JP7481340B2 - 血液サンプルの血小板を分析する方法 - Google Patents

血液サンプルの血小板を分析する方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7481340B2
JP7481340B2 JP2021529530A JP2021529530A JP7481340B2 JP 7481340 B2 JP7481340 B2 JP 7481340B2 JP 2021529530 A JP2021529530 A JP 2021529530A JP 2021529530 A JP2021529530 A JP 2021529530A JP 7481340 B2 JP7481340 B2 JP 7481340B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
platelets
platelet
mfi
fsc
thrombocytopenia
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021529530A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2021533390A (ja
Inventor
ブランディーヌ メートル，
カトリーヌ アングニュー，
ラ サール， アンリ ドゥ
クリスチャン ガシェ，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Strasbourg
Original Assignee
Universite de Strasbourg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Strasbourg filed Critical Universite de Strasbourg
Publication of JP2021533390A publication Critical patent/JP2021533390A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7481340B2 publication Critical patent/JP7481340B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1012—Calibrating particle analysers; References therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/47—Scattering, i.e. diffuse reflection
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/49—Blood
    • G01N33/4915—Blood using flow cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/1012—Calibrating particle analysers; References therefor
    • G01N2015/1014—Constitution of reference particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/22—Haematology
    • G01N2800/222—Platelet disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/32—Cardiovascular disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

