JP7470436B2 - 血管内皮前駆細胞の調製及び拡大培養 - Google Patents
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Description
本発明は血管内皮前駆細胞の調製及び拡大培養に関する。詳しくは、多能性幹細胞から高純度の血管内皮前駆細胞を調製する方法、及び血管内皮前駆細胞を効率的に増殖させる方法等に関する。本出願は、２０１９年３月６日に出願された日本国特許出願第２０１９－０４０１１７号に基づく優先権を主張するものであり、当該特許出願の全内容は参照により援用される。
人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells, iPS細胞）や胚性幹細胞（embryonic stem cells, ES細胞）を含むヒト多能性幹細胞は無限に増殖し、ヒトの体のあらゆる部位へと分化する能力を有する。この特性が故に、ヒト多能性幹細胞（特にiPS細胞）を人体の器官を模倣した薬物スクリーニングモデルの構築や再生医療における臨床応用などに用いることが期待されている。
iPS細胞由来の血管内皮前駆細胞（EPCs）には血管の再生、心筋との共移植による心筋梗塞の治療や高度な臓器の三次元細胞組織構築など、様々な臨床応用が考えられる。また、血管疾患の病態モデルの構築や脳毛細血管内皮細胞に分化させ新薬開発におけるスクリーニング系に用いることも期待されている。このような目的で使用するためには高純度な血管内皮前駆細胞が大量に必要となる。
現在、血管内皮細胞（ECs）や血管内皮前駆細胞はES細胞及びiPS細胞から効率よく分化誘導されるという報告が数多くなされている（例えば非特許文献１、２を参照）。しかし、血管内皮細胞や血管内皮前駆細胞へと分化する割合は使用するセルラインや分化前の状態の影響を大きく受けるため、高純度の細胞を得るためには最終的に抗体ビーズ／磁気ビーズやセルソーターを用いて純化することが多い。また、iPS細胞由来血管内皮前駆細胞の効率的な拡大培養法については報告が限られている。尚、本発明者らの研究グループは、先の特許出願（特許文献１）において、iPS-sac法を応用した新規な血管内皮前駆細胞分化誘導法を報告した。また、特許文献２には、胚性幹細胞から血管内皮前駆細胞を調製する方法が開示されている。
Mien T.X. et al. Differentiation of Human Embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem cell reports, 2016;7:802-16.
Kyung-dal Chot. Et al. Hematopoietic and endothelial differentiation of human induced pluripotent stem cells. Stem cells, 2009;27:559-67.
抗体ビーズ／磁気ビーズやセルソーターを用いた純化法によれば細胞の高純度化を達成し得るものの、細胞へのダメージ（例えば、処理時間が長いために細胞が疲弊する）が大きい。また、操作が煩雑であり、費用も嵩む。更には、抗体由来の成分等、異種成分の混入の可能性を排除できない。これらの事情を踏まえ、本発明の第１の課題は、簡便且つ低コストで高純度の血管内皮前駆細胞を調製する手段の提供にある。本発明はまた、血管内皮前駆細胞の調製過程のXeno-free化（異種由来成分を含まない条件下での調製）を可能にすることも課題とする。更に本発明は、血管内皮前駆細胞を効率的に増殖させる方法を提供することも課題とする。
iPS細胞を血管内皮前駆細胞へと分化誘導すると、通常、血管内皮前駆細胞とその他の不要な細胞（分化方向の異なる細胞等）が混在した状態となる。本発明者らは簡便性を重視し、培養過程において不要な細胞を選択的に除去する（言い換えれば血管内皮前駆細胞を選択的に培養系に残存させる）方法・条件を様々な角度から検討することにした。その結果、血管内皮前駆細胞と不要な細胞との間に接着能力の差があることが偶然にも見出され、特定の剥離処理を介在させることにより、不要な細胞を選択的に除去し、血管内皮前駆細胞を高純度化することに成功した。即ち、本発明者らは、血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して分化終期に血管内皮前駆細胞を選択的に単離する方法を確立した。この方法は極めて簡便な操作にもかかわらず、従来の手法に匹敵する血管内皮前駆細胞の高純度化を達成した。また、この方法を用いれば、抗体ビーズ／磁気ビーズやセルソーター等によるセレクションが不要となり、細胞へのダメージ及び異種成分（抗体由来の成分等）の混入を回避できる。特筆すべきは、異種由来成分不含（Xeno-free）条件下で分化誘導した血管内皮前駆細胞に対しても当該方法が適用可能であったことである。この事実は、iPS細胞樹立から血管内皮前駆細胞作出の過程における全ての行程をXeno-free化し得る手法、即ち、実用上ないし臨床応用上、極めて有用な手法の確立に成功したことを意味する。
一方、特定の３種の低分子化合物（ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤及びTGFβ受容体阻害剤）を組合せて使用するとiPS細胞由来血管内皮前駆細胞の増殖率が飛躍的に上がることが判明した。即ち、血管内皮前駆細胞の安定供給に大きく寄与し得る「低分子化合物の新規な組合せ」を見出すことに成功した。当該組合せはXeno-free条件下で血管内皮前駆細胞を培養した場合にも有効であり、その臨床応用を大いに期待できる。本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
（ｉ）以下の工程（１）及び（２）を含む、血管内皮前駆細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程であって、以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる工程：
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程、
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程、
であり、
工程（２）では、ゼラチン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジンを１種類又は２種類以上、培養容器の表面にコートされた培養面を用い、
前記第１剥離処理と前記第２剥離処理が、以下の（ａ）と（ｄ）との中の一以上の条件を満たす、調製方法：
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が1.5倍～10倍長く、前記第１剥離処理に用いる第１細胞解離液と前記第２剥離処理に用いる第２細胞解離液とが同一の組成の細胞解離液であり、有効成分がトリプシン-EDTAおよびディスパーゼのうちの一つ以上である、
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強く、第１細胞解離液の有効成分がコラゲナーゼおよびEDTAのうちの一つ以上であり、第２細胞剥離液の有効成分がトリプシン-EDTAおよびディスパーゼのうちの一つ以上である。
その他、本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、血管内皮前駆細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程。
［２］工程（２）が以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる、［１］に記載の調製方法：
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程、
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程。
［３］前記第１剥離処理と前記第２剥離処理が、以下の（ａ）～（ｄ）の中の一以上の条件を満たす、［２］に記載の調製方法：
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が長い、
（ｂ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理温度が高い、
（ｃ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分濃度が高い、
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強い。
［４］前記第１剥離処理が、工程（１）で得られた細胞集団の前記第１細胞解離液への接触とそれに続くタッピング処理を含む、［２］又は［３］に記載の調製方法。
［５］工程（１）が以下の工程（１－１）及び（１－２）からなる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の調製方法：
（１－１）多能性幹細胞を中胚葉へと分化させる工程；
（１－２）工程（１－１）で得られた細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程。
［６］工程（１－２）における培養期間が2日間～14日間である、［５］に記載の調製方法。
［７］工程（１－２）の途中で、細胞接着性の強い培養面から細胞接着性の弱い培養面へ切り替える、［５］又は［６］に記載の調製方法。
