－カルボン酸類を、本発明のポリペプチド又は本発明の形質転換細胞と接触させることにより、下記の一般式（２）：
[In the formula, R 1 and R 2 may be the same or different and each represents a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms, a carboxyl group, or an amino group.]
By contacting an indole-2-carboxylic acid represented by the following general formula (2):
〔式中、Ｒ1及びＲ2は前記と同じものを示す。〕
で示されるインドール類を製造するものである。
(In the formula, R1 and R2 are the same as defined above.)
The present invention relates to the production of indoles represented by the following formula:
式（１）又は（２）において、Ｒ1、Ｒ2で示されるハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子が挙げられ、好ましくはフッ素原子、塩素原子、臭素原子である。
炭素数１～３のアルキル基としては、好ましくはメチル基、エチル基である。
炭素数１～３のアルコキシ基としては、好ましくはメトキシ基、エトキシ基である。
Ｒ1及びＲ2は、共に水素原子であるのが好ましい。
In the formula (1) or (2), examples of the halogen atom represented by R 1 or R 2 include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom and an iodine atom, and preferably a fluorine atom, a chlorine atom and a bromine atom.
The alkyl group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a methyl group or an ethyl group.
The alkoxy group having 1 to 3 carbon atoms is preferably a methoxy group or an ethoxy group.
It is preferable that R 1 and R 2 are both hydrogen atoms.
インドール－２－カルボン酸類と本発明のポリペプチドとの接触は、インドール－２－カルボン酸類と当該ポリペプチドを水性媒体中に接触（共存）させ、撹拌又は振とうしながら一定時間加温することにより行うことができる。
例えば、インドール－２－カルボン酸類の濃度を０．１～１０ｍＭ、好ましくは１～５ｍＭ、本発明のポリペプチドの濃度を０．１～５ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１～５ｍｇ／ｍｌとし、ｐＨ５～９、１０℃～４０℃で、６時間～７２時間、好ましくは９時間～６０時間、より好ましくは１２時間～４８時間接触させることが挙げられる。
The contact of the indole-2-carboxylic acid with the polypeptide of the present invention can be carried out by contacting (coexisting) the indole-2-carboxylic acid with the polypeptide in an aqueous medium and heating for a certain period of time with stirring or shaking.
For example, the concentration of the indole-2-carboxylic acids may be 0.1 to 10 mM, preferably 1 to 5 mM, the concentration of the polypeptide of the present invention may be 0.1 to 5 mg/ml, preferably 1 to 5 mg/ml, and the contact may be performed at pH 5 to 9, at 10° C. to 40° C., for 6 to 72 hours, preferably 9 to 60 hours, more preferably 12 to 48 hours.
インドール－２－カルボン酸類と本発明の本発明の形質転換細胞との接触は、インドール－２－カルボン酸類を添加した培地で当該形質転換細胞を培養することにより行うことができる。
形質転換細胞を培養する培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、本発明の形質転換細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、例えば、グルコース等の糖類、グリセリン等のポリオール類、エタノール等のアルコール類、またはピルビン酸、コハク酸もしくはクエン酸等の有機酸類を使用することができる。また、窒素源としては、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物、メチルアミン等のアルキルアミン類、またはアンモニアもしくはその塩等を使用することができる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛等の塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミン、消泡剤等も必要に応じて使用してもよい。
Contact of the indole-2-carboxylic acid with the transformed cell of the present invention can be achieved by culturing the transformed cell in a medium containing the indole-2-carboxylic acid.
The medium for culturing the transformed cells may be either a natural medium or a synthetic medium, as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, etc., and can efficiently culture the transformed cells of the present invention. Examples of the carbon source that can be used include sugars such as glucose, polyols such as glycerin, alcohols such as ethanol, and organic acids such as pyruvic acid, succinic acid, and citric acid. Examples of the nitrogen source that can be used include peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolysate, alkaline extract of soybean meal, alkylamines such as methylamine, and ammonia or a salt thereof. In addition, salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and antifoaming agents may also be used as necessary.
