JP7483234B2 - Ｈｉｖワクチン免疫原 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく、２０１８年１２月４日に出願された米国仮特許出願第６２／７７５，１９２号に対する優先権を主張する。上記の出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１９年１１月１４日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーの名称は０７０４１３＿２０４０３＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１７８，８３８バイトである。

技術分野
本開示は、免疫原性ポリペプチドに関し、具体的には、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ：ＨＩＶ）に対する免疫応答を刺激することができる免疫原性ポリペプチドに関する。

ＨＩＶ－１感染ヒトドナーからの単一細胞抗体クローニングにより、広域中和抗ＨＩＶ－１抗体（ｂｒｏａｄｌｙ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｎｔｉ－ＨＩＶ－１ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｂＮＡｂ）が高度に体細胞変異しているという点で珍しいことが明らかになった。更に、高度の体細胞変異は、天然のＨＩＶ－１ Ｅｎｖへの結合及びｂＮＡｂ中和活性に不可欠である。多数の変異の蓄積は、ｂＮＡｂが、胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ：ＧＣ）における体細胞高頻度変異及び選択の反復ラウンドに応答して進化することを示唆している。ヒトにおける前向き研究によって明らかにされるように、ｂＮＡｂは、抗体圧から生じるウイルス回避バリアントに応答して進化する。まとめると、これらの所見は、ｂＮＡｂを誘発するためのワクチン接種が、ｂＮＡｂの生殖系列前駆体を保有するＢリンパ球の増殖を誘導する免疫原から出発する一連の連続免疫原を必要とすることを示唆している。

連続した免疫化がｂＮＡｂの発達を導くことができるという考えは、ヒトｂＮＡｂの推定生殖系列（ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｇｅｒｍｌｉｎｅ：ｉＧＬ）前駆体を保有する遺伝子改変マウスにおける実験によって確認された。しかしながら、応答を開始するために使用されるプライミング免疫原は、ポリクローナル抗体レパートリを有する動物において、推定されたｂＮＡｂ前駆体を発現するＢ細胞を活性化及び増殖させることができなかった。実際、ほぼ全てのｂＮＡｂのｉＧＬは、天然様ＨＩＶ－１免疫原に結合することができないか、又はＨＩＶ－１株を中和することができない。したがって、ＨＩＶ－１ワクチン開発の重要な目標は、ｂＮＡｂ前駆体を発現するＢ細胞を、霊長類を含むポリクローナルレパートリを有する動物のＧＣ反応に動員する免疫原を設計することであった。

この目的のために、免疫原設計への生殖系列標的化アプローチは、特異的ｂＮＡｂ前駆体に高親和性で結合する免疫原の製造に焦点を当てており、その理論的根拠は、ＧＣへのＢ細胞動員が抗原に対する受容体親和性に部分的に依存することである。しかしながら、この方法論は、動員されたＢ細胞のレパートリを定性的及び定量的に、効果的に制限する。更に、各ＧＣが広範囲の親和性で複数の異なる創始Ｂ細胞を受け入れることができ、ＧＣ侵入（ＧＣ ｅｎｔｒｙ）が競合によって制限され、かつ絶対的な親和性ではないという知見を説明することができない。代替法は、オフターゲット部位をマスクしながら標的化エピトープの利用可能性を高める免疫原を設計することである。このアプローチは、抗原に対する特定の生殖系列抗体の親和性に関知しないという点で、生殖系列標的化とは異なる。代わりに、標的部位に特異的な前駆体の多様な群を動員及び増殖することを目的とする。どちらのアプローチもＢ細胞の増殖クローンを産生することを目的としており、その後、連続的な免疫原により増強してｂＮＡｂ産生を導くことができる。今日まで、これらの方法のいずれも、野生型動物において所望のＨＩＶ－１標的に特異的なＢ細胞クローンの増殖は示されていない。

したがって、例えば所望のＨＩＶ－１標的に特異的なＢ細胞クローンを増殖させることによって、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対する免疫応答を刺激することができる免疫原の差し迫った必要性が依然として存在する。

本文書に記載される様々な実施形態は、ＨＩＶ免疫原及びその使用を提供することで、上述の満たされていないニーズ及び／又は他のニーズに対処する。

一態様では、本開示は、必要とする対象の免疫応答（例えば、ＨＩＶ免疫応答）を刺激するための免疫原に関する。免疫原は、配列番号２、４、６、８、１１及び１３からなる群から選択される配列と少なくとも７５％同一の配列を有するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、配列番号１のＮ１３３、Ｎ１３７及びＮ１５６に対応する位置に置換を含む。一例では、ポリペプチドは、Ｎ１５６Ｑ置換又はＮ１５６の保存的置換を含む。別の例では、ポリペプチドは、Ｖ１３４Ｙ、Ｔ１３５Ａ、Ｉ１３８Ｌ、Ｔ１３９Ｌ、Ｄ１４０Ｓ、Ｄ１４１Ｎ、Ｔ３２０Ｆ、Ｑ３２８Ｍ、Ｔ４１５Ｖ置換又はそれらの保存的置換を含む。

上記免疫原は、広域中和抗体に親和性（例えば、約５０μＭ以下のＫ_Ｄ）で結合する。広域中和抗体の例としては、１０－１０７４及びＰＧＴ１２１広域中和抗体を挙げることができる。

上記のポリペプチドをコードする単離された核酸、核酸を含むベクタ、及び核酸を含む宿主細胞もまた本発明の範囲内である。宿主細胞はポリペプチドの製造方法で使用することができる。本方法は、この宿主細胞を、核酸によりコードされるポリペプチドが発現可能な条件下における培地中で培養し、培養細胞又は細胞の培地からポリペプチドを精製することを含む。

別の態様では、本開示は、少なくとも１つの上記ポリペプチドを含むタンパク質複合体と、少なくとも１つの上記ポリペプチドを含むウイルス粒子と、を提供する。

別の態様では、本開示は、必要とする対象において免疫応答を刺激するための免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、（ｉ）上記のポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体又はウイルス粒子、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。本方法は組成物を２回以上投与することを更に含み得る。この組成物の投与は、Ｖ３－グリカンエピトープを認識可能な血清中の広域中和抗体の数を増加させ得る。

別の態様では、本開示は、必要とする対象において免疫応答を刺激する方法を提供する。この方法は、上記のポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ：ＶＬＰ）、又はそれらの組合せを含む、有効量の組成物を対象に投与することを含む。

別の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるＨＩＶ感染症を治療又は予防する方法を提供する。この方法は、上記のポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス粒子、又はそれらの組合せの治療有効量を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、本方法はまた、治療有効量の抗ウイルス剤を対象に投与することも含み得る。

別の態様では、本開示は、対象におけるＨＩＶ感染症の治療又は予防のための医薬品の調製における、上記のポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス粒子、又はそれらの組合せの使用を提供する。

別の態様では、本開示は、ＨＩＶ－１に感染した対象においてＨＩＶ－１結合抗体を検出又は単離する方法を提供する。本方法は、以下：（ｉ）上記のポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス粒子、又はそれらの組合せを提供すること；と、（ｉｉ）免疫原性組成物を対象からの一定量の体液と接触させること；と、（ｉｉｉ）ＨＩＶ－１結合抗体のポリペプチドへの結合を検出し、それにより対象におけるＨＩＶ－１結合抗体を検出又は単離することと、を含む。

更に別の態様では、本開示は、対象において免疫応答を刺激するためのキットを提供する。このキットは、（ｉ）上記のポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体又はウイルス粒子のうち１種以上の単位投与量、（ｉｉ）ポリペプチド、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体又はウイルス粒子を投与するための説明書、及び（ｉｉｉ）任意にアジュバントを含む。

本開示はまた、表４、５、６、７、９、１０及び１１に列挙されるポリペプチド配列と少なくとも７５％同一の配列を有する相補性決定領域を含む、単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分も提供する。

本開示の主旨の範囲内には、上記のような単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分と、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、医薬組成物もある。

別の態様では、本開示は、ＨＩＶ感染症又はＨＩＶ関連疾患を予防又は治療する方法であって、以下の工程：（ｉ）かかる予防又は治療を必要とする患者を同定することと、（ｉｉ）治療有効量である上記の少なくとも１つの抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分を含む、第１の治療剤を該患者に投与することと、を含む、方法を提供する。本開示は更に、薬学的有効量の少なくとも１つの上記単離された抗ＨＩＶ抗体又はその抗原結合部分の薬学的に許容される用量単位を含むキットを更に提供する。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細は以下の説明に記載される。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。

図１ａは、ＲＣ１免疫原の特性を示す図である。図１ｂは、ＲＣ１免疫原の特性を示す図である。図１ｃは、ＲＣ１免疫原の特性を示す図である。図１ａは、ｗｔＢＧ５０５、１１ＭＵＴＢ及びＲＣ１ Ｅｎｖ三量体のＶ３－グリカンパッチにおけるＮ－グリカン（着色した球）及びＧＤＩＲモチーフ（配列番号１５）（赤色の表面）の位置を示す。グリカンの座標を、トップダウン配向で見られるｗｔＢＧ５０５ Ｅｎｖ三量体構造（ＰＤＢ ５Ｔ３Ｚ）（ＰＤＢ ５ＦＹＬ由来のＮ１３７グリカン）の曲面表現上にマッピングする。図１ｂは、１０－１０７４Ｆａｂと複合体化したｗｔＢＧ５０５（ＰＤＢ ５Ｔ３Ｚ）（左）及びＲＣ１（右）（４．０Å ｃｒｙｏ－ＥＭ構造）の構造の比較を示す。Ｅｎｖ三量体－Ｆａｂ複合体は、着色した球としてグリカン原子を有する曲面表現として側面から示されている。中央のパネルは、ｗｔＢＧ５０５及びＲＣ１との１０－１０７４複合体のボックス内領域をクローズアップした重複画像を示す。タンパク質領域は漫画的表現で示され（１０－１０７４ Ｖ_Ｈ及びＶ_Ｌは濃紫色及び薄紫色、Ｅｎｖ ＧＤＩＲ領域は赤色（配列番号１５）、コムギのＲＣ１の他の部分であるｗｔＢＧ５０５は灰色で示され、Ｎ１５６グリカンはオレンジ色の球で示したｗｔＢＧ５０５構造により座標を示す。構造間の最大置換（ｇｐ１２０残基１３９～１４０）を示すＶ１の領域の位置は、置換を示す矢印を伴うドットによって示されている。Ｖ１残基１４９～１５１は、ＲＣ１構造では順序付けられているが、ｗｔＢＧ５０５構造では順序付けられていない。図１ｃは、ＰＧＴ１２１及び１０－１０７４の一般的なｉＧＬのＦａｂを示された固定化Ｅｎｖ三量体上に注入した実験について示された、ＳＰＲ結合データ（Ｒ_ｅｑ、平衡結合応答対注入タンパク質の濃度の対数）を示す。Ｎ．Ｂ．＝バックグラウンドを超える結合なし。 図２ａは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｂは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｃは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｄは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｅは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｆは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｇは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｈは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。 図２ｉは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｊは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｋは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ｌは、ＲＣ１誘発抗グリカンパッチ抗体による野生型マウス免疫化を示す図である。図２ａは、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４ ｉＧＬ抗体を保有するノックインマウス由来の血清の、１１ＭＵＴＢによる免疫化後の１１ＭＵＴＢとの結合（左）、及びＲＣ１による免疫化後のＲＣ１との結合（右）を示す、代表的なＥＬＩＳＡ結果である。対照には、ナイーブ血清、精製ＰＧＴ１２１及びｉＧＬ－ＰＧＴ１２１が含まれる。図２ｂは、図２ａと同様のＥＬＩＳＡの曲線下面積（ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｃｕｒｖｅ：ＡＵＣ）を示すが、各３匹のマウスを用いた２回の独立した実験の結果を組み合わせたものである。各ドットは１匹のマウスの血清を表す。図２ｄは、１１ＭＵＴＢ（左）及びＲＣ１（右）で免疫化した野生型マウスからの血清の、それぞれ１１ＭＵＴＢ及びＲＣ１への結合に対する代表的なＥＬＩＳＡ結果を示す。図２ｄは、図２ｃと同様にＥＬＩＳＡのＡＵＣを示すが、各３匹のマウスを用いた２つの実験の結果を組み合わせたものである。各ドットは１匹のマウスの血清を表す。図２ｅは、ＥＬＩＳＡにおけるＲＣ１～ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯで免疫化した１つの代表的な野生型マウス由来の血清の結合を示す。図２ｆは、図２ｅと同様のＲＣ１対ＲＣ１－グリカンＫＯ ＥＬＩＳＡのＡＵＣの比を示す。グラフは、ＲＣ１で免疫化した２～３匹のマウスによる７回の実験の結果を組み合わせたものを示す。各点は１匹のマウスを表す。図２ｇは、１１ＭＵＴＢΔ３０１～１１ＭＵＴＢΔ３０１で免疫化した野生型マウスの血清の結合を示す代表的なＥＬＩＳＡ結果を示す。図２ｈは、ＲＣ１又はＲＣ１－４ｆｉｌｌで免疫化した野生型マウスのＲＣ１対ＲＣ１－グリカンＫＯ ＥＬＩＳＡのＡＵＣの比を示す。図２ｉは、ＩｇＶ_Ｈ遺伝子シーケンシングによって決定されたＲＣ１結合胚中心Ｂ細胞のクローン増殖を示す円グラフである。着色された扇形はクローン関連物の数に比例する。白色は単一のＩｇＶ_Ｈ配列を示す。中央の数字は分析した重鎖の数を示す。図２ｊは、図２ｉのナイーブ及びＲＣ１免疫化マウス由来のＩｇＨヌクレオチド変異を示す。図２ｋは、ＥＬＩＳＡにおけるＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯに対するＲＣ１免疫化マウスから得られたモノクローナル抗体の結合を示す。図２ｌは、示されたＥｎｖタンパク質に対するＥＬＩＳＡによる、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌ免疫化野生型マウスから単離されたＡｂ２７５_ＭＵＲ及びＡｂ２７６_ＭＵＲの結合パターンの特徴付けを示す。図２ｌは、配列番号１６として「ＧＡＩＡ」を開示している。 図３ａは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｂは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｃは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｄは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。 図３ｅは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｆは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｇは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｈは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｉは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ｊは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化が、ｉＧＬ ｂＮＡｂに類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す一組の図である。図３ａは、ＲＣ１、ｓｐｙｔａｇ、ｓｐｙｃａｔｃｈｅｒ及びＶＬＰを示すＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰの図を示す。図３ｂは、ＶＬＰ（上）及びＲＣ１－４ｆｉｌｌ－ＶＬＰ（下）の電子顕微鏡写真を示す。図３ｃは、ナイーブ対照であるＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰ、並びにモノクローナル抗体ＰＧＴ１２１及び３ＢＮＣ１１７で免疫化した４匹のウサギ由来の血清の、ＥＬＩＳＡ曲線下面積（ＡＵＣ）として示されるＲＣ１（黒色）及びＲＣ１－グリカンＫＯ（灰色）への結合を示す。図３ｄは、ナイーブ対照であるＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰ、並びにモノクローナル抗体ＰＧＴ１２１及び３ＢＮＣ１１７で免疫化した８匹のアカゲザル由来の血清の、ＥＬＩＳＡ曲線下面積（ＡＵＣ）として示されるＲＣ１（黒色）及びＲＣ１－グリカンＫＯ（灰色）への結合を示す。図３ｅは、ナイーブ（左）及び免疫化マカク（右）に関する、ＲＣ１－ＰＥ（Ｙ軸）及びＲＣ１－ＡＦ６４７又はＲＣ１－グリカンＫＯ（Ｘ軸）へのマカク胚中心Ｂ細胞結合を示す、代表的なフローサイトメトリのドットプロットである。図３ｆは、フローサイトメトリによってＲＣ１に結合するがＲＣ１－グリカンＫＯには結合しない４匹のナイーブマカク又は４匹の免疫化マカク由来のリンパ節試料からの、胚中心における全Ｂ細胞の割合を示す。図３ｇは、ＩｇＨ遺伝子シーケンシングによって決定されたＲＣ１結合胚中心Ｂ細胞のクローン増殖を示す円グラフである。中央の数字は分析したＩｇＶ_Ｈ配列の数を示す。図３ｈは、図３ｇの全配列に対するＩｇＶ_Ｈ変異を示し、各ドットは１つのＩｇＶ_Ｈを表す。図３ｉは、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４に関するＣＤＲＬ３（配列番号４４６）のｉＧＬ配列、及び免疫化マカク由来のＲＣ１結合ＧＣＢ細胞からクローニングされた全ＩｇＬ鎖に関するロゴプロット（ｌｏｇｏ ｐｌｏｔ）を示す。図３ｊは、ＤＳＳ様モチーフを示す４匹のナイーブマカク及び４匹のＲＣ１免疫化マカク由来のＧＣ Ｂ細胞からクローニングされた、ＩｇＬ ＣＤＲ３配列のフラクションを示す。 図４ａは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰで免疫化したマカク由来のモノクローナル抗体が、Ｖ３－グリカンパッチに結合することを示す。図４ｂは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰで免疫化したマカク由来のモノクローナル抗体が、Ｖ３－グリカンパッチに結合することを示す。図４ｃは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰで免疫化したマカク由来のモノクローナル抗体が、Ｖ３－グリカンパッチに結合することを示す。図４ｄは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰで免疫化したマカク由来のモノクローナル抗体が、Ｖ３－グリカンパッチに結合することを示す。図４ｅは、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰで免疫化したマカク由来のモノクローナル抗体が、Ｖ３－グリカンパッチに結合することを示す。図４ａは、ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯ－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）へのモノクローナルマカク抗体の結合に対するＥＬＩＳＡの結果を示す。対照は１０－１０７４及び３ＢＮＣ１１７である。図４ｂは、Ｖ３－グリカンパッチ特異的マカク抗体のＩｇＨ ＣＤＲ３長さを示す。図４ｃは、Ｖ３－グリカンパッチ特異的マカク抗体のＩｇＶ_Ｈ及びＩｇＶ_Ｌ領域における、多数のヌクレオチド変異を示す。図４ｄは、抗体Ａｂ８７６_ＮＨＰ、Ａｂ８９７_ＮＨＰ、Ａｂ９３３_ＮＨＰ、Ａｂ９３６_ＮＨＰ、Ａｂ１１７０_ＮＨＰ、３ＢＮＣ１１７及び１０－１０７４に関して、示されたタンパク質上のＥＬＩＳＡについての曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。図４ｅは、配列番号１６として「ＧＡＩＡ」を開示している。 図５ａは、１０－１０７４の構造及びＲＣ１免疫原に結合した誘発抗体の比較を示す。図５ｂは、１０－１０７４の構造及びＲＣ１免疫原に結合した誘発抗体の比較を示す。図５ｃは、１０－１０７４の構造及びＲＣ１免疫原に結合した誘発抗体の比較を示す。図５ａは、他のＶ３－グリカンパッチｂＮＡｂ Ｆａｂ（ＰＧＴ１２８及びＰＧＴ１３５；ＰＤＢ ５ＡＣＯ及び４ＪＭ２）（左）、Ａｂ２７５_ＭＵＲ（左から２番目）、Ａｂ８７４_ＮＨＰ（左から３番目）及びＡｂ８９７_ＮＨＰ（右）と比較した、１０－１０７４Ｆａｂの結合配向の下向き図を示す。Ｅｎｖ及びＦａｂ構造を漫画表現で示す。図５ｂ（上パネル）は、１０－１０７４のＶ_Ｈ－Ｖ_Ｌドメイン（左）及びＲＣ１三量体の１つのプロトマ上のＶ３－グリカンパッチに結合した誘発抗体Ｆａｂ（右パネル３つ）を示す（ＲＣ１ Ｅｎｖ三量体に結合した１０－１０７４（左）、Ａｂ２７５_ＭＵＲ（左から２番目）、Ａｂ８７４_ＮＨＰ（左から３番目）及びＡｂ８９７_ＮＨＰ（右）の複合体のｃｒｙｏ－ＥＭ構造由来）。ｇｐ１２０上のＧＤＩＲ残基（配列番号１５）は赤色で強調され、グリカン座標は着色した球として示されている。図５ｂ（下パネル）は、ループとして強調されたＣＤＲ、並びに抗体結合部位にマッピングされたＲＣ１由来のｇｐ１２０グリカン（着色した球）及びＧＤＩＲ（配列番号１５）（赤）領域とを有する抗体結合部位の下向き図を示すための、上のパネルにおける複合体の９０°回転を示す。図５ｃは、ＧＤＩＲモチーフ（配列番号１５）と、１０－１０７４及び誘発抗体との相互作用の比較を示す。 図６ａは、ＥＬＩＳＡによってｂＮＡｂとの相互作用を評価することによるＲＣ１の特徴付けを示す。図６ａは、Ｎ１５６グリカン３２と相互作用するＶ１－Ｖ２特異的ｂＮＡｂがＢＧ５０５と比較してＲＣ１への結合の減少を示し、Ｎ１５６ ＰＮＧＳの非存在がＰＧＴ１２１及び１０－１０７４による中和を増強することを示す。図６ｂは、ＥＬＩＳＡによってｂＮＡｂとの相互作用を評価することによるＲＣ１の特徴付けを示す。図６ａは、Ｎ１５６グリカン３２と相互作用するＶ１－Ｖ２特異的ｂＮＡｂがＢＧ５０５と比較してＲＣ１への結合の減少を示し、Ｎ１５６ ＰＮＧＳの非存在がＰＧＴ１２１及び１０－１０７４による中和を増強することを示す。図６ｂは、Ｖ３－グリカンエピトープ、ＣＤ４結合部位又はｇｐ１２０－ｇｐ４１界面を標的とするｂＮＡｂが、ＲＣ１及びＢＧ５０５と同様に結合したことを示す。 図７ａは、１０－１０７４（図７ａ）の抗原結合断片（ａｎｔｉｇｅｎ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｆｒａｇｍｅｎｔ：Ｆａｂ）と複合体化したＲＣ１の単一粒子ｃｒｙｏ－ＥＭ試験を示す。図７ｂは、Ａｂ８７４_ＮＨＰ（図７ｂ）の抗原結合断片（Ｆａｂ）と複合体化したＲＣ１の単一粒子ｃｒｙｏ－ＥＭ試験を示す。 図７ｃは、Ａｂ２７５_ＭＵＲ（図７ｃ）の抗原結合断片（Ｆａｂ）と複合体化したＲＣ１の単一粒子ｃｒｙｏ－ＥＭ試験を示す。図７ｄは、Ａｂ８９７_ＮＨＰ（図７ｄ）の抗原結合断片（Ｆａｂ）と複合体化したＲＣ１の単一粒子ｃｒｙｏ－ＥＭ試験を示す。 図８は、ＲＣ１免疫化マウス由来の血清が、１１ＭＵＴＢと交差反応したが、より天然の１０ＭＵＴ Ｅｎｖ又はＢＧ５０５には交差反応しなかったことを示す。 図９ａは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌの特徴付け、並びにオフターゲット部位に対するそれらの応答を示す。図９ｂは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌの特徴付け、並びにオフターゲット部位に対するそれらの応答を示す。図９ｃは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌの特徴付け、並びにオフターゲット部位に対するそれらの応答を示す。図９ｄは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌの特徴付け、並びにオフターゲット部位に対するそれらの応答を示す。 図１０は、野生型マウスにおいてＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌによって誘発される体液性応答の特徴付けを示す。ＲＣ１に結合したがＲＣ１－グリカンＫＯには結合しなかった単一ＧＣ Ｂ細胞由来の抗体遺伝子をシーケンシングした。 図１１ａは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌが、野生型マウスにおいてＶ３－グリカンパッチ特異的Ｂ細胞を増殖させたことを示す。図１１ｂは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌが、野生型マウスにおいてＶ３－グリカンパッチ特異的Ｂ細胞を増殖させたことを示す。図１１ｃは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌが、野生型マウスにおいてＶ３－グリカンパッチ特異的Ｂ細胞を増殖させたことを示す。図１１ｄは、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌが、野生型マウスにおいてＶ３－グリカンパッチ特異的Ｂ細胞を増殖させたことを示す。ＲＣ１（Ａｂ２７５_ＭＵＲ）又はＲＣ１－４ｆｉｌｌ（Ａｂ２７６_ＭＵＲ）で免疫化したマウスから単離した両方の抗体は、１１ＭＵＴＢに結合したが、ＢＧ５０５又はＶ３ループのクラウンを覆うペプチドには結合しなかった（図１１ａ）。Ａｂ２７５_ＭＵＲはＫ_Ｄ約３０ｎＭでＲＣ１に結合した（図１１ｂ）。重要なことに、Ａｂ２７５_ＭＵＲは１１ＭＵＴＢへの結合を保持し（Ｋ_Ｄ約２３０ｎＭ）、Ｎ１５６グリカンを受け入れられることが実証された（図１１ｃ）。ｉＧＬ配列への復帰はＲＣ１への結合喪失をもたらしたので、獲得された突然変異は結合に不可欠であった（図１１ｄ）。 図１２は、ＶＬＰ－ＲＣ１－４ｆｉｌｌが、ウサギ及びアカゲザルにおいてＶ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す。ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰでプライミングされたマカク由来の血清は、より天然様の免疫原１１ＭＵＴＢ及び１０ＭＵＴへの結合の連続的な減少を示した。 図１３ａは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。図１３ｂは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。 図１３ｃは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。図１３ｄは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。 図１３ｅは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。図１３ｆは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。 図１３ｇは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。図１３ｈは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。図１３ｉは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。図１３ｊは、ＲＣ１－３ｆｉｌｌを含む免疫原の特徴付けを示す図である。（まとめて「図１３」）。図１３ａは、ＲＣ１、ＲＣ１－３ｆｉｌｌ及びＲＣ１－４ｆｉｌｌ免疫原のサイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＳＥＣ）トレースを示す図である。図１３ｂは、各免疫原についてのＨＥＫ ２９３Ｔ ６Ｅ細胞における１Ｌ発現からの代表的な収率を提示する。図１３ｃ、図１３ｄ、図１３ｅ及び図１３ｆは、ＲＣ１及びＲＣ１－３ｆｉｌｌ免疫原のＳＥＣトレース及び電子顕微鏡写真を示す図のセットである。図１３ｇは、ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰ及びＡＰ２０５－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＶＬＰの精製のための代表的なＳＥＣトレースを示す。図１３ｄは、ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰ（左）及びＡＰ２０５－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＶＬＰ（右）の電子顕微鏡写真を示す。図１３ｅは、ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ及びｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰの精製のための代表的なＳＥＣトレースを示す。図１３ｆは、ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（左）及びｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰ（右）の電子顕微鏡写真を示す。図１３ｆ及び図１３ｈは、ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰ（図１３ｆ）及びｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（図１３ｈ）の初期精製、並びに２８日目（ＡＰ２０５）及び１１日目（ｍｉ３）における試料の再注入の両方に対する、ＳＥＣプロファイルを示す。図１３ｉ及び図１３ｊは、ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（図１３ｉ）又はｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰ（図１３ｊ）のいずれか、ナイーブ対照並びにモノクローナル抗体１０－１０７４及び３ＢＮＣ１１７で免疫化した６匹の野生型マウス由来血清の、ＥＬＩＳＡ曲線下面積（ＡＵＣ）として示されるＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯへの結合を示す。