［８］工程（１－２）が、以下の培養工程（１－２－１）と（１－２－２）を含む、［５］又は［６］に記載の調製方法。：
（１－２－１）骨形成因子4及び血管内皮増殖因子の存在下での培養、
（１－２－２）塩基性線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子の存在下での培養。
［９］工程（１－２－１）の培養期間が1日間～7日間であり、工程（１－２－２）の培養期間が1日間～7日間である、［８］に記載の調製方法。
［１０］工程（１－２－１）の培養に細胞接着性の強い培養面を用い、
工程（１－２－２）の培養に細胞接着性の弱い培養面を用いる、［９］に記載の調製方法。
［１１］細胞接着性の強い前記培養面が基底膜成分又はその断片を表面にコートした培養面であり、細胞接着性の弱い前記培養面がゼラチン、ポリ-D-リジン及びポリ-L-リジンからなる群より選択される材料を表面にコートした培養面である、［７］又は［１０］に記載の調製方法。
［１２］異種動物由来成分を含まない条件下で全ての工程が行われる、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１３］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１４］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１３］に記載の調製方法。
［１５］［１］～［１４］のいずれか一項に記載の調製方法で得られた血管内皮前駆細胞。
［１６］純度が９０％以上である、［１５］に記載の血管内皮前駆細胞。
［１７］［１５］又は［１６］に記載の血管内皮前駆細胞を含む、細胞製剤。
［１８］［１５］又は［１６］に記載の血管内皮前駆細胞の、in vitroでの血管の構築又はヒト血液脳関門モデルの構築への使用。
［１９］血管内皮前駆細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子と上皮成長因子に加え、ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤の存在下で培養する工程を含む、血管内皮前駆細胞の拡大培養法。
［２０］ROCK阻害剤がY-27632であり、GSK-3β阻害剤がCHIR 99021であり、TGF-β受容体阻害剤がA 83-01である、［１９］に記載の拡大培養法。
［２１］前記血管内皮前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞である、［１９］又は［２０］に記載の拡大培養法。
［２２］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［２１］に記載の拡大培養法。
［２３］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［２２］に記載の拡大培養法。
［２４］前記血管内皮前駆細胞が［１］～［１４］のいずれか一項に記載の調製方法で調製された細胞である、［１９］又は［２０］に記載の拡大培養法。
［２５］前記血管内皮前駆細胞が、生体から事前に採取された血管内皮前駆細胞又はそれを生体外で維持又は増殖させた細胞である、［１９］又は［２０］に記載の拡大培養法。
［２６］異種動物由来成分を含まない条件下で前記工程が行われる、［１９］～［２５］のいずれか一項に記載の拡大培養法。
（ｉ）以下の工程（１）及び（２）を含む、血管内皮前駆細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程であって、以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる工程：
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程、
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程、
であり、
工程（２）では、ゼラチン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジンを１種類又は２種類以上、培養容器の表面にコートされた培養面を用い、
前記第１剥離処理と前記第２剥離処理が、以下の（ａ）と（ｄ）との中の一以上の条件を満たす、調製方法：
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が1.5倍～10倍長く、前記第１剥離処理に用いる第１細胞解離液と前記第２剥離処理に用いる第２細胞解離液とが同一の組成の細胞解離液であり、有効成分がトリプシン-EDTAおよびディスパーゼのうちの一つ以上である、
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強く、第１細胞解離液の有効成分がコラゲナーゼおよびEDTAのうちの一つ以上であり、第２細胞剥離液の有効成分がトリプシン-EDTAおよびディスパーゼのうちの一つ以上である。
その他、本発明は、以下の形態として実現することが可能である。
［１］以下の工程（１）及び（２）を含む、血管内皮前駆細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程。
［２］工程（２）が以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる、［１］に記載の調製方法：
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程、
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程。
［３］前記第１剥離処理と前記第２剥離処理が、以下の（ａ）～（ｄ）の中の一以上の条件を満たす、［２］に記載の調製方法：
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が長い、
（ｂ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理温度が高い、
（ｃ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分濃度が高い、
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強い。
［４］前記第１剥離処理が、工程（１）で得られた細胞集団の前記第１細胞解離液への接触とそれに続くタッピング処理を含む、［２］又は［３］に記載の調製方法。
［５］工程（１）が以下の工程（１－１）及び（１－２）からなる、［１］～［４］のいずれか一項に記載の調製方法：
（１－１）多能性幹細胞を中胚葉へと分化させる工程；
（１－２）工程（１－１）で得られた細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程。
［６］工程（１－２）における培養期間が2日間～14日間である、［５］に記載の調製方法。
［７］工程（１－２）の途中で、細胞接着性の強い培養面から細胞接着性の弱い培養面へ切り替える、［５］又は［６］に記載の調製方法。
［８］工程（１－２）が、以下の培養工程（１－２－１）と（１－２－２）を含む、［５］又は［６］に記載の調製方法。：
（１－２－１）骨形成因子4及び血管内皮増殖因子の存在下での培養、
（１－２－２）塩基性線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子の存在下での培養。
［９］工程（１－２－１）の培養期間が1日間～7日間であり、工程（１－２－２）の培養期間が1日間～7日間である、［８］に記載の調製方法。
［１０］工程（１－２－１）の培養に細胞接着性の強い培養面を用い、
工程（１－２－２）の培養に細胞接着性の弱い培養面を用いる、［９］に記載の調製方法。
［１１］細胞接着性の強い前記培養面が基底膜成分又はその断片を表面にコートした培養面であり、細胞接着性の弱い前記培養面がゼラチン、ポリ-D-リジン及びポリ-L-リジンからなる群より選択される材料を表面にコートした培養面である、［７］又は［１０］に記載の調製方法。
［１２］異種動物由来成分を含まない条件下で全ての工程が行われる、［１］～［１１］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１３］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］～［１２］のいずれか一項に記載の調製方法。
［１４］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［１３］に記載の調製方法。
［１５］［１］～［１４］のいずれか一項に記載の調製方法で得られた血管内皮前駆細胞。
［１６］純度が９０％以上である、［１５］に記載の血管内皮前駆細胞。
［１７］［１５］又は［１６］に記載の血管内皮前駆細胞を含む、細胞製剤。
［１８］［１５］又は［１６］に記載の血管内皮前駆細胞の、in vitroでの血管の構築又はヒト血液脳関門モデルの構築への使用。
［１９］血管内皮前駆細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子と上皮成長因子に加え、ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤の存在下で培養する工程を含む、血管内皮前駆細胞の拡大培養法。
［２０］ROCK阻害剤がY-27632であり、GSK-3β阻害剤がCHIR 99021であり、TGF-β受容体阻害剤がA 83-01である、［１９］に記載の拡大培養法。
