JP7482538B2 - キノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤 - Google Patents
キノコ栽培廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法、及びラジカル消去剤 Download PDFInfo
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Description
非特許文献1には、廃菌床を堆肥、他のキノコ形成菌の基質、動物飼料、プラスチック代替包装材や建築材料、バイオ燃料、酵素源等として活用することが記載されている。
本発明によれば、高いラジカル消去活性を有するラジカル消去剤を提供することができる。
上面栽培は、袋詰めした後に滅菌した菌床にキノコ菌を接種して1次培養後、菌床の上面のみを露出させ、袋と菌床をゴムバンドで固定して袋の内側を一定の水で常に満たした状態に保ち、菌床の上面のみにキノコを発生させる。一方、全面栽培は、袋詰めした後に滅菌した菌床にキノコ菌を接種して1次培養後、脱袋した菌床を浸水槽中にて浸漬して菌床表面に被膜を形成し、その後菌床を浸水槽から取り出し、適宜、散水処理を行い、菌床全面にキノコを発生させる。
キノコの上面栽培後の廃菌床と、キノコの全面栽培後の廃菌床は、外観が明らかに異なるとともに、含水率も異なる。
以下において、特に指摘がない場合は、廃菌床は、キノコの上面栽培後の廃菌床を意味する。
<廃菌床>
シイタケ(Letina edodes)菌床栽培(全面栽培方式;群馬県上野村きのこセンター、シイタケ菌種H607、栽培回数:1回、菌床培地基材組成:木質としてナラチップ、栄養体として特フスマ、ホミニフィード、貝化石を配合)に用いられ、シイタケを栽培し、子実体を収穫後に廃棄された菌床を用い、粉砕し、気流乾燥機で乾燥後、50~100メッシュ程度に分級した。
<加圧水装置>
加圧水処理には、図1に示した加圧水処理装置を用いた。加圧水処理装置1は、窒素ボンベ2、高圧ポンプ3、反応器4、冷却器5、保圧弁6、バルブ7、熱電対8、及びこれらを接続する配管9、オイルバス10、処理液受け13、保温用外部ヒーター(図示なし)、計器類(図示なし)からなる。11は加熱コイルであり、12は水である。反応器は、両端をガスケットフィルター(平均孔径:5μm)でキャップした流通式パーコレータ型反応器(SUS316、23.5 mm i.d. ×65 mm length, 28 ml)であった。
<廃菌床の加圧熱水処理>
上記の乾燥状態の廃菌床(乾燥廃菌床)9gを正確に秤量し、28mL容のステンレス製反応器に充填した後、これを配管に接続した。次に、反応器及び周囲配管に保温用外部ヒーターを取り付けた後、系内に窒素ガスを充填し、保安弁で系内圧を2.5MPaとした。さらに、オイルバスで系内の温度を制御し、蒸留水を10mL/minの流速で反応器を通過させることで、廃菌床を加圧熱水と接触させた。温度は30~170℃に設定し、70分かけて連続的に昇温した。図6に、実験例1におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示した。反応器を通過した後の処理液(抽出物)は冷却したのち5分ごとに回収し、試料番号1~15の加圧熱水抽出物(水溶液又は水分散液)を得た。その後、凍結乾燥することで、試料番号1~15の乾燥状態の加圧熱水抽出物を得た。下記表2に、試料番号1~15に対応する加圧熱水の温度を示した。試料番号1~15は、比較例に該当する。
シイタケ菌床栽培(上面栽培方式;農林業公社しんしろ菌床センター作手より入手、シイタケ菌種H607、栽培回数8回、菌床培地基材組成:木質としてナラチップ、栄養体としてフスマ、デンプン、米糠、コーンスターチ、炭酸カルシウムを配合)に用いられ、シイタケを栽培し、子実体を収穫後に廃棄された菌床を用いた以外は、実験例1と同様にして、試料番号16~30の加圧熱水抽出物を得た。図6に、実験例2におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示した。下記表3に、試料番号16~30に対応する加圧熱水の温度を示した。試料番号16~17は、比較例に該当し、試料番号18~30は、実施例に該当する。
オイルバスで系内の温度を2段階で昇温させた以外は、実験例2と同様にして、試料番号31~43の加圧熱水抽出物を得た。昇温は、具体的には、30℃から10分かけて約150℃に昇温させた後、20分間保持し、次いで、35分かけて約230℃までに昇温させた後、30個分間保持した。図7に、実験例3におけるステンレス製反応器内部の温度推移を示した。下記表4に、試料番号31~43に対応する加圧熱水の温度を示した。試料番号31~43は、実施例に該当する。
DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)は、99.5%エタノールに溶解した。試料は99.5%ジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解した。
96穴マイクロプレートの各ウェルに試料溶液20μL、Assay Bufferとして100mMのTris-HCl緩衝液(pH7.4)80μL、0.20mMのDPPH溶液100μLを添加し、混和後、遮光下、25℃で30分間静置した。反応後、プレートリーダーで517nmの吸光度を測定した。下記表1の組成のブランク1、ブランク2、及びブランク3についても、同時に吸光度を測定し、下記の数式1により試料のDPPHラジカル消去率(%)を算出した。