対象において免疫応答を刺激するための開示された免疫原は、新規免疫原ＲＣ１及びそのバリアントが、ポリクローナルレパートリ内のｂＮＡｂの前駆体を発現するＢ細胞を活性化するという予想外の発見に基づく。

広域中和抗体（ｂＮＡｂ）はＨＩＶ－１感染を防ぎ、これを誘発するワクチンが有効であることを示唆している。しかしながら、主な障害の１つはワクチン接種がｂＮＡｂを誘発しないことであり、その理由の１つは、生殖系列ｂＮＡｂ前駆体を発現するＢ細胞が天然様ＨＩＶ－１エンベロープ（Ｅｎｖ）抗原に応答しないことである。したがって、本開示は、例えばグリカンの付加及び／又はウイルス様粒子への多量体化によって、保存されていない免疫優性領域を隠ぺいする一方で、ＨＩＶ－１ Ｅｎｖ上におけるＶ３－グリカンパッチの認識を促進する免疫原を提供する。本開示は、開示された免疫原（例えば、ＲＣ１、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ、ＲＣ１－３ｆｉｌｌ）によるマウス、ウサギ及びアカゲザルの免疫化が、Ｖ３－グリカンパッチを標的とする血清学的応答を誘発したことを実証する。更に、抗体－Ｅｎｖ複合体の抗体クローニング及びｃｒｙｏ－ＥＭ構造は、ＲＣ１免疫化は、ヒトｂＮＡｂの予測前駆体に類似する抗Ｖ３－グリカンパッチ抗体を保有するＢ細胞のクローンを増殖させることを確認した。したがって、開示される免疫原、例えばＲＣ１とは、対象において免疫応答（例えば、ＨＩＶ免疫応答）を刺激するための逐次ワクチン接種戦略に適したプライミング免疫原である。

Ｉ．免疫原及び免疫原性組成物
Ａ．ポリペプチド
本開示は、それを必要とする対象の免疫応答（例えば、ＨＩＶ免疫応答）を刺激するための免疫原及びそのバリアントを提供する。いくつかの実施形態では、免疫原は、ＨＩＶエンベロープタンパク質の一部、すなわちＨＩＶの表面に位置するｇｐ１２０を含む。ｇｐ１２０は、そのカルボキシル末端領域で膜二重層にアンカーされたＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０のＮ末端セグメントである。ｇｐ１２０はビリオンを取り囲む水性環境中に突出するが、そのＣ末端の対応物であるｇｐ４１は、膜に及ぶ。ｇｐ１２０分子は６０，０００ダルトンのポリペプチドコアからなり、これはＮ結合型グリコシル化によって広範囲に修飾されることで、分子の見かけの分子量を１２０，０００ダルトンに増加させる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、５つの超可変ドメインが散在する５つの比較的保存されたドメインを含有する。ｇｐ１２０一次配列中の１８個のシステイン残基の位置及びｇｐ１２０配列中のおよそ２４個のＮ結合型グリコシル化部位の１３個の位置は、全てのｇｐ１２０配列に共通である。

いくつかの実施形態では、免疫原は、ｇｐ１２０のＥｎｖ Ｖ３領域を含み得る。ｇｐ１２０のＥｎｖ Ｖ３領域は、Ｅｎｖ Ｖ３領域を取り囲む高マンノース及び複合型Ｎ－グリカンの群を含む、Ｖ３－グリカン・パッチ・エピトープを包含する。Ｖ３－グリカン・パッチ・エピトープでは、グリコシル化は概して、ｇｐ１２０の残基Ｎ１３３、Ｎ１３７、Ｎ１５６、Ｎ２９５、Ｎ３０１、Ｎ３３２、Ｎ３３９、Ｎ３８５、及びＮ３９２で起こる。ｂＮＡｂ、例えばＰＧＴ１２１、１０－１０７４及びＢＧ１８は、Ｖ３－グリカン・パッチ・エピトープを標的とする。これらは、伸長したＣＤＲＨ３ループ並びにＣＤＲＬ１及びＣＤＲＬ３の一部を用いてグリカンを介し到達して、Ｖ３ループの基部で高度に保存されたＧＤＩＲモチーフ（Ｇ３２４－Ｄ３２５－Ｉ３２６－Ｒ３２７）（配列番号１５）と接触する。

いくつかの実施形態では、免疫原は、ｇｐ１２０のＥｎｖ Ｖ３領域に１つ以上の修飾を含み得る。免疫原は、表１に列挙される配列番号２、４、６、８、１１及び１３からなる群から選択される配列と少なくとも７５％同一の配列を有するポリペプチドを含む。ポリペプチドは、Ｅｎｖ領域の１つ以上のグリコシル化部位（例えば、Ｎ１３３、Ｎ１３７、Ｎ１５６、Ｎ２９５、Ｎ３０１、Ｎ３３２、Ｎ３３９、Ｎ３８５及びＮ３９２）における置換を含み得る。例えば、ポリペプチドは、配列番号１のＮ１３３、Ｎ１３７及びＮ１５６に対応する位置における置換を含み得る。一例では、ポリペプチドは、Ｎ１５６Ｑ置換又はＮ１５６の保存的置換を含む。別の例では、ＲＣ１（配列番号２、表１）などのポリペプチドは、Ｎ１３３、Ｎ１３７及びＮ１５６における欠失、並びにＶ１３４Ｙ、Ｔ１３５Ａ、Ｉ１３８Ｌ、Ｔ１３９Ｌ、Ｄ１４０Ｓ、Ｄ１４１Ｎ、Ｔ３２０Ｆ、Ｑ３２８Ｍ及びＴ４１５Ｖを含む更なる置換を含む。実施例で示されるように、ＲＣ１などの開示された免疫原は、マウス、ウサギ及びアカゲザルにおいてヒトＶ３－グリカンｂＮＡｂ前駆体に類似する抗体を発現するＢ細胞の多様な群を活性化及び増殖させる。

ＨＩＶ免疫原の上記のアミノ酸又は核酸配列には、Ｎ末端（アミノ酸配列の場合）又は５’末端（核酸配列の場合）における分泌リーダ配列が含まれる。分泌リーダ配列は一般的な分泌シグナルであり、最終／成熟発現タンパク質の一部ではない。当業者によって理解されるように、他の分泌リーダ配列もまた、同じ最終／成熟ＨＩＶ免疫原を生成するために使用することができる。

「ポリペプチド」は、その従来の意味で、すなわちアミノ酸の配列として用いている。ポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されない。ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドの定義に含まれ、かかる用語は、特に別段の指示がない限り、本明細書では互換的に用いることができる。この用語は、自然に発生するもの及び自然に発生しないもの両方の、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化など、及び当該技術分野において公知の他の修飾も含む。ポリペプチドは、タンパク質全体である場合もあり、又はその部分配列である場合もある。ポリペプチド「バリアント」は、この用語を本明細書において用いる場合、本明細書に具体的に開示するポリペプチドとは１つ以上の置換、欠失、付加及び／又は挿入の点で典型的に異なるポリペプチドである。かかるバリアントは、天然起源である場合もあり、又は例えば、本開示の上記ポリペプチド配列の１つ以上の修飾、及び本明細書に記載のポリペプチドの１つ以上の生物活性の評価、及び／若しくは当該技術分野において周知のいくつかの技法のうちのいずれかの使用によって、合成的に生成される場合もある。

例えば、あるアミノ酸を、タンパク質構造内の他のアミノ酸と、他のポリペプチド（例えば、抗原）又は細胞に結合する能力のかなりの喪失を伴うことなく置換することができる。タンパク質の結合能力及び性質は、そのタンパク質の生物学的機能活性を規定するので、あるアミノ酸配列置換をタンパク質配列、したがってその基礎となるＤＮＡコード配列に起こすことができ、それにより同様の特性を有するタンパク質を得られる。したがって、本開示組成物のペプチド配列、又はこのペプチドをコードする対応ＤＮＡ配列に、それらの生物学的有用性又は活性を著しく喪失することなく、様々な変更を加えることができることが考えられる。

バリアント配列は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により保存的置換が導入されている配列を含む。アミノ酸は、物理的性質と、二次及び三次タンパク質構造への寄与と、によって分類できる。そのような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリは、当技術分野で定義されている。これらのファミリには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。

「配列同一性」又は「相同性」は、配列をアラインし、必要に応じて、最大相同率を達成するためにギャップを挿入した後に非バリアント配列と同一であるポリヌクレオチド又はポリペプチド配列バリアントでの残基の百分率を指す。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド及びポリペプチドバリアントは、本明細書に記載するポリヌクレオチド又はポリペプチドとの少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のポリヌクレオチド又はポリペプチド相同性を有する。

ポリペプチドバリアント配列は、本開示に列挙した配列と７０％以上の（すなわち、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、又は９９％以上）配列同一性を共有し得る。ポリペプチドバリアントはまた、本明細書に開示するアミノ酸配列の様々な長さの連続ストレッチを含むポリペプチド断片も提供する。ポリペプチドバリアント配列は、本明細書に開示された配列の１つ以上の少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、又は１５０以上の近接するペプチド及びこれらの間の全ての中間長のペプチドを含むペプチド配列を含む。