［２１］前記血管内皮前駆細胞が、多能性幹細胞を分化誘導して得られた細胞である、［１９］又は［２０］に記載の拡大培養法。
［２２］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［２１］に記載の拡大培養法。
［２３］人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、［２２］に記載の拡大培養法。
［２４］前記血管内皮前駆細胞が［１］～［１４］のいずれか一項に記載の調製方法で調製された細胞である、［１９］又は［２０］に記載の拡大培養法。
［２５］前記血管内皮前駆細胞が、生体から事前に採取された血管内皮前駆細胞又はそれを生体外で維持又は増殖させた細胞である、［１９］又は［２０］に記載の拡大培養法。
［２６］異種動物由来成分を含まない条件下で前記工程が行われる、［１９］～［２５］のいずれか一項に記載の拡大培養法。
１．血管内皮前駆細胞の調製方法
本発明の第１の局面は、多能性幹細胞から血管内皮前駆細胞（EPCs）を調製する方法（以下、「本発明の調製方法」とも呼ぶ。）に関する。本発明によれば、血管内皮細胞（ECs）への分化能を有する血管内皮前駆細胞が得られる。血管内皮前駆細胞を適切な条件で分化誘導するか、或いは血管内皮前駆細胞を分化誘導に適した環境に置けば（典型的には、生体において血管内皮細胞が存在する部位又はその近傍などへの移植／投与）、血管内皮細胞が生じることになる。血管内皮前駆細胞は、冠動脈疾患や下肢虚血性疾患などの重傷虚血性疾患に対する再生療法や血管再生実験などに利用されている。本発明の調製方法は、このように有用性の高い血管内皮前駆細胞を簡便且つ安価に調製することを可能にする。
本発明の第１の局面は、多能性幹細胞から血管内皮前駆細胞（EPCs）を調製する方法（以下、「本発明の調製方法」とも呼ぶ。）に関する。本発明によれば、血管内皮細胞（ECs）への分化能を有する血管内皮前駆細胞が得られる。血管内皮前駆細胞を適切な条件で分化誘導するか、或いは血管内皮前駆細胞を分化誘導に適した環境に置けば（典型的には、生体において血管内皮細胞が存在する部位又はその近傍などへの移植／投与）、血管内皮細胞が生じることになる。血管内皮前駆細胞は、冠動脈疾患や下肢虚血性疾患などの重傷虚血性疾患に対する再生療法や血管再生実験などに利用されている。本発明の調製方法は、このように有用性の高い血管内皮前駆細胞を簡便且つ安価に調製することを可能にする。
「多能性幹細胞」とは、生体を構成するすべての細胞に分化しうる能力（分化多能性）と、細胞分裂を経て自己と同一の分化能を有する娘細胞を生み出す能力（自己複製能）とを併せ持つ細胞をいう。分化多能性は、評価対象の細胞を、ヌードマウスに移植し、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）のそれぞれの細胞を含むテラトーマ形成の有無を試験することにより、評価することができる。
多能性幹細胞として、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等を挙げることができるが、分化多能性及び自己複製能を併せ持つ細胞である限り、これに限定されない。好ましくはES細胞又はiPS細胞を用いる。更に好ましくはiPS細胞を用いる。多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の細胞、特に好ましくはヒトの細胞である。従って、本発明の最も好ましい態様では、多能性幹細胞として、ヒトiPS細胞が用いられる。
ES細胞は、例えば、着床以前の初期胚、当該初期胚を構成する内部細胞塊、単一割球等を培養することによって樹立することができる（Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual， Second Edition， Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994） ;Thomson，J. A. et al.，Science，282， 1145-1147（1998））。初期胚として、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を用いてもよい（Wilmut et al.（Nature， 385， 810（1997））、Cibelli et al. （Science， 280， 1256（1998））、入谷明ら（蛋白質核酸酵素， 44， 892 （1999））、Baguisi et al. （Nature Biotechnology， 17， 456 （1999））、Wakayama et al. （Nature， 394， 369 （1998）; Nature Genetics， 22， 127 （1999）; Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 96， 14984 （1999））、Rideout III et al. （Nature Genetics， 24， 109 （2000）、Tachibana et al. （Human Embryonic Stem Cells Derived by Somatic Cell Nuclear Transfer, Cell （2013） in press）。初期座として、単為発生胚を用いてもよい（Kim et al. （Science， 315， 482-486 （2007））、Nakajima et al. （Stem Cells， 25， 983-985 （2007））、Kim et al. （Cell Stem Cell， 1， 346-352 （2007））、Revazova et al. （Cloning Stem Cells， 9， 432-449 （2007））、Revazova et al.（Cloning Stem Cells， 10， 11-24 （2008））。上掲の論文の他、ES細胞の作製についてはStrelchenko N., et al. Reprod Biomed Online. 9: 623-629, 2004；Klimanskaya I., et al. Nature 444: 481-485, 2006；Chung Y., et al. Cell Stem Cell 2: 113-117, 2008；Zhang X., et al Stem Cells 24: 2669-2676, 2006；Wassarman, P.M. et al. Methods in Enzymology, Vol.365, 2003等が参考になる。尚、ES細胞と体細胞の細胞融合によって得られる融合ES細胞も、本発明の方法に用いられる胚性幹細胞に含まれる。
ES細胞の中には、保存機関から入手可能なもの、或いは市販されているものもある。例えば、ヒトES細胞については京都大学再生医科学研究所（例えばKhES-1、KhES-2及びKhES-3）、WiCell Research Institute、ESI BIOなどから入手可能である。
EG細胞は、始原生殖細胞を、LIF、bFGF、SCFの存在下で培養すること等により樹立することができる（Matsui et al.， Cell， 70， 841-847 （1992）、Shamblott et al.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 95 （23）, 13726-13731 （1998）、Turnpenny et al.， Stem Cells， 21（5）， 598-609， （2003））。
「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、初期化因子の導入などにより体細胞をリプログラミングすることによって作製される、多能性（多分化能）と増殖能を有する細胞である。人工多能性幹細胞はES細胞に近い性質を示す。iPS細胞の作製に使用する体細胞は特に限定されず、分化した体細胞でもよいし、未分化の幹細胞でもよい。また、その由来も特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒトやチンパンジーなどの霊長類、マウスやラットなどのげっ歯類）の体細胞、特に好ましくはヒトの体細胞を用いる。iPS細胞は、これまでに報告された各種方法によって作製することができる。また、今後開発されるiPS細胞作製法を適用することも当然に想定される。