本発明は体外血液分析方法の分野に関し、特に血液サンプル中に存在する血小板を分析する方法の分野に関する。より具体的には、本発明に係る方法を用いると、対象における末梢性又は中枢性血小板減少症を体外診断できる。
血小板は核を持たない血液細胞であり、骨髄中の巨核球が分裂して生成される。ヒトにおいて、通常は１５０，０００～４００，０００個／μＬの平均濃度で血液中に存在しており、出血を防止及び停止させる全ての現象を包含する生物学的プロセスである止血において必要不可欠な役割を果たす。
いくつかの病態は、血液中の血小板数の異常に関係している。これは、血小板の血中濃度の上昇（すなわち血小板増加症）であったり、血小板の血中濃度の低下（すなわち血小板減少症）であったりする。
血小板増加症の大半は重度の骨髄損傷（特に骨髄増殖症候群）に起因する。適切な医学的処置を採用できるように、このような種類の血小板増加症を検出することが必須である。血中血小板及び幼若血小板比率の初期分析は、はるかに侵襲的な手順である骨髄生検分析を行うこともある診査工程を容易に決定できる単純な手順である。
血小板減少症は以下の２種類に識別できる。
・中枢性又は本態性血小板減少症：巨核球形成における質及び／又は数の欠陥に起因し、低血小板生成、ひいては低血小板血中濃度として現れる。中枢性血小板減少症にはいろいろな原因があり、遺伝的原因や後天的なものが考えられ、例えば、ビタミンＢ１２欠乏、何らかのがん、脊髄形成異常症、肝損傷、又は化学療法や放射線療法のようなある種の治療が挙げられる。原因が特定されないケースもある。ベルナール・スーリエ症候群又はメイ・ヘグリン異常（ＭＹＨ９）等、中枢性血小板減少症に関連することが知られている疾患もある。
・末梢性血小板減少症は、循環血小板数の低下、代償的な巨核球形成の増加、それによる血小板生成の上昇を特徴とする。末梢性血小板減少症は、通常、自己抗体、又はある種の薬剤（ヘパリン、キニーネ等）の存在下で血小板に結合する抗体の作用などによって循環血小板が破壊されることで引き起こされる。従って、末梢性血小板減少症は、幼若血小板（未成熟血小板ともいう）比率の上昇を特徴とする。末梢性血小板減少症の最も一般的な原因は、自己免疫に由来する特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）である。また、末梢性血小板減少症は、循環血小板の消費をもたらしたり、アレルギー由来であったりする場合もある患者の炎症症状によっても説明され得る。
血小板減少症は、点状出血又は紫斑として可視化される出血を引き起こすこともあり、鼻や口からの異常出血、重度の月経、血腫も生じ得る。
血小板減少症の治療はその原因によって異なる。従って、中枢性血小板減少症と末梢性血小板減少症とを識別できることが必須である。
血中の血小板数を、通常は「全血球数」、「ＣＢＣ」、又は「血液像」と呼ばれる血液検査によって、測定することで、血小板減少症を同定する。血小板数が血液１Ｌあたり１５０×１０９個未満である場合、血小板減少症であると診断される。しかしながら、血小板数を測定するだけでは、中枢性血小板減少症と末梢性血小板減少症とを識別することはできない。
従って、中枢性血小板減少症と末梢性血小板減少症との識別においては、血中の幼若血小板量、すなわち骨髄で生成されたばかりの血小板の量を決定することが特に肝心である。幼若血小板は、ラージＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）含量が多く、サイズがわずかに大きいことで、他の循環血小板と識別される。ＲＮＡに結合すると蛍光放射が１０００倍に増大する染料であるチアゾールオレンジ（ＴＯ）又はその類似体（アクリジンオレンジ等）を用いて、フローサイトメトリーにより幼若血小板を判別する。しかしながら、特にヒトにおいては、幼若血小板集団が通常は全血小板のわずか１～２％であることから、ＴＯ及びその類似体を幼若血小板の分析に用いるのは難儀である。事実、血小板におけるＴＯ（又はその類似体）蛍光の一部は、細胞質ＲＮＡを標的とするＲＮａｓｅによる処理に無反応であり、これは、ミトコンドリア核酸、又は密顆粒中に存在するヌクレオチドと結合した際の蛍光によって説明できる。従って、ＴＯ（又はその類似体）で血小板を標識すると、以下の２つの集団が明らかになる。１つ目は「ＴＯｂｒｉｇｈｔ」と呼ばれるものであり、その強い蛍光は、ＲＮａｓｅで処理すると劇的に減少することから、ＲＮＡ含量が多く、幼若血小板と効果的に対応するものである。２つ目は「ＴＯｄｉｍ」と呼ばれるものであり、そのＴＯ（又はその類似体）蛍光は弱く、ＲＮａｓｅ処理に無反応であることから、細胞質ＲＮＡをほとんど又は全く含まず、幼若血小板と対応しない。
このような制約があるにもかかわらず、血小板減少症の原因（すなわち、中枢性か末梢性か）を特定するのに今日まで使用されてきた手順は、ＴＯ類似体を用いて全血サンプル中の「未成熟血小板画分」又は「ＩＰＦ」と呼ばれる幼若血小板集団を決定することに基づいている。例えば、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）として知られているプロセスが挙げられる。Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）プロセスでは、ＲＮＡに対してＴＯと類似した特性を示す分子であるアクリジンオレンジ誘導体の存在下の蛍光を血小板サイズと統合するアルゴリズムを用いている。このプロセスを用いてＩＰＦ比率を得て、それにより孤立性血小板減少症に直面しても臨床診断を下すことができる。ＩＰＦレベルが高いことが明らかになれば末梢性血小板減少症が示されていると考えられる一方、Ｓｙｓｍｅｘ法で測定した従来のＩＰＦレベル（１５％未満）では中枢性血小板減少症が示され得る。しかしながら、上述の通り、一部のアクリジンオレンジはミトコンドリア核酸、又は密顆粒中のヌクレオチドと結合し、後者はＲＮａｓｅ処理に無反応なので、偽陽性を生じ得る。
このように、特に末梢性血小板減少症又は中枢性血小板減少症の体外診断のために、チアゾールオレンジ（ＴＯ）又はその類似体の１種（アクリジンオレンジ等）を使用せずに、血液サンプル中に存在する血小板を信頼性及び再現性のある方法で分析できる使いやすいプロセスが真に求められている。
本発明者らは、血小板の細胞膜における主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子の発現レベルのフローサイトメトリー測定が血小板年齢と相関しており、発現レベルが高いほど「幼若血小板」に対応することを明らかにした。従って、本発明者らは、蛍光色素と結合した抗ＭＨＣ Ｉアルファ鎖リガンドを用いてフローサイトメトリーによって血液サンプル中の血小板を分析する方法を開発した。この分析方法は、末梢性血小板減少症と中枢性血小板減少症とを識別するのに特に好適である。
本発明の第１の目的は、血液サンプル中に存在する血小板を分析する方法であって、
（ａ）蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンドを上記サンプルに添加する工程と、
（ｂ）フローサイトメーターを用いて上記血小板の平均蛍光強度（ＭＦＩ血小板）を測定する工程と、
（ｃ）上記フローサイトメーターを用いて平均前方散乱（ＦＳＣ）パラメータを測定し、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比を決定する工程と
を有する方法に関する。
本発明の第２の目的は、血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する方法であって、
（ａ）本発明に係る方法を実施することで血液サンプル中に存在する血小板を分析する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を用いて血小板集団を同定する工程と
を有する方法に関する。
本発明の第３の目的は、対象における末梢性又は中枢性血小板減少症を体外診断する方法であって、
（ａ）本発明に係る分析方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板を分析するか、或いは本発明に係る同定方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を末梢性又は中枢性血小板減少症の診断に用いる工程と
を有する方法に関する。
本発明の第４の目的は、中枢性又は末梢性血小板減少症の治療の治療効果を体外でモニタリングする方法であって、
（ａ）本発明に係る分析方法を実施することで、中枢性又は末梢性血小板減少症の治療を受けた患者の血液サンプル中に存在する血小板を分析するか、或いは本発明に係る同定方法を実施することで、中枢性又は末梢性血小板減少症の治療を受けた患者の血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を末梢性又は中枢性血小板減少症の治療の治療効果を決定するのに用いる工程と
を有する方法に関する。
本発明の第５の目的は、炎症性疾患又は心血管系疾患の発生を体外で予後診断する方法であって、
（ａ）本発明に係る分析方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板を分析するか、或いは本発明に係る同定方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を炎症性疾患又は心血管系疾患の発生の予後診断に用いる工程と
を有する方法に関する。
本発明の第６の目的は、本発明に係る診断方法、治療の治療効果のモニタリング方法、或いは炎症性疾患又は心血管系疾患の発生の予後診断方法を実施するためのキットであって、
蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンド、
内部標準、及び
指示書
を有するキットに関する。
マウス幼若血小板ではＭＨＣ Ｉ分子の表面発現がより高いことを表す。（Ａ）マウス血小板でのＴＯ及びＭＨＣ Ｉ発現の代表的なＦＡＣＳ分析のグラフである。ＰＥ又はＡｌｅｘａ－６４７結合抗ＧＰＩｂベータ抗体及びチアゾールオレンジ（ＴＯ）で血小板を標識した（左パネル）。ＧＰＩｂベータ＋血小板を選択し、ＰＥ結合抗ＭＨＣ Ｉ抗体、又はＡｌｅｘａ－６４７結合ヤギ抗マウス二次抗体で顕示した抗β２ｍ抗体で共標識することでＭＨＣ Ｉ発現を分析した（右パネル）。ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板は薄灰色で強調した（左パネル及び右パネル）。（Ｂ）ＴＯｄｉｍ血小板又はＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板においてＦＳＣパラメータの平均蛍光強度（ＭＦＩ）に対するＭＨＣ ＩのＭＦＩ又はＧＰＩｂβのＭＦＩの比を算出して、ＭＨＣ Ｉ分子及びＧＰ１ｂβ分子の表面発現を評価した（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎｓ ｐ＞０．０５；ｎ＝３）。 血小板加齢中に体内でＭＨＣ Ｉ分子の表面発現が低下することを表す。ジフテリア毒素（ＤＴ）で処理したｉＤＴＲ ＰＦ４ ｃｒｅマウスの血小板を単離及びビオチン化し、ＷＴマウスに輸血した。輸血から５分後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後のビオチン化輸血血小板（▲）及び内在性ＴＯｄｉｍ（□）又はＴＯｂｒｉｇｈｔ（●）血小板における（Ａ）ＭＨＣ Ｉ発現、（Ｂ）ＧＰＩｂβ発現、及び（Ｃ）ＴＯ標識のフローサイトメトリー分析を行った。結果は、標識のＭＦＩとＦＳＣパラメータのＭＦＩとの比として表す（ｎ＝３、３つの独立した実験の代表）。 ＨＬＡ Ｉ分子は、チアゾールオレンジに対する蛍光性の高いヒト血小板によって優先的に発現されることを表す。（Ａ）ヒト血小板でのＴＯ及びＭＨＣ Ｉ発現の代表的なＦＡＣＳグラフである。ＰＥ結合抗ＧＰＩｂ及びＴＯで血小板を標識した（左パネル）。ＧＰＩｂβ＋血小板を選択し、Ａ６４７結合抗ＭＨＣ Ｉ及びＰＥ－ＣＹ７結合抗β２ｍ抗体で染色してＭＨＣ Ｉ発現を分析した（右パネル）。ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板は薄灰色で強調した（左パネル及び右パネル）。（Ｂ）ＴＯｄｉｍ血小板又はＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板におけるＭＨＣ ＩのＭＦＩ（抗β２ｍ標識若しくは抗ＨＬＡ Ｉ標識）又はＧＰＩｂβのＭＦＩとＦＳＣパラメータのＭＦＩとの比を算出して、ＭＨＣ Ｉ分子及びＧＰ１ｂβ分子の細胞表面発現を評価した（＊ｐ＜．０５、＊＊ｐ＜．０１、ｎｓ ｐ＞．０５；ｎ＝７）。 ＭＨＣ Ｉ分子を高密度で発現しているヒト血小板は、幼若血小板の特徴を示していることを表す。ヒト血小板でのリボソームタンパク質発現、ＴＯ、及びＭＨＣ Ｉ分子発現の代表的なＦＡＣＳグラフを表す。