培養は、通常、１０℃～４０℃で、６時間～７２時間、好ましくは９時間～６０時間、より好ましくは１２時間～４８時間、必要に応じ撹拌または振とうしながら行うことができる。また、培養中は必要に応じてアンピシリンやカナマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。 The culture is usually carried out at 10°C to 40°C for 6 to 72 hours, preferably 9 to 60 hours, and more preferably 12 to 48 hours, with stirring or shaking as necessary. During the culture, antibiotics such as ampicillin or kanamycin may be added to the medium as necessary.
反応系からのインドール類の回収及び精製方法は特に制限されない。すなわち、周知のイオン交換樹脂法、沈澱法、晶析法、再結晶法、濃縮法その他の方法を組み合わせることにより実施できる。
例えば、形質転換細胞を用いた製造においては、菌体を遠心分離等で除去した後、カチオン及びアニオン交換樹脂でイオン性の物質を除き、濃縮すればインドール類を取得することができる。培養物中に蓄積されたインドール類は、そのまま単離することなく用いてもよい。
The method for recovering and purifying the indoles from the reaction system is not particularly limited, and can be carried out by combining well-known methods such as ion exchange resin method, precipitation method, crystallization method, recrystallization method, concentration method, and others.
For example, in the case of production using transformed cells, the indoles can be obtained by removing the bacterial cells by centrifugation or the like, removing ionic substances with cation and anion exchange resins, and concentrating the indoles. The indoles accumulated in the culture may be used as they are without isolation.
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基が下記のアミノ酸である、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有するポリペプチド；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン、好ましくはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン又はスレオニン。
＜２＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸脱炭酸活性を有する変異ポリペプチドの製造方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン、好ましくはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン又はスレオニン。
＜３＞配列番号２で示されるアミノ酸配列において、当該アミノ酸配列の３２２位におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換すること、又は配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列の３２２位に相当する位置におけるアミノ酸残基を下記のアミノ酸に置換することを含む、インドール－２－カルボン酸に対する脱炭酸活性の付与方法；
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン、好ましくはアラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン又はスレオニン。
＜４＞＜１＞のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
＜５＞＜４＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜６＞フラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチド配列をさらに含む、＜５＞のベクター又はＤＮＡ断片。
＜７＞＜５＞又は＜６＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜８＞前記形質転換細胞又はその宿主がフラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼをコードする遺伝子をさらに保有する、＜７＞の形質転換細胞。
＜９＞細胞が大腸菌、酵母又はコリネ型細菌である、＜７＞又は＜８＞の形質転換細胞。
＜１０＞下記の一般式（１）：
The present invention also includes the following substances, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments, but the present invention is not limited to these embodiments.
<1> A polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, in which the amino acid residue at position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the following amino acid, or in which the amino acid residue at the position corresponding to position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is the following amino acid in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine or tyrosine, preferably alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, leucine, methionine, asparagine, serine or threonine.
<2> A method for producing a mutant polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, comprising substituting an amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with the amino acid shown below, or substituting an amino acid residue at a position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with the amino acid shown below in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine or tyrosine, preferably alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, leucine, methionine, asparagine, serine or threonine.
<3> A method for imparting decarboxylation activity to indole-2-carboxylic acid, comprising substituting an amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with the following amino acid, or substituting an amino acid residue at a position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with the following amino acid in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine or tyrosine, preferably alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, leucine, methionine, asparagine, serine or threonine.
<4> A polynucleotide encoding the polypeptide of <1>.
<5> A vector or a DNA fragment containing the polynucleotide of <4>.
<6> The vector or DNA fragment of <5>, further comprising a polynucleotide sequence encoding flavin mononucleotide prenyltransferase.
<7> A transformed cell containing the vector or DNA fragment of <5> or <6>.
<8> The transformed cell according to <7>, wherein the transformed cell or a host thereof further comprises a gene encoding flavin mononucleotide prenyltransferase.
<9> The transformed cell according to <7> or <8>, wherein the cell is Escherichia coli, yeast or coryneform bacteria.