iPS細胞作製法の最も基本的な手法は、転写因子であるOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの４因子を、ウイルスを利用して細胞へ導入する方法である（Takahashi K, Yamanaka S: Cell 126 (4), 663-676, 2006; Takahashi, K, et al: Cell 131 (5), 861-72, 2007）。ヒトiPS細胞についてはOct4、Sox2、Lin28及びNonogの４因子の導入による樹立の報告がある（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）。c-Mycを除く３因子（Nakagawa M, et al: Nat. Biotechnol. 26 (1), 101-106, 2008）、Oct3/4及びKlf4の２因子（Kim J B, et al: Nature 454 (7204), 646-650, 2008）、或いはOct3/4のみ（Kim J B, et al: Cell 136 (3), 411-419, 2009）の導入によるiPS細胞の樹立も報告されている。また、遺伝子の発現産物であるタンパク質を細胞に導入する手法（Zhou H, Wu S, Joo JY, et al: Cell Stem Cell 4, 381-384, 2009; Kim D, Kim CH, Moon JI, et al: Cell Stem Cell 4, 472-476, 2009）も報告されている。一方、ヒストンメチル基転移酵素G9aに対する阻害剤BIX-01294やヒストン脱アセチル化酵素阻害剤バルプロ酸（VPA）或いはBayK8644等を使用することによって作製効率の向上や導入する因子の低減などが可能であるとの報告もある（Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (7), 795-797, 2008; Huangfu D, et al: Nat. Biotechnol. 26 (11), 1269-1275, 2008; Silva J, et al: PLoS. Biol. 6 (10), e 253, 2008）。遺伝子導入法についても検討が進められ、レトロウイルスの他、レンチウイルス（Yu J, et al: Science 318(5858), 1917-1920, 2007）、アデノウイルス（Stadtfeld M, et al: Science 322 (5903), 945-949, 2008）、プラスミド（Okita K, et al: Science 322 (5903), 949-953, 2008）、トランスポゾンベクター（Woltjen K, Michael IP, Mohseni P, et al: Nature 458, 766-770, 2009; Kaji K, Norrby K, Pac a A, et al: Nature 458, 771-775, 2009; Yusa K, Rad R, Takeda J, et al: Nat Methods 6, 363-369, 2009）、或いはエピソーマルベクター（Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, et al: Science 324, 797-801, 2009）を遺伝子導入に利用した技術が開発されている。
iPS細胞への形質転換、即ち初期化（リプログラミング）が生じた細胞はFbxo15、Nanog、Oct/4、Fgf-4、Esg-1及びCript等の多能性幹細胞マーカー（未分化マーカー）の発現などを指標として選択することができる。選択された細胞をiPS細胞として回収する。
iPS細胞は、例えば、国立大学法人京都大学又は国立研究開発法人理化学研究所バイオリソースセンターから提供を受けることもできる。
本明細書において「分化させる」とは、特定の細胞系譜に沿って分化するように働きかけること、即ち、分化を誘導することをいう。本発明の調製方法では、多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化誘導した後、血管内皮前駆細胞を純化する。具体的には、本発明の調製方法では以下の工程（１）及び（２）が行われる。
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程
＜工程（１） 血管内皮前駆細胞への分化誘導＞
この工程では多能性幹細胞を培養し、血管内皮前駆細胞へと分化させる。換言すれば、血管内皮前駆細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が血管内皮前駆細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。典型的には、多能性幹細胞が中胚葉を介して血管内皮前駆細胞へと分化するように、以下で説明する２段階の分化誘導、即ち、多能性幹細胞を中胚葉へと分化させる工程（工程（１－１））と、得られた細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程（工程（１－２））を行う。
この工程では多能性幹細胞を培養し、血管内皮前駆細胞へと分化させる。換言すれば、血管内皮前駆細胞への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が血管内皮前駆細胞へ分化する限り、培養条件は特に限定されない。典型的には、多能性幹細胞が中胚葉を介して血管内皮前駆細胞へと分化するように、以下で説明する２段階の分化誘導、即ち、多能性幹細胞を中胚葉へと分化させる工程（工程（１－１））と、得られた細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程（工程（１－２））を行う。
工程（１－１） 中胚葉への分化
この工程では多能性幹細胞を培養し、中胚葉へと分化させる。換言すれば、中胚葉への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が中胚葉へと分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、過去の報告（例えばSriram G. et al, Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy 2015;6:261が参考になる）に準じ、GSK-3β阻害剤の存在下で培養した後、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で培養する。
この工程では多能性幹細胞を培養し、中胚葉へと分化させる。換言すれば、中胚葉への分化を誘導する条件下で多能性幹細胞を培養する。多能性幹細胞が中胚葉へと分化する限り、培養条件は特に限定されない。例えば、過去の報告（例えばSriram G. et al, Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions. Stem Cell Research & Therapy 2015;6:261が参考になる）に準じ、GSK-3β阻害剤の存在下で培養した後、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下で培養する。
「GSK-3β阻害剤の存在下」とは、GSK-3β阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。従って、GSK-3β阻害剤の存在下での培養を行うためには、GSK-3β阻害剤が添加された培地を用いればよい。GSK-3β阻害剤としてCHIR 99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、1-Azakenpaulloneを例示することができる。GSK-3β阻害剤の添加濃度の例（CHIR 99021の場合）を示すと1μM～100μM、好ましくは3μM～30μMである。GSK-3β阻害剤の存在下での培養の期間（培養期間）は例えば1日間～4日間、好ましくは1日間～2日間とする。尚、例示した化合物、即ち、CHIR99021とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
「塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の存在下」とは、bFGFが培地中に添加された条件と同義である。従って、bFGFの存在下での培養を行うためには、bFGFが添加された培地を用いればよい。bFGFの添加濃度の例を示すと5ng/mL～500ng/mL、好ましくは10ng/mL～200ng/mLである。bFGFとしては好ましくはヒトbFGF（例えばヒト組換えbFGF）を用いる。尚、bFGFは線維芽細胞増殖因子2（FGF2）とも呼ばれる。
工程（１－２） 血管内皮前駆細胞への分化
この工程では、工程（１－１）で得られた細胞を培養し、血管内皮前駆細胞へと分化させる。換言すれば、血管内皮前駆細胞への分化を誘導する条件下で培養する。血管内皮前駆細胞への分化誘導が可能な限り、培養条件は特に限定されない。例えば、分化誘導因子として骨形成因子4（BMP4）、血管内皮増殖因子（VEGF）、bFGF等を用い、血管内皮前駆細胞へと分化誘導する。
この工程では、工程（１－１）で得られた細胞を培養し、血管内皮前駆細胞へと分化させる。換言すれば、血管内皮前駆細胞への分化を誘導する条件下で培養する。血管内皮前駆細胞への分化誘導が可能な限り、培養条件は特に限定されない。例えば、分化誘導因子として骨形成因子4（BMP4）、血管内皮増殖因子（VEGF）、bFGF等を用い、血管内皮前駆細胞へと分化誘導する。
次の工程、即ち、工程（２）（血管内皮前駆細胞の純化）における剥離処理の効率や操作性等を高めるため、工程（１－２）の途中で、細胞接着性の強い培養面から細胞接着性の弱い培養面へ切り替えることが好ましい。言い換えれば、工程（１－２）の最後には細胞接着性の弱い培養面上に細胞が培養されている状態にするとよい。この態様によれば、工程（２）において不要な細胞、即ち、血管内皮前駆細胞以外の細胞を剥離し易くなる。