上記の免疫原はｂＮＡｂに特異的に結合し得る。ｂＮＡｂは複数のＨＩＶ－１ウイルス株を中和する中和抗体である。ｂＮＡｂはウイルスの保存されたエピトープを標的とするという点で独特である。広域中和抗体の例としては、これらに限定されないが、ＶＲＣ２６．２５、ＰＣＴ６４－２４Ｅ、ＶＲＣ３８．０１、ＰＧ９、ＰＧＤＭ１４００、ＣＨ０１、ＢＧ１８、ＤＨ２７０．１、ＤＨ２７０．６、ＰＧＤＭ１２、ＶＲＣ４１．０１、ＰＧＤＭ２１、ＰＣＤＮ－３３Ａ、ＢＦ５２０．１、ＶＲＣ２９．０３、ＰＧＴ１２１、１０－１０７４、Ｎ４９－Ｐ７、Ｎ６、ＮＣ－Ｃｏｗ１、ＩＯＭＡ、ＣＨ２３５、ＣＨ２３５．１２、ｂ１２、ＶＲＣ０１、３ＢＮＣ１１７、ＣＨ１０３、ＶＲＣ－ＰＧ０５、ＶＲＣ３４．０１、ＡＣＳ２０２、ＰＧＴ１５１、３５Ｏ２２、８ＡＮＣ１９５、ＤＨ５１１．１１Ｐが挙げられ得る。これらのｂＮＡｂの中で、ＢＧ１８、ＤＨ２７０．１、ＤＨ２７０．６、ＰＧＤＭ１２、ＶＲＣ４１．０１、ＰＧＤＭ２１、ＰＣＤＮ－３３Ａ、ＢＦ５２０．１、ＶＲＣ２９．０３、ＰＧＴ１２１、１０－１０７４広域中和抗体は、Ｖ３グリカンに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、開示される免疫原は、約５０μＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する親和性でＰＧＴ１２１又は１０－１０７４広域中和抗体に結合する。

用語「特異的結合」、「選択的結合」、「選択的に結合する」及び「特異的に結合する」とは、所定の抗原上のエピトープに結合するが他の抗原には結合しない抗体を指す。典型的には、抗体は、例えば、所定の抗原、例としてＨＩＶ－１のウイルスエンベロープ上のエピトープ、例えばｇｐｌ２０を分析物として用い、かつ抗体をリガンドとして用いるＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）２０００表面プラズモン共鳴装置におけるＥＬＩＳＡ、平衡透析若しくは表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：ＳＰＲ）技術、又は抗原陽性細胞への抗体の結合のスキャッチャード解析によって決定される場合、およそ１０^－６Ｍ未満、例えばおよそ１０^－７Ｍ、１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ若しくは１０^－１０Ｍ又は更に低い平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）で結合し、そして（ｉｉ）所定の抗原又は密接に関連する抗原以外の非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合に対する親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で所定の抗原に結合する。

別の態様では、本開示は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）上で多量体化された免疫原ポリペプチド（例えば、レトロウイルス様粒子、ＨＩＶ様粒子）を提供する。本開示の文脈において、ウイルス様粒子又はレトロウイルス様粒子は、それらが産生される宿主細胞の膜内に埋め込まれたウイルスエンベロープタンパク質、好ましくはＶＬＰ中の更なるウイルスコアタンパク質を含む膜に囲まれた構造である。これらのＶＬＰは、インタクトなウイルス核酸を含有せず、非感染性である。望ましくは、ＶＬＰ調製物を免疫原性組成物に製剤化し動物又はヒトに投与する際に免疫応答（細胞媒介性又は体液性）が上昇するように、ＶＬＰの表面に充分なエンベロープタンパク質が存在する。望ましくは、Ｅｎｖタンパク質は、天然に存在するウイルスエンベロープタンパク質と比較して、カルボキシ末端から短縮されている。本発明の文脈において、「短縮された」エンベロープタンパク質とは完全長細胞質ドメイン未満を含有するタンパク質だが、免疫応答が生成される表面抗原決定基、好ましくは防御免疫応答を保持し、適切な前駆体プロセシング及び膜挿入に充分なエンベロープ配列を保持するタンパク質である。当業者は組換えＤＮＡ技術及びウイルスコード配列を用いて短縮型ウイルスエンベロープタンパク質を産生することができ、これらは容易に公衆に利用可能である。例えば、ウイルスエンベロープタンパク質のコード配列は、例として市販のバキュロウイルスベクタを用い、ウイルスプロモータの調節制御下において、制御配列へのコード配列の機能的連結を可能にするように配列を適切に修飾し、そしてエンベロープタンパク質の細胞質ドメインをコードするコード配列の部分の短縮（欠失）を、ここでも短縮型エンベロープ及び関連配列のベクタへの操作可能なスプライシングを可能にする適切な翻訳停止シグナル及び配列によって、バキュロウイルス発現ベクタでの発現のために操作することができる。具体的に例示される短縮型ＳＩＶエンベロープタンパク質は、天然に存在するＳＩＶエンベロープタンパク質のカルボキシ末端で８９個のアミノ酸を欠く。

別の態様では、本開示は、共有又は非共有の結合／相互作用（例えば、ファンデルワールス相互作用）を介して多量体化された少なくとも１つの上記免疫原ポリペプチドを含む、タンパク質複合体を提供する。例えば、２つ以上の免疫原ポリペプチドは、１つ以上の架橋剤によって架橋され得る。架橋剤は、タンパク質又は他の分子上の特定の官能基（例えば、第一級アミン又はスルフヒドリル）に対する反応性末端を有する試薬である。架橋剤は共有結合によって２つ以上の分子を結合することができる。架橋剤としては、アミン－アミン架橋剤（例えば、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ））、アミン－スルフヒドリル架橋剤（例えば、Ｎ－γ－マレイミドブチリル－オキシスクシンイミドエステル（ＧＭＢＳ））、カルボキシル－アミン架橋剤（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ））、スルフヒドリル－炭水化物架橋剤（例えば、Ｎ－β－マレイミドプロピオン酸ヒドラジド（ＢＭＰＨ））、スルフヒドリル－スルフヒドリル架橋剤（例えば、１，４－ビスマレイミドブタン（ＢＭＢ））、光反応性架橋剤（例えば、Ｎ－５－アジド－２－ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ－ＮＯＳ））、化学選択的ライゲーション架橋剤（例えば、ＮＨＳ－ＰＥＧ４－アジド）が挙げられるが、これらに限定されない。

Ｂ．核酸
本開示の別の態様は、上記のポリペプチド又はタンパク質をコードする配列を含む単離された核酸を特徴とする。核酸とは、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ類似体を指す。ＤＮＡ又はＲＮＡ類似体はヌクレオチド類似体から合成することができる。核酸分子は一本鎖又は二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。

「単離された核酸」とは、その構造が任意の天然に存在する核酸の構造又は天然に存在するゲノム核酸の任意の断片の構造と同一ではない核酸を指す。この用語は、したがって、例えば（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然に存在する生物のゲノム中の分子のその部分に隣接するコード配列の両方には隣接しないＤＮＡ；と、（ｂ）得られた分子が天然に存在するベクター又はゲノムＤＮＡと同一とならないように、ベクタ中又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた核酸；と、（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によって産生される断片、又は制限酵素断片などの別個の分子；と、（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列と、を包含する。上記の核酸は、本発明のポリペプチド、融合タンパク質又は抗体を発現させるために使用することができる。この目的のために、核酸を好適な制御配列へ作動可能に連結して、発現ベクタを生成することができる。

本明細書に開示される核酸及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準的な文字略語及びアミノ酸の１文字コードを用いて示される。各核酸配列の１本の鎖だけが示されているが、相補鎖は、表示された鎖に対する任意の参照によって含まれると理解される。

本開示はまた、開示される免疫原のコード配列を含むベクターと、ベクターを含む宿主細胞と、免疫原のコード配列を宿主細胞に導入する工程及び免疫原が産生され分泌されるような適切な条件下において宿主細胞を培養する工程を含む、実質的に純粋な免疫原を作製する方法と、を含む。そのようにして産生された免疫原は従来の方法で回収され得る。したがって、本発明はまた、本明細書で開示される免疫原及び生物学的等価物を発現する方法と、これらの遺伝子産物を使用するアッセイと、これらの受容体タンパク質を発現するＤＮＡ構築物を含む組換え宿主細胞と、に関する。

開示される免疫原は、免疫原をコードする核酸を、好適なプロモーター及び他の適切な転写調節エレメントを含有する発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２又はｐＬＩＴＭＵＳ２８）に分子クローニングすることによって組換え発現させ、原核生物又は真核生物宿主細胞中に移入して、免疫原を産生することができる。そのような操作のための技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、（ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー）に見出すことができ、公知のものであり、かつ当業者は容易に利用可能である。したがって、本発明の別の態様は、免疫原をコードするＤＮＡ配列を含有及び／又は発現するように操作された宿主細胞を含む。そのような組換え宿主細胞は、開示された免疫原又は生物学的に等価な形態を産生するのに好適な条件下において培養することができる。組換え宿主細胞は、大腸菌などの細菌、酵母などの真菌細胞、ヒト、ウシ、ブタ、サル及びげっ歯類起源の細胞株を含むがこれらに限定されない哺乳動物細胞、並びにショウジョウバエ及びカイコ由来細胞株を含むがこれらに限定されない昆虫細胞を含むが、これらに限定されない、原核生物又は真核生物であり得る。

例えば、１つの昆虫発現系は、バキュロウイルス発現ベクター（ｐＡｃＧ２Ｔ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）とタンデムにＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ２１）昆虫細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用する。また、好適であり、かつ市販されている哺乳動物種としては、Ｌ細胞Ｌ－Ｍ（ＴＫ～）（ＡＴＣＣＣＣＬ１．３）、Ｌ細胞Ｌ－Ｍ（ＡＴＣＣＣＣＬ１．２）、Ｓａｏｓ－２（ＡＴＣＣＨＴＢ－８５）、２９３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣＣＣＬ８６）、ＣＶ－１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ－１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ－７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ－Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ－Ｃ－ｌ（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）、ＭＲＣ－５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）及びＣＰＡＥ（ＡＴＣＣＣＣＬ２０９）が挙げられるが、これらに限定されない。

様々な哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞において組換え免疫原を発現させることができる。発現ベクターは、クローニングＤＮＡの転写及び適切な宿主におけるそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として、本明細書で定義される。そのようなベクターは、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞などの様々な宿主において、真核生物ＤＮＡを発現させるために使用することができる。特異的に設計されたベクタは、細菌－酵母又は細菌－動物細胞などの宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切に構築された発現ベクターは、宿主細胞における自律複製のための複製のｏπｇｍ、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、高コピー数の可能性、及び活性プロモーターを含むべきである。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼがＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するように指示するＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターとはｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーターである。

発現ベクタには、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特異的に設計されたプラスミド又はウイルスが含まれ得るが、これらに限定されない。免疫原発現に好適であり得る市販の哺乳動物発現ベクターとしては、ｐＩＲＥＳ－ｈｙｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＩＲＥＳ－ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＣＩ－ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８及びｐＬＩＴＭＵＳ３９（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌｏａｂｓ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＭＣｌｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ－ｐＳＶ２－ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）ｐＢＰＶ－ｌ（８－２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ－ＭＭＴｎｅｏ（３４２－１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）並びに１ＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられるが、これらに限定されない。

また、様々な細菌発現ベクターを使用して、細菌細胞において開示される免疫原を発現させることができる。免疫原発現に好適であり得る市販の細菌発現ベクターには、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＥＴｌ ｌａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｌａｍｂｄａ ｇｔｌ ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＫＫ２２３－３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）が含まれるが、これらに限定されない。

その上、様々な真菌細胞発現ベクターを使用して、真菌細胞において免疫原を発現させることができる。組換え免疫原発現に好適であり得る市販の真菌細胞発現ベクターには、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びピキア発現ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれるが、これらに限定されない。

また、様々な昆虫細胞発現ベクターを使用して、昆虫細胞において組換え受容体を発現させることができる。免疫原の組換え発現に好適であり得る市販の昆虫細胞発現ベクターとしては、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ及びｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びｐＡｃＧ２Ｔ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。

発現ベクターは、形質転換、トランスフェクション、プロトプラスト融合、及び電気穿孔を含むがこれらに限定されない多数の技術のいずれか１つを介して、宿主細胞に導入され得る。形質転換とは、ＤＮＡの組込みから生じる標的細胞への遺伝的変化を包含することを意味する。トランスフェクションとは、試験細胞へ免疫原を導入するための当技術分野で公知である任意の方法を含むよう意図される。例えば、トランスフェクションには、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム媒介トランスフェクション、リポフェクション、電気穿孔、及び例えば、免疫原をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えレトロウイルスベクタなどのウイルスベクタによる感染、並びにそれらの組合せが含まれる。発現ベクター含有細胞を個々に分析して、それらが免疫原を産生するかどうかを判定する。免疫原発現細胞の同定は、特異的ｂＮＡｂとの免疫学的反応性、標識リガンド結合、及び免疫原に対する宿主細胞関連活性の存在を含むが、これらに限定されない、いくつかの手段によって行われ得る。

上記の核酸を含有する宿主細胞もまた本発明の範囲内である。例としては、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターの使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞が挙げられる。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０年）「Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」第１８５巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（カリフォルニア州サンディエゴ）を参照されたい。本発明のポリペプチドを製造するためには、本発明の核酸によりコードされるポリペプチドが発現可能な条件下における培地中で宿主細胞を培養し、培養細胞又は細胞の培地からポリペプチドを精製することができる。あるいは、本発明の核酸は、例えばＴ７プロモーター制御配列及びＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写及び翻訳され得る。

Ｃ．組成物
別の態様では、本開示は、必要とする対象において免疫応答を刺激するための免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、（ｉ）上記の免疫原、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体又はウイルス粒子、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む。本方法は組成物を２回以上投与することを更に含み得る。この組成物の投与は、Ｖ３－グリカンエピトープを認識可能な血清中の広域中和抗体の数を増加させ得る。

免疫原性組成物は、免疫原性ペプチドを発現するウイルスに対して測定可能なＣＴＬ応答を誘導するか、又は免疫原性ペプチドに対して測定可能なＢ細胞応答（抗体の産生など）を誘導する、免疫原性ペプチドを含む組成物である。一例では、「免疫原性組成物」とは、ｇｐｌ２０又はその抗原性断片に由来する開示された免疫原を含む組成物である。これは更に、免疫原をコードする単離された核酸、例えば免疫原を発現するために使用することができる（したがって、このポリペプチドに対する免疫応答を誘発するために使用することができる）核酸を指す。

インビトロ使用のために、免疫原性組成物は、単離されたタンパク質、ペプチドエピトープ、又はタンパク質若しくはペプチドエピトープをコードする核酸からなり得る。インビボ使用のために、免疫原性組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体及び／又は他の薬剤中のタンパク質、免疫原性ペプチド又は核酸を含む。開示される免疫原又は免疫原をコードする核酸などの任意の特定のペプチドは、当技術分野で認識されているアッセイによってＣＴＬ又はＢ細胞応答を誘導するその能力について容易に試験することができる。免疫原性組成物は当業者に周知のアジュバントを含み得る。

滅菌注射用組成物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤又は溶媒中の溶液又は懸濁液であり得る。そのような溶液には、１，３－ブタンジオール、マンニトール、水、リンゲル溶液、及び等張食塩水が含まれるが、これらに限定されない。その上、固定油は、溶媒又は懸濁媒として従来より使用されている（例えば、合成モノグリセリド又はジグリセリド）。オレイン酸及びそのグリセリド誘導体などこれらに限定されない脂肪酸は、限定されないが、オリーブ油又はヒマシ油、そのポリオキシエチル化バージョンなどだが、これらに限定されない天然の薬学的に許容される油と同様に、注射剤の調製に有用である。これらの油溶液又は懸濁液はまた、カルボキシメチルセルロース又は同様の分散剤などだが、これらに限定されない、長鎖アルコール希釈剤又は分散剤も含み得る。薬学的に許容される固体、液体、又は他の剤形の製造で一般的に使用される、その他一般で用いられる界面活性剤、例えば、これらに限定されないがＴＷＥＥＮＳ若しくはＳＰＡＮＳ又は他の同様の乳化剤若しくは生物学的利用能増強剤もまた、製剤化目的のために使用することができる。

経口投与のための組成物は、カプセル、錠剤、エマルジョン及び水性懸濁液、分散液、並びに溶液を含む、任意の経口的に許容され得る剤形であり得る。錠剤の場合、一般的に使用される担体には、ラクトース及びコーンスターチが含まれるが、これらに限定されない。潤滑剤、例えば限定されないが、ステアリン酸マグネシウムもまた、典型的には添加される。カプセル形態での経口投与について、有用な希釈剤には、ラクトース及び乾燥コーンスターチが含まれるが、これらに限定されない。水性懸濁液又はエマルジョンを経口投与する場合、活性成分を乳化剤又は懸濁剤と組み合わせて、油相中に懸濁又は溶解することができる。所望であれば、特定の甘味剤、香味剤又は着色剤を添加してもよい。

記載された本発明に係る局所投与のための医薬組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル又は油として製剤化することができる。あるいは、局所製剤は、活性成分（複数可）を含浸させたパッチ又は包帯の形態であってもよく、これは、場合により１種以上の賦形剤又は希釈剤を含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、局所製剤は、皮膚又は他の患部を介する活性剤（複数可）の吸収又は浸透を促進する材料を含む。局所組成物は、湿疹、座瘡、酒さ、乾癬、接触性皮膚炎、及びツタウルシへの反応を含むが、これらに限定されない皮膚の炎症性障害を治療するのに有用である。

局所組成物は、皮膚への適用に好適な皮膚科学的に許容される担体の安全かつ有効な量を含有する。「化粧品的に許容される」又は「皮膚科学的に許容される」組成物又は成分とは、過度の毒性、不適合性、不安定性及びアレルギー反応などを伴わずに、ヒトの皮膚と接触させて使用するのに適した組成物又は成分を指す。担体は、活性剤及び任意の成分を適切な濃度で皮膚に送達することを可能にする。担体は、したがって、希釈剤、分散剤又は溶媒などとして作用して、活物質が適切な濃度で選択された標的に適用され、その上に均一に分配されるのを確実にすることができる。担体は、固体、半固体又は液体であり得る。担体は、ローション、クリーム又はゲルの形態で、特に、活物質の沈降を防ぐのに充分な厚さ又は降伏点を有する担体であり得る。担体は、不活性であり得るか、又は皮膚科学的な利益を有し得る。担体はまた、本明細書に記載の活性成分と物理的及び化学的に適合性であるべきであり、組成物に関連する安定性、有効性、又は他の使用利益を過度に損なわないべきである。局所組成物は、溶液、エアロゾル、クリーム、ゲル、パッチ、軟膏、ローション又は泡を含む、局所又は経皮適用のための当技術分野で公知の形態の化粧品又は皮膚科製品であり得る。