ヒト血小板を固定し、透過処理し、ＰＥ結合抗ＧＰＩｂ、ｍＡｂリボソームＰタンパク質抗体、Ａ６４７結合抗ＭＨＣ Ｉ、ＰＥ－ＣＹ７結合抗β２ｍ抗体、及びＴＯで共標識してから、ＦＡＣＳで分析した。（Ａ）ＧＰＩｂβ＋血小板を選択した。ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板を濃灰色で強調してリボソームタンパク質発現を分析した（右上パネル）。ＴＯｂｒｉｇｈｔ又は高Ｐリボソーム血小板を濃灰色で強調してＭＨＣ Ｉ分子の発現を分析した（下パネル）。（Ｂ）ＨＬＡ Ｉ分子を強く又は弱く発現している集団におけるリボソームＰタンパク質又はＴＯｂｒｉｇｈｔ標識の分布を分析した。 ＭＨＣ Ｉの細胞表面発現は、患者における幼若血小板比率を決定するのに信頼できる基準であることを表す。（Ａ）ＴＯｂｒｉｇｈｔ及びＨＬＡ Ｉｈｉｇｈ血小板比率についてはＦＡＣＳ分析で、ＭＦＩ比率についてはＳｙｓｍｅｘ（登録商標）システムで、健常提供者の血液サンプルを試験した（ｎ＝６）。（Ｂ）健常提供者又はＭｙＨ９欠損患者の血液サンプルを分析し、血小板におけるＴＯ及びＨＬＡ ＩのＭＦＩをＦＡＣＳ分析で決定した。結果は、ＦＳＣのＭＦＩに対するＨＬＡ Ｉ標識（Ｗ６／３２若しくはβ２ｍ）又はＴＯ標識のＭＦＩの比として表す。 （Ｃ）ＲＮａｓｅ処理前後の各血液サンプルにおけるＴＯ標識のＦＡＣＳグラフである。各条件についてＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板比率を示す。 （Ｄ）０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、又は１００μＭのＴＲＡＰで健常提供者のクエン酸血サンプルを活性化してから、ＩＰＦ比率をＳｙｓｍｅｘ（登録商標）で推定するか（上パネル）、或いはＨＬＡ Ｉ／ＦＳＣ比又はβ２ｍ／ＦＳＣ比をフローサイトメトリーで分析した（下パネル）（ｎ＝３～５）。
本出願人らは、正確で再現性のある方法で血液サンプル中の血小板を分析する方法を開発した。本方法を用いると、特に血小板減少症の原因（中枢性か末梢性か）を体外で決定できる。
＜定義＞
「血小板」は、骨髄中の巨核球が分裂して生成される血液細胞である。哺乳類において血小板は核を持たず、ヒトにおいて、脾臓又は肝臓中のマクロファージで除去されるまでの寿命はおよそ７～１０日である。血小板は一次止血に必須の成分である。ヒトにおいて、血小板の直径は２～４ミクロンであり、その正常な血中濃度は血液１リットルあたり１５０～４００×１０９個である。その数は年齢とともに減少する傾向にある。血小板は、表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子を発現する。
「幼若血小板」という語は、骨髄で新たに生成された血小板、すなわち、２４時間齢未満、例えば１２時間未満の血小板を意味する。
血小板濃度が血液１リットルあたり１５０×１０９個未満である場合、血小板レベルは低いとみなされ、「血小板減少」又は「血小板減少症」と呼ばれ、出血リスクが増大する。
血小板濃度が血液１リットルあたり４００×１０９個超である場合、血小板レベルは高いとみなされ、「血小板増加症」と呼ばれ、血栓症リスクを伴う。
血小板減少症は以下の２種類に識別できる。
・中枢性又は本態性血小板減少症：巨核球形成における質及び／又は数の欠陥に起因し、低血小板生成をもたらす（血液１リットルあたりの血中血小板濃度が１５０×１０９個未満）。中枢性血小板減少症にはいろいろな原因があり、遺伝的原因や後天的なものが考えられ、例えば、ビタミンＢ１２欠乏、何らかのがん、脊髄形成異常症、肝損傷、又は化学療法や放射線療法のようなある種の治療が挙げられる。原因が特定されないケースもある。ベルナール・スーリエ症候群又はメイ・ヘグリン異常（ＭＹＨ９）等、中枢性血小板減少症に関連することが知られている疾患もある。
・末梢性血小板減少症は、循環血小板数の低下、代償的な巨核球形成の増加、それによる血小板生成の上昇を特徴とする。末梢性血小板減少症は、通常、自己抗体、又はある種の薬剤（ヘパリン、キニーネ等）の存在下で血小板に結合する抗体の作用などによって血小板が破壊されることで引き起こされる。従って、末梢性血小板減少症は、幼若血小板（未成熟血小板ともいう）比率の上昇を特徴とする。末梢性血小板減少症の一般的な原因は、自己免疫に由来する特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）である。また、末梢性血小板減少症は、循環血小板の消費をもたらしたり、免疫由来であったりする場合もある患者の炎症症状によっても説明され得る。
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ（ＭＨＣ Ｉ）分子は自己認識系を構成し、Ｔリンパ球にペプチド抗原を提示する。ヒトにおいては、ＭＨＣ Ｉはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩと呼ばれる。これらの分子は、ほとんど全ての有核細胞の細胞膜及び血中血小板で発現される。これらは、アルファ鎖（３つの免疫グロブリン様ドメインα１、α２、及びα３を有する）とベータ－２ミクログロブリン（β２ｍ）との非共有会合からなる。細胞膜で発現されたＭＨＣ Ｉは常にペプチドと会合しており、これによってＭＨＣ Ｉが安定化する。ＭＨＣ Ｉは、特にＣＤ８Ｔリンパ球への抗原提示に関与し、自己と非自己との識別を可能とする。
本明細書中、「血液サンプル」という語は、血小板を含む任意のサンプルを包含する。血液サンプルは、例えば、対象の血液から得られる。全血サンプル、有利には当業者のベストプラクティスに従って抗凝固剤の存在下で採血されたものであることが好ましい。上記抗凝固剤はＥＤＴＡ又はクエン酸塩であってもよい。
本発明の意味において、「リガンド」という語は、標的に特異的に結合する分子を表す。従って、例えば、本発明の文脈において、ＭＨＣ Ｉに結合するリガンドは、ＭＨＣ Ｉに特異的に結合するリガンドを表す。
本発明の具体的な実施形態において、上記リガンドは、アルファ鎖と会合していないβ２ｍ鎖、すなわち可溶性β２ｍ鎖には結合できない。
本発明の別の具体的な実施形態において、上記リガンドは、アルファ鎖と会合していないβ２ｍ鎖に結合できる。この具体的な実施形態において、本発明に係る方法を実施した際に血液サンプル中に存在する可溶性β２ｍ鎖がＭＨＣ Ｉへの結合に干渉しないよう、十分に高い濃度でリガンドを使用するのが有利である。
本発明の具体的な実施形態において、上記リガンドは、ＭＨＣ Ｉの全てのアイソタイプ、すなわち、アイソタイプＡ（ＨＬＡ Ａ）、アイソタイプＢ（ＨＬＡ Ｂ）、及びアイソタイプＣ（ＨＬＡ Ｃ）に結合できる。
上記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、タンパク質、ペプチド、又は小分子であってもよい。当業者であれば、本発明の文脈で使用できるリガンドを容易に得ることができる。例えば、アプタマーの場合はＳｅｌｅｘ法、抗体の場合は免疫化及びクローニング法が挙げられる。好ましい実施形態において、上記リガンドは抗体又は抗体断片である。本発明で使用できるいくつかの抗体は市販されており、例えば、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ－９５によって産生された抗体Ｗ６／３２、例えばＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製のＡＰＣ結合済み抗体Ｗ６／３２、又はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製のフルオロフォアＰＥ／Ｃｙ７結合済み抗ヒトβ２ｍ抗体（品番：３１６３１８）が挙げられる。
本明細書中、「抗体」という語はその最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を有する様々な抗体構造、特にモノクローナル抗体を包含する。これらは、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、又はマウス抗体等の非ヒト抗体であってもよい。
本発明の文脈において、上記リガンドは、フローサイトメトリーでその検出を可能とする手段、好ましくは蛍光色素（又はフルオロフォア）と結合している。「蛍光色素」という語は、励起して蛍光を発することができる分子を意味する。蛍光色素が発する蛍光強度（又はＭＦＩ）は、蛍光色素の蛍光強度を検出及び測定できるフローサイトメーターを用いるなど、任意の公知手段によって測定できる。
「フローサイトメトリー」は、レーザービームを介して粒子又は細胞を高速で移動させてそれらをカウント及び特徴付けすることができる広く採用されている技術である。フローサイトメトリーは、個々の粒子、分子、又は細胞の蛍光強度を、レーザービームの前でそれらを１つずつ通過させることで測定できることから、非常に有利な技術である。
本発明の意味において、「内部標準」は、フローサイトメトリーで測定した蛍光強度（ＭＦＩ）の正規化を可能とする。本発明の文脈において、上記内部標準は、リガンドに結合する要素であることが好ましい。特に、リガンドが吸着可能なポリスチレンマイクロビーズであってもよい。各種のリガンドに適合した多くの内部標準が市販されており、例えば、マウス抗体のカッパ鎖を有する抗体がリガンドである場合に使用できる「ＢＤ Ｃｏｍｐｂｅａｄ Ｎｏ．５５２８４３」標準が挙げられる。
本発明の意味において、「対象」は、哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、又はヒトを意味し、上記対象はヒトであることが好ましい。本発明の意味において、「健常対象」は、異常な血中血小板数を引き起こす病態を何ら示さず、且つ薬物療法を受けていない対象を意味する。
本明細書中、「診断」という語はその最も広い意味で使用され、当業者によって一般的に使用され、よく理解されている。この用語は、例えば、対象において病態が生じる確率、リスク、又は可能性の決定を表す。
本発明の意味において、「治療」、「治療する」、又は「治療に応答する」という語は、病態の改善、軽減、回復、又はその進行の阻害を意味する。特に、病態の治療は、骨髄による正常な血小板生成を回復させることからなっていてもよい。
＜血小板を分析する方法又は血小板集団を同定する方法＞
本明細書は、血液サンプル中に存在する血小板を分析する方法であって、
（ａ）蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンドを上記サンプルに添加する工程と、
（ｂ）フローサイトメーターを用いて上記血小板の平均蛍光強度（ＭＦＩ血小板）を測定する工程と
を有する方法に関する。
本発明は、血液サンプル中に存在する血小板を分析する方法であって、
（ａ）蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンドを上記サンプルに添加する工程と、
（ｂ）フローサイトメーターを用いて上記血小板の平均蛍光強度（ＭＦＩ血小板）を測定する工程と、有利には
（ｃ）上記フローサイトメーターを用いて平均前方散乱（ＦＳＣ）パラメータを測定し、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比を決定する工程と、
を有する方法に関する。
実際に、本出願人は、血小板表面でのＭＨＣ Ｉ発現レベルが血小板年齢と相関することを見出した。従って、より幼若な血小板は、より加齢した血小板よりも多くのＭＨＣ Ｉを細胞膜上に発現する。
特に、本出願人は、ＦＳＣパラメータに対して正規化した血小板表面でのＭＨＣ Ｉ発現レベルがその年齢と相関することを見出した。従って、より幼若な血小板は、より加齢した血小板よりも細胞膜上のＭＨＣ Ｉ分子密度が高い。
＜工程（ａ）＞
工程（ａ）は、蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンドを上記サンプルに添加することで構成される。この工程は、例えば振とう下、蛍光色素結合リガンドを血液サンプルに添加することで実施される。振とうさせることによって混合物を均質化して、標識化リガンドと血小板との接触を促進する。
インキュベート時間は、標識化リガンドを血小板と接触させるのに十分な時間とすべきである。典型的には、当業者が採用するインキュベート時間は、抗体の場合には２０～３０分であるが、使用するリガンドに応じて短縮することもでき、その場合、５分未満、例えば、４分未満、３分未満、２分未満、１分未満、３０秒未満としてもよい。また、インキュベート時間は、５分超、１０分超、更には１５分超にもできる。
本発明に係る分析方法は全血サンプルを用いて実施できるので、非常に実施しやすい。それにもかかわらず、特定の血液サンプルの使用に限定されない。例えば、多血小板血漿（ＰＲＰ）や、全血から単離した血小板等、血小板を含む全血画分であってもよい。上記血液サンプルは全血サンプルであることが好ましい。