例えば、基底膜成分（例えばラミニン（ラミニン511など）、コラーゲン（IV型コラーゲンなど）４、エンタクチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン）又はその断片（例えばビトロネクチン-N、ラミニン（ラミニン511など）のE8断片）等が１種類又は２種類以上、培養容器（例えば培養皿、培養フラスコ、細胞培養用マイクロプレート）の表面にコートされた培養面を、「細胞接着性の強い培養面」として採用することができる。このように、「細胞接着性の強い培養面」は、細胞に対して高い接着力を示す物質を用いて構成することができる。「細胞接着性の弱い培養面」は、「細胞接着性の強い培養面」との比較において細胞接着性が弱い（即ち、細胞接着性が相対的に弱い）ものであり、「細胞接着性の強い培養面」と同様に細胞接着性の培養面である。「細胞接着性の弱い培養面」は、例えば、ゼラチン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン等を１種類又は２種類以上、培養容器の表面にコートすることで構成することができる。尚、表面コート剤の濃度（培養面上に存在することになる細胞接着性物質の密度）の差によって、細胞接着性の強弱を設けることにしてもよい。
工程（１－２）の期間（培養期間）は例えば2日間～14日間、好ましくは4日間～10日間である。
好ましい一態様では、工程（１－２）として２段階の培養、即ち、BMP4及びVEGFの存在下での培養（工程（１－２－１））と、当該培養の後に行われる、bFGF及びVEGFの存在下での培養（工程（１－２－２））を行う。この態様によれば、血管内皮前駆細胞への効率的な分化を誘導しつつ、次の工程（工程（２））の前に細胞密度が高い状態を形成することができる。細胞密度を高めておくことは、血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を大きくできる点で好ましく、血管内皮前駆細胞以外の細胞の選択的剥離に有利となる。
工程（１－２－１）における「BMP4及びVEGFの存在下」とは、BMP4及びVEGFが培地中に添加された条件と同義である。従って、BMP4及びVEGFの存在下での培養を行うためには、BMP4及びVEGFが添加された培地を用いればよい。BMP4は分化誘導因子であり、その使用によって血管内皮前駆細胞へと分化する。BMP4の添加濃度は例えば5 mg/mL～200 ng/mL、好ましくは10 mg/mL～100 mg/mLである。一方、血管誘導因子であるVEGFの添加濃度は例えば10 ng/mL～200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL～100 ng/mLとする。好ましくはヒトBMP4（例えばヒト組換えBMP4）とヒトVEGF（例えばヒト組換えVEGF）を用いる。
工程（１－２－１）の期間（培養期間）は例えば1日間～7日間、好ましくは2日間～5日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（即ち、血管内皮前駆細胞への分化誘導）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、異なる細胞への分化誘導を引き起こす。
工程（１－２－２）における「bFGF及びVEGFの存在下」とは、bFGF及びVEGFが培地中に添加された条件と同義である。従って、bFGF及びVEGFの存在下での培養を行うためには、bFGF及びVEGFが添加された培地を用いればよいbFGFの添加濃度は例えば1ng/mL～5200ng/mL、好ましくは2ng/mL～100ng/mLである。VEGFの添加濃度は例えば10 ng/mL～200 ng/mL、好ましくは20 ng/mL～100 ng/mLである。上記の工程の場合と同様に、好ましくはヒトbFGF（例えばヒト組換えbFGF）とヒトVEGF（例えばヒト組換えVEGF）を用いる。
工程（１－２－２）の期間（培養期間）は例えば1日間～7日間、好ましくは2日間～5日間である。当該培養期間が短すぎると、期待される効果（即ち、血管内皮前駆細胞への分化を誘導しつつ、細胞を増殖させること）が十分に得られない。他方、当該培養期間が長すぎると、異なる細胞への分化誘導を引き起こす。
好ましい態様では、上記の培養面の切り替え、即ち、「細胞接着性の強い培養面」から「細胞接着性の弱い培養面」へ切り替へを、工程（１－２－１）から工程（１－２－２）への切り替えと同期させる。換言すれば、工程（１－２－１）の培養に「細胞接着性の強い培養面」を用い、工程（１－２－２）の培養に「細胞接着性の弱い培養面」を用いる。この態様によれば操作が簡便化され、また、細胞ダメージを最小限に抑えることができる。
本発明を構成する各工程（工程（１）、工程（１－１）、工程（１－２）、工程（１－２－１）、工程（１－２－２））において、途中で継代培養を行ってもよい。例えばコンフルエント又はサブコンフルエントになった際に細胞の一部を採取して別の培養容器に移し、培養を継続する。分化を促進するために細胞密度を低く設定することが好ましい。例えば1×104個／cm2～1×106個／cm2程度の細胞密度で細胞を播種するとよい。細胞の回収には細胞解離液などを利用すればよい。細胞解離液としては、例えば、トリプシン-EDTA、各種コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼIV）、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ等のタンパク分解酵素を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。また、TrypLETM (Invitrogen社）、AcutaseTM（Innova Cell Technologies社）、Accumax TM（Innova Cell Technologies社）等、市販の細胞解離液を使用することにしてもよい。
培地交換や継代培養などに伴う、細胞の回収の際には、細胞死を抑制するためにY-27632等のROCK阻害剤（Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho結合キナーゼ）で予め細胞を処理しておくとよい。
本発明を構成する各工程における、その他の培養条件（培養温度など）は、動物細胞の培養において一般に採用されている条件とすればよい。即ち、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。また、基本培地として、例えば、イスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）（GIBCO社等）、MEMα培地、無血清血管内皮細胞用培地（Human Endothelial SFM(Gibco社)、Medium 200(Gibco社)等）、ハムF12培地（HamF12）（SIGMA社、Gibco社等）、ダルベッコ変法イーグル培地（D-MEM）（ナカライテスク株式会社、シグマ社、Gibco社等）、グラスゴー基本培地（Gibco社等）、RPMI1640培地、MCDB107培地（機能性ペプチド研究所）等を用いることができる。二種以上の基本培地を混合した培地、例えば、D-MEMとハムF12培地の混合培地を用いることにしてもよい。
培地に添加可能なその他の成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など）、血清代替物（Knockout serum replacement（KSR）など）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、サプリメント（例えばITS-Gサプリメント）、L-グルタミン、L-アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物、非必須アミノ酸（NEAA）、2-メルカプトエタノール、Chemically Defined Lipid Concentrate(Gibco社)を挙げることができる。
好ましい一態様では、工程（１）をXeno-free条件下で実施する。工程（１）が工程（１－１）と工程（１－２）で構成される場合はこれら二つの工程がXeno-free条件下で実施されることになる。同様に、工程（１－２）が工程（１－２－１）と工程（１－２－２）で構成される場合にはこれら二つの工程についてもXeno-free条件下で実施されることになる。Xeno-free条件下で培養する場合には、通常、無血清培地を採用し、好ましくは細胞増殖率の向上等の目的でKnockOutTM SR XenoFree Medium（Gibco社）、ITS-G、ホルモン（ヒト組換えヒドロコルチゾン等）、Chemically Defined Lipid Concentrate等を添加する。
血管内皮前駆細胞へ分化したことは、例えば、血管内皮前駆細胞マーカーの発現を指標にして判定ないし評価することができる。血管内皮前駆細胞マーカーの例を挙げると、PECAM1（CD31）、CD34、CDH5（VE-Cadherin）、FLK1（VEGFR-2）である。中でもCD34は血管内皮前駆細胞特異的であり、特に有用な血管内皮前駆細胞マーカーである。
一方、血管内皮細胞への分化を誘導した際、血管内皮細胞としての機能を示せば、血管内皮前駆細胞へ分化したことを確認できる。血管内皮細胞としての機能の評価には、Dil-Ac LDL取り込み試験、チューブフォーメーション試験を利用することができる。
＜工程（２） 血管内皮前駆細胞の純化＞
工程（１）によって血管内皮前駆細胞を含む細胞集団が得られる。工程（１）に続く工程（２）では血管内皮前駆細胞を純化する。「血管内皮前駆細胞を純化」とは、細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞の比率（即ち、存在率ないし含有率）を高めることをいう。従って、処理前に比較して処理後の方が血管内皮前駆細胞の比率が高まっていれば、当該処理は純化に該当する。純化の程度（純度）は特に限定されない。使用する細胞の状態や培養条件等によって純度は変動し得るが、工程（２）を経ることにより、例えば80％以上の純度、好ましくは90％以上の純度、更に好ましくは95％以上の純度を達成し得る。純度は以下の計算式で算出することができる。細胞数の計測には血球計算盤等を利用すればよい。
