JP7491523B2 - 下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻からオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを製造する方法 - Google Patents
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
[1]精製されたオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを製造する方法であって、
(1)オカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを含む渦鞭毛藻の抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行うことにより、第1の精製画分を得る工程、
(2)前記第1の精製画分について金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行うことにより、第2の精製画分を得る工程、及び
(3)前記第2の精製画分について、逆相クロマトグラフィーを用いた精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを得る工程、
を含む方法。
[2]前記抽出物が、渦鞭毛藻を溶媒と接触させる工程、及び任意で液液抽出法により精製を行う工程に付すことにより得られる、[1]に記載の方法。
[3]前記π電子相互作用を利用した精製が、フェニル基を有する固相を用いた精製である、[1]又は[2]に記載の方法。
[4]前記金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製が、銀イオン浸漬シリカゲルを用いた精製である、[1]~[3]のいずれか1つに記載の方法。
[5]前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム属の渦鞭毛藻である、[1]~[4]のいずれか1つに記載の方法。
[6]前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム・リマ(Prorocentrum lima)である[1]~[5]のいずれか1つに記載の方法。
[7]前記ジノフィシストキシンがジノフィシストキシン-1である、[1]~[6]のいずれか1つに記載の方法。
[8]下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻の抽出物からオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを精製する方法であって、
(1)前記抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行うことにより、第1の精製画分を得る工程、
(2)前記第1の精製画分について金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行うことにより、第2の精製画分を得る工程、及び
(3)前記第2の精製画分について、逆相クロマトグラフィーを用いた精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを得る工程、
を含む方法。
下痢性貝毒を産生する渦鞭毛藻の前処理を行うことにより、オカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを含む抽出物を得る。ここで行われる前処理工程は、その後に行われるπ電子相互作用を利用した精製、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製、及び逆相高速液体クロマトグラフィーカラムを用いた精製により、十分に純度が高いオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンの標準物質を得ることができるものであれば良く、特に限定されるものではない。
上記1の工程で得た抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行う。この工程において使用される精製手段はπ電子相互作用を利用した精製である限り特に限定されないが、好ましくはフェニル基を有する固相を用いた精製により実施することができる。
工程2で得た第1の精製画分について、金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行う。本明細書において「金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製」とは、金属イオンが二重結合と錯体を形成することを利用した精製を言う。二重結合と錯体を形成することができる金属イオンとして銀イオンを挙げることができるが、それに限定されるものではない。
上記3の工程で得た第2の精製画分について、逆相高速液体クロマトグラフィーを用いた精製を行い、オカダ酸及び/又はジノフィシストキシンの精製された標準物質を得る。この逆相高速液体クロマトグラフィーにおいて使用されるカラムは特に限定されるものではない。下記の実施例で使用されているCAPCELL PAK ADME(大阪ソーダ)を用いることは好適であるが、他の逆相高速液体クロマトグラフィー用カラム、例えばオクタデシル基、オクタデシルシリル基、トリアコンチル基などで修飾された逆相分配系のHPLCカラムも、十分に純度が高い標準物質を得ることができる限り使用することができる。
工程1 下痢性貝毒オカダ酸及びジノフィシストキシン-1の生産と抽出
渦鞭毛藻Prorocentrum limaを培養して、オカダ酸及びジノフィシストキシン-1を生産させた。人工海水に栄養塩を添加した培地を用いて、25℃で約6週間培養した。培地を除去し、培養槽に付着したProrocentrum limaの藻体を集めた。集めた藻体をメタノールにより抽出した。
工程1で得た抽出物の溶媒を除いてメタノールに再溶解した。メタノール溶液にヘキサンを加えて攪拌し、分離したヘキサン層を除去することにより脱脂した。残ったメタノール層に蒸留水を加え、その後にクロロホルムを加えて攪拌し、クロロホルム層を分離して液液抽出画分を得た。
工程2で得られたクロロホルム層(液液抽出画分)の溶媒を除き、蒸留水:メタノール(4:1、v/v)に試料を溶解し、フェニル基を有する固相抽出カラム(Inert Sep Ph、ジーエルサイエンス)へ供した。メタノール比を10%ずつ上げるステップワイズ溶出法により、オカダ酸とジノフィシストキシン-1を精製して第一画分を得た。