<10> The following general formula (1):
で表されるインドール－２－カルボン酸類を、＜１＞のポリペプチド又は＜７＞～＜９＞のいずれかの形質転換細胞と接触させる工程を含む、下記の一般式（２）： The method includes a step of contacting an indole-2-carboxylic acid represented by the following general formula (2):
で示されるインドール類の製造方法。
＜１１＞一般式（１）及び（２）におけるＲ1及びＲ2が共に水素原子である、＜１０＞の方法。
＜１２＞インドール類を回収する工程を含む、＜１０＞又は＜１１＞の方法。
A method for producing an indole compound represented by the following formula:
<11> The method according to <10>, wherein R 1 and R 2 in the general formulae (1) and (2) are both hydrogen atoms.
<12> The method according to <10> or <11>, further comprising a step of recovering the indoles.
以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。 The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these.
試験例１ インドールの生産
（１）デカルボキシラーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
以下の実施例において、ＰＣＲはＫＯＤ Ｏｎｅ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（東洋紡）を使用して行った。ＰＣＲ産物に対してＤｐｎＩ（タカラバイオ）処理を行った後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ（タカラバイオ）を用いてＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片の連結にはＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いた。連結されたＤＮＡ断片を用いてＥＣＯＳ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株（ニッポンジーン）を形質転換し、細胞液をＬＢＡｍｐ寒天培地（Ｄｉｆｃｏ ＬＢ Ｂｒｏｔｈ Ｌｅｎｎｏｘ ２０ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ５０μｇ／ｍＬ、寒天 １．５％）に塗布した後３７℃で一晩静置し、得られたコロニーをＴＢＡｍｐ液体培地（Ｄｉｆｃｏ Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ ４７．６ ｇ／Ｌ、アンピシリンナトリウム ５０μｇ／ｍＬ）７５０μＬに接種し、３７℃で一晩培養した。得られた菌体からＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｐｌａｓｍｉｄ ＥａｓｙＰｕｒｅ（タカラバイオ）を用いてプラスミドを調製した。得られたプラスミドのＤＮＡ配列解析はサンガー法により行った（ユーロフィンジェノミクス）。
Test Example 1: Production of indole (1) Preparation of a plasmid containing a gene encoding decarboxylase In the following examples, PCR was performed using KOD One PCR Master Mix (Toyobo). After treating the PCR product with DpnI (Takara Bio), the DNA fragment was purified using NucleoSpin Gel and PCR Clean-up (Takara Bio). The DNA fragments were ligated using In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). The ligated DNA fragments were used to generate ECOS Competent E. E. coli JM109 strain (Nippon Gene) was transformed, and the cell solution was applied to LBAmp agar medium (Difco LB Broth Lennox 20 g/L, ampicillin sodium 50 μg/mL, agar 1.5%) and left to stand overnight at 37 ° C., and the obtained colonies were inoculated into 750 μL of TBAmp liquid medium (Difco Terrific Broth 47.6 g/L, ampicillin sodium 50 μg/mL) and cultured overnight at 37 ° C. Plasmids were prepared from the obtained bacterial cells using NucleoSpin Plasmid EasyPure (Takara Bio). DNA sequence analysis of the obtained plasmid was performed by the Sanger method (Eurofins Genomics).