純度（％）＝（血管内皮前駆細胞の数）／（細胞集団を構成する全細胞の数）×１００
工程（１）によって血管内皮前駆細胞を含む細胞集団が得られる。工程（１）に続く工程（２）では血管内皮前駆細胞を純化する。「血管内皮前駆細胞を純化」とは、細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞の比率（即ち、存在率ないし含有率）を高めることをいう。従って、処理前に比較して処理後の方が血管内皮前駆細胞の比率が高まっていれば、当該処理は純化に該当する。純化の程度（純度）は特に限定されない。使用する細胞の状態や培養条件等によって純度は変動し得るが、工程（２）を経ることにより、例えば80％以上の純度、好ましくは90％以上の純度、更に好ましくは95％以上の純度を達成し得る。純度は以下の計算式で算出することができる。細胞数の計測には血球計算盤等を利用すればよい。
純度（％）＝（血管内皮前駆細胞の数）／（細胞集団を構成する全細胞の数）×１００
工程（２）は本発明の最大の特徴の一つであり、培養面に対する接着力が血管内皮前駆細胞とその他の細胞の間で相違するという知見に基づき、工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する。後述の実施例に示すように、血管内皮前駆細胞はその他の細胞よりも高い接着能力を示す。そこで、典型的には、接着能力の低いその他の細胞を優先的ないし選択的に剥離、除去することによって（血管内皮前駆細胞が選択的に培養系に維持されることになる）血管内皮前駆細胞の純化を図る。この場合、例えば、以下の工程（２－１）及び（２－２）を行えばよい。
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程
工程（２－１）は不要な細胞、即ち、血管内皮前駆細胞以外の細胞を選択的に除去する処理である。この処理の後、残存する細胞を工程（２－２）によって回収し、血管内皮前駆細胞を高純度で含む細胞集団を得る。
工程（２－１）の第１剥離処理では、典型的には、工程（１）で得られた細胞集団を第１剥離液へ接触させることによって細胞と培養面の間の接着力を弱めた後（細胞が剥がれやすい状態が形成される）、タッピングやピペッティング等による衝撃を与え、除去すべき不要な細胞、即ち、血管内皮前駆細胞以外の細胞を培養面から解離させる。解離した細胞を除去し、次の工程、即ち工程（２－２）を行う。「タッピング」とは、指や棒などによって培養容器の壁面等を弾くこと、或いは培養容器の上部等を把持し、軽くスナップを利かせて培養容器を壁面等に打ち付けること等によって、内容物に断続的かつ急激な衝撃を与えることをいう。
工程（２－１）に続く工程（２－２）では、第２細胞解離液を用いた同様の操作によって、残存した細胞、即ち、血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する。尚、細胞集団に対する細胞解離液の接触は、通常、瞬間的なものではなく、接触状態が一定時間維持されることになる。
工程（２－１）及び工程（２－２）によって血管内皮前駆細胞の高純度化を達成するため、例えば、以下の（ａ）～（ｄ）の中の一以上の条件を満たすように、工程（２－１）の第１剥離処理と工程（２－２）の第２剥離処理の条件を設定する。尚、第１細胞解離液及び第２細胞解離液の有効成分としては、トリプシン-EDTA、各種コラゲナーゼ（例えばコラゲナーゼIV）、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ等のタンパク分解酵素を単独で又は適宜組み合わせて用いることができる。また、TrypLETM（Invitrogen社）、AcutaseTM（Innova Cell Technologies社）、Accumax TM（Innova Cell Technologies社）等、市販の細胞解離液を使用することにしてもよい。
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が長い
（ｂ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理温度が高い
（ｃ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分濃度が高い
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強い
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が長い
（ｂ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理温度が高い
（ｃ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分濃度が高い
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強い
条件（ａ）～（ｃ）については、通常、有効成分が同一である第１細胞解離液と第２細胞解離液を用意し、第１剥離処理及び第２剥離処理を行う。従って、細胞解離液の調製が容易である。この点に関して、条件（ａ）及び（ｂ）では、有効成分を含め、同一の組成の細胞解離液を利用することができ、特に有利となる。また、条件（ａ）は、第１剥離処理と第２剥離処理の間に処理時間の差を設けるだけでよく、処理温度に差を設ける条件（ｂ）よりも簡便であり、最適な条件といえる。
一方、条件（ｃ）と条件（ｄ）は、第１細胞解離液よりも剥離効果の高い第２細胞解離液を用いる条件であり、これらの条件を採用する場合には、有効成分濃度が異なる（条件（ｃ）の場合）又は有効成分自体が異なる（条件（ｄ）の場合）、２種類の細胞解離液を用意することになる。
第１剥離処理及び第２剥離処理の最適な条件は、使用する細胞の種類や状態、細胞解離液の有効成分、又はその他の要因によって変動し得るが、本願明細書の開示事項を参考にしつつ予備実験によって設定すればよい。以下、細胞解離液の有効成分及び濃度、並びに剥離処理の処理時間及び処理温度の例を挙げる。
細胞解離液の有効成分：EDTA、トリプシン-EDTA、各種コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ
細胞解離液の有効成分濃度：EDTA：0.5 mM～500 mM、トリプシン-EDTA：0.005～0.5％、コラゲナーゼIV：0.005～0.5％、ディスパーゼ：100～2000PU/mL
剥離処理の処理時間：5秒～1時間
剥離処理の処理温度：10℃～38℃
細胞解離液の有効成分：EDTA、トリプシン-EDTA、各種コラゲナーゼ、メタロプロテアーゼ、ディスパーゼ
細胞解離液の有効成分濃度：EDTA：0.5 mM～500 mM、トリプシン-EDTA：0.005～0.5％、コラゲナーゼIV：0.005～0.5％、ディスパーゼ：100～2000PU/mL
剥離処理の処理時間：5秒～1時間
剥離処理の処理温度：10℃～38℃
条件（ａ）の場合、例えば、第２剥離処理の処理時間を第１剥離処理の処理時間の1.5倍～10倍とする。条件（ｂ）の場合、例えば、第１剥離処理を20℃～30℃で行い、第２剥離処理を30℃～38℃で行う。条件（ｃ）の場合、例えば、第２細胞解離液の有効成分濃度を、第１細胞剥離液の有効成分濃度の1.5倍～10倍とする。条件（ｄ）については、例えば、第１細胞解離液の有効成分をコラゲナーゼ又はEDTA （これらの中の二つ以上を組み合わせても良い）とし、第２細胞剥離液の有効成分をトリプシン-EDTA又はディスパーゼ（これらの中の二つ以上を組み合わせても良い）とする。
TrypLETM（Invitrogen社）、AcutaseTM（Innova Cell Technologies社）、Accumax TM（Innova Cell Technologies社）等、市販の細胞解離液を用いれば、より簡便に第１剥離処理及び第２剥離処理を行うことができる。この場合には、使用する細胞解離液の種類／数が低減されることや操作の簡便性等を考慮し、好ましくは条件（ａ）～（ｃ）のいずれか、更に好ましくは条件（ａ）又は（ｃ）、一層好ましくは条件（ａ）を採用する。
純化後の細胞（高純度の血管内皮前駆細胞）は各種用途へ利用される。また、必要に応じて維持・増殖のために培養に供される。或いは、使用時（培養に供することも、ここでの使用に該当する）まで保存される。
維持・増殖のための培養には、血管内皮前駆細胞の培養に適する限り、各種培養方法（例えば、James D. et al, Expansion and maintenance of human embryonic stem cell-derived endothelial cells by TGFbeta inhibition is Id1 dependent. Nature Biotechnology. 2010;28(2):161-6.やMien T.X. et al. Differentiation of Human Embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem cell reports. 2016;7:802-16.等の報告を参考にすればよい）を利用できる。好ましい一態様では、以下で説明する本発明の拡大培養法によって純化後の細胞を培養する。