DPPHラジカルを50%消去する濃度(50%阻害濃度:IC50)を算出のため、まず、1,10,100,1000μg/mLの各試料溶液の消去率を測定し、消去率50%を含む濃度域を決定した。次に、この濃度域において50%消去率を含む3濃度と対応する消去率を直線回帰し、求めた回帰式から50%阻害濃度(IC50)を算出した。
乾燥KBr粉末で150倍に希釈した試料の赤外スペクトルを、フーリエ変換赤外分光光度計(FT/IR-4600 typeA、日本分光社製)を用いて、拡散反射フーリエ変換赤外分光(diffuse reflectance infrared Fourier transforms)法によりIRスペクトルを測定した。測定は、400~4000cm-1波数域で、200スキャン(対照として測定したKBr粉末はスキャン回数を64回に設定した)、解像度4cm-1で行った。
水溶液又は水分散状態の試料を0.45μmのセルロースエステル膜でろ過後、4℃で冷蔵保存した試料の溶存有機炭素(DOC)濃度を全有機体炭素測定装置(TOC-V、島津製作所製)で測定し、DOCが1mg/LになるようにMilli-Q水で希釈し、三次元蛍光(EEM)測定に供した。EEM測定は蛍光分光光度計(F7000、日立ハイテックサイエンス製)を使用し、1cmキュベットを用いて5nmの間隔で220-450nmの励起波長と1nmの間隔で250-550nmの蛍光波長をスキャンした。励起及び蛍光スリットの幅はともに5nmに設定した。光電子増倍管(PMT)電圧は700μV、スキャン速度は2400nm/minとした。比較のためのMilli-Q水のEEM測定は実験期間を通して毎回行った。PARAFAC解析は、多変量解析ソフトウェア「3D SpectAlyzeR Ver.1.4(ダイナコム)」を用いて行った。
試料の収率は以下のように求めた。
試料の収率(%)=(凍結乾燥後の加圧熱水抽出物の重量/乾燥廃菌床仕込み重量)×100
70~120℃の範囲の加圧熱水で抽出した実施例5の加圧熱水抽出物で検出された1260cm-1付近のピークは、C=O伸縮を伴うグアイアシル環(リグニンの構成単位のひとつ)振動を意味する。
145~170℃の範囲の加圧熱水で抽出した実施例15及び205~235℃の範囲の加圧熱水で抽出した実施例21の加圧熱水抽出物で検出された1260cm-1付近のピークは1720cm-1付近のピークとの連動性もみられることから、C=O伸縮を伴うグアイアシル環振動以外にヘミセルロース分解産物、セルロース分解産物およびβ-グルカン分解産物由来のCOOHの影響も示唆される。ピーク強度は、実施例15の方が高い。
900cm-1付近のピークはβ-グルカン(木質由来セルロース、菌糸体由来β-グルカン)により生じるオリゴ糖のグリコシド結合のC-O-C伸縮に起因しており、リグニンに関係する1510cm-1(ベンゼン環振動)付近のピーク強度と900cm-1のピーク強度との比(1510cm-1付近のピーク強度/900cm-1のピーク強度)が、実施例5(1.20)>実施例15(0.93)>実施例21(0.79)であったことから、この順に芳香族成分が減り、糖成分が増えたと推察される。実施例5、実施例15、及び実施例21の順にラジカル消去活性が減少していることから、糖成分が加圧熱水抽出物のラジカル消去活性を阻害すると推察される。
2 窒素ボンベ
3 高圧ポンプ
4 反応器
5 冷却器
6 保圧弁
7 バルブ
8 熱電対
9 配管
10 オイルバス
11 加熱コイル
12 水
13 処理液受け
Claims (8)
- シイタケ菌床栽培後の廃菌床の加圧熱水抽出物の製造方法であって、
シイタケ菌床栽培後の廃菌床を、飽和水蒸気圧以上の圧力下で、40℃を超え、かつ171.0℃以下の温度の加圧熱水と接触させて加圧熱水抽出物を抽出する工程Aを含み、
前記シイタケ菌床栽培後の廃菌床は、シイタケの上面栽培後の廃菌床であり、
前記加圧熱水抽出物は、ラジカル消去活性を有する、加圧熱水抽出物の製造方法。 - 前記工程Aにおいて、加圧熱水の圧力は0.1~2.5MPaである、請求項1に記載の加圧熱水抽出物の製造方法。
- 前記工程Aは、加圧熱水の温度が64℃超、かつ113℃以下の範囲である工程A1、及び加圧熱水の温度が117℃超、かつ169.7℃以下の範囲である工程A2からなる群から選ばれる一つ以上の工程を含む、請求項1又は2に記載の加圧熱水抽出物の製造方法。
- 前記工程Aで得られた加圧熱水抽出物を乾燥する工程Bをさらに含む、請求項1~3のいずれかに記載の加圧熱水抽出物の製造方法。
- ラジカル消去活性を有するラジカル消去剤であって、
前記ラジカル消去剤は、シイタケ菌床栽培後の廃菌床の加圧熱水抽出物を含み、
前記加圧熱水抽出物は、シイタケ菌床栽培後の廃菌床を飽和水蒸気圧以上の圧力下で、40℃を超え、かつ171.0℃以下の温度の加圧熱水と接触させて抽出したものであり、
前記シイタケ菌床栽培後の廃菌床は、シイタケの上面栽培後の廃菌床である、ラジカル消去剤。 - 前記加圧熱水の圧力は0.1~2.5MPaである、請求項5に記載のラジカル消去剤。
- 前記加圧熱水の温度は、64℃超、かつ113℃以下の範囲である条件1、及び117℃超、かつ169.7℃以下の範囲である条件2からなる群から選ばれる一つ以上の条件を満たす、請求項5又は6に記載のラジカル消去剤。
- 前記加圧熱水の温度は、64℃超、かつ113℃以下の範囲であり、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル(DPPH)ラジカル消去活性IC50が100mg/L以下である、請求項5~7のいずれかに記載のラジカル消去剤。
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