（ａ）野生型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来デカルボキシラーゼ（ＰａＨｕｄＡ）をコードする遺伝子（配列番号１）を人工合成したＤＮＡを鋳型に、プライマーＰａＨｕｄＡ－ｉｎｓ－Ｆ（配列番号７、ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＡＡＴＣＧＧＡＧＣＧＣＧＴＴＧＧＡ）とＰａＨｕｄＡ－ｉｎｓ－Ｒ（配列番号８、ＴＧＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＧＧＣＧＴＣＧＣＣＡＡＡＡＣＣＡＴ）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。また、枯草菌由来フラビンモノヌクレオチドプレニルトランスフェラーゼ（ＢｓＵｂｉＸ）をコードする遺伝子（配列番号５）を人工合成したＤＮＡを鋳型に、プライマーＢｓＵｂｉＸ－ｉｎｓ－Ｆ（配列番号１１、ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＧＣ）とＢｓＵｂｉＸ－ｉｎｓ－Ｒ（配列番号１２、ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴ）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ産物を、ｐＥＴ２１ベクターを鋳型にプライマーｐＥＴ－ｖｅｃ－Ｆ（配列番号１３、ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣ）とｐＥＴ－ｖｅｃ－Ｒ（配列番号１４、ＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴ）を用いたＰＣＲにて増幅したＤＮＡ断片と連結することでプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＰａＨｕｄＡ－ＢｓＵｂｉＸを得た。同様に、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来デカルボキシラーゼ（ＡｎＦＤＣ１）をコードする遺伝子（配列番号３）を人工合成したＤＮＡを鋳型に、プライマーＡｎＦＤＣ１－ｉｎｓ－Ｆ（配列番号９、ＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＴＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＡ）とＡｎＦＤＣ１－ｉｎｓ－Ｒ（配列番号１０、ＴＧＡＡＴＣＡＡＡＣＣＴＣＣＴＴＴＡＡＴＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＣＡＴＴＴ）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。また、ＢｓＵｂｉＸをコードする遺伝子を人工合成したＤＮＡを鋳型に、プライマーＢｓＵｂｉＸ－ｉｎｓ－Ｆ（配列番号１１、ＡＧＧＡＧＧＴＴＴＧＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＧＣＣＧＡＡＴＴＣＡＡＡＣＧＣ）とＢｓＵｂｉＸ－ｉｎｓ－Ｒ（配列番号１２、ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＡＣＧＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＣＴＧＴＴ）を用いたＰＣＲにてＤＮＡ断片を増幅した。これらのＰＣＲ産物を、ｐＥＴ２１ベクターを鋳型にプライマーｐＥＴ－ｖｅｃ－Ｆ（配列番号１３、ＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣ）とｐＥＴ－ｖｅｃ－Ｒ（配列番号１４、ＡＴＧＴＡＴＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＴＡＡＡＧＴＴＡＡＡＣＡＡＡＡＴＴＡＴ）を用いたＰＣＲにて増幅したＤＮＡ断片と連結することでプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＡｎＦＤＣ１－ＢｓＵｂｉＸを得た。
(a) Preparation of a plasmid containing a gene encoding a wild-type enzyme Using artificially synthesized DNA of the gene (SEQ ID NO: 1) encoding decarboxylase derived from Pseudomonas aeruginosa (PaHudA) as a template, a DNA fragment was amplified by PCR using primers PaHudA-ins-F (SEQ ID NO: 7, GAAGGAGATATACATATGAATCGGAGCGCGTTGGA) and PaHudA-ins-R (SEQ ID NO: 8, TGAATCAAACCTCCTTTAGGCGTCGCCAAAACCAT). Furthermore, a DNA fragment was amplified by PCR using an artificially synthesized DNA of a gene (SEQ ID NO: 5) encoding Bacillus subtilis-derived flavin mononucleotide prenyltransferase (BsUbiX) as a template and primers BsUbiX-ins-F (SEQ ID NO: 11, AGGAGGTTTGATTCATGAAAGCCGAATTCAAACGC) and BsUbiX-ins-R (SEQ ID NO: 12, GTGGTGGTGGTGGTGTTACGCTCCACCTTTCTGTT). These PCR products were ligated to a DNA fragment amplified by PCR using the pET21 vector as a template and primers pET-vec-F (SEQ ID NO: 13, CACCACCACCACCACCACCACTGAGATC) and pET-vec-R (SEQ ID NO: 14, ATGTATATCTCCTTCTAAAGTTAAACAAATTAT) to obtain plasmid pET21a-PaHudA-BsUbiX. Similarly, a DNA fragment was amplified by PCR using an artificially synthesized DNA of a gene (SEQ ID NO: 3) encoding Aspergillus niger-derived decarboxylase (AnFDC1) as a template and primers AnFDC1-ins-F (SEQ ID NO: 9, GAAGGAGATATACATATGTCAGCACAACCAGCGCA) and AnFDC1-ins-R (SEQ ID NO: 10, TGAATCAAACCTCCTTTTAATTCGAGAACCCCATTT). Furthermore, a DNA fragment was amplified by PCR using an artificially synthesized DNA of a gene encoding BsUbiX as a template and primers BsUbiX-ins-F (SEQ ID NO: 11, AGGAGGTTTGATTCATGAAAGCCGAATTCAAACGC) and BsUbiX-ins-R (SEQ ID NO: 12, GTGGTGGTGGTGGTGTTACGCTCCACCTTTCTGTT). These PCR products were ligated to a DNA fragment amplified by PCR using the pET21 vector as a template and primers pET-vec-F (SEQ ID NO: 13, CACCACCACCACCACCACCACTGAGATC) and pET-vec-R (SEQ ID NO: 14, ATGTATATCTCCTTCTAAAGTTAAACAAATTAT) to obtain plasmid pET21a-AnFDC1-BsUbiX.