純化後の細胞を保存する場合の保存方法は常法に従えばよい。例えば、TC protector (DSファーマバイオメディカル社)、Cell Banker (ゼノアック社)、Stem Cell Banker (ゼノアック社)、Cell Reserver One (ナカライ社)等を利用し、凍結保存する。
２．血管内皮前駆細胞の用途
本発明の第２の局面は、本発明の調製方法で得られた血管内皮前駆細胞（説明の便宜上、以下、「本発明の血管内皮前駆細胞」と呼ぶ）の用途に関する。第１の用途として、本発明の血管内皮前駆細胞を含有する細胞製剤が提供される。上記の通り、血管内皮前駆細胞は冠動脈疾患や下肢虚血疾患（バージャー病や閉塞性動脈硬化症など）などの治療への適用が期待されている。実際、血管内皮前駆細胞を用いた臨床試験も行われており、良好な成績が報告されている。本発明の細胞製剤は、血管内皮前駆細胞の投与／移植が有効とされる各種疾患の治療（再生医療）に利用され得る。
本発明の第２の局面は、本発明の調製方法で得られた血管内皮前駆細胞（説明の便宜上、以下、「本発明の血管内皮前駆細胞」と呼ぶ）の用途に関する。第１の用途として、本発明の血管内皮前駆細胞を含有する細胞製剤が提供される。上記の通り、血管内皮前駆細胞は冠動脈疾患や下肢虚血疾患（バージャー病や閉塞性動脈硬化症など）などの治療への適用が期待されている。実際、血管内皮前駆細胞を用いた臨床試験も行われており、良好な成績が報告されている。本発明の細胞製剤は、血管内皮前駆細胞の投与／移植が有効とされる各種疾患の治療（再生医療）に利用され得る。
本発明の細胞製剤は、例えば、本発明の血管内皮前駆細胞を生理食塩水や緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）などに懸濁することによって調製することができる。治療上有効量の細胞を投与できるように、一回投与分の量として例えば1×105個～1×1010個の細胞を含有させるとよい。細胞の含有量は、使用目的、対象疾患、適用対象（レシピエント）の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態などを考慮して適宜調整することができる。
細胞の保護を目的としてジメチルスルホキシド（DMSO）や血清アルブミン等を、細菌の混入を阻止することを目的として抗生物質等を、細胞の活性化、増殖又は分化誘導等を目的として各種の成分（ビタミン類、サイトカイン、成長因子、ステロイド等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等）を本発明の細胞製剤に含有させてもよい。
細胞製剤として再生医療に利用するのではなく、再生医療に用いられる材料、具体的には、移植用の血管をin vitroで構築するために本発明の血管内皮前駆細胞を用いることもできる。血管内皮前駆細胞を用いた血管の構築方法については、例えば血管再生治療（井村裕夫 監修、診断と治療社）に詳しい。
本発明の血管内皮前駆細胞を、ヒト血液脳関門モデルの構築に利用することも可能である。例えば、血管内皮前駆細胞をトランズウェルのインサート部に播種し、その裏側にペリサイト、ウェル底面にアストロサイトを播種することで、生体内の血液脳関門と同様の構造を模倣する。（Nakagawa S, Maria A. D, Nakao S, Honda M, Hayashi M, Nakaoke R, Kataoka Y, Niwa M. Cellular and Molecular Neurobiology. 27:687-694, 2007）。
３．血管内皮前駆細胞の拡大培養
本発明の第３の局面は血管内皮前駆細胞の拡大培養法に関する。「拡大培養」とは、細胞の性質を維持しつつ、細胞数を増加させることをいう。血管内皮前駆細胞を拡大培養に供すれば、その性質（特に血管内皮細胞への分化能）を維持しつつ、血管内皮前駆細胞を増殖させることができる。本発明の拡大培養法によると高い増殖率が得られ、効率的な拡大培養が可能になる。従って、臨床用途や研究用途等に有用な血管内皮前駆細胞を大量に用意する手段として本発明は有用であり、血管内皮前駆細胞の安定供給に寄与する。
本発明の第３の局面は血管内皮前駆細胞の拡大培養法に関する。「拡大培養」とは、細胞の性質を維持しつつ、細胞数を増加させることをいう。血管内皮前駆細胞を拡大培養に供すれば、その性質（特に血管内皮細胞への分化能）を維持しつつ、血管内皮前駆細胞を増殖させることができる。本発明の拡大培養法によると高い増殖率が得られ、効率的な拡大培養が可能になる。従って、臨床用途や研究用途等に有用な血管内皮前駆細胞を大量に用意する手段として本発明は有用であり、血管内皮前駆細胞の安定供給に寄与する。
本発明の拡大培養法では、「血管内皮前駆細胞を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）と上皮成長因子（EGF）に加え、ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤の存在下で培養する」という特徴的な工程が行われる。「塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）と上皮成長因子（EGF）に加え、ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤の存在下」とは、bFGF、EGF、ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤が培地中に添加された条件と同義である。前２者（bFGF、EGF）は血管内皮前駆細胞や血管内皮細胞を培養する際に一般的に用いられる因子である。bFGFの添加濃度の例を示すと5 ng/mL～200 ng/mL、好ましくは10 ng/mL～50 ng/mLであり、EGFの添加濃度の例を示すと5 ng/mL～500 ng/mL、好ましくは10 ng/mL～200 ng/mLである。一方、後３者（ROCK阻害剤、GSK-3β阻害剤及びTGF-β受容体阻害剤）は本発明に特徴的であり、即ち、これら３種の化合物の組合せを用いる点が本発明の根幹をなす。
理論に拘泥する訳ではないが、ROCK阻害剤には細胞死を抑制し、細胞増殖能を高める効果を期待できる。また、GSK-3β阻害剤は wnt経路活性化作用を持ち、wnt/βカテニンシグナルを介して細胞増殖能を高める効果を期待できる。TGF-β受容体阻害剤は細胞増殖抑制因子として知られるTGFβシグナルを抑制することによって細胞増殖能を高める効果を期待できる。これら３種の化合物の併用し、その相乗効果によって、血管内皮前駆細胞の増殖能の飛躍的な向上を図る。
ROCK阻害剤として例えばY-27632を用いることができる。一方、GSK-3β阻害剤としてCHIR 99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin、1-Azakenpaulloneを例示することができる。TGF-β受容体阻害剤の例はA 83-01、SB431542、SB-505124、SB525334、D4476、ALK5 inhibitor、LY2157299、LY364947、GW788388、RepSoxである。
ROCK阻害剤の添加濃度の例（Y-27632の場合）を示すと1μM～50μM、好ましくは3μM～30μMである。GSK-3β阻害剤の添加濃度の例（CHIR 99021の場合）を示すと0.1μM～100μM、好ましくは1μM～30μMである。TGF-β受容体阻害剤の添加濃度の例（A 83-01の場合）を示すと0.05μM～20μM、好ましくは0.1μM～10μMである。
尚、例示した化合物、即ち、Y-27632、CHIR99021、A 83-01とは異なる化合物を使用する場合の添加濃度については、使用する化合物の特性と、例示した化合物の特性の相違（特に活性の相違）を考慮すれば、当業者であれば上記濃度範囲に準じて設定することができる。また、設定した濃度範囲が適切であるか否かは、後述の実施例に準じた予備実験によって確認することができる。
その他の培養条件は常法（例えば、Ikuno T. et al, Efficient and robust differentiation of endothelial cells from human induced pluripotent stem cells via lineage control with VEGF and cyclic AMP.PLOS ONE. 2017;12:3やLi S. et al, Inhibition of cell growth and induction of inflammation by endosulfan in HUVEC-C cells. Environmental Toxicology. 2016;12:1785-1795等の報告が参考になる）に従えばよく、即ち、一般的な培地を使用し（第１の局面における培地の説明を参照）、例えば37℃、5%CO2の環境下で培養すればよい。
培地に添加可能なその他の成分の例として、血清（ウシ胎仔血清、ヒト血清、羊血清など）、血清代替物（Knockout serum replacement（KSR）など）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシンなど）、サプリメント（例えばITS-Gサプリメント）、L-グルタミン、L-アスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩n水和物、非必須アミノ酸（NEAA）、2-メルカプトエタノール、Chemically Defined Lipid Concentrateを挙げることができる。