工程3で得た第一画分の溶媒を除き、アセトンに溶解した試料を銀イオン浸漬シリカゲルの固相抽出カラム(Discovery Ag-ion SPE、シグマ-アルドリッチ)に供した。カラムをアセトンで洗浄した後、アセトニトリル:アセトンの比率を変えたステップワイズ溶出法で分画し、第二画分を得た。
工程4で得た第二画分の溶媒を除き、逆相高速液体クロマトグラフィーで分画に用いる移動相に溶解させた。逆相高速液体クロマトグラフィー(CAPCELL PAK ADME、大阪ソーダ)を用いて、水:アセトニトリル:酢酸(30:70:0.1)を混合した酸性条件の移動相により分離を行った。CAPCELL PAK ADMEによる高速液体クロマトグラフィーを行った際のチャートを図5に示す。
工程5で得られたオカダ酸及びジノフィシストキシン-1の精製された標準物質について核磁気共鳴装置による解析を行って純度を検定した。工程5で得られた純度95%以上のオカダ酸及びジノフィシストキシン-1のNMRスペクトルを図6に示す。このようにして得られたオカダ酸及びジノフィシストキシン-1の標準物質について、例えば定量NMR法により値付けを行い認証標準物質とすることもできる。
工程1 下痢性貝毒オカダ酸及びジノフィシストキシン-1の生産と抽出
渦鞭毛藻Prorocentrum limaを培養して、オカダ酸及びジノフィシストキシン-1を生産させた。人工海水に栄養塩を添加したものを培地として、25℃で約6週間培養した。培地を除去し、培養槽に付着したProrocentrum limaの藻体を集めた。集めた藻体をメタノールにより抽出した。
工程1で得た抽出物の溶媒を除いてメタノールに再溶解した。メタノール溶液にヘキサンを加えて攪拌し、分離したヘキサン層を除去することにより脱脂した。残ったメタノール層に蒸留水を加え、その後にクロロホルムを加えて攪拌し、クロロホルム層を分離させて採集した。
工程2で得られたクロロホルム層の溶媒を除き、ジクロロメタンとメタノール(1:1、v/v)に溶解した試料をアルミナ(Al2O3)カラムに供した。1%アンモニアを含む水:メタノール(1:1、v/v)で分画してオカダ酸及びジノフィシストキシン-1を溶出した。
工程3で分画した画分をジクロロメタン:メタノール(95:5、v/v)に溶解し、シリカゲルカラムに供した。ジクロロメタン:メタノール(95:5、v/v)及びジクロロメタン:メタノール(1:1、v/v)で分画し、1%アンモニアを含む水:メタノール(1:1、v/v)でオカダ酸及びジノフィシストキシン-1を溶出した。
工程4で分画したジクロロメタン:メタノール(1:1、v/v)画分をDeverosil LOP ODS(野村化学)の中圧カラムによって水:メタノールの比率によるステップワイズグラジエントで分画した。メタノール:水(85:15、v/v)でオカダ酸及びジノフィシストキシン-1を溶出した。
工程5で分画したメタノール:水(85:15、v/v)画分をCosmosil 5C18-AR-II(ナカライテスク)のHPLCカラムで精製した。0.1%の酢酸を含む水及びアセトニトリルの2相によるリニアグラジエントで分画し、オカダ酸及びジノフィシストキシン-1を分画した。
工程6で分画したオカダ酸及びジノフィシストキシン-1を含む画分をゲルろ過カラム(HW40S、φ100mm×300mm、東ソー)でメタノールを移動相として、オカダ酸及びジノフィシストキシン-1を分画した。
工程7で分画したオカダ酸及びジノフィシストキシン-1を、Deverosil C30 UG-5(野村化学)のHPLCカラムで0.5%酢酸を含むアセトニトリル:水(7:3、v/v)で精製し、オカダ酸及びジノフィシストキシン-1を得た。
Claims (7)
- 精製されたオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを製造する方法であって、
(1)オカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを含む渦鞭毛藻の抽出物についてπ電子相互作用を利用した精製を行うことにより、第1の精製画分を得る工程、
(2)前記第1の精製画分について金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製を行うことにより、第2の精製画分を得る工程、及び
(3)前記第2の精製画分について、逆相クロマトグラフィーを用いた精製を行うことにより、精製されたオカダ酸及び/又はジノフィシストキシンを得る工程、
を含む方法。 - 前記抽出物が、渦鞭毛藻を溶媒と接触させる工程、及び任意で液液抽出法により精製を行う工程に付すことにより得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記π電子相互作用を利用した精製が、フェニル基を有する固相を用いた精製である、請求項1又は請求項2に記載の方法。
- 前記金属イオンと二重結合との錯体形成を利用した精製が、銀イオン浸漬シリカゲルを用いた精製である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム属の渦鞭毛藻である、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記渦鞭毛藻が、プロロセントラム・リマ(Prorocentrum lima)である請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ジノフィシストキシンが、ジノフィシストキシン-1である、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
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Journal of AOAC International,2016年,Vol.99, No.5 ,pp.1151-1162 |
Journal of Chromatgraphic Science,2013年,Vol.51,pp.166-172 |
SHIMADZU,C18(ODS)で困ったときに:フェニルカラムによる分離の改善,Technical Report No.50,2011年,pp.1-4 |
SUPELCO,Discovery Ab-Ion SPE for FAME Fractionation and Cis/Trans Separation,Technical Report,2006年,pp.1-9 |
アジレント・テクノロジー株式会社,Bond Elut QuEchERS EMR Lipidsを用いた下痢性貝毒分析の前処理法,2016年,Pub. No. LC-MS-201607TK-001,pp.1,2 |
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