（ｂ）変異型酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドの作製
プラスミドｐＥＴ２１ａ－ＰａＨｕｄＡ－ＢｓＵｂｉＸを鋳型として、相補的プライマーＰａＨｕｄＡ－Ｗ３２２Ａ－Ｆ（配列番号１５、ＡＣＧＡＴＴＧＣＡＧＧＡＡＣＴＡＴＧＡＴＣＴＣＡＧＣＣ）、ＰａＨｕｄＡ－Ｗ３２２Ａ－Ｒ（配列番号１６、ＡＧＴＴＣＣＴＧＣＡＡＴＣＧＴＧＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＣ）を用いたＰＣＲにてプラスミドｐＥＴ２１ａ－ＰａＨｕｄＡ（Ｗ３２２Ａ）－ＢｓＵｂｉＸを構築した。同様に、プライマーＰａＨｕｄＡ－Ｗ３２２Ａ－ＦおよびＰａＨｕｄＡ－Ｗ３２２Ａ－Ｒに代えて表１の「プライマー」に示すプライマーを用いたＰＣＲにて各酵素変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを得た。
(b) Preparation of a plasmid containing a gene encoding a mutant enzyme Plasmid pET21a-PaHudA-BsUbiX was constructed by PCR using the complementary primers PaHudA-W322A-F (SEQ ID NO: 15, ACGATTGCAGGAACTATGATCTCAGCC) and PaHudA-W322A-R (SEQ ID NO: 16, AGTTCCTGCAATCGTGTGGTTCTCTTC) with the plasmid pET21a-PaHudA(W322A)-BsUbiX as a template. Similarly, plasmids containing genes encoding each enzyme mutant were obtained by PCR using the primers shown in "Primer" in Table 1 instead of primers PaHudA-W322A-F and PaHudA-W322A-R.
（２）インドールの生産
上記で得られた各プラスミドを用いてＥＣＯＳ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ニッポン・ジーン）を形質転換し、得られた形質転換細胞液をＬＢＡｍｐ寒天培地に塗布した後、３７℃で終夜静置し、得られたコロニーを試験株とした。また、同様にｐＥＴ２１ａベクターを形質転換して得られたコロニーを対照株とした。得られた菌株をそれぞれＴＢＡｍｐＩＣ培地（１Ｌあたり：Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＴＢ ｍｅｄｉｕｍ（メルク） ６０ｇ，グリセリン１０ｍＬ，アンピシリンナトリウム ５０μｇ，インドール－２－カルボン酸 ０．５ｇ）７５０μＬに接種し、３０℃で４０時間培養した。培養後の上清５０μＬを０．１％リン酸水溶液２５０μＬと混合し、アクロプレップ９６フィルタープレート（０．２μｍ，ＷＷＰＴＦＥ膜、日本ポール）を用いて不溶物の除去を行い高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に供した。ＨＰＬＣの装置は、Ｃｈｒｏｍａｓｔｅｒ（日立ハイテクサイエンス）を用いた。分析カラムには、Ｌ－カラム ＯＤＳ（４．６ｍｍ Ｉ．Ｄ．×１５０ｍｍ、化学物質評価研究機構）を用い、溶離液Ａを０．１Ｍ リン酸二水素カリウムの０．１％リン酸溶液、溶離液Ｂを７０％メタノールとし、流速１．０ｍＬ／分、カラム温度４０℃の条件にてグラジエント溶出を行なった。インドール－２－カルボン酸およびインドールの検出にはＵＶ検出器（検出波長２８０ｎｍ）を用い、濃度検量線を用いて定量した。試験株のインドール生産能は下記式（数１）に従い算出した。
(2) Production of indole ECOS competent cell BL21 (DE3) (Nippon Gene) was transformed with each of the plasmids obtained above, and the resulting transformed cell solution was spread on LBAmp agar medium and left to stand overnight at 37°C, and the resulting colonies were used as test strains. Similarly, colonies obtained by transforming the pET21a vector were used as control strains. Each of the obtained strains was inoculated into 750 μL of TBAmpIC medium (per 1 L: Overnight Express TB medium (Merck) 60 g, glycerin 10 mL, ampicillin sodium 50 μg, indole-2-carboxylic acid 0.5 g) and cultured at 30°C for 40 hours. 50 μL of the supernatant after the culture was mixed with 250 μL of 0.1% phosphoric acid aqueous solution, and insoluble matter was removed using an AcroPrep 96 filter plate (0.2 μm, WWPTFE membrane, Nippon Pole) and subjected to high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC device used was a Chromaster (Hitachi High-Tech Science). The analytical column used was an L-column ODS (4.6 mm ID x 150 mm, Chemicals Evaluation and Research Institute), and gradient elution was performed under conditions of a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 40°C, with eluent A being a 0.1% phosphoric acid solution of 0.1 M potassium dihydrogen phosphate and eluent B being 70% methanol. A UV detector (detection wavelength 280 nm) was used to detect indole-2-carboxylic acid and indole, and quantification was performed using a concentration calibration curve. The indole productivity of the test strain was calculated according to the following formula (math 1).