薬学的に許容される担体としては、生理学的に適合性である、任意かつ全ての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び防カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤などが挙げられる。「薬学的に許容される担体」は、対象に投与された後又は対象へ投与する際、望ましくない生理学的効果は引き起こさない。医薬組成物中の担体は、活性成分と適合性であり、それを安定化することができるという意味でもまた「許容され」なければならない。１つ以上の可溶化剤を活性剤の送達のための医薬担体として利用することができる。薬学的に許容される担体の例としては、剤形として利用可能な組成物を得るための生体適合性ビヒクル、アジュバント、添加剤及び希釈剤が挙げられるが、これらに限定されない。他の担体としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セルロース及びラウリル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。更なる適切な薬学的担体及び希釈剤、並びにそれらの使用のための薬学的必要性は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は上皮投与（例えば、注射又は注入による）に適している。治療化合物は１種以上の薬学的に許容される塩を含み得る。「薬学的に許容される塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、いかなる望ましくない毒物学的効果（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．ら（１９７７年）「Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．」第６６巻第１～１９頁）も付与しない塩を指す。

免疫原性組成物中に提供される宿主細胞は、腫瘍細胞及び細胞内病原体に感染した細胞の溶解に必要な細胞傷害性Ｔリンパ球（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ：ＣＴＬ）免疫応答を誘発しない不活化又は化学的／遺伝的に弱毒化された細菌ワクチンであり得る。

ＩＩ．開示される免疫原を用いる免疫応答の刺激方法
本明細書に開示される免疫原、開示される免疫原をコードする核酸分子、宿主細胞、タンパク質複合体又はウイルス粒子は、ＨＩＶなどの病原体に対する免疫応答を生成するために対象へ投与することができる。別の態様では、本開示は、それを必要とする対象のＨＩＶ感染症を治療又は予防する方法を提供する。この方法は、上記の免疫原、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス粒子、又はそれらの組合せの治療有効量を対象に投与することを含む。本開示はまた、対象におけるＨＩＶ感染症の治療又は予防のための医薬品の調製における、上記の免疫原、核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス粒子、又はそれらの組合せの使用を提供する。

例示的な用途では、組成物は、ＨＩＶ感染症に罹患しているか、又はＨＩＶに感染するリスクがある対象に投与される。他の用途では、本明細書に開示される免疫原は、例えば、免疫化レジメンの一部として予防的に投与することができる。

免疫原はＨＩＶウイルスに対する免疫応答を高めるのに充分な量で投与される。投与は病原性感染を治療するのに充分な免疫応答を誘導し、例えば、感染を阻害し、並びに／又は感染の徴候及び／若しくは症状を軽減する。この使用に有効な量は、疾患の重症度、対象の健康の全身状態、及び対象の免疫系の頑健性に依存する。免疫原の治療有効量は、症状（複数可）の主観的軽減か、又は臨床医若しくは他の資格ある観察者によって指摘されるような客観的に特定可能である改善かのいずれかを提供する量である。

治療有効量又は有効量とは、例えばＨＩＶを予防、阻害及び／又は治療するために、障害又は疾患のいずれかの症状及び／又は根本的な原因を、防止、治療（予防含む）、軽減及び／又は改善するのに充分な、核酸ワクチン又は他の治療剤などの薬剤の量を指す。いくつかの実施形態では、「有効量」は、ＡＩＤＳなどの疾患の症状を軽減又は除去するのに充分である。例えば、これは、ウイルス複製を阻害する、又はＨＩＶ－１感染の場合のＴ細胞数の増加などのウイルス感染の外面的症状を測定可能に変化させるのに必要な量であり得る。一般に、この量は、ウイルス（例えば、ＨＩＶ）の複製又は感染性を測定可能に阻害するのに充分であろう。対象に投与される場合、ウイルス複製のインビトロ阻害を達成することが示されている標的組織濃度（例えば、リンパ球における）を達成する投与量が一般に使用される。

免疫原は、当業者に公知の任意の手段（Ｂａｎｇａ，Ａ．、「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」中、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州ランカスタ（１９９５年）参照）によって、局所的又は全身的に、例えば筋肉内、皮下、又は静脈内注射などによって投与することができるが、経口、経鼻、又は肛門投与さえも企図される。一実施形態では、投与は、皮下又は筋肉内注射によるものである。開示される免疫原が応答を刺激するために利用可能である時間を延長するために、免疫原は、インプラント、油性注射又は微粒子系として提供されてもよい。微粒子系は、微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル又は同様の粒子であり得る（例えば、前掲のＢａｎｇａを参照のこと）。合成ポリマーに基づく粒子状担体は、制御放出を提供することに加えて、免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用することが示されている。アルミニウム塩はまた、免疫応答を生じさせるアジュバントとしても使用することができる。

場合により、１つ以上のサイトカイン、例えばインターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＲＡＮＴＥＳ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ－ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ：ＧＭ－ＣＳＦ）、腫瘍壊死因子（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ：ＴＮＦ）－ａ、インターフェロン（ＩＦＮ）－ａ又はＩＦＮ－γ、１つ以上の増殖因子、例えばＧＭ－ＣＳＦ又はＧ－ＣＳＦ、１つ以上の共刺激分子、例えばＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、又は他のＢ７関連分子；ＯＸ－４０Ｌ若しくは４１ＢＢＬ、又はこれらの分子の組合せなどの１つ以上の分子を、生物学的アジュバントとして使用することができる（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒら１９９８，年）「Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．」第６８巻第２号第１２２～３８頁；Ｌｏｔｚｅら（２０００年）「Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｓｃｉ．Ａｍ．」第６巻（補足ｌ）第Ｓ６１～６頁；Ｃａｏら（１９９８年）「Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」第１６巻（補足１）第Ｊ．－２５１－６０頁；Ｋｕｉｐｅｒら（２０００年）「Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．」第４６５巻第３８１～９０頁を参照のこと）。これらの分子は宿主へ全身的に（又は局所的に）投与することができる。いくつかの例では、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－１Ｂ．７－２、ＯＸ－４０Ｌ、４１ＢＢＬ、及びＩＣＡＭ－１が投与される。

単離された免疫原を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、免疫原は、安定化洗浄剤、ミセル形成剤及び油のうちの２つ以上を含有するアジュバントと混合される。適切な安定化洗浄剤、ミセル形成剤及び油は、米国特許第５，５８５，１０３号、米国特許第５，７０９，８６０号、米国特許第５，２７０，２０２号及び米国特許第５，６９５，７７０号に詳述されている。安定化洗剤は、エマルジョンの成分が安定なエマルジョンとして残ることを可能にする任意の洗浄剤である。そのような洗浄剤としては、ポリソルベート、８０（ＴＷＥＥＮ）（ソルビタン－モノ－９－オクタデセノエート－ポリ（オキシ－１，２－エタンジイル；ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｓ製（デラウェア州ウィルミントン））、ＴＷＥＥＮ４０（商標）、ＴＷＥＥＮ２０（商標）、ＴＷＥＥＮ６０（商標）、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（商標）３－１２、ＴＥＥＰＯＬ ＨＢ７（商標）及びＳＰＡＮ８５（商標）が挙げられる。これらの洗浄剤は、通常、およそ０．０５～０．５％、例えば約０．２％の量で提供される。ミセル形成剤は、他の成分で形成されたエマルジョンを、ミセル様構造を形成するように安定化させることができる薬剤である。そのような薬剤は、一般に、マクロファージを動員して細胞応答を増強するために、注射部位でいくらかの刺激を引き起こす。そのような薬剤の例としては、ＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓの例えばＳｃｈｍｏｌｋａ、「Ｊ．Ａｍ．Ｏｉｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．」第５４巻第１１０頁（１９７７年）及びＨｕｎｔｅｒら「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ」第１２９巻第１２４４頁（１９８１年）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｌ６２ＬＦ、Ｌ１０１及びＬ６４、ＰＥＧ１０００、並びにＴＥＴＲＯＮＩＣ（商標）１５０１、１５０Ｒ１、７０１、９０１、１３０１及び１３０Ｒ１にて説明されているポリマー界面活性剤が挙げられる。そのような薬剤の化学構造は当技術分野で周知である。一実施形態では、薬剤は、Ｈｕｎｔｅｒ及びＢｅｎｎｅｔｔ「Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．」第１３３巻第３１６７頁（１９８４年）により定義されるように、０～２の親水性－親油性バランス（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｅ－ｌｉｐｏｐｈｉｌｅ ｂａｌａｎｃｅ：ＨＬＢ）を有するように選択される。薬剤は、有効量、例えば０．５～１０％の間の量又は１．２５～５％の間の量で提供することができる。

制御放出非経口製剤は、インプラント、油性注射又は微粒子系として作製することができる。タンパク質送達系の広範な概要については、Ｂａｎｇａ「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州ランカスタ、１９９５年）を参照されたい。微粒子系としては、ミクロスフェア、マイクロ粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア及びナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルは中心コアとして治療用タンパク質を含有する。ミクロスフェアでは、治療剤は粒子全体に分散している。約１μｍより小さい粒子、ミクロスフェア及びマイクロカプセルは、一般に、それぞれナノ粒子、ナノスフェア及びナノカプセルと称される。キャピラリは、ナノ粒子のみが静脈内投与されるようにおよそ５μｍの直径である。微粒子は、典型的には直径１００μｍ前後であり、皮下又は筋肉内に投与される（Ｋｒｅｕｔｅｒ、「Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｊ．Ｋｒｅｕｔｅｒ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）第２１９～３４２頁（１９９４年）；Ｔｉｃｅ＆Ｔａｂｉｂｉ、「Ｔｒｅａｔｉｓｅ ｏｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ａ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（ニューヨーク州ニューヨーク）第３１５～３３９頁（１９９２年）を参照のこと）。

イオン制御放出のためにポリマーを使用することができる。制御された薬物送達に使用するための様々な分解性及び非分解性ポリマーマトリックスが当技術分野で公知である（Ｌａｎｇｅｒ、「Ａｃｃｏｕｎｔｓ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．」第２６巻第５３頁（１９９３年））。例えば、ブロックコポリマーであるポロキサマー４０７は、低温では粘性なものの可動性の液体として存在するが、体温では半固体ゲルを形成する。これは組換えインターロイキン－２及びウレアーゼの製剤化及び持続送達に有効なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎら、「Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．」第９巻第４２５頁（１９９２年）及びＰｅｃ、「Ｐａｒｅｎｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈ．」第４４巻第２号第５８頁（１９９０年）を参照のこと）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されてきた（Ｉｊｎｔｅｍａら、「Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．」第１１２巻第２１５頁（１９９４年））。更に別の態様では、リポソームは、脂質カプセル化薬の制御放出及び薬物標的化のために使用される（Ｂｅｔａｇｅｒｉら、「Ｌｉｐｏｓｏｍｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．（ペンシルベニア州ランカスタ、１９９３年））。治療用タンパク質の制御送達のための多数の更なるシステムが公知である（例えば、米国特許第５，０５５，３０３号；同第５，１８８，８３７号；同第４，２３５，８７１号；同第４，５０１，７２８号；同第４，８３７，０２８号；同第４，９５７，７３５；及び同第５，０１９，３６９号；同第５，０５５，３０３号；同第５，５１４，６７０号；同第５，４１３，７９７号；同第５，２６８，１６４号；同第５，００４，６９７号；同第４，９０２，５０５号；同第５，５０６，２０６号；同第５，２７１，９６１号；同第５，２５４，３４２；及び同第５，５３４，４９６号）。

別の実施形態では、医薬組成物は、開示される免疫原をコードする核酸を含む。免疫応答を生成するために、治療有効量の核酸を対象に投与してもよい。具体的で非限定的な一例では、開示されるｇｐｌ２０免疫原又はその免疫原性断片をコードする治療有効量の核酸は、ＨＩＶ感染症を治療又は予防又は阻害するために対象に投与される。

場合により、１つ以上のサイトカイン、例えばＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－ａ又はＩＦＮ－γ、１つ以上の増殖因子、例えばＧＭ－ＣＳＦ又はＧ－ＣＳＦ、１つ以上の共刺激分子、例えばＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、又は他のＢ７関連分子；ＯＸ－４０Ｌ若しくは４１ＢＢＬ、又はこれらの分子の組合せなどの１つ以上の分子を、生物学的アジュバントとして使用することができる（例えば、Ｓａｌｇａｌｌｅｒら１９９８，年）「Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．」第６８巻第２号第１２２～３８頁；Ｌｏｔｚｅら（２０００年）「Ｃａｎｃｅｒ Ｊ Ｓｃｉ．Ａｍ．」第６巻（補足ｌ）第Ｓ６１～６頁；Ｃａｏら（１９９８年）「Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ」第１６巻（補足１）第２５１－６０頁；Ｋｕｉｐｅｒら（２０００年）「Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．」第４６５巻第３８１～９０頁を参照のこと）。これらの分子は宿主へ全身的に投与することができる。これらの分子は、分子をコードする核酸をベクター、例えば組換え痘症ベクターへ挿入することによって、同時投与することができることに留意すべきである（例えば、米国特許第６，０４５，８０２号を参照されたい）。種々の実施形態では、生物学的アジュバントをコードする核酸は、開示される免疫原コード配列と同じベクターにクローニングすることができるか、又は核酸は、同時投与のために１つ以上の別個のベクターにクローニングすることができる。その上、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｈｎｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）及びレバミゾールなどの非特異的免疫調節因子を同時投与することができる。核酸の投与に対する１つのアプローチは、プラスミドＤＮＡ、例えば哺乳動物発現プラスミドによる直接免疫化である。上記のように、開示される免疫原をコードするヌクレオチド配列は、分子の発現を増加させるためにプロモーターの制御下に置くことができる。

核酸構築物による免疫化は当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，６４３，５７８号（所望の免疫原をコードするＤＮＡを導入して細胞媒介性又は体液性応答を誘発することによって脊椎動物を免疫化する方法を記載）、並びに同第５，５９３，９７２号及び同第５，８１７，６３７号（抗原をコードする核酸配列を、発現可能にする制御配列へと動作可能に連結することについて記載）に教示されている。米国特許第５，８８０，１０３号は、免疫原性ペプチド又は他の抗原をコードする核酸を生物へと送達するいくつかの方法について記載している。この方法は、核酸のリポソーム送達（又は合成ペプチドの送達）、及びコレステロールとＱｕｉｌ Ａ（商標）（サポニン）とを混合すると自然に形成される３０～４０ｎｍのサイズの負に荷電したケージ様構造体である免疫刺激構築物又はＩＳＣＯＭＳ（商標）を含む。防御免疫は、ＩＳＣＯＭＳ（商標）を抗原の送達ビヒクルとして用いて、トキソプラズマ症及びＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス誘導腫瘍を含む様々な感染実験モデルで生成されている（Ｍｏｗａｔ及びＤｏｎａｃｈｉｅ、「Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ」第１２巻第３８３頁（１９９１年））。ＩＳＣＯＭＳ（商標）に封入された１μｇという低用量の抗原は、クラスＩ媒介性ＣＴＬ応答をもたらすことが見出されている（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、「Ｎａｔｕｒｅ」第３４４巻第８７３頁（１９９０年））。

免疫化のために核酸を用いる別のアプローチでは、開示される免疫原はまた、弱毒化ウイルス宿主又はベクター若しくは細菌ベクターによって発現させることもできる。組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、サイトメガロウイルス又は他のウイルスベクタを使用して、ペプチド又はタンパク質を発現させ、それによりＣＴＬ応答を誘発することができる。例えば、免疫化プロトコルに有用なワクシニアのベクター及び方法は、米国特許第４，７２２，８４８号に記載されている。ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）は、ペプチド発現のための別のベクターを提供する（Ｓｔｏｖｅｒ、「Ｎａｔｕｒｅ」第３５１巻第４５６～４６０頁（１９９１年）を参照されたい）。

一実施形態では、開示される免疫原をコードする核酸を、細胞へ直接導入する。例えば、核酸は、標準的な方法によって金のミクロスフェアへロードされてもよく、Ｂｉｏ－Ｒａｄ製ＨＥＬＩＯＳ（商標）Ｇｅｎｅ Ｇｕｎなどの装置によって皮膚へ導入され得る。核酸は、強力なプロモータの制御下にあるプラスミドからなる「裸の」核酸であり得る。典型的には、ＤＮＡは筋肉に注射されるが、転移に近接する組織を含む他の部位に直接注射することもできる。注射のための投与量は、通常、約０．５ｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇであり、典型的には、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである（例えば、米国特許第５，５８９，４６６号を参照のこと）。

組成物の単回又は複数回投与は、対象が必要とし、許容する投与量及び頻度に応じて投与される。一実施形態では、投与量はボーラスとして１回で投与されるが、別の実施形態では、治療結果が達成されるまで定期的に適用することができる。一般に、用量は、対象へ許容できない毒性を生じさせることなく疾患の症状又は徴候を治療又は改善するのに充分である。全身投与又は局所投与を利用することができる。

本明細書に開示される免疫原性組成物を、タンパク質、ペプチド、抗体などの他の薬剤、及び抗ＨＩＶ剤などの他の抗ウイルス剤と共に投与することが有利であり得る。このような抗ＨＩＶ治療剤の例としては、ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、例えばアバカビル、ＡＺＴ、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、テノホビル、ザルシタビン及びジドブジンなど、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤、例えばデラビルジン、エファビレンツ、ネビラピンなど、プロテアーゼ阻害剤、例えばアンプレナビル、アタザナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、フォサムプレナビル、リトナビル、サキナビル及びチプラナビルなど、並びに融合タンパク質阻害剤、例えばエンフビルチドなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、他の抗ＨＩＶ治療剤と同時に投与される。いくつかの例では、開示される免疫原は、外因性Ｔヘルパ細胞などのＴヘルパー細胞と共に投与される。Ｔヘルパー細胞を産生及び投与するための例示的な方法は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願第０３／０２０９０４号に見出すことができる。ある特定の実施形態では、免疫原性組成物は、他の薬剤の前又は後などに、他の抗ＨＩＶ治療剤と連続して投与される。当業者は、逐次投与が、数時間、数日、数週間、数ヶ月、又は更には数年後などの適切な期間の直後又は後を意味し得ることを理解するであろう。