具体的な実施形態において、上記血液サンプルは、血液サンプル中に元々存在している成分以外の成分、例えば、緩衝液（ｐＨ調整を可能とする）や、ＥＤＴＡ又はクエン酸塩等の好適な抗凝固剤を含んでいてもよい。
具体的な実施形態において、上記リガンドは、抗体、抗体断片、アプタマー、タンパク質、ペプチド、又は小分子から選択できる。適切なリガンド量は実験者であれば容易に決定できる。例えば、リガンドが抗体である場合、０．１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲の濃度で添加できる。リガンドを飽和状態でサンプルに添加することで、血小板を適切に標識できる。
具体的な実施形態において、上記リガンドは抗体又は抗体断片であり、例えば、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ－９５によって産生されたＷ６／３２抗体、又はＭＨＣ Ｉへの結合能を保持した断片である。また、β２ｍに結合する抗体であってもよく、その場合、血中に存在する可溶性β２ｍが当該方法の実施に干渉しないよう、十分に高い濃度で抗体を用いるべきである。
上記リガンドは、フローサイトメーターでその検出を可能とする手段、好ましくは蛍光色素（又はフルオロフォア）と結合している。上記リガンドは蛍光色素と直接結合していても間接的に結合していてもよく、直接結合しているのが好ましい。リガンドを蛍光色素と結合する方法は広く文献に記載されている。従って、結合に特段の技術的な困難さは存在しない。
フローサイトメーターで検出できる限り、本方法は特定の蛍光色素に限定されない。上記蛍光色素は、励起波長及び発光波長がＲＮＡを検出するのに使用される試薬に干渉しない蛍光色素であることが有利である。フルオロフォアの一例について以下の記載及び実施例で言及するが、これらに限定されない。ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（Ｒ－フィコエリトリン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）、ＰＥ－ＣＦ５９４、ペリジニンクロロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）－Ｃｙ５．５、ＰＥ－テキサスレッド、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、又はＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）。
＜工程（ｂ）＞
工程（ｂ）は、フローサイトメーターを用いて上記血小板の平均蛍光強度（ＭＦＩ血小板）を測定することで構成される。当然ながら、上記フローサイトメーターは上記蛍光色素の蛍光を検出及び測定できる。測定は上記フローサイトメーターによって自動的に実施される。上記フローサイトメーターのパラメータ化に特段の技術的な困難さは存在しない。具体的には、当業者であれば、選択した蛍光色素に応じてフローサイトメーターをどのようにセットアップすればよいか分かる。
工程（ｂ）で実施する測定によって、標識化リガンドに結合した血小板を同定でき、１つ以上の血小板集団、とりわけ幼若血小板集団を同定できる。
＜工程（ｃ）＞
工程（ｃ）は、上記フローサイトメーターを用いて平均前方散乱（ＦＳＣ）パラメータを測定し、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比を決定することで構成される。蛍光強度に加えて、上記フローサイトメーターは、粒子径、例えば血小板サイズを表すことができる他のパラメータを測定できる。血小板サイズを表すために最も一般的に測定されるパラメータは前方散乱（ＦＳＣ）であり、以下、「ＦＳＣ血小板」ともいう。これは、ＦＳＣ－Ａ、ＦＳＣ－Ｈ、又はＦＣＳ－Ｗであってもよい。通常はＦＳＣ－Ａが使用される。
具体的な実施形態において、ＭＦＩ血小板測定値を内部標準の平均蛍光強度（ＭＦＩ標準）に対して正規化することで、正規化血小板平均蛍光強度（ＭＦＩ正規化血小板）が得られる。上記内部標準は、工程（ａ）において上記リガンドの前若しくは後に、又は上記リガンドと同時に、好ましくは上記リガンドの前に、上記サンプルに添加するのが好ましい。適切な内部標準量は実験者であれば容易に決定でき、好ましくは血小板数と同じ桁の量を投入することで決定できる。
実験間、実験室間、及び／又は実験者間の変動を克服できることから、ＭＦＩ血小板測定値を内部標準に対して正規化するのが非常に有利である。
具体的な実施形態において、上記内部標準は上記蛍光色素結合リガンドに結合し、例えば、上記蛍光色素結合リガンドは上記内部標準に吸着する。従って、この具体的な実施形態において、ＭＦＩ標準は、上記標準と結合した蛍光色素から発せられ、該蛍光色素の蛍光を検出及び測定できるフローサイトメーターで測定された平均蛍光強度である。上記フローサイトメーターは、標識化血小板と標識化内部標準とを識別できるよう調整すべきである。一般的にはサイズによって識別する。従って、サイズによって識別する場合、標識化標準と血小板とを容易に識別できるように該標準のサイズを選択することが必須となる。
上記内部標準は、上記蛍光色素結合リガンドが吸着するポリスチレンマイクロビーズであることが有利である。例えば、上記蛍光色素結合リガンドに結合する抗体で被覆されたポリスチレンマイクロビーズであってもよい。例えば、マウス抗体のカッパ鎖を有する抗体（キメラ抗体等）がリガンドである場合に使用できる市販品である「ＢＤ Ｃｏｍｐｂｅａｄ Ｎｏ．５５２８４３」が挙げられる。
好ましい実施形態において、本発明の方法は、上記フローサイトメーターを用いて平均ＦＳＣ拡散パラメータ（ＦＳＣ）を測定し、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比を決定する工程（ｃ）を更に有する。血小板をより精密に分析できることから、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比を決定することが非常に有利である。これにより、１つ以上の血小板集団、特に幼若血小板集団をより精密に識別できる。工程（ｃ）は、フローサイトメーターによって工程（ｂ）と同時に自動的に実行される。この具体的な実施形態において、上記比の決定は、フローサイトメーターで測定した値を用いて自動的に行われる。ＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比は、例えば、（ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ血小板）／（ＭＦＩ標準／ＦＳＣ標準）比を算出することで得られる。血小板サイズを表すＦＳＣ血小板と同様に、ＦＳＣ標準パラメータは標準粒子径を表す。
本発明はまた、血液サンプル中に存在する血小板集団、好ましくは幼若血小板集団を同定する方法であって、
（ａ）本発明に係る方法を実施することで血液サンプル中に存在する血小板を分析する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を用いて血小板集団、好ましくは幼若血小板集団を同定する工程と
を有する方法に関する。
血小板集団の同定は、上述したパラメータに従ってフローサイトメーターによって自動的に実行される。
＜診断方法＞
本発明は、対象における末梢性又は中枢性血小板減少症を体外診断する方法であって、
（ａ）本発明に係る血小板を分析する方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板を分析する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を末梢性又は中枢性血小板減少症の診断に用いる工程と
を有する方法に関する。
本発明に従って血小板を分析して得られた結果から、対象における末梢性血小板減少症を診断できる。具体的には、上記対象においてＭＦＩ血小板、ＭＦＩ正規化血小板、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比、及び／又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比のパラメータが、健常対象で測定した同パラメータに対して増加している場合、末梢性血小板減少症の陽性診断を下す。
当該対象において上記パラメータが、健常対象で測定した同パラメータと比較して増加している場合、当該対象において幼若血小板量が増加していることを表しており、骨髄活性が増大していることが確認されるので、末梢性血小板減少症と診断できる。
好ましい実施形態において、上記パラメータのうちの１つ以上の増加は、１．５倍超程度であり、例えば２倍超、２．５倍超、３倍超、又は３．５倍超程度である。
本発明に従って血小板を分析して得られた結果から、対象における中枢性血小板減少症を診断できる。具体的には、上記対象においてＭＦＩ血小板、ＭＦＩ正規化血小板、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比、及び／又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比のパラメータが、健常対象で測定した同パラメータと同様又は同一である場合、中枢性血小板減少症の陽性診断を下す。
具体的な実施形態において、上記対象は、血小板減少症であると或いは血小板減少症になりやすいと以前に診断されている。そして、本発明に係る診断方法によって、血小板減少症の原因（中枢性か末梢性か）を知ることができる。
＜治療の治療効果をモニタリングする方法＞
本発明はまた、中枢性又は末梢性血小板減少症の治療の治療効果を体外でモニタリングする方法であって、
（ａ）本発明に係る分析方法を実施することで、中枢性又は末梢性血小板減少症の治療を受けた患者の血液サンプル中に存在する血小板を分析する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を中枢性又は末梢性血小板減少症の治療の治療効果を決定するのに用いる工程と
を有する方法に関する。
＜予後診断方法＞
本発明はまた、炎症性疾患又は心血管系疾患の発生を体外で予後診断する方法であって、
（ａ）本発明に係る分析方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板を分析する工程と、
（ｂ）工程（ａ）の結果を炎症性疾患又は心血管系疾患の発生の予後診断に用いる工程と
を有する方法に関する。
具体的な実施形態において、上記炎症性疾患は敗血症である。他の具体的な実施形態において、上記心血管系疾患はアテローム性動脈硬化症である。
＜診断キット＞
本発明はまた、対象における末梢性血小板減少症又は中枢性血小板減少症を診断するためのキット、治療の治療効果をモニタリングするためのキット、或いは炎症性疾患又は心血管系疾患の発生を予後診断するためのキットであって、
・蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンド、
・内部標準、及び
・本発明に係る体外診断方法を実施するための指示書
を有するキットに関する。
＜治療方法＞
本発明はまた、対象における末梢性血小板減少症又は中枢性血小板減少症を治療する方法であって、
・本発明に係る体外診断方法を実施することと、
・該診断が陽性である場合、上記対象の適切な治療を開始することと
を有する方法に関する。
適切な治療は、特に文献［８］（参照により本出願に援用される）、具体的には「Ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、「Ｓｅｃｏｎｄ－ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、「Ｔｈｉｒｄ－ｌｉｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ」、及び「Ｏｔｈｅｒ ｎｅｗ ａｇｅｎｔｓ」の章、並びに表２（１８～１９ページ）に記載されている。
材料及び方法
＜試薬＞
試薬は市販のものである。チアゾールオレンジ（ＴＯ）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製である。キシラジン（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標））及びケタミン（Ｉｍａｌｇｅｎｅ １，０００（登録商標））はそれぞれＢａｙｅｒ社製及びＭｅｒｉａｌ社製である。ビオチンはＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ社から、ジフテリア毒素（ＤＴ）はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ社から供給されたものである。