（数１）
試験株のインドール生産能＝試験株の培養上清中のインドール量（ｍｏｌ）／対照株の培養上清中のインドール－２－カルボン酸量（ｍｏｌ）
(Equation 1)
Indole-producing ability of test strain=amount of indole in culture supernatant of test strain (mol)/amount of indole-2-carboxylic acid in culture supernatant of control strain (mol)
（２）結果
表２に示す通り、ＰａＨｕｄＡのＷ３２２位がアラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アスパラギン（Ｎ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）に置換された酵素を発現する菌株は、ＡｎＦＤＣ１のＩ３２７位がセリン（Ｓ）に置換された酵素を発現する菌株よりも高いインドール生産能を示した。
(2) Results As shown in Table 2, the strains expressing the enzyme in which the W322 position of PaHudA was replaced with alanine (A), cysteine (C), aspartic acid (D), glutamic acid (E), phenylalanine (F), glycine (G), isoleucine (I), leucine (L), methionine (M), asparagine (N), proline (P), glutamine (Q), serine (S), threonine (T), valine (V), or tyrosine (Y) exhibited higher indole production ability than the strains expressing the enzyme in which the I327 position of AnFDC1 was replaced with serine (S).
Claims (12)
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。 A polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, in which the amino acid residue at position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the following amino acid, or in which the amino acid residue at the position corresponding to position 322 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 is the following amino acid in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。 A method for producing a mutant polypeptide having indole-2-carboxylic acid decarboxylation activity, comprising substituting an amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the amino acid shown below, or substituting an amino acid residue at a position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the amino acid shown below in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、セリン、スレオニン、バリン又はチロシン。 A method for imparting decarboxylation activity to indole-2-carboxylic acid, comprising substituting an amino acid residue at position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the following amino acid, or substituting an amino acid residue at a position corresponding to position 322 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 in an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:2 with the following amino acid;
Alanine, cysteine, aspartic acid, glutamic acid, phenylalanine, glycine, isoleucine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, serine, threonine, valine, or tyrosine.
で表されるインドール－２－カルボン酸類を、請求項１記載のポリペプチド又は請求項７～９のいずれか１項記載の形質転換細胞と接触させる工程を含む、下記の一般式（２）：
で示されるインドール類の製造方法。 The following general formula (1):
A method for producing an indole-2-carboxylic acid represented by the following general formula (2):
A method for producing an indole compound represented by the following formula:
Publications (1)
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