開示されるｇｐｌ２０免疫原又はその免疫原性断片及びこれらの免疫原をコードする核酸は、多段階免疫化レジームで使用することができる。いくつかの例では、レジームは、治療有効量の本明細書に開示される第１の免疫原又はその免疫原性断片（プライム）を対象に投与し、適切な期間の後に、１つ以上の追加の免疫原又はその免疫原性断片で免疫原性応答を増強することを含む。このように免疫反応を誘発する方法は、いわゆる「プライムブースト」である。この方法では、選択された免疫原性表面に対する抗体応答は、複数の状況において対象の免疫系に抗原性表面を「見る」機会を与えることによってフォーカスされる。言い換えれば、共通の抗原表面を有する複数の免疫原又はその免疫原性断片の使用は、共通の免疫原の表面に結合する抗体を選択する。

いくつかの例では、免疫原又はその免疫原性断片及びこれらの免疫原をコードする核酸は、「プライムブースト」免疫化レジームで投与することができる。例えば、免疫原又はその免疫原性断片及びこれらの免疫原をコードする核酸を、安定化されたｇｐｌ４０三量体（例えば、Ｙａｎｇら、「Ｊ Ｖｉｒｏｌ．」第７６巻第９号第４６３４～４２頁（２００２年）を参照）の投与前、投与中、投与後に対象へ投与することができる。

様々な異なるＨＩＶ株由来の三量体又は複数のＨＩＶ株の混合物である三量体でプライミングし、次いでブーストするために、開示された免疫原性剤、例えば上記の免疫原、免疫原をコードする核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくはウイルス粒子、又はこれらの組合せを含有するカクテルもまた使用することができる。プライムは単回用量又は複数回用量として投与することができ、例えば、２回用量、３回用量、４回用量、５回用量、６回用量又はそれ以上を、対象に、数日間、数週間又は数ヶ月にわたって投与することができる。ブーストは単回用量又は複数回用量として投与することができ、例えば、２～６回用量又はそれ以上を、対象に、１日、１週間又は数ヶ月にわたって投与することができる。１～５回又はそれ以上など、複数のブーストを与えることもできる。一連の連続接種では異なる投与量を使用することができる。例えば、一次接種では比較的大きい用量、続いて比較的小さい用量によりブースト。選択された抗原性表面に対する免疫応答は、本明細書に開示される免疫原性組成物を対象に１回以上接種することによって生成することができる。

ＩＩＩ．免疫診断試薬及びキット
本開示は、ＨＩＶ－１に感染した対象においてＨＩＶ－１結合抗体を検出又は単離する方法を提供する。この方法は、対象由来の血液、血清、血漿、尿又は痰の試料などだがこれらに限定されない対象由来の試料を、開示される免疫原性剤、例えば免疫原、免疫原をコードする核酸、宿主細胞、タンパク質複合体若しくは上記のウイルス粒子、又はこれらの組合せの１つ以上と接触させることを含む。この方法はまた、開示される免疫原性剤に対する試料中での抗体の結合の検出も含み得る。結合は、試料由来の抗体に特異的に結合する標識二次抗体の使用を含む、当業者に公知の任意の手段によって検出することができる。標識には、放射性標識、酵素標識及び蛍光標識が含まれる。いくつかの実施形態では、この方法は、対象においてＨＩＶ－１結合抗体を単離することを更に含み得る。

開示される免疫原性剤は、キットの構成要素であり得る。そのようなキットはまた、包装、説明書及び様々な他の試薬、例えば緩衝液、基質、抗体又はリガンド、例えば対照抗体若しくはリガンド、及び検出試薬を含む追加の構成要素も含み得る。キットは場合によりアジュバントを含み得る。

アジュバントは、抗原性を増強するために使用されるビヒクルである。アジュバントには、抗原が吸着された鉱物（ミョウバン、水酸化アルミニウム又はリン酸塩）、又は抗原溶液が鉱物油中で乳化される油中水型エマルジョン（フロイント不完全アジュバント）の懸濁液が含まれこれには時として、抗原性を更に増強するために死滅したマイコバクテリア（フロイント完全アジュバント
）が含まれる（抗原の分解を阻害する及び／又はマクロファージの流入を引き起こす）。免疫賦活性オリゴヌクレオチド（例えば、ＣｐＧモチーフを含むもの）もまた、アジュバントとして使用することができる（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号；同第６，２０７，６４６号；同第６，２１４，８０６号；同第６，２１８，３７１号；同第６，２３９，１１６号；同第６，３３９，０６８号；同第６，４０６，７０５；及び同第６，４２９，１９９号を参照のこと）。アジュバントには同時刺激分子などの生物学的分子（「生物学的アジュバント」）が含まれる。例示的なアジュバントとしては、ＩＬ－２、ＲＡＮＴＥＳ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－ａ、ＩＦＮ－γ、Ｇ－ＣＳＦ、ＬＦＡ－３、ＣＤ７２、Ｂ７－１、Ｂ７－２、ＯＸ－４０Ｌ、及び４１ＢＢＬが挙げられる。アジュバントは開示される免疫原と組み合わせて使用することができる。

ＩＶ．定義
本文書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確にそうでないことが指示されない限り、複数の参照を含む。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語。

用語「及び／又は」とは、この用語が関連付けられている項目のいずれか１つ、項目の任意の組合せ、又は項目の全てを意味する。

本発明の組成物は、特許請求される成分を含むか、該成分から本質的になるか、又は該成分からなることができる。単語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの任意のｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇの形態）、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」（及び「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」などの任意のｈａｖｉｎｇの形態）、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの任意のｉｎｃｌｕｄｉｎｇの形態）、又は「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの任意のｃｏｎｔａｉｎｉｎｇの形態）は、包括的又は変更可能であり、追加の列挙されない要素又は方法工程を排除しない。

用語「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」又は「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、障害、障害の症状、障害に続発する疾患状態、又は障害の素因を治療、軽減、緩和、矯正、発症遅延、予防、又は改善する目的で、障害を有するか又は障害を発症するリスクがある対象に、化合物又は薬剤を投与することを指す。

用語「予防する」、「予防すること」、「予防」及び「予防的処置」などは、障害又は状態を発症しないが、障害又は状態を発症するリスクがある又は発症しやすい対象における、障害又は状態を発症する確率を低下させることを指す。

用語「対象」とは、ヒト及び非ヒト動物を指す。非ヒト動物の例としては、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物、例として非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類（特に、高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えば、マウス又はラット）、モルモット、ネコ及びウサギ、並びに非哺乳動物、例として鳥類、両生類、爬虫類等が挙げられる。一実施形態では、対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患モデルとして好適な実験的非ヒト動物又は動物である。

本明細書に開示されるように、多数の値の範囲が提供される。文脈で明確にそうでないことが指示されない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値もまた、具体的に開示されていることが理解される。言及された範囲内の任意の言及された値又は介在する値と、その言及された範囲内の任意の他の言及された値又は介在する値との間のより小さい各範囲が、本発明に包含される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して範囲に含まれても又は除外されてもよく、いずれかの、いずれでもない又は両方の限界がより小さい範囲に含まれる各範囲もまた、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限界を条件として、本発明に包含される。記載の範囲に一方又は両方の限界値が含まれている場合、それらのいずれか又は両方の限界値を除いた範囲もまた、本発明に含まれる。

用語「約」とは、一般に、示された数のプラス又はマイナス１０％を指す。例えば、「約１０％」は９％～１１％の範囲を示すことができ、「約１」は０．９～１．１を意味することができる。「約」の他の意味は、四捨五入など文脈から明らかであり得るので、例えば、「約１」は０．５～１．４も意味し得る。

ｇｐ１２０は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のエンベロープタンパク質である。成熟ｇｐｌ２０野生型ポリペプチドは一次配列中に約５００個のアミノ酸を有する。ｇｐｌ２０は高度にＮ－グリコシル化されており、見かけの分子量は１２０ｋＤである。ポリペプチドは、５つの保存された領域（Ｃ１～Ｃ５）及び５つの高い可変性の領域（Ｖ１～Ｖ５）から構成される。野生型ｇｐｌ６０ポリペプチドの例示的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、例えば受託番号ＡＡＢ０５６０４及びＡＡＤ１２１４２に示されており、これらは、２０１０年６月２９日時点で入手可能なようにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＨＩＶ－１ ＤＵ１５６由来のｇｐｌ２０ポリペプチドの例示的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、例えば受託番号ＡＢＤ８３６３５、ＡＡＯ５０３５０及びＡＡＴ９１９９７に示されており、これらは、２０１０年９月２７日時点で入手可能なようにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＨＩＶ－１ ＺＡ０１２由来のｇｐｌ２０ポリペプチドの例示的な配列は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、例えば受託番号ＡＣＦ７５９３９に示されており、これは、２０１０年９月２７日時点で入手可能なようにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

「グリコシル化部位」とは、グリカンの結合に適応する、タンパク質などのポリペプチドの表面上のアミノ酸配列を指す。Ｎ結合型グリコシル化部位はＮＸＳ／Ｔのトリプレット（ｔｒｉｐｌｅｔ）配列であり、Ｎはアスパラギンであり、Ｘはプロリンを除く任意の残基であり、Ｓ／Ｔとはセリン又はスレオニンを意味する。グリカンは多糖又はオリゴ糖である。グリカンはまた、糖タンパク質、糖脂質又はプロテオグリカンなどの複合糖質の炭水化物部分を指すためにも使用され得る。

「免疫原性ポリペプチド」とは、哺乳動物、例えば病原体に感染した又は感染のリスクがある哺乳動物において免疫応答を誘導することができる、タンパク質又はその一部を指す。免疫応答を誘導する目的の病原体に由来する免疫原性ポリペプチドの投与。免疫原性ポリペプチドの投与は目的の病原体に対する防御免疫をもたらし得る。いくつかの例では、免疫原性ポリペプチドは、標的エピトープに免疫原性を集中させるために再表面化される抗原である。「免疫原性ｇｐｌ２０ポリペプチド」とは、ＨＩＶ感染症を有する又は有しない哺乳動物などの哺乳動物において免疫応答を誘導することができる、ｇｐｌ２０分子、再表面化ｇｐｌ２０分子又はその一部である。免疫応答を誘導する免疫原性ｇｐｌ２０ポリペプチドの投与はＨＩＶに対する防御免疫をもたらし得る。

「免疫応答」とは、刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞又は単球などの免疫系の細胞の応答を指す。一実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答又はＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生をもたらす。

「単離された（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」とは、「単離された」生物学的成分（タンパク質、例えば、開示される抗原又はそのような抗原をコードする核酸など）が、その成分が天然に存在する他の生物学的成分、例えば他の染色体及び染色体外のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質から実質的に分離又は精製されていることを指す。「単離された」タンパク質、ペプチド及び核酸には、標準的な精製方法によって精製されたタンパク質が含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製されたタンパク質又はペプチド、並びに化学合成されたタンパク質、ペプチド及び核酸分子も包含する。単離された（又は精製された）とは、絶対的な純度を必要とせず、少なくとも５０％単離された、例えば少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は更には９９．９％単離されたタンパク質、ペプチド又は核酸分子を含み得る。

「コードすること（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）」とは、定義されたヌクレオチドの配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義されたアミノ酸の配列のいずれかを有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のためのテンプレートとして働く、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性と、それから生じる生物学的特性とを指す。したがって、その遺伝子によって産生されるｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又は他の生物学系においてタンパク質を産生する場合、遺伝子はタンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり通常は配列表に提示されるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写のためのテンプレートとして使用される非コード鎖との両方は、その遺伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又は他の産物をコードするものと称することができる。特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いに縮重し、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。いくつかの例では、核酸は、開示される抗原をコードする。「組換え核酸」とは、天然では一緒に結合していないヌクレオチド配列を有する核酸を指す。これには、適切な宿主細胞を形質転換するのに使用することができる、増幅又は組み立てられた核酸を含む核酸ベクタが含まれる。組換え核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と称される。遺伝子を、次いで、組換え宿主細胞で発現させて、「組換えポリペプチド」などを産生する。組換え核酸は、非コード機能（例えば、プロモータ、複製起点、リボソーム結合部位等）にも役立ち得る。

別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は必然的に類似する任意の方法及び材料もまた、本発明の実施又は試験に使用することができるが、ここで、好ましい方法及び材料を解説する。本明細書で言及される全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

［実施例］
実施例１
この実施例は、以下の実施例２～６で使用される材料及び方法を説明する。

エンベロープタンパク質
Ｅｎｖ三量体を、ＳＯＳＩＰ置換を含む可溶性の天然様可溶性ｇｐ１４０三量体として表した：「ＳＯＳ」置換（Ａ５０１Ｃ_{ｇｐ１２０}、Ｔ６０５Ｃ_ｇｐ４１）、「ＩＰ」（Ｉ５５９Ｐ_ｇｐ４１）、残基３３２_{ｇｐ１２０}におけるＮ結合型グリカン配列の付加（Ｔ３３２Ｎ_{ｇｐ１２０}）、ｇｐ１２０－ｇｐ４１切断部位の増強（ＲＥＫＲ（配列番号１７）～ＲＲＲＲＲＲ（配列番号１８））、及び残基６６４_ｇｐ４１後の終止コドン（ＨＸ命名法によるＥｎｖナンバリング）。新規に操作されたＥｎｖ三量体ＲＣ１、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ、ＲＣ１－Ａｖｉｔａｇ、ＲＣ１－Ｓｐｙｔａｇ、ＲＣ１－ｇｌｙｃａｎＫＯ、ＲＣ１－ｇｌｙｃａｎＫＯ－Ａｖｉｔａｇ、ＲＣ１－ｇｌｙｃａｎＫＯ－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）及びＲＣ１－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）、ｗｔＢＧ５０５、並びに以前報告されたＢＧ５０５バリアント１１ＭＵＴＢ、１０ＭＵＴ、７ＭＵＴ、５ＭＵＴを、合成遺伝子断片を用いてｐＰＰＰＩ４発現ベクターにクローニングした（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ））。グリカンバリアントＲＣ１Δ３０１、ＲＣ１Δ３３２及び１１ＭＵＴＢΔ３０１は、部位特異的突然変異誘発（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－ｓｉｔｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ、カタログ番号２１０５１５、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって産生された。

Ｅｎｖタンパク質の非タグ化バージョンをＥＬＩＳＡにおいて（ＥＬＩＳＡのセクション参照）、野生型マウスでの免疫化のために使用した（動物のセクションを参照のこと）。ＲＣ１－４ｆｉｌｌのＳｐｙｔａｇバージョンをウイルス様粒子（ＶＬＰ）にコンジュゲートし、ウサギ及びマカクでの免疫化に使用した（ＶＬＰ産生及びコンジュゲーションセクション及び動物セクションを参照）。ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯのＡｖｉｔａｇバージョンをビオチン化し、ＦＡＣＳのベイトとして使用した（フローサイトメトリー及び単一Ｂ細胞選別セクションを参照）。

可溶性Ｅｎｖ三量体を、ＨＥＫ２９３－６Ｅ細胞（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ｃａｎａｄａ）又はＥｘｐｉ２９３細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）における一過性トランスフェクションによって発現させ、以前に記載されたように（Ｗａｎｇ，Ｈ．ら、「Ｅｌｉｆｅ ６」（２０１７年））、２Ｇ１２又はＮＩＨ４５－４６免疫親和性クロマトグラフィ及びサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によって細胞上清から精製した。タンパク質を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム（ＴＢＳ緩衝液）中４℃で保存した。ＳｐｙＴａｇｇｅｄ免疫原を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ中に緩衝液交換した。

ＶＬＰの産生及びコンジュゲーション
ＶＬＰへの結合のために、Ｃ末端ＳｐｙＴａｇ配列（１３残基）をＲＣ１－４ｆｉｌｌに付加して、ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質への不可逆的イソペプチド結合を形成した（Ｚａｋｅｒｉ，Ｂ．ら、「Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ」第１０９巻第Ｅ６９０～６９７頁（２０１２年））。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒタンパク質が結合したバクテリオファージＡＰ２０５コートタンパク質をコードする遺伝子は、Ｍａｒｋ Ｈｏｗａｒｔｈ博士（オックスフォード大学）の厚意によるものであった。ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒ－ＡＰ２０５ ＶＬＰを記載のように精製し（Ｂｒｕｎｅ，Ｋ．Ｄ．ら、「Ｓｃｉ Ｒｅｐ」第６巻第１９２３４頁（２０１６年））、３倍モル過剰のＳｐｙＴａｇｇｅｄ ＲＣ１－４ｆｉｌｌ Ｅｎｖ三量体と共にインキュベートし、そして２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム上でＳＥＣにより遊離Ｅｎｖ三量体から共コンジュゲートＶＬＰを分離した。Ｅｎｖ三量体のコンジュゲーションをネガティブ染色ＥＭ及び／又はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって検証し、免疫原濃度を、同じＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で泳動した既知量の遊離免疫原と比較することによって推定した。

動物
ヒトＰＧＴ１２１及び１０－１０７４広域中和抗体に対応するｉＧＬＩｇＨ及びＩｇＬをコードするＩｇＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子を保有するマウス（ＧＬ_ＨＬ１２１ノックインマウス）が、以前に記載された（Ｅｓｃｏｌａｎｏ，Ａ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１６６巻第１４４５～１４５８頁、第ｅ１４１２頁（２０１６年））。Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの６～８週齢Ｃ５７ＢＬ６雄マウスを免疫化に使用した。全ての動物手順はロックフェラー大学ＩＡＣＵＣによって承認されたプロトコルに従って実施した。雄及び雌のＧＬ_ＨＬ１２１ノックインマウス又は雄のＣ５７ＢＬ６野生型マウスを群に等しく分配し、Ｒｉｂｉアジュバント（Ｓｉｇｍａ）（１：１）中１０μｇの可溶性ＳＯＳＩＰエンベロープ三量体で腹腔内免疫化した。

６月齢のニュージーランドシロウサギ（Ｃｏｖａｎｃｅ）を免疫化に使用した。ウサギを、ＩＳＣＯＭ様サポニンアジュバント中のＶＬＰにコンジュゲートした約２２μｇのＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ三量体（ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰ）で皮下免疫化した（アジュバント合成のセクションを参照されたい）。免疫化後０週目及び２週目にマウス及びウサギから血清試料を採取した。