＜抗体及びフローサイトメトリー＞
我々の実験室において、血小板糖タンパク質ＧＰＩｂベータ（Ｒａｍ１、［７］）の細胞外ドメインに対するラットモノクローナル抗体を作製し、Ａｌｅｘａ６４７又は４８８と結合させた。アロフィコシアニン（ＡＰＣ）と結合した抗ＨＬＡＩマウス抗体（クローンＷ６／３２）（品番：３１１４１０）、ＰＥ－ＣＹ７と結合したヒト抗β２ｍ（品番：３１６３１８）、及びＡＰＣ－ｃｙ７と結合したヒト抗ＣＤ４５（クローン２Ｄ１）（品番：３６８５１６）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社製である。フィコエリトリン（ＰＥ）と結合したマウス抗Ｈ２（クローンＭ１／４２）（品番：１２５５０６）及びＡＰＣ－ＣＹ７と結合したストレプトアビジン（品番：４０５２０８）はＢｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入した。マウス抗ｂ２ミクログロブリン（β２ｍ）抗体（クローンＳ１９．８）（品番：５５５２９９）はＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製である。ＰＥ－ｃｙ７と結合したマウス抗ＣＤ４５抗体（クローン３０－Ｆ１１）（品番：２５－０４５１）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から供給されたものである。ヒト抗リボソームＰタンパク質抗体は、台湾国立陽明大学のＳｕｎ教授［１］よりご提供いただいたものである。
１％ＢＳＡ及び６ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ１０体積部で全血を希釈した。１／２００に希釈した「ＦｃＲブロッキング」試薬（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ社）でＦｃγ受容体をブロッキングしてから、抗体で標識した。洗浄工程の後、ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのＴＯで１５分間、細胞を対抗標識した（ｃｏｕｎｔｅｒ－ｌａｂｅｌｅｄ）。次いで、１％パラホルムアルデヒド２０体積部でサンプルを希釈し、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ細胞分析装置、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で４５分間分析した。データはＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアで分析した。
＜マウス＞
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から購入した８～１０週齢のＣ５７Ｂｌ６／Ｊマウスで実験した。［２］に既に記載されているようにジフテリア毒素受容体及びＰＦ４導入遺伝子の両方に対して陽性であるマウス（文中ではＰＦ４－ｃｒｅ／ｉＤＴＲという）を作製した。
＜血小板輸血＞
ジフテリア毒素（ＤＴ）（１００ｎｇ／日、腹腔内）を４日間注射して、ＰＦ４－ｃｒｅ／ｉＤＴＲマウスを重度の血小板減少状態とした。最後の注射から８日後、抗凝固剤としてクエン酸塩（３．８％）を使用して、麻酔をかけたマウスの腹部大動脈から血液を採取し、［３］に既に記載されているように血小板を単離した。洗浄した架橋血小板をビオチン化し、１．２×１０６個／μＬで再懸濁させ、懸濁液１５０μＬをＷＴマウスの後眼窩洞に注射した。輸血（０時間）から５分後、３０分後、２時間後、２４時間後、４８時間後、及び７２時間後に血液サンプルを採取した。
＜倫理的声明＞
研究を実施したＥｔａｂｌｉｓｓｅｍｅｎｔ Ｆｒａｎｃａｉｓ ｄｕ Ｓａｎｇ－Ｇｒａｎｄ Ｅｓｔ（ＥＦＳ－Ａｌｓａｃｅ）によって採用された無給のボランティア提供者からヒト血液サンプルを得た。各採血時、提供者は、サンプルが研究目的で使用されることが表示されたインフォームドコンセントにサインした。動物実験の倫理的承認は欧州連合指令２０１０／６３／ＥＵに従ったものであった。研究はＣｏｍｉｔｅ ｒｅｇｉｏｎａｌ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ ｐｏｕｒ ｌ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ ｄｅ Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ（ＣＲＥＭＥＡＳ）（ＣＥＥＡ３５）によって承認された。
＜統計分析＞
統計分析はＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ５．０２）を用いて行った。
結果
＜マウス幼若血小板は表面により多くのＭＨＣ Ｉ分子を発現する＞
まず、マウス血小板の表面でのクラスＩ分子の発現がその年齢に依存しているかどうかを分析した。マウスでは、チアゾールオレンジ（ＴＯ）標識によって２つの血小板集団を容易に識別できる。そのうち約１０％は強いＴＯ蛍光（ＴＯｂｒｉｇｈｔ）を示し（図１Ａ左）、１２時間齢未満である［２］。抗β２ｍ抗体又は抗ＭＨＣ Ｉ（Ｈ２）抗体で標識してからＴＯ標識した後、血小板表面でのＭＨＣ Ｉ分子の発現をフローサイトメトリーで推定した。クラスＩ分子の発現は、ＴＯｄｉｍ血小板よりもＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板においてより多いように見えた（図１Ａ右）。血小板が幼若であるほどサイズが大きくなるため、より多くのＭＨＣ Ｉ分子が発現されるという事実を排除するために、ＴＯｄｉｍ集団及びＴＯｂｒｉｇｈｔ集団の両方において平均ＦＳＣパラメータ（細胞サイズと相関したパラメータ）に対するβ２ｍ又は重鎖（Ｈ２）標識の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の比を算出した（図１Ｂ）。上記比はＴＯｄｉｍ血小板集団よりもＴＯｂｒｉｇｈｔ集団で著しく高かった（Ｈ２／ＦＳＣ比：ＴＯｂｒｉｇｈｔにおいて１４．５５±０．４６であるのに対し、ＴＯｄｉｍにおいて８．３５±０．１４、ｐ＜０．００１；β２ｍ／ＦＳＣ比：ＴＯｂｒｉｇｈｔにおいて４４．７８±１６．５０であるのに対し、ＴＯｄｉｍにおいて８．２５±２．３２、ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。一方、主要な血小板特異的糖タンパク質であるＧＰＩｂβの発現を分析したところ、その比は両血小板集団について同様であった（ＧＰＩｂ／ＦＳＣ比：ＴＯｂｒｉｇｈｔにおいて２４７．０７±３．５７であるのに対し、ＴＯｄｉｍにおいて２５４．７０±８．１５、ｎ＝３、ｎｓ）。
総じて、これらのデータから、恒常性条件下においてマウス幼若血小板は表面により多くのＭＨＣ Ｉ分子を発現することが分かった。
＜血小板の加齢に伴って体内でクラスＩ分子の表面発現が低下する＞
次いで、体内で加齢によって血小板でのＭＨＣ Ｉ表面発現が影響を受けるかどうかを決定した。ｉＤＴＲ ＰＦ４ ｃｒｅマウスを利用して同調的幼若血小板集団を得た［２］。ジフテリア毒素（ＤＴ）を４日間、毎日投与したところ、成熟巨核球の消失が誘発されて、血小板生成が妨げられ、進行性血小板減少症が生じた。処理を止めてから４日後（８日目）、巨核球形成及び血小板生成が著しく向上し、その結果、一過的に幼若血小板が圧倒的多数となった（データは示さず、［２］）。従って、ＤＴ処理したｉＤＴＲ ＰＦ４ ｃｒｅマウスの血小板を８日目に単離し、ビオチン化し、ＷＴマウスに輸血した。輸血後の様々な時間において、ビオチン化輸血血小板でのＭＨＣ Ｉ発現をフローサイトメトリーで分析し、内在性血小板でのＭＨＣ Ｉ発現と比較した。その結果、輸血から５分後のビオチン化血小板では（ＴＯ平均蛍光）／（平均ＦＳＣ）比が高く、内在性ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板と同等であることが分かった。２４時間後には、内在性ＴＯｄｉｍ血小板と等しかったことから（図２Ｃ）、体内での輸血血小板の加齢が確認された。注目すべきこととして、ビオチン化輸血血小板でのＭＨＣ Ｉ発現は時間経過に伴って次第に減少した。輸血から５分後、ビオチン化血小板でのＭＨＣ Ｉ発現は内在性ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板での発現レベルと同様であった。２４時間後、この発現レベルは著しく低下して内在性ＴＯｄｉｍ血小板での発現レベルと同じになった（図２Ａ）。この実験から、体内において、血小板表面でのＭＨＣ Ｉ分子の発現レベルはその年齢と関係することが分かる。一方、輸血血小板でのＧＰＩｂβ発現は７２時間という期間にわたって安定していた（図２Ｂ）。
総じて、これらのデータから、２４時間齢未満の幼若血小板を識別する際のＭＨＣ Ｉ発現パラメータの関連性が強調された。
＜ＨＬＡ Ｉ分子はヒトＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板によって優先的に発現される＞
ヒトにおいて、ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板は全血小板集団の１～２％に相当する（図３Ａ左パネル）。ヒト血小板表面でのＨＬＡ Ｉ分子の発現を特徴付けるために、抗β２ｍ抗体、汎抗ＨＬＡクラスＩ抗体（Ｗ６／３２）［４］で共標識してからＴＯで対抗標識した。フローサイトメトリー分析から、マウスで観察されたように、ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板はＨＬＡ Ｉ分子をより高レベルで発現することが明らかになった（図３Ａ右パネル、灰色で強調）。
血小板サイズとは無関係に血小板集団におけるＨＬＡ Ｉ分子の分布を分析するために、マウス血小板の場合と同じアプローチ、すなわち（ＨＬＡ ＩのＭＦＩ）／（ＦＳＣパラメータ）比を採用した（図３Ｂ）。今回も、ＴＯｄｉｍ血小板よりもＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板でこの比がより高いことが分かった（β２ｍ／ＦＳＣ比：ＴＯｂｒｉｇｈｔにおいて１１．５８±１．２５であるのに対し、ＴＯｄｉｍにおいて６．５９±０．７６２、ｎ＝７、ｐ＜０．０５；Ｗ６３２／ＦＳＣ比：ＴＯｂｒｉｇｈｔにおいて１６．０２±１．９９であるのに対し、ＴＯｄｉｍにおいて８．４６±０．９３、ｎ＝７、ｐ＜０．００１）。逆に、（ＧＰＩｂβのＭＦＩ）／（ＦＳＣ）比はＴＯｄｉｍとＴＯｂｒｉｇｈｔとで同様であり、幼若血小板でのＨＬＡ Ｉ分子発現の特殊性が強調された。
＜ＨＬＡ Ｉ分子を強く発現するヒト血小板は、より高いリボソームタンパク質含量（幼若血小板の特徴）を有する＞
リボソームＰタンパク質抗原は、ｍＲＮＡ翻訳に必要な３つのリボソームサブユニット（ＲＬＰ０、２、及び３）のＣ末端部に存在している［５］。ｍＲＮＡ翻訳は主として血小板寿命の最初の数時間で起こるため［２］、少なくともＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板ではリボソームＰタンパク質抗原の検出が期待される。
ヒト血小板を固定し、透過処理し、リボソームＰタンパク質抗原に対する抗体、抗β２ｍ抗体、汎抗ＨＬＡ Ｉ抗体（Ｗ６／３２）、及びＴＯで共標識してから、フローサイトメトリーで分析した（図４Ａ）。
リボソームＰタンパク質に対する抗体で標識することで、ヒト血小板の１３．３±％（ｎ＝４）がこのタンパク質を発現する一方、ＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板亜集団では８３±％（ｎ＝４）であることが明らかになり、この抗原はより幼若な血小板でより多く発現されることが示された。更に、ＭＨＣ Ｉ分子発現を分析すると、濃灰色で表したＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板又は高リボソームＰ血小板上で存在が増大したことが分かった（下パネル）。次いで、ＨＬＡ Ｉ分子（Ｗ６／３２又は抗β２ｍで標識）の発現が高い又は低い集団におけるリボソームＰタンパク質の分布を分析した。図４Ｂに示す通り、リボソームＰタンパク質はＨＬＡ Ｉｈｉｇｈ血小板の大半で発現されたが、ＨＬＡ Ｉｌｏｗ血小板ではほんの少数であった（それぞれ８２．７７±１０．６３％、１０．４７±３．５９％、ｎ＝４）（図４Ｂ）。
＜血小板でのＨＬＡ Ｉ分子の発現レベルは、患者における幼若血小板比率を評価する基準として使用できる＞