好ましい一態様では、上記の工程をXeno-free条件下で実施する。Xeno-free条件下で培養する場合には、通常、無血清培地を採用し、好ましくは細胞増殖率の向上等の目的でKnockOutTM SR XenoFree Medium、ホルモン（ヒト組換えヒドロコルチゾン等）、ITS-G、Chemically Defined Lipid Concentrate等を添加する。
必要に応じて継代する。通常、コンフルエント又はサブコンフルエントな状態になった際に継代し、細胞の更なる増殖、維持を図る。継代培養の操作等は第１の局面の場合と同様であり、その詳細な説明を省略する。
本発明の拡大培養法に供する血管内皮前駆細胞は特に限定されない。多能性幹細胞を分化誘導して得られた血管内皮前駆細胞の他、生体から事前に採取された血管内皮前駆細胞又はそれを生体外で維持又は増殖させた細胞（採取直後の細胞、採取後に保存しておいた細胞、採取後に維持培養した細胞、採取後に培養し、増殖させた細胞等）に対して本発明の拡大培養法を適用することができる。
多能性幹細胞を分化誘導して得られた血管内皮前駆細胞を用いる場合の分化誘導法は特に限定されない。従って、既報の分化誘導法（例えば、Lian X. et al, Efficient differentiation of human pluripotent stem cells to endothelial progenitors via small-molecule activation of WNT signaling. Stem cell reports. 2014;3(5):804-16.やMien T.X. et al. Differentiation of Human Embryonic stem cells to endothelial progenitor cells on laminins in defined and xeno-free systems. Stem cell reports, 2016;7:802-16.等の報告を参照）はもとより、今後開発される分化誘導法によって調製された血管内皮前駆細胞を本発明の拡大培養法に供することができる。「多能性幹細胞」とは、上記本発明の調製方法の説明において定義した通りであり、胚性幹細胞（ES細胞）、胚性生殖細胞（EG細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）等が多能性幹細胞に該当する。多能性幹細胞として、好ましくはES細胞又はiPS細胞が用いられ、更に好ましくはiPS細胞（特に好ましくはヒトiPS細胞）が用いられる。
好ましい一態様としては、上記本発明の調製方法で得られた血管内皮前駆細胞に対して本発明の拡大培養法を適用する。即ち、特徴的な純化工程を経て調製された、高純度の多能性幹細胞由来血管内皮前駆細胞を拡大培養し、各種用途（特に医療用途）に適した高純度の血管内皮前駆細胞を得る。
生体から事前に採取された血管内皮前駆細胞を用いる場合の生体は典型的にはヒトである。例えば、血管内皮前駆細胞の移植／移入による治療効果が期待される疾患、例えば、冠動脈疾患や下肢虚血疾患（バージャー病や閉塞性動脈硬化症など）の患者由来の血管内皮前駆細胞を本発明の拡大培養法に供することができる。
拡大培養後の細胞は、上記本発明の調製方法で得られた細胞と同様、各種用途へ利用される（上記の項目２．の欄を参照）。直ぐに使用しない場合には保存しておけばよい。細胞の保存方法については第１の局面での説明が援用される。
多能性幹細胞から分化誘導した血管内皮前駆細胞を純化する方法の開発を目指し、以下の実験を行った。また、血管内皮前駆細胞の拡大培養に関して検討を加えた。
１．方法
（１）培養面のコート
ゼラチン: 0.1%ゼラチン溶液を37℃で1時間もしくは4℃で一晩静置した。
ビトロネクチン-N (VTN-N): 1μg/cm2となるようD-PBS (-) で希釈し、37℃で1時間～2時間静置した。
フィブロネクチン: 1μg/cm2となるようD-PBS (-) で希釈し、37℃で1時間もしくは4℃で一晩静置した。
（１）培養面のコート
ゼラチン: 0.1%ゼラチン溶液を37℃で1時間もしくは4℃で一晩静置した。
ビトロネクチン-N (VTN-N): 1μg/cm2となるようD-PBS (-) で希釈し、37℃で1時間～2時間静置した。
フィブロネクチン: 1μg/cm2となるようD-PBS (-) で希釈し、37℃で1時間もしくは4℃で一晩静置した。
（２）ヒト生体由来細胞の培養
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVECs) はScienCell社から購入し、ECM培地 (ScienCell) を用いて培養を行った。継代は3日に一度行い、培地交換は継代してから2日目に行った。また、培養にはフィブロネクチンコート培養皿を用いた。細胞播種数は5,000個/cm2とした。
ヒト臍帯静脈内皮細胞 (Human Umbilical Vein Endothelial Cells：HUVECs) はScienCell社から購入し、ECM培地 (ScienCell) を用いて培養を行った。継代は3日に一度行い、培地交換は継代してから2日目に行った。また、培養にはフィブロネクチンコート培養皿を用いた。細胞播種数は5,000個/cm2とした。
（３）ヒトiPS細胞の培養
ヒトの臍帯血にエピソーマルベクター (pCXLE) を用いて5因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28）を導入することで樹立された610B1 株 (京都大学で樹立) を用いて実験を行なった。610B1株はEssential 8 flex medium (Gibco) を用いて、5% CO2/95% air 条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。610B1株の継代時の剥離液には0.5 M EDTA (pH 8.0) またはTrypLETM Select (Gibco) を用いた。剥離にTrypLETM Selectを用いた場合、継代直後に10μM Y-27632を添加して翌日培地交換をした。また、VTN-Nをコートした培養皿上で培養を行った。
ヒトの臍帯血にエピソーマルベクター (pCXLE) を用いて5因子（Oct3/4, Sox2, Klf4, L-Myc, Lin28）を導入することで樹立された610B1 株 (京都大学で樹立) を用いて実験を行なった。610B1株はEssential 8 flex medium (Gibco) を用いて、5% CO2/95% air 条件下CO2インキュベーター中37℃にて培養した。610B1株の継代時の剥離液には0.5 M EDTA (pH 8.0) またはTrypLETM Select (Gibco) を用いた。剥離にTrypLETM Selectを用いた場合、継代直後に10μM Y-27632を添加して翌日培地交換をした。また、VTN-Nをコートした培養皿上で培養を行った。
（４）ヒト iPS 細胞の血管内皮前駆細胞への分化
細胞を2×104個 / cm2の密度でVTN-Nコート培養皿上に播種し、Essential 8 Flex mediumで24時間培養した。その後、modified DMEM/F12 (450 mmol/Lモノチオグリセロール、50μg/mL L-アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩n水和物、1/10 ITS、 2 mM Gluta-MAX、0.1% chemically defined concentrate、１% ペニシリン-ストレプトマイシン) に5μMのCHIR99021を添加した培地で1日培養した。その後、modified DMEM / F12に50 ng/mLのbFGFを添加した培地で1日培養した。その後、modified DMEM/F12に50 ng/mLのVEGFおよび25 ng/mLのBMP4を添加した培地で3日間培養した。この間、毎日培地交換を行った。5日目に、10μMのY-27632を1時間処理した細胞をTrypLTME Select（Gibco）で解離させ、3.5×104細胞/cm2で新しいゼラチンをコートした培養皿に継代し、modified Human endothelial SFM ｛Human Endothelial SFM (Gibco) ＋5% knockout serum replacement (Gibco)｝に50 ng/mLのVEGFと10 ng/mLのbFGFを添加した培地、もしくはmodified medium 200 ｛medium 200 (Gibco)＋5% knockout serum replacement XenoFree Medium (Gibco)＋1/10 ITS｝ に2.5μMのHydrocortisone、50 ng/mLのVEGFと10 ng/mLのbFGFを添加した培地にて分化誘導を行った。この間、毎日培地交換した。
細胞を2×104個 / cm2の密度でVTN-Nコート培養皿上に播種し、Essential 8 Flex mediumで24時間培養した。その後、modified DMEM/F12 (450 mmol/Lモノチオグリセロール、50μg/mL L-アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩n水和物、1/10 ITS、 2 mM Gluta-MAX、0.1% chemically defined concentrate、１% ペニシリン-ストレプトマイシン) に5μMのCHIR99021を添加した培地で1日培養した。その後、modified DMEM / F12に50