インドが遺伝的起源である２～４歳のアカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）８匹を、「Ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ Ｒｅｐｏｒｔ」第ＮＩＨ８２～５３（アメリカ合衆国保健福祉省、メリーランド州ベゼスタ、１９８５年）に従ってバイオセーフティレベル２のＮＩＨ施設に収容し、飼育した。全ての動物手順及び実験は、アメリカ合衆国保健福祉省、アメリカ国立アレルギー・感染症研究所の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。

ＩｓｃｏＭＰＬＡにアジュバントを添加したＶＬＰにコンジュゲートさせたおよそ２００μｇのＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ三量体（ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰ）を、内側前脚及び後脚に皮下（ｓ．ｃ）で免疫化した（合計４部位／動物）。血清中和活性を監視し、ＥＬＩＳＡによって血清抗体結合を特徴付けるために、定期的に血液を採取した。リンパ節生検はナイーブマカク及び免疫後３週間の免疫化マカクから得た。

アジュバント合成
ＩＳＣＯＭ様サポニンアジュバントを以前に記載されたように調製した（Ｋ．Ｌｏｖｇｒｅｎ－Ｂｅｎｇｔｓｓｏｎら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ：Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」中、Ｄ．Ｏ’Ｈａｇａｎ編（Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、ニュージャージー州トトワ、２０００年）第４２巻第２３９～２５８頁）。簡潔には、コレステロール（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ ７０００００）及び１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ ８５０３５５）の２０ｍｇ／ｍＬ溶液を、２０％ＭＥＧＡ－１０（Ｓｉｇｍａ Ｄ６２７７）洗浄剤中で調製した。Ｑｕｉｌ－Ａサポニン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ ｖａｃ－ｑｕｉｌ）をＭｉｌｌｉ－Ｑ水中に１００ｍｇ／ｍＬの最終濃度で溶解した。全ての成分を１：１：５（コレステロール：ＤＰＰＣ：Ｑｕｉｌ－Ａ）の比で混合し、続いてコレステロールの最終濃度が１ｍｇ／ｍＬになるように１×ＰＢＳで希釈した。ＩＳＣＯＭ－ＭＰＬＡサポニンアジュバントとして、２０％ＭＥＧＡ－１０中５ｍｇ／ｍＬのＭＰＬＡ（Ａｖａｎｔｉ ６９９８００）溶液を調製し、成分を２：１：１：１０（コレステロール：ＤＰＰＣ：ＭＰＬＡ：Ｑｕｉｌ－Ａ）の割合で混合した。溶液を室温で一晩平衡化させ、続いて１０ｋ ＭＷＣＯ膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ６６４５６）を用いて１×ＰＢＳに対して透析した。次いで、アジュバント溶液を滅菌してフィルタにかけ、５０ｋ ＭＷＣＯ Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎスピンフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ ＵＦＣ９０５０２４）を用いて濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ－５００ ＨＲサイズ排除カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２８－９３５６－０６）を用いて高速タンパク質液体クロマトグラフィ（Ｆａｓｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＦＰＬＣ）によって更に精製した。最終アジュバント濃度をコレステロール定量（Ｓｉｇｍａ ＭＡＫ０４３）によって判定した。

ＥＬＩＳＡ
ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ三量体１１ＭＵＴＢ、ＲＣ１、１１ＭＵＴＢΔ３０１、ＲＣ１Δ３０１、ＲＣ１－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）、ＲＣ１－グリカンノックアウト（ＲＣ１－グリカンＫＯ）、ＲＣ１－グリカンＫＯ－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）、ＲＣ１Δ３３２、ＢＧ５０５）、１０ＭＵＴ、７ＭＵＴ、５ＭＵＴ又はＶ３ループ－コンセンサスＣペプチド（配列番号１０：ＫＧＫＧＫＧＫＧＫＧＣＴＲＰＮＮＮＴＲＫＳＩＲＩＧＰＧＱＴＦＹＡＴＧＤＩＩＧＤＩＲＱＡＨＣ）によるＥＬＩＳＡを、１×ＰＢＳ中２μｇ／ｍＬのタンパク質溶液５０μＬ／ウェルにより４℃で一晩直接コーティングすることによって、高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、＃９０１８）の直接コーティングで行った。プレートを洗浄緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含む１×ＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ））で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液（２％ミルク（Ｍｉｌｋ）を含む１×ＰＢＳ）中において室温（ＲＴ）で１時間（ｈ）インキュベートした。ブロッキングの直後に、モノクローナル抗体又は血清試料をブロッキング緩衝液に添加し、室温で２時間インキュベートした。血清試料を１：１００又は１：３０の開始希釈、及び７回の追加３倍連続希釈でアッセイした。マウス及びヒトモノクローナル抗体（ＩｇＧ）又はヒトＦａｂを、結果のセクションで指定した濃度にて評価した。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで、１：５０００希釈で洗浄緩衝液中の抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１１５－０３５－０７１）、抗ヒトＩｇＧ重鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－０３５－０９８）又は西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）にコンジュゲートした抗ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１０９－０３６－０８８）とインキュベートした。ＨＲＰ基質であるＡＢＴＳ Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＃００－２０２４）の添加によってプレートを発展させ、吸光度をＥＬＩＳＡマイクロプレートリーダ（ＦｌｕｏＳｔａｒ Ｏｍｅｇａ、ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ）により４０５ｎｍで測定した。

他のＥＬＩＳＡでは、高結合性９６ウェルプレートを、１×ＰＢＳ中２０μｇ／ｍＬのＦａｂの５０μＬ溶液で、４℃にて一晩直接コーティングした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ブロッキング緩衝液中で室温において１時間インキュベートした。ブロッキング直後に、プレートをブロッキング緩衝液中２μｇ／ｍＬのＲＣ１又はＲＣ１－グリカンＫＯ－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）の５０μＬ溶液中で、室温において１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＣＤ４結合部位ｂＮＡｂ ３ＢＮＣ６０のキメラバージョン（ヒトＦａｂ及びマウスＦｃ）５０μＬと共に室温で、ブロッキング緩衝液中において、５μｇ／ｍＬで開始する３倍連続希釈にて１時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、ＨＲＰにコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ ＃１１５－０３５－０７１）と室温にて１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、発展させた。

フローサイトメトリー及び単一Ｂ細胞選別
単一細胞懸濁液を免疫化マウスの排出リンパ節及び脾臓から得て、成熟Ｂ細胞を、抗ＣＤ４３磁気ビーズ（ＭＡＣＳ）を製造者の説明書に従って用いるネガティブ選択によって単離した。

凍結ＰＢＭＣ、又はナイーブマカク及び免疫化マカクから得られたリンパ節生検由来の細胞を解凍し、ＲＰＭＩ培地１６４０（１倍）（Ｇｉｂｃｏ ＃１１８７５－０９３）で洗浄した。マウス又はマカク細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清及び１ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１倍ＰＢＳ）の溶液１００μＬと、マウス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５５３１４２）又はヒト（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃５６４２１９）Ｆｃブロッカと、それぞれ１：５００希釈で氷上において３０分間インキュベートした。

ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯ（ＲＣ１^＋／ＲＣ１グリカンＫＯ^－）テトラマーは、５μｇのＡｖｉｔａｇ化及びビオチン化ＲＣ１（ＲＣ１－ＡｖｉＢｉｏ）又はＡｖｉｔａｇ化及びビオチン化ＲＣ１－グリカンＫＯ（ＲＣ１－グリカンＫＯ ＡｖｉＢｉｏ）を、フルオロフォア化ストレプトアビジンと共に、１×ＰＢＳ中にて１：２００希釈で氷上において３０分間インキュベートすることによって調製した。

ストレプトアビジンＢＶ７１１にコンジュゲートしたＲＣ１－ＡｖｉＢｉｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６３２６２）及びストレプトアビジン－ＰＥにコンジュゲートしたＲＣ１－グリカンＫＯ ＡｖｉＢｉｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５４０６１）をベイトとして用いて、ＲＣ１^＋／ＲＣ１－グリカンＫＯ^－マウスＢ細胞を単離した。ＲＣ１^＋／ＲＣ１－グリカンＫＯ^－マカクＢ細胞を、３つのベイト：ストレプトアビジン－ＰＥ及びストレプトアビジンＡＦ６４７とコンジュゲートしたＲＣ１－ＡｖｉＢｉｏ、並びにストレプトアビジンＢＶ６０５とコンジュゲートしたＲＣ１－グリカンＫＯ ＡｖｉＢｉｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６３２６０）を用いて単離した。テトラマーを以下に示すヒト又はマウス抗体カクテルと混合し、それぞれの最終濃度を５μｇ／ｍＬにした。

マウス細胞を、マウス細胞表面マーカに対して以下の蛍光色素抗体で染色した：１：２００希釈での抗ＣＤ４ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－００４２－８２）、抗ＣＤ８ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－００８１－８２）、抗Ｆ４／８０ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－４８０１－８２）、抗ＮＫ１．１ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－５９４１－８２）、抗ＣＤ１１ｂ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃４７－０１１２－８２）、抗ＣＤ１１ｃ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃４７－０１１４－８２）、抗Ｇｒ－１ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－５９３１－８２）、抗Ｂ２２０ ＡＰＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃１０３２１２）、抗ＧＬ７ ＦＩＴＣ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５５３６６６）及び抗ＣＤ９５ ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ＃５６２６３３）、及びＦＡＣＳ緩衝液中１：４００希釈での生／死マーカＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃７７１８４）。マカク細胞を、以下の抗ヒト抗体で染色した：１：２００希釈での抗ＣＤ１６ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－０１６８－４１）、抗ＣＤ８ａ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－００８６－４２）、抗ＣＤ３ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４７－００３７－４１）、抗ＣＤ１４ ＡＰＣ－ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃４７－０１４９－４１）、抗ＣＤ２０ ＰｅＣｙ７（ＢＤ、＃３３５７９３）、抗ＣＤ３８ ＦＩＴＣ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃６０１３１ＦＩ）、抗ＩｇＧ ＢＶ４２１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６２５８１）、抗ＩｇＭ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６１２８５）、及びＦＡＣＳ緩衝液中１：４００希釈での生／死マーカＺｏｍｂｉｅ ＮＩＲ。マウス又はマカク細胞を、ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯベイトを含有する対応抗体カクテルと共に氷上で３０分間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。選別又は分析の前に、細胞懸濁液を４０μＭの細胞ストレーナでフィルタにかけた。

Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ^－／ＣＤ４^－／ＣＤ８^－／Ｆ４／８０^－／ＮＫ１．１^－／ＣＤ１１ｂ^－／ＣＤ１１ｃ^－／Ｂ２２０^＋／ＧＬ７^＋／ＣＤ９５^＋ＲＣ１^＋／ＲＣ１－グリカンＫＯ^－単一細胞をマウス細胞ホモジネートから単離し、Ｚｏｍｂｉｅ ＮＩＲ^－／ＣＤ１６^－／ＣＤ８ａ^－／ＣＤ３^－／ＣＤ１４^－／ＣＤ２０^＋／ＣＤ３８^＋／ＩｇＧ^＋／－／二重ＲＣ１^＋／ＲＣ１－グリカンＫＯ^－単一細胞をＦＡＣＳ Ａｒｉａ ＩＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いてマカク細胞ホモジネートから単離した。

単一細胞を、５μｌの溶解緩衝液（１％の２－β－メルカプトエタノールを含むＴＣＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、＃１０３１５７６））を含有する９６ウェルプレートの個々のウェルに分けた。プレートを直ちにドライアイス上で凍結し、－８０℃で保存した。

抗体シーケンシング及びクローニング
単一細胞溶解物を含有する９６ウェルプレートを氷上で解凍した。単一細胞ＲＮＡを、製造者の説明書に従って磁気ビーズ（ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ、＃Ａ６３９８７ Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、指定された清潔区域で精製した。精製プロトコルの最終工程では、ＲＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水（Ｑｉａｇｅｎ）中（１４．５ｎｇ／μｌのランダムプライマ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃４８１９０－０１１）、０．５％テルジトール（ＮＰ－４０型、Ｈ_２Ｏ中７０％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃ＮＰ４０Ｓ－１００ＭＬ）、０．６Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｎ２６１５）を含有する１１μＬの溶液で磁気ビーズから溶出し、６５℃で３分間インキュベートした。続いて、ｃＤＮＡを、以前に記載されたように（ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｌ．ら、「Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ」第１１巻第１９０８～１９２３頁（２０１６年））、逆転写（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ逆転写酵素、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１８０８０－０４４、１０’０００Ｕ）によって合成した。ｃＤＮＡを－８０℃で保存するか、又はネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による抗体遺伝子増幅に使用した。単一Ｂ細胞から抗体遺伝子を増幅するために、１０μｌのヌクレアーゼを含まない水を、ｃＤＮＡを含有する溶液に添加した。

マウス及びマカク抗体遺伝子を、以前に記載されたようにネステッドＰＣＲによって増幅した（ｖｏｎ Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｌ．ら、「Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ」第１１巻第１９０８～１９２３頁（２０１６年））。ＰＣＲプロトコル：（アニーリング（℃）／伸長（秒）／サイクル数）：１回目ＰＣＲ（ＩｇＧ ＩｇＨ及びＩｇλ）：４６／５５／５０；２回目のＰＣＲ（ＩｇＧ ＩｇＨ及びＩｇλ）：５０／５５／５０。増幅した重鎖及び軽鎖ｃＤＮＡを、配列及びライゲーション非依存性クローニング（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｌｏｎｉｎｇ：ＳＬＩＣ）方法論（Ｌｉ，Ｍ．Ｚ．＆Ｅｌｌｅｄｇｅ，Ｓ．Ｊ．「Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻第２５１～２５６頁（２００７年））を用いることで、完全なマウス又はヒトＩｇＧ抗体定常領域又はヒト重鎖定常領域１（断片抗原結合（Ｆａｂ）ベクター）を含有する発現ベクターへと個別にクローニングした。

抗体の作製及び精製
Ｉｇは、Ａｂ Ｓｐｉｎ Ｔｒａｐ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、＃２８－４０８３－４７）を製造者の説明書に従って用いて、２００μｌのマウス血清又はマカク血清から精製した。Ｉｇを２００μｌの４つのフラクション中に溶出させた。Ｉｇ含有フラクションを、４℃にて一晩の透析によってＰＢＳと緩衝液交換した（透析カセット２００００、ＭＷＣＯ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃６６００５）。

構造試験のために、マウスＩｇＧ及びマカクＨｉｓ_６タグ付きＦａｂ（配列番号１９として開示される「Ｈｉｓ_６」）を、ＨＥＫ２９３－６Ｅ又はＥｘｐｉ２９３細胞において一過性トランスフェクションによって発現させ、記載されているように（Ｓｃｈａｒｆ，Ｌ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１６２巻第１３７９～１３９０頁（２０１５年））、プロテインＡ若しくはＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（ＩｇＧについて）又はＮｉ－ＮＴＡ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）又はＮｉ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）（Ｆａｂについて）クロマトグラフィ及びＳＥＣを用いて、細胞上清から精製した。マウスＦａｂは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから改変されたプロトコルを用いて、１～５ｍｇ ｍｌ^－１のＩｇＧをフィシン（Ｓｉｇｍａ）で消化することによって得た。Ｆａｂを、記載のように、プロテインＧ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＳＥＣクロマトグラフィ、続いてＭｏｎｏ Ｑ５／５０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）イオン交換クロマトグラフィによって精製した（Ｄｉｓｋｉｎ Ｒ．ら、「Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ」第１７巻第６０８～６１３頁）。ＰＧＴ１２１及び１０－１０７４ ｂＮＡｂの共通するｉＧＬを、上記のようにＨｉｓ_６タグ付きＦａｂ（配列番号１９として開示される「Ｈｉｓ_６」）として発現させた。

インビトロ中和アッセイ
ＴＺＭ－ｂｌアッセイを記載のように実施した（Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、「Ｄ．Ｃ．Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ」第１２章第１２部第１１頁（２００５年））。手短に言えば、中和活性は、１回のウイルス感染後のＴＺＭ－ｂｌレポータ細胞株における、Ｔａｔ誘導性ルシフェラーゼ発現の減少の関数として算出した。

ＳＰＲ
ＳＰＲ実験を、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００（Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて行った。ＰＧＴ１２１／１０－１０７４ ｉＧＬ Ｆａｂに対する親和性を測定するために、プロテインＡを第一級アミン化学反応（Ｂｉａｃｏｒｅマニュアル）によってＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）上に固定化し、２００ｎＭ ８ＡＮＣ１９５_{Ｇ５２Ｋ５}抗Ｅｎｖ ＩｇＧを記載のように実験フローセル上に注入した（Ｓｃｈａｒｆ，Ｌ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１６２巻第１３７９～１３９０頁（２０１５年））。参照フローセルは、ＨＩＶ Ｅｎｖに結合しない２００ｎＭ ｍＧ０５３ ＩｇＧを注射することによって作製した。ヒトＦｃを１μＭで注射して、残りのプロテインＡ部位をブロックした。１０μＭ ＳＯＳＩＰタンパク質（ＲＣ１、１１ＭＵＴＢ又は１０ＭＵＴ）を捕捉した後、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４ ｉＧＬ Ｆａｂ（１０ＭＵＴについては最高濃度１６０μＭから４倍希釈、並びに１１ＭＵＴＢ及びＲＣ１については最高濃度１５０μＭから２倍希釈）の濃度系列を注射し、結合反応を平衡に到達させた。フローセルを、記載のように流速９０μＬ／分で、１０ｍＭグリシンｐＨ２．０及び１ＭグアニジンＨＣｌを用いて再生した（Ｓｃｈａｒｆ，Ｌ．ら、「Ｃｅｌｌ」第１６２巻第１３７９～１３９０頁（２０１５年））。Ｒ_ｅｑ（平衡結合応答）対注射したタンパク質濃度の対数のプロットの非線形回帰分析によってＫ_Ｄを導出し、データを記載のように１：１結合モデルに適合させた（Ｖａｕｇｈｎら、「Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」第３６巻第９３７４～９３８０頁（１９９７年））。

マウス及びサルから単離した抗体の相対結合を測定するために、ＳＯＳＩＰ Ｅｎｖ三量体をＣＭ５チップ上に一次アミン化学反応によって固定化し、選択したＦａｂを２００ｎＭで注入した。フローセルを１０ｍＭグリシンｐＨ２．０で再生した。