臨床用途においてこれらの観察結果の関連性を調査するために、健常提供者、又は循環中の幼若血小板比率の増加に関連する病態を有する患者から得たヒト血小板の表面でのＨＬＡ Ｉ分子の発現を評価した。まず、健常ボランティアにおいて「ＨＬＡ Ｉｈｉｇｈ」血小板及びＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板の比率をＳｙｓｍｅｘ（登録商標）により提供されたＩＰＦ比率と比較した（図５Ａ、ｎ＝６）。ＨＬＡ Ｉｈｉｇｈ血小板及びＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板の比率は同様であった（２．２５％±０．２６に対し、２．１７％±０．１９、ｎ＝６）。一方、ＩＰＦ比率はより不均一ではあったが、健常ボランティアでは依然として１５％未満であった（６．７％±１．６、ｎ＝６）。
最後に、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）分析によってＩＰＦ比率が高いことが分かったｍｙｏｓｉｎ９欠損患者２名（それぞれＩＰＦが６４．９％及び４２．７％）の血小板表面でのＨＬＡ Ｉ分子の発現を分析した。
各患者のクエン酸血をβ２ｍに対する抗体、汎抗ＨＬＡ Ｉ抗体（Ｗ６／３２）、及びＴＯで共標識してから、フローサイトメトリーで分析した。注目すべきこととして、一方の患者（Ｐ１）のみβ２ｍ／ＦＳＣ比及び（Ｗ６／３２）／ＦＳＣ比がコントロールと比較して高かったのに対し、ＴＯ／ＦＳＣ比は両患者（Ｐ１及びＰ２）とも健常ボランティアと比較して高かった（図５Ｂ）。ＴＯがＲＮＡだけでなく顆粒の内容物とも結合できるという事実を考慮して、ＴＯ標識の前にＲＮａｓｅＡ処理を実施した。フローサイトメトリー分析から、ＲＮａｓｅＡ処理によって患者１のＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板比率が著しく低下したことが分かった（ＲＮａｓｅＡ処理後のＴＯｂｒｉｇｈｔ４．９％に対し、ＲＮａｓｅＡ処理前のＴＯｂｒｉｇｈｔ１５．９％）。一方、この処理は患者２のＴＯｂｒｉｇｈｔ血小板集団には影響を及ぼさなかったことが分かった（ＲＮａｓｅＡ処理後のＴＯｂｒｉｇｈｔ２６．１％に対し、ＲＮａｓｅＡ処理前のＴＯｂｒｉｇｈｔ２９．４％）（図５Ｃ）。
ＩＰＦの推定は、特に凝集体の存在を原因として、血小板活性化によってバイアスが掛かる可能性があることが知られているので［６］、ＨＬＡ Ｉ分子の表面発現が幼若血小板比率を評価するためのより信頼性の高い基準となるかどうかを検証した。
従って、各濃度（０．１μＭ、０．５μＭ、１μＭ、１０μＭ、５０μＭ、又は１００μＭ）の血小板凝集試薬ＴＲＡＰとともにクエン酸血をインキュベートしてから、フローサイトメトリー又はＳｙｓｍｅｘ（登録商標）技術で分析した。０．５μＭのＴＲＡＰから、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）技術ではＩＰＦの著しい増加が観察されたが（０．５μＭ ＴＲＡＰ条件ではＩＰＦ１０．７±８％であるのに対し、非活性化条件ではＩＰＦ４．２±０．８％、ｎ＝３）、β２ｍ／ＦＳＣ比又はＷ６３２／ＦＳＣ比は安定したままであった（０．５μＭ ＴＲＡＰ条件では１．３±０．４であるのに対し、非活性化条件では１．５±０．３、ｎ＝３）。なお、ＴＲＡＰの用量が高くなるほど（１００μＭ）、ＨＬＡ Ｉ／ＦＳＣ比が増加したが、これは顆粒中に存在するＨＬＡ Ｉ複合体の細胞膜へ曝露されたことが原因かもしれない（図５Ｄ）。しかしながら、このような増加は健常ボランティアで見られた参照値内に留まっていたことに注目すると、興味深い。
これらのデータから、ＨＬＡ Ｉ分子の発現レベルは、幼若血小板比率が高い患者サンプルの検出においてＴＯ標識又はＳｙｓｍｅｘ（登録商標）技術よりも信頼性が高いことが示唆される。
＜ＦＳＣ（ＦＳＣ－Ａ）に対して正規化する利点＞
（ａ）健常提供者７名及びベルナール・スーリエ症候群患者１名から採取した血液サンプルを本発明に係る方法で分析し、必要に応じてＦＳＣを用いて（すなわち、ＦＳＣ正規化を行って又は行わずに）比を算出した。結果を図６に表す。
正規化を行わずに得られた結果に関して言えば、ＢＳＳ患者は末梢性血小板減少症を患っているようである。実際、正規化を行わないデータから、ＢＳＳ患者の血小板は表面により多くのＨＬＡ Ｉ分子を発現するように思われる。従って、この患者は健常提供者より多くの幼若血小板を有しているようである。
ＦＳＣを用いて比を算出することで、ＢＳＳ患者の血小板は表面により多くのＨＬＡ Ｉ分子を発現しないことが分かる。従って、ＢＳＳ患者は健常提供者と同程度の幼若血小板しか有していない。故に、正規化することで偽陽性を回避できる。
（ｂ）健常提供者２１名、骨髄線維症（ＭＦ）患者１名、メイ・ヘグリン異常（ＭＹＨ９）患者２名、及び血栓性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）患者２名から採取した血液サンプルを本発明に係る方法で分析し、必要に応じてＦＳＣを用いて（すなわち、ＦＳＣ正規化を行って又は行わずに）比を算出した。結果を図７に表す。
血小板サイズを考慮しない場合、全ての患者がより多くの幼若血小板を有しているとの疑いを持てるようであり、従って「末梢性血小板減少症」と分類されるようである。この知見はＭＦ患者及びＩＴＰ患者の病態（骨髄活性の増大）と一致するが、ＭＹＨ９患者の骨髄活性は増大していないかもしれない。
血小板サイズに対する比から、ＭＹＨ９患者２は実際には偽陽性であり、健常提供者と同程度の幼若血小板しか有していないことが分かる。
＜考察＞
結果から、血小板サイズに関連してフローサイトメトリーでＭＨＣ Ｉ発現レベルを測定することは、血小板の分析、特に幼若血小板の同定に有用であることが分かった。実際に、幼若血小板は表面により多くのＭＨＣ Ｉを発現し、このレベルは血小板の年齢に伴って低下することが分かった。これら全ての結果から、対象における幼若血小板比率を評価する際のＭＨＣ Ｉ／ＦＳＣ比の利点が強調される。
今日まで、臨床医は通常、ＴＯによるＲＮＡ標識を可視化させて、サンプル中に存在する幼若血小板（ＴＯｂｒｉｇｈｔ）を分析している。だが、この技術には、細胞質ＲＮＡを結合させるのに使用する試薬（ＴＯ）が顆粒中に含まれるヌクレオチドとも結合し得る以上、制約がある。ＭＨＣ Ｉ発現の測定によって、ＲＮＡの非特異的な標識を回避できる。
更に、ＭＨＣ Ｉ発現の測定によって、Ｓｙｓｍｅｘ（登録商標）法では偽陽性を生じさせる凝集体が分析サンプル中に存在するという別の問題も回避できる。
ＭＦＩ血小板パラメータの測定によるＭＨＣ Ｉ発現レベルの測定値を、特に血小板サイズ等の粒子径を表すことができるＦＳＣパラメータに対して正規化し、次いで内部標準の蛍光強度（ＭＦＩ標準）に対して正規化した場合、本発明者らが得た結果は非常に正確であった。このような正規化によって、特に、実験間、実験室間、及び／又は実験者間の変動を補正することができる。
本発明者らが（ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ血小板）／（ＭＦＩ標準／ＦＳＣ標準）比（すなわち、ＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ）を決定することで血小板を分析した場合、更により正確な結果が得られた。この比から、血小板を驚くほど精密に分析できる。最終的には、１つ以上の血小板集団、特に幼若血小板集団をより精密に識別できる。結論として、フローサイトメトリーで測定したＭＨＣ Ｉ発現レベルは、血液サンプル中に存在する血小板を分析するための、特に幼若血小板比率を決定するための良好なマーカーである。従って、ＭＨＣ Ｉ分子の発現密度は、対象における末梢性又は中枢性血小板減少症を診断するために、及び中枢性又は末梢性血小板減少症の治療の治療効果をモニタリングするために選択されるマーカーを構成する。
＜［参照番号］として本願で引用された文献＞
１．Ｓｕｎ，Ｋ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｐｅｎｅｔｒａｔｅ ｉｎｔｏ ｌｉｖｉｎｇ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃａｕｓｅ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｏｆ Ｊｕｒｋａｔ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｏｘｆｏｒｄ），２００１．４０（７）：ｐ．７５０－６．
２．Ａｎｇｅｎｉｅｕｘ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｉｍｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｄｅｃａｙ ｏｆ ｍＲＮＡ ａｎｄ Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ ｄｕｒｉｎｇ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｇｉｎｇ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，２０１６．１１（１）：ｐ．ｅ０１４８０６４．
３．Ｈｅｃｈｌｅｒ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ ａｒｅ ｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｆｏｒ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｃｕｔｅ ｌｕｎｇ ｉｎｊｕｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ．Ｊ Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，２０１６．１４（６）：ｐ．１２５５－６７．
４．Ｔｒａｎ，Ｔ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｅｐｉｔｏｐｅ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ｐａｎ－ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｗ６／３２ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｔｏ ｕｎｕｓｕａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＨＬＡ－Ｂ２７／ｂｅｔａ２－ｍｉｃｒｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００１．５３（６）：ｐ．４４０－６．
５．Ｄｅｒｙｌｏ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ｕＬ１０ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ Ｐ－ｓｔａｌｋ，ｉｓ ｒｅｌｅａｓｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｉｎ ｎｕｃｌｅｏｌａｒ ｓｔｒｅｓｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０１８．１８６５（１）：ｐ．３４－４７．
６．Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍａｔｕｒｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｉｓ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｉｓ ａ ｕｓｅｆｕｌ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｆｏｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０１５．２０（１０）：ｐ．５８７－９２．
７．Ｐｅｒｒａｕｌｔ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｖｅｌ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ＧＰＩｂＭｏｄｕｌａｔｅｓ ｖＷＦ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ａｄｈｅｓｉｏｎ，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ，２００１．８６：ｐ．１２３８－４８．
８．Ｎｏｍｕｒａ，Ｓ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｉｎｓｉｇｈｔｓ：Ｂｌｏｏｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，２０１６．９：ｐ．１５－２２．