Ｃｒｙｏ－ＥＭ試料調製
１０－１０７４と複合体化したＲＣ１を、精製ＲＣ１を１：３：３のモル比（ｇｐ１４０プロトマ：１０－１０７４Ｆａｂ：ＣＤ４ｂｓ Ｆａｂ）で１０－１０７４Ｆａｂ及びＣＤ４結合部位（ＣＤ４ｂｓ）Ｆａｂと共に室温で一晩インキュベートすることによって調製した。ＲＣ１－Ｆａｂ複合体を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてＴＢＳ（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中のＳＥＣによって単離した。マウス及びマカクＦａｂとのＲＣ１複合体を、精製ＲＣ１をマウス又はマカクＦａｂ及び８ＡＮＣ１９５ Ｆａｂと共に１：１．３：１．３のモル比（ｇｐ１４０プロトマ：マウス又はマカクＦａｂ：８ＡＮＣ１９５ Ｆａｂ）で室温にて一晩インキュベートすることによって調製し、ＳＥＣ精製を行わずに使用した。ＲＣ１－Ｆａｂ複合体を、ＴＢＳ中で０．７５～１．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、グロー放電した３００Ｍｅｓｈ Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３銅グリッドに添加し、Ｍａｒｋ ＩＶ Ｖｉｔｒｏｂｏｔ（ＦＥＩ）を用いて液体エタン中でガラス化した。

Ｃｒｙｏ－ＥＭデータ収集
ＲＣ１－Ｆａｂ複合体を、ＥＰＵ自動画像取得ソフトウェアを用いて、２００ｋＶで動作し、Ｆａｌｃｏｎ ３ＥＣ直接電子検出器を備えた、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａクライオ電子顕微鏡で画像化した（Ｔａｎら、「Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（Ｏｘｆ）」第６５巻第４３～５６頁（２０１６年））。ＲＣ１－１０－１０７４データを別々の２日間で収集し、処理の際に組み合わせた。各顕微鏡写真を７３，０００倍の倍率で収集した。これは１．４３６Åのピクセルサイズであった。

Ｃｒｙｏ－ＥＭデータ処理
顕微鏡動画をＲＥＬＩＯＮ－３で動作補正し、線量を、ＭｏｔｉｏｎＣｏｒ２を用いて調整し、Ｇｃｔｆを用いてＣＴＦを推定し、そしてガウシアン・ブロブ・オートピッキング（Ｇａｕｓｓｉａｎ ｂｌｏｂ ａｕｔｏ－ｐｉｃｋｉｎｇ）を用いて顕微鏡写真から粒子を採取した（Ｚｉｖａｎｏｖ，Ｊ．ら、「Ｅｌｉｆｅ」第７巻（２０１８年）；Ｚｈｅｎｇ，Ｓ．Ｑ．ら、「Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第１４巻第３３１～３３２頁（２０１７年）；Ｚｈａｎｇ，Ｋ．Ｇｃｔｆ．、「Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ」第１９３巻第１～１２頁（２０１６年））。抽出した粒子をｃｒｙｏＳＰＡＲＣ ｖ２にインポートし、２Ｄクラス平均に分類した（Ｐｕｎｊａｎｉ，Ａ．ら、「Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第１４巻第２９０～２９６頁（２０１７年））。選択された粒子を２つのアビニシオ（ａｂ ｉｎｉｔｉｏ）モデルへ選別し、選択されたモデルをそれらの選択した粒子の均質な改良における参照として使用した。分解能は、独立して純化されたハーフマップのゴールド・スタンダード・フーリエ・シェル相関（Ｇｏｌｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｆｏｕｒｉｅｒ ｓｈｅｌｌ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）を使用して推定し（ＦＳＣ＝０．１４３）、マップはｃｒｙｏＳＰＡＲＣで自動鮮明化した（Ｐｕｎｊａｎｉ，Ａ．ら、「Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第１４巻第２９０～２９６頁（２０１７年）；Ｓｃｈｅｒｅｓ，Ｓ．Ｈ．＆Ｃｈｅｎ，Ｓ．、「Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ」第９巻第８５３～８５４頁（２０１２年））。Ｎ結合型グリカンを解釈するため、ＰＮＧＳにおける局所的特徴及びマップ結合性を改善するように、－１５０～－４００Å^２の範囲の全体的なＢ因子を有する一連のマップを作成した（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．ら、「Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ」第７４巻第５４５～５５９頁（２０１８年））。

モデル構築
各複合体の個々の成分の座標を、ＵＣＳＦキメラを用いてマップにドッキングした。ＲＣ１－１０－１０７４複合体について、ＢＧ５０５（ＰＤＢ ５Ｔ３Ｚ）、１０－１０７４Ｆａｂ（ＰＤＢ ５Ｔ３Ｚ）及び８ＡＮＣ１３１ Ｆａｂ（ＰＤＢ ４ＲＷＹ）を、密度にドッキングした（Ｇｏｄｄａｒｄ，Ｔ．Ｄ．ら、「Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ」第１５７巻第２８１～２８７頁（２００７年））。ＲＣ１、ＢＧ５０５ Ｅｎｖ（ＰＤＢ ５ＣＥＺ）、ＰＧＴ１２１／１０－１０７４ ｉＧＬ Ｆａｂ（ＰＤＢ ４ＦＱＱ）及び８ＡＮＣ１９５ Ｆａｂ（ＰＤＢ ５ＣＪＸ）を有するマウス又はマカクＦａｂ複合体について、座標を密度マップにドッキングした。複合体中のＦａｂ及びＲＣ１の配列を置き換えた後、Ｃｏｏｔ及びＰｈｅｎｉｘで反復的に改良して、モデルを構築した（Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｄ．ら、「Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ」第６６巻第２１３～２２１頁（２０１０年）；Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ら、「Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ」第６６巻第４８６～５０１頁（２０１０年））。グリカンの座標をＭａｎ_９として追加し、次いで、σ＝５でマップに適合するようトリミングした。モデル検証は、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ及びＰｒｉｖａｔｅｅｒを用いて行った（Ｃｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．ら、「Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ Ｄ Ｂｉｏｌ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ」第６６巻第１２～２１頁（２０１０年）；Ａｇｉｒｒｅ，Ｊ．ら、「Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ」第２２巻第８３３～８３４頁（２０１５年））。

ＲＣ１－１０－１０７４複合体中のＣＤ４結合部位Ｆａｂ、並びにマウス及びマカクＦａｂとのＲＣ１複合体中の８ＡＮＣ１９５ Ｆａｂは構造図に示されず、それらの座標は、ＥＭＤＢ及びＰＤＢに寄託されたＲＣ１－Ｆａｂ複合体構造に含まれなかった。

解析ソフトウェア
Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｘ及びＭａｃＶｅｃｔｏｒ １５．５．３を配列分析に使用し、Ｒ言語を用いてグラフを作成した。フローサイトメトリデータはＦｌｏｗＪｏ １０．５．０を用いて処理した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ７をデータ分析に使用した。

定量化及び統計分析
ｎ、平均及び統計的有意性値を含む統計情報は、テキスト又は図の凡例に示されている。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７を独立Ｔ検定による統計分析に使用した。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１、＊＊＊ｐ≦０．００１及び＊＊＊＊ｐ≦０．０００１で、データを統計的に有意とみなした。

実施例２
ＲＣ１はＶ３－グリカンエピトープへの抗体結合を促進する
ＲＣ１は、クレードＡ／Ｅ ＢＧ５０５ Ｅｎｖに由来する修飾天然様可溶性Ｅｎｖ三量体（ＳＯＳＩＰ．６６４）である１１ＭＵＴＢを、テンプレートとして用いて設計した。ＢＧ５０５と比較して、１１ＭＵＴＢはＶ１に複数の置換を含み、位置Ｎ１３３及びＮ１３７で潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｎ－ｌｉｎｋｅｄ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ：ＰＮＧＳ）を欠いている（図１ａ）（Ｓｔｅｉｃｈｅｎ，Ｊ．Ｍ．ら、「Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」第４５巻第４８３～４９６頁（２０１６年）；Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｒ．Ｗ．ら、「ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ」第９巻第ｅ１００３６１８頁（２０１３年））。位置１５６（Ｎ１５６Ｑ）のＰＮＧＳの更なる除去は、Ｖ３－グリカンパッチｂＮＡｂと相互作用するＶ１の部分の接近可能性を増大させることによって、Ｖ３－グリカンパッチの認識を容易にするであろうと仮定された。この考えと一致して、Ｎ１５６ ＰＮＧＳが存在しないことで、ＰＧＴ１２１及び１０－１０７４による中和が増強される（図６ａ）。加えて、負に荷電した末端シアル酸を含むＮ１５６グリカンの除去は、Ｖ３－グリカンｂＮＡｂ ＰＧＴ１２１及び１０－１０７４（ｉＧＬ ＰＧＴ１２１／１０－１０７４）のほぼ中性の抗体前駆体の結合を促進することができる、より静電的に中性なＥｎｖ表面を生成すると仮定された。

ＲＣ１は、ＥＬＩＳＡによってｂＮＡｂとのその相互作用を評価することで最初に特徴付けられた。予想されるように、Ｎ１５６グリカンと相互作用するＶ１－Ｖ２特異的ｂＮＡｂは、ＢＧ５０５と比較してＲＣ１への結合の減少を示した（図６ａ及び図６ｂ）。対照的に、Ｖ３－グリカンエピトープ、ＣＤ４結合部位又はｇｐ１２０－ｇｐ４１界面を標的とするｂＮＡｂは、ＲＣ１及びＢＧ５０５と同様に結合した（図６ｂ）。したがって、ＲＣ１はＢＧ５０５の全体的な抗原特性を保持していた。

ＲＣ１を更に特徴付けるために、１０－１０７４の抗原結合断片（Ｆａｂ）と複合体化したＲＣ１の４．０Å単一粒子ｃｒｙｏ－ＥＭ構造を解明し、これをＢＧ５０５に結合した同じｂＮＡｂの構造と比較した（図１ｂ、図７、表３）。ＲＣ１構造はＢＧ５０５に類似しており、両方ともＥｎｖの閉じた立体配座を示し、かつ３つのＶ３－グリカン・パッチ・エピトープに結合する３つの１０－１０７４Ｆａｂを含有していた（図１ｂ）。ＢＧ５０５と比較して、ＲＣ１のＶ１ループはより規則的な残基を含み、１０－１０７４のＣＤＲＨ３に向かってシフトし、ＲＣ１と１０－１０７４との間の相互作用の増加させた（図１ｂ）。

Ｎ１５６グリカンの欠失に起因するＶ１の構造変化にもかかわらず（図１ｂ）、ＰＧＴ１２１及び１０－１０７４の共通するｉＧＬ前駆体は、同様の親和性（Ｋ_Ｄ約５０μＭ）でＲＣ１及び１１ＭＵＴＢに結合した（図１ｃ）。これらの観察結果と一致して、ＲＣ１及び１１ＭＵＴＢは、ｉＧＬ ＰＧＴ１２１／１０－１０７４をコードする遺伝子を保有するノックイン（ｋｎｏｃｋ－ｉｎ：ＫＩ）マウスにおいて同等のＶ３－グリカンエピトープ特異的血清学的応答を誘発した（図２ａ及び図２ｂ）。結論として、ＲＣ１はＢＧ５０５からの構造変化を示したが、これらはｉＧＬ ＰＧＴ１２１／１０－１０７４前駆体抗体に対するその親和性には影響を及ぼさなかった。

実施例３
ＲＣ１は野生型マウスにおけるＶ３－グリカンパッチ抗体を誘発する
ＲＣ１が野生型マウスにおいてＶ３－グリカンパッチ特異的抗体を保有するＢ細胞を活性化できるかどうかを判定するために、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、ＲＣ１又は１１ＭＵＴＢで免疫化した。１１ＭＵＴＢは測定可能な血清学的応答をもたらすことができなかった（図２ｃ）。対照的に、ＲＣ１免疫化マウスは、ＲＣ１並びに位置３０１及び３３２で２つの更なるＶ３ ＰＮＧＳを欠く変異ＲＣ１（ＲＣ１－グリカンＫＯ）への結合を比較するＥＬＩＳＡによって判定されるように、再現性のある抗Ｖ３－グリカンパッチ応答を示した（図２ｃ、図２ｄ、図２ｅ及び図２ｆ、表２）。更に、ＲＣ１免疫化マウス由来の血清は１１ＭＵＴＢと交差反応したが、より天然の１０ＭＵＴ Ｅｎｖ又はＢＧ５０５には交差反応しなかった（図８）。ＲＣ１のＶ３－グリカン・パッチ・エピトープの免疫原性の改善は、１１ＭＵＴＢからのＮ１５６グリカンの特異的除去の結果であって、これは、１１ＭＵＴＢからのＮ３０１グリカンの除去（１１ＭＵＴＢΔ３０１）（表２参照）がマウスにおいて検出可能な血清学的応答を誘導できなかったためである（図２ｇ）。１１ＭＵＴＢ及び１１ＭＵＴＢΔ３０１とは異なり、ＲＣ１は、野生型マウスにおいてＶ３－グリカン特異的血清学的応答を誘発すると結論付けられた。

オフターゲットエピトープに対する抗体応答を減少させ、応答をＶ３－グリカンパッチに集中させるために、ｇｐ１２０の２３０位、２４１位、２８９位及び３４４位のグリカンで潜在的なオフターゲット部位を覆うためにＰＮＧＳを添加することによって、ＲＣ１バリアントであるＲＣ１－４ｆｉｌｌを作製した（図９）。ＲＣ１－４ｆｉｌｌは、ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯに対するＥＬＩＳＡによって判定されるように、野生型マウスにおいてＲＣ１により誘発されるものよりもＶ３－グリカンパッチにより特異的である血清学的応答を誘発した（図２ｈ）。ＲＣ１－４ｆｉｌｌは、Ｖ３－グリカン・パッチ・エピトープに対する抗体応答を集中させるものと結論付けられた。

実施例４
野生型マウスにおけるＶ３－グリカンパッチ特異的Ｂ細胞のクローン増殖
野生型マウスにおいてＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌによって誘発される体液性応答を更に特徴付けるために、ＲＣ１－グリカンＫＯには結合しないがＲＣ１に結合する単一ＧＣ Ｂ細胞由来の抗体遺伝子をシーケンシングした（図１０）。分析した全てのＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌ免疫化マウスはがＧＣ Ｂ細胞クローンの増殖を示した（図２ｉ）。増殖したクローンは、主に、重鎖Ｖ遺伝子セグメントＶＨ５－６、ＶＨ９－３及びＶＨ２－９、並びに軽鎖セグメントＶＫ３－４及びＶＫ１４－１１１を発現した（図２ｉ、表４、表５及び表６）。増殖クローン中のＣＤＲＨ３配列は、Ｔｙｒリッチ又はＲｘＹモチーフ（表４及び表６）及び平均よりも長いＣＤＲＨ３などのヒトＶ３－グリカンパッチｂＮＡｂとの類似性を示したが、挿入又は欠失はなかった。増殖したクローンのＶＨ遺伝子は、平均３．２のヌクレオチド変異を有していた（図２ｊ、表４）。

増殖したＢ細胞クローンによって産生される抗体の標的部位を判定するために、選択された抗体をクローニングし、産生し、ＥＬＩＳＡをＲＣ１及びＲＣ１変異タンパク質に対して行った。多様な群のモノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｍＡｂ）は、ＥＬＩＳＡにおいてＶ３－グリカンパッチ特異的結合を示した（図２ｋ）。ＲＣ１（Ａｂ２７５_ＭＵＲ）又はＲＣ１－４ｆｉｌｌ（Ａｂ２７６_ＭＵＲ）で免疫化したマウスから単離した２つのｍＡｂのＥｎｖ結合特性の更なる特徴付けは、これらの抗体が、ＧＤＩＲ（配列番号１５）及びＮ３０１－グリカン依存的様式でＶ３－グリカン・パッチ・エピトープに結合することを示した（図２ｌ、表２）。両方の抗体は１１ＭＵＴＢに結合したが、ＢＧ５０５又はＶ３ループのクラウンを覆うペプチドには結合しなかった（図２ｌ、図１１ａ）。Ａｂ２７５_ＭＵＲはＫ_Ｄ約３０ｎＭでＲＣ１に結合した（図１１ｂ）。重要なことに、Ａｂ２７５_ＭＵＲは１１ＭＵＴＢへの結合を保持し（Ｋ_Ｄ約２３０ｎＭ）、Ｎ１５６グリカンを受け入れられることが実証された（図１１ｃ）。ｉＧＬ配列への復帰はＲＣ１への結合喪失をもたらしたので、獲得された突然変異は結合に不可欠であった（図１１ｄ）。予想通り、Ａｂ２７５_ＭＵＲ又はＡｂ２７６_ＭＵＲのいずれも、ＴＺＭｂｌアッセイにおいて、ｔｉｅｒ１Ｂ及びｔｉｅｒ２ＨＩＶ－１単離株の小パネルに対して検出可能な中和活性を示さなかった（データ示さず）。したがって、ＲＣ１及びＲＣ１－４ｆｉｌｌは、Ｖ３－グリカンパッチを標的とする抗体を発現するマウスＢ細胞クローンを増殖させるものと結論付けられた。

実施例５
ＶＬＰ－ＲＣ１－４ｆｉｌｌは、ウサギ及びアカゲザルにおいてＶ３－グリカンパッチ抗体を誘発することを示す。

潜在的な結合活性効果を高め、Ｅｎｖ三量体の塩基における更なるオフターゲットエピトープの曝露を制限するために、Ｓｐｙｔａｇ－ＳｐｙＣａｔｃｈｅｒシステムを用いて、ＲＣ１－４ｆｉｌｌをウイルス様粒子（ＶＬＰ）上で多量体化した（図３ａ及び図３ｂ）。ウサギ及びアカゲザルは、それらの抗体がマウスよりも長いＣＤＲＨ３を有するので、ＨＩＶ－１ワクチン研究のためのマウスよりも優れたモデルであると考えられている（マウスでは平均１１残基、ウサギでは１３残基、並びにアカゲザル及びヒトの両方では１５残基）。

ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによる４匹のウサギ及び８匹のアカゲザルの免疫化は、ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯに対するＥＬＩＳＡによって判定されるように、全ての動物においてＶ３－グリカンパッチに部分的に特異的Ｄである血清学的応答を誘発した（図３ｃ及び図３ｄ）。ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰでプライミングされたマカク由来の血清は、より天然様の免疫原１１ＭＵＴＢ及び１０ＭＵＴへの結合の連続的な減少を示した（図１２）。したがって、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰは、ウサギ及びアカゲザルにおいてＶ３－グリカンパッチにマッピングされる、ロバストな血清学的応答を誘発した。

マカクにおいてＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰにより誘発される応答を更に特徴付けるために、ＲＣ１－グリカンＫＯではなくＲＣ１に結合した排出リンパ節ＧＣ Ｂ細胞を、フローサイトメトリーによって精製した（ＲＣ１^＋／ＲＣ１－グリカンＫＯ^－）。ＲＣ１^＋細胞はナイーブマカクのＧＣには存在しなかったが、ＲＣ１^＋／ＲＣ１－グリカンＫＯ^－ＧＣ Ｂ細胞は、分析した４匹のマカクのリンパ節において、全ＧＣ Ｂ細胞の０．４％の平均頻度で見られた（図３ｅ及び図３ｆ）。

４匹の免疫化マカクからの抗体クローニングにより、平均５．６ヌクレオチドの体細胞変異を伴う様々なＶＨ遺伝子を使用した増殖Ｂ細胞クローンが全てにより示されたことが明らかになった（図３ｇ及び図３ｈ、表７）。ほとんどの特徴付けられたヒトＶ３－グリカンパッチｂＮＡｂはラムダ軽鎖を含有する。ラムダ遺伝子使用の分析により、マカクＲＣ１結合細胞は、ＰＧＴ１２５－１２８及びＰＧＴ１３０－１３１においてＶＬ２－８と９０．６％同一である遺伝子ＶＬ１３２と、ＰＧＴ１２１－１２３／１０－１０７４においてＶＬ３－２１と９３．８％同一であるＶＬ１２４と、を優先的に使用したことが明らかになった（図３ｉ、表８）。更に、ラムダ軽鎖の８６％は、ＰＧＴ１２１－１２３、１０－１０７４及びＰＧＴ１２４のｉＧＬ中に存在するＤＳＳモチーフを含むＣＤＲ３を有していた（図３ｊ、表９）。このモチーフは成熟ｂＮＡｂにおいてＤＳＲに変異し、この置換はＰＧＴ１２１の中和活性にとって重要である。ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化は、抗体配列がヒトＶ３－グリカンパッチｂＮＡｂ前駆体に類似するＢ細胞クローンを増殖させるものと結論付けられた。

３８匹のマカクのＧＣ抗体を、ｉＧＬ Ｖ３－グリカンパッチｂＮＡｂのＣＤＲＬ３に類似するＣＤＲＬ３により発現させた（表１０）。これらの抗体の３３個のＣＤＲＬ３は、ＰＧＴ１２１－３、１０－１０７４、ＰＧＴ１２４及びＢＧ１８ ｉＧＬのＣＤＲＬ３にも見られるＤＳＳモチーフ及び８９位のＱ（ＱｘｘＤＳＳモチーフ（配列番号２０））を含有した（表１１）。他の５つの抗体は、ＰＧＴ１２５－７、ＰＧＴ１２８、ＰＧＴ１３０及びＰＧＴ１３１ｉＧＬのＣＤＲＬ３に存在する、ＳＹＡＧモチーフ（配列番号２１）を含有していた（表１１）。ＲＣ１及びＲＣ１－グリカンＫＯ－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）を用いたＥＬＩＳＡによって判定定した場合、３３個のＱｘｘＤＳＳモチーフ含有抗体のうち３０個（配列番号２０として開示される「ＱｘｘＤＳＳ」）及び５個のＳＹＡＧモチーフ含有抗体のうちの２個（配列番号２１として開示される「ＳＹＡＧ」）が、Ｖ３－グリカン・パッチ・エピトープに結合した（図４ａ、表１０）。これら３８個のＶ３－グリカンパッチ抗体のＣＤＲＨ３長は、１１～２１残基（平均＝１５．５残基）の範囲であった（図４ｂ）。より長いＣＤＲＨ３は、ヒトＶ３－グリカンパッチｂＮＡｂの長いＣＤＲＨ３と同様に、高い含有量のＴｙｒ及び／又はＰｈｅ残基を含有していた（表１０）。これらの抗体のＶＨ及びＶＬ遺伝子は、それぞれ、平均４．９及び３．３のヌクレオチド変異を有していた（図４ｃ）。

ＲＣ１の抗体認識を更に特徴付けるために、追加の変異体ＲＣ１－グリカンＫＯ、ＲＣ１－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）、ＲＣ１－グリカンＫＯ－ＧＡＩＡ（配列番号１６として開示される「ＧＡＩＡ」）、１１ＭＵＴＢΔ３０１、ＲＣ１Δ３０１、ＲＣ１Δ３３２、１１ＭＵＴＢ及びＢＧ５０５に対して、ＥＬＩＳＡを行った（図４ｄ及び図４ｅ、表２）。ＥＬＩＳＡは、ＣＤＲＬ３にＱｘｘＤＳＳモチーフ（配列番号２０）を含有する抗体間でＲＣ１に対して４つの異なる結合パターンを示唆し（図４ｄ）、ＳＹＡＧモチーフ（配列番号２１）を含有する抗体間で追加のパターンを示唆した（図４ｅ）。全ての抗体がＲＣ１－グリカンＫＯへの結合の非存在によって決定されるようにグリカン依存性であったのに対して、これらは、１１ＭＵＴＢ又は１０ＭＵＴへのそれらの結合、ＧＤＩＲモチーフ（配列番号１５）への依存性、並びにＮ３０１、Ｎ３３２及びＮ１５６グリカンへの依存性において異なっていた（図４ａ、図４ｄ及び図４ｅ）。試験した抗体はいずれもＢＧ５０５に結合しなかったか、又はＴＺＭｂｌアッセイにおいてｔｉｅｒ１Ｂ及びｔｉｅｒ２ ＨＩＶ－１単離株の小パネルに対して中和活性を有しなかった（図４ｄ及び図４ｅ、データ示さず）。ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰによるマカク免疫化は、この部位を標的とするヒトｂＮＡｂの前駆体に類似するＶ３－グリカンパッチ特異的抗体を誘発するものと結論付けられた。

実施例６
ＲＣ１と複合体化したマウス抗体及びマカク抗体のＣｒｙｏ－ＥＭ構造
結合の分子機構を定義し、Ｖ３－グリカンパッチ認識の様式を比較するために、ＲＣ１と複合体化した１匹のマウス及び２匹のマカクＦａｂの構造を、単一粒子クライオ電子顕微鏡法を用いて決定した。全３つの抗体は１０－１０７４フットプリントと重複するフットプリントでＶ３－グリカン・パッチ・エピトープに結合したが、１０－１０７４と比較して、異なるアプローチの角度で結合した（図５ａ及び図５ｂ）。Ａｂ２７５_ＭＵＲ（分解能４．４Å）及びＡｂ８７４_ＮＨＰ（３．９Å）（Ａｂ８７６_ＮＨＰと同じクローンに由来）は、互いに同様に結合し、それらの６９％の配列同一性と一致したが、一方でＡｂ８９７_ＮＨＰ（４．４Å）（それぞれ、Ａｂ２７５_ＭＵＲ及びＡｂ８７４_ＮＨＰと４８％及び５４％の配列同一性により関連）は異なるアプローチの角度を採用した（図５ｂ）。

ＲＣ１複合体中の３つのＦａｂは全てＧＤＩＲモチーフ（配列番号１５）と接触したが、互いに、及び１０－１０７４と比較して、異なるフットプリントを有していた。１０－１０７４は、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１及びＣＤＲＬ３を用いて保存されたＧＤＩＲモチーフ（配列番号１５）と接触したが（図１ｃ及び図５ｂ）、Ａｂ８７４_ＭＵＲ及びＡｂ２７５_ＮＨＰはそれらのＣＤＲＨ２を用いて主にＧＤＩＲ（配列番号１５）と接触し、Ａｂ８９７_ＮＨＰはＣＤＲＬ１及びＣＤＲＬ３を利用した（図５ｂ及び図５ｃ）。ＧＤＩＲ（配列番号１５）との接触に加えて、Ａｂ２７５_ＭＵＲ及びＡｂ８７４_ＮＨＰは、Ｎ３３２グリカンと相互作用した（図５ａ及び図５ｂ）。しかしながら、そのＣＤＲＬ１、ＦＲＷＬ３、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３を介してＮ３３２グリカンと広範囲に相互作用する１０－１０７４とは異なり、Ａｂ２７５_ＭＵＲはそのＣＤＲＨ２のみを用いて最小限の接触を行い、Ａｂ８７４_ＮＨＰはＮ３３２グリカンをそのＣＤＲＨ２及びＦＲＷＨ３と係合させた。Ｎ３３２グリカンとの相互作用はＡｂ８９７_ＮＨＰ－ＲＣ１構造では観察されなかった。ＲＣ１Δ３０１に対するＡｂ２７５_ＭＵＲ、Ａｂ８７６_ＮＨＰ（Ａｂ８７４_ＮＨＰと同じクローン）及びＡｂ８９７_ＮＨＰの結合の減少にもかかわらず（図２ｌ）、ＲＣ１複合体中のＦａｂはいずれもＮ３０１グリカンとの相互作用を示さず、この相互作用を不明瞭にするグリカン不均一性及び／又は結合を減少させるこのグリカンを欠くＶ３－グリカンパッチの立体構造変化のいずれかを示唆した。ＲＣ１は、霊長類を含むポリクローナル抗体レパートリを有する動物において異なる結合様式でＶ３－グリカンパッチ標的化抗体を誘発するものと結論付けられた。

ＨＩＶ－１ ｂＮＡｂは、急速に進化する病原体に応答して、体細胞変異の連続したラウンドにより感染したヒトにおいて発症する。一連の関連抗原によるワクチン接種は、ｂＮＡｂのｉＧＬ前駆体を発現する超生理学的数のＢリンパ球を保有する遺伝子操作マウスにおいて、この事象の進行を再現することができる。ＨＩＶ－１ワクチン設計の重要な目的は、ヒトにおいてこれらの応答を再現することを目的とした、ポリクローナル免疫系を有する生物においてこの応答を開始する免疫原を設計することである。

ＨＩＶ－１ワクチン免疫原の設計は、稀な前駆体の特定の群をＧＣに動員する目的で、特異的なｉＧＬ ｂＮＡｂ前駆体に対する候補免疫原の親和性を増加させることに焦点を当ててきた。このアプローチは、典型的には、Ｂ細胞の表面上の多量体化抗原と多価抗原受容体との間の相互作用によって生じる見かけの親和性の増加を説明することができない。更に、ＧＣエントリは主に競合によって制限される。したがって、低い親和性受容体を有するＢ細胞が生理学的条件下においてＧＣで頻繁に見られるという観察によって証明されるように、親和性の重要性とは相対的である。

ＲＣ１を生成するために使用される原理は、親和性を考慮しなかった。代わりに、ＲＣ１は、ＧＣエントリについて競合し得るｂＮＡｂ前駆体の数を増加させるように設計された。これは、静電気的に中性なｉＧＬ前駆体への結合を促進しながら、抗原性標的部位をより利用可能にすることによって行われた。加えて、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰには、オフターゲットエピトープについて競合するマスキングがＧＣエントリについての競合を最小化するという考えが組み込まれている。

ＲＣ１は、完全にポリクローナルなＢ細胞レパートリを有する動物のＧＣにおいてクローン増殖を受けるように標的化エピトープに対する抗体を発現するＢ細胞を誘導するという点で、他のＨＩＶ－１ワクチン候補とは異なる。マカクでは、これらのＢ細胞は、Ｖ３－グリカンパッチを標的とするｂＮＡｂのｉＧＬ前駆体に対する配列及び構造類似性を示す抗体を発現する。したがって、ＲＣ１－４ｆｉｌｌ ＶＬＰは、Ｖ３－グリカンｂＮＡｂを誘発することを目的とする逐次ワクチン接種戦略に適した候補免疫原である。

実施例７
ＲＣ１－３ｆｉｌｌ ＶＬＰ及びＮＰは、ＲＣ１ ＶＬＰ及びＮＰと同様に挙動する
ＲＣ１、ＲＣ１－３ｆｉｌｌ及びＲＣ１－４ｆｉｌｌ免疫原のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）トレース（図１３ａ）は、ＲＣ１－４ｆｉｌｌと比較してＲＣ１及びＲＣ１－３ｆｉｌｌ免疫原のより小さなフラクションが空隙容積中で溶出することを示し、ＲＣ１及びＲＣ１－３ｆｉｌｌがＲＣ１－４ｆｉｌｌよりも安定でありかつ、凝集しにくいことを実証している。各免疫原についてのＨＥＫ ２９３Ｔ ６Ｅ細胞における１Ｌ発現からの代表的な収率（図１３ｂ）は、ＲＣ１－３ｆｉｌｌがＲＣ１－４ｆｉｌｌよりも高いレベル及びＲＣ１と同様のレベルで発現されたことを示唆する。

図１３ｃは、ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰ（暗灰色）及びＡＰ２０５－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＶＬＰ（黒色）の精製のための代表的なＳＥＣトレースを示す。図１３ｄは、ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰ（左）及びＡＰ２０５－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＶＬＰ（右）の電子顕微鏡写真を示し、これは、ＡＰ２０５－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＶＬＰが、ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰと類似しているように見え、粒子当たりのコンジュゲートした三量体の数が類似していることを示す。顕微鏡写真はまた、精製戦略が充分であり、いずれの試料にも遊離三量体が存在しなかったことも示す。ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（暗灰色）及びｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰ（黒色）の精製のための代表的なＳＥＣトレース（図１３ｅ）は、ＲＣ１及びＲＣ１－３ｆｉｌｌがｍｉ３ ＮＰにコンジュゲートされ得ることを示している。ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（左）及びｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰ（右）の電子顕微鏡写真（図１３ｆ）は、ｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰが、ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰと類似しているように見え、粒子当たりのコンジュゲートした三量体の数が類似していることを示す。顕微鏡写真はまた、精製戦略が充分であり、いずれの試料にも遊離三量体が存在しなかったことも示す。ＡＰ２０５－ＲＣ１－ＶＬＰ（図１３ｇ）及びｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（図１３ｈ）の初期精製と、２８日目（ＡＰ２０５）及び１１日目（ｍｉ３）の試料の再注入との両方に関するＳＥＣプロファイルは、コンジュゲート粒子が経時的に安定であり、２８日間又は１１日間の貯蔵後に非コンジュゲートＲＣ１又は分解産物が見られなかったことを示している。

ｍｉ３－ＲＣ１－ＮＰ（図１３ｉ）又はｍｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌ－ＮＰ（図１３ｊ）のいずれかで免疫化した６匹の野生型マウスの血清を、ＲＣ１（黒色）及びＲＣ１グリカンＫＯ（灰色）への結合について試験した。ＥＬＩＳＡにおいてＲＣ１に結合したＭｉ３－ＲＣ１又はＭｉ３－ＲＣ１－３ｆｉｌｌのいずれかで免疫化した全６匹のマウスの血清は、ＲＣ１グリカンＫＯへの結合が減少しており、Ｖ３／Ｎ３３２グリカンパッチに特異的な血清応答を示唆した。モノクローナル抗体１０－１０７４及び３ＢＮＣ１１７を陽性対照及び陰性対照として含めた。ＥＬＩＳＡデータをＥＬＩＳＡ曲線下面積（ＡＵＣ）として示す。

Claims (17)

1. 配列番号２、４、６、８、１１及び１３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離されたポリペプチド。
2. 約５０μＭ以下のＫ_Ｄを有する親和性で広域中和抗体に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
3. 請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
4. 請求項３に記載の核酸分子を含む、ベクター。
5. 請求項３に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
6. 請求項１又は２に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、タンパク質複合体。
7. 請求項１又は２に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、ウイルス様粒子。
8. 免疫応答の刺激を必要とする対象において免疫応答を刺激するための免疫原性組成物であって、（ｉ）請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質複合体又は請求項７に記載のウイルス様粒子、及び（ｉｉ）薬学的に許容される担体を含む、免疫原性組成物。
9. 免疫応答の刺激を必要とする対象において免疫応答を刺激する方法において使用するための医薬組成物であって、前記方法が、請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質複合体若しくは請求項７に記載のウイルス様粒子、又はそれらの組合せを含む、有効量の組成物を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
10. 前記方法において、前記組成物が、前記対象へ２回以上投与される、請求項９に記載の医薬組成物。
11. 前記方法において、前記組成物の投与が、Ｖ３－グリカンエピトープを認識可能な、前記対象の血清中の広域中和抗体の数を増加させる、請求項９に記載の医薬組成物。
12. ＨＩＶ感染症の治療又は予防を必要とする対象においてＨＩＶ感染症の治療又は予防する方法において使用するための医薬組成物であって、前記方法が、請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質複合体若しくは請求項７に記載のウイルス様粒子、又はそれらの組合せの治療有効量を前記対象に投与することを含む、医薬組成物。
13. 対象におけるＨＩＶ感染症の治療又は予防のための医薬品の調製における、請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質複合体若しくは請求項７に記載のウイルス様粒子、又はそれらの組合せの、使用。
14. 請求項５に記載の宿主細胞を、前記核酸によりコードされるポリペプチドが発現可能な条件下における培地中で培養し、培養細胞又は細胞の前記培地から前記ポリペプチドを精製することを含む、ポリペプチドを製造する方法。
15. 前記方法において、治療有効量の抗ウイルス剤を前記対象に投与することを更に含む、請求項１２に記載の医薬組成物。
16. （ｉ）請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項３に記載の核酸分子、請求項４に記載のベクター、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質複合体又は請求項７に記載のウイルス様粒子のうち１種以上の単位投与量、（ｉｉ）前記ポリペプチド、前記核酸、前記宿主細胞、前記タンパク質複合体又は前記ウイルス粒子を投与するための説明書、及び（ｉｉｉ）任意にアジュバントを含む、キット。
17. ＨＩＶ－１に感染している対象においてＨＩＶ－１結合抗体を検出又は単離する方法であって、
    請求項１又は２に記載のポリペプチド、請求項５に記載の宿主細胞、請求項６に記載のタンパク質複合体若しくは請求項７に記載のウイルス様粒子、又はそれらの組合せを含む組成物を提供することと、
    前記組成物を前記対象からの一定量の体液と接触させることと、
    前記ＨＩＶ－１結合抗体の前記ポリペプチドへの結合を検出し、それにより対象における前記ＨＩＶ－１結合抗体を検出又は単離することと、を含む、方法。