Claims (11)

  1. 血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する方法であって、
    （ａ）血液サンプル中に存在する血小板を分析する工程と、
    （ｂ）工程（ａ）の結果を用いて血小板集団を同定する工程と
    を有し、
    上記血小板集団は幼若血小板集団であり、
    前記工程（ａ）が、
    （ａ１）蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンドを上記サンプルに添加する工程と、
    （ａ２）フローサイトメーターを用いて上記血小板の平均蛍光強度（ＭＦＩ血小板）を測定する工程と、
    （ａ３）上記フローサイトメーターを用いて平均前方散乱（ＦＳＣ）パラメータを測定し、ＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比を決定する工程と
    を有する、
    方法。
  2. 上記血液サンプルは、全血のサンプル、又は血小板を含む全血画分のサンプルである、請求項１に記載の方法。
  3. 上記リガンドは抗体又は抗体断片である、請求項１又は２のいずれか１項に記載の方法。
  4. 上記蛍光色素は、励起波長及び発光波長がＲＮＡを検出するための試薬に干渉しない蛍光色素である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 上記ＭＦＩ血小板測定値を内部標準の平均蛍光強度（ＭＦＩ標準）に対して正規化することで、正規化血小板平均蛍光強度（ＭＦＩ正規化血小板）が得られ、工程（ａ３）は、上記フローサイトメーターを用いて平均前方散乱（ＦＳＣ）パラメータを測定して、ＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比を決定することで構成される、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 上記内部標準は上記蛍光色素結合リガンドに結合する、請求項５に記載の方法。
  7. 上記内部標準は上記蛍光色素結合リガンドに結合するポリスチレンマイクロビーズである、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 上記リガンドは、ＭＨＣ Ｉアルファ鎖に少なくとも部分的に結合する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
  9. 請求項６～８のいずれか１項に方法を実施するためのキットであって、
    蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンド、
    内部標準、及び
    指示書
    を有するキット。
  10. 蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンド、内部標準、及び指示書を有するキットであって、
    （ａ）請求項１～８のいずれか１項に記載の方法を実施することで対象の血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する工程と、
    （ｂ）上記対象においてＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比及び／又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比が、健常対象で測定した同パラメータに対して増加している場合、末梢性血小板減少症の陽性判定を下し、
    上記対象においてＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比及び／又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比のパラメータが、健常対象で測定した同パラメータと同様又は同一である場合、中枢性血小板減少症の陽性判定を下す工程と
    を有する、
    対象における末梢性又は中枢性血小板減少症を体外判定する方法を実施するための、
    キット。
  11. 蛍光色素と結合したＭＨＣ Ｉに結合するリガンド、内部標準、及び指示書を有するキットであって、
    （ａ）請求項１～８のいずれか１項に記載の方法を実施することで、中枢性又は末梢性血小板減少症の治療を受けた患者の血液サンプル中に存在する血小板集団を同定する工程と、
    （ｂ）上記患者においてＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比及び／又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比が、健常対象で測定した同パラメータに対して増加している場合、末梢性血小板減少症の治療が必要であると判定し、
    上記患者においてＭＦＩ血小板／ＦＳＣ比及び／又はＭＦＩ正規化血小板／ＦＳＣ比のパラメータが、健常対象で測定した同パラメータと同様又は同一である場合、中枢性血小板減少症の治療が必要であると判定する工程と
    を有する、
    中枢性又は末梢性血小板減少症の治療の治療効果を体外で判定する方法を実施するための、
    キット。
JP2021529530A 2018-07-30 2019-07-29 血液サンプルの血小板を分析する方法 Active JP7481340B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1857095 2018-07-30
FR1857095A FR3084463B1 (fr) 2018-07-30 2018-07-30 Procede d'analyse des plaquettes d'un echantillon sanguin
PCT/FR2019/051867 WO2020025891A1 (fr) 2018-07-30 2019-07-29 Procede d'analyse des plaquettes d'un echantillon sanguin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2021533390A JP2021533390A (ja) 2021-12-02
JP7481340B2 true JP7481340B2 (ja) 2024-05-10

Family

ID=64049380

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021529530A Active JP7481340B2 (ja) 2018-07-30 2019-07-29 血液サンプルの血小板を分析する方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20210148919A1 (ja)
EP (1) EP3830548B1 (ja)
JP (1) JP7481340B2 (ja)
KR (1) KR20210034050A (ja)
CN (1) CN112714865A (ja)
FR (1) FR3084463B1 (ja)
WO (1) WO2020025891A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024096737A1 (en) * 2022-11-01 2024-05-10 Erasmus University Medical Center Rotterdam Methods for determining the age of platelets

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008517948A (ja) 2004-10-25 2008-05-29 セルラント セラピューティクス，インコーポレイティド 骨髄細胞集団の増殖方法及びその使用
WO2017045691A1 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Herlev Hospital Vaccine compositions comprising c-c motif chemokine 22 (ccl22) or fragments thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2253965C (en) * 1997-11-22 2003-01-21 Robert A. Levine Method for the detection, identification, enumeration and confirmation of circulating cancer cells and/or hematologic progenitor cells in whole blood
JP2007263958A (ja) * 2006-02-28 2007-10-11 Nippon Medical Soken:Kk 血液細胞の分類法および診断ならびにそれを利用したテイラーメード治療および予防
WO2009058876A1 (en) * 2007-10-29 2009-05-07 Beckman Coulter, Inc. Method for a rapid antibody-based analysis of platelet populations
EP2398900A4 (en) * 2009-02-20 2012-08-22 Scripps Research Inst INSULATED MONOCYTIC POPULATIONS AND ASSOCIATED THERAPEUTIC APPLICATIONS
CN101713782A (zh) * 2009-10-27 2010-05-26 苏州苏大赛尔免疫生物技术有限公司 单抗纳米微球联合检测特异性血小板自身抗体的试剂盒
CN107422111A (zh) * 2017-07-25 2017-12-01 冀学斌 一种检测免疫性血小板减少症血小板自身抗体的流式微球方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008517948A (ja) 2004-10-25 2008-05-29 セルラント セラピューティクス，インコーポレイティド 骨髄細胞集団の増殖方法及びその使用
WO2017045691A1 (en) 2015-09-16 2017-03-23 Herlev Hospital Vaccine compositions comprising c-c motif chemokine 22 (ccl22) or fragments thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Abcam, "Product datasheet Anti-HLA Class I antibody [W6/32]"，2006年04月12日，https://www.abcam.com/hla-class-i-antibody-w632-ab22432.html
Binita Shah，Mean platelet volume reproducibility and association with platelet activity and anti-platelet therapy，Platelets，2014年，Vol.25 No.3，Page.188-192
D Vucetic et al，Flow cyrometry analysis of platelet populations: usefulness for monitoring the storage lesion in pooled buffy-coat platelet concentrates，Blood Transfusion，2018年01月31日，Vol.16，Page.83-92
K Javela et al，Mean platelet size related to glycoprotein-specific autoantibodies and platelet-associated IgG，International Journal of Labiratory Hematology，2007年12月31日，vol.29，Page.433-441
Lesley M. Chapman，Platelets Present Antigen in the Context of MHC Class I，J Immunol，2012年，Vol.189 No.2，Page.916-923
小池由佳子，網血小板／幼若血小板比率の臨床応用，血栓止血誌，2018年，Vol.29 No.6，Page.555-557

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020025891A1 (fr) 2020-02-06
FR3084463B1 (fr) 2023-04-21
EP3830548B1 (fr) 2023-07-05
US20210148919A1 (en) 2021-05-20
WO2020025891A9 (fr) 2020-03-19
EP3830548A1 (fr) 2021-06-09
KR20210034050A (ko) 2021-03-29
CN112714865A (zh) 2021-04-27
FR3084463A1 (fr) 2020-01-31
JP2021533390A (ja) 2021-12-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Theodoraki et al. Evaluation of exosome proteins by on‐bead flow cytometry
Schneider-Hohendorf et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells
US7387880B2 (en) Method for monitoring resting and activated platelets in unfixed blood samples
Angénieux et al. Cell surface expression of HLA I molecules as a marker of young platelets
Choi et al. Diagnostic value of peripheral blood immune profiling in colorectal cancer
Weiss Application of flow cytometric techniques to veterinary clinical hematology
JP2016515215A (ja) ドナー特異的抗体を検出する方法及び該方法を実施するためのシステム
US20180348238A1 (en) Platelet analysis system
Illingworth et al. Sensitive and accurate identification of PNH clones based on ICCS/ESCCA PNH Consensus Guidelines—a summary
JP7481340B2 (ja) 血液サンプルの血小板を分析する方法
JP2012168012A (ja) 血管内皮障害を検査するための新規な検査方法および検査用キット
JP7220474B2 (ja) 迅速なオンデマンドヘパリン起因性血小板減少症機能的アッセイ
WO2020014175A1 (en) Methods and compositions for analyzing immortalized megakaryocyte progenitor cell lines and platelet-like particles derived therefrom
Johansson et al. Detection of CAR‐T19 cells in peripheral blood and cerebrospinal fluid: An assay applicable to routine diagnostic laboratories
AU2015263482B2 (en) Diagnostic of chronic myelomonocytic leukemia (CMML) by flow cytometry
US10788481B2 (en) One step phagocytosis-cell activation-cell death assay
Stafylidis et al. A study of platelet function in patients with chronic immune thrombocytopenia treated with thrombopoietin receptor agonists
Pekárková et al. Stra nák, Z.; Holada, K. Cord Blood Extracellular Vesicles Analyzed by Flow Cytometry with Thresholding Using 405 nm or 488 nm Laser Leads to Concurrent Results. Diagnostics 2021, 11, 1320
CN103596576B (zh) 血小板分析系统
WO2013013268A1 (en) Platelet assessment assays, diagnosis and kits therefor
Harrison Tests of platelet function

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220512

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230427

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230516

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230724

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230926

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20231225

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240122

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240402

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240425

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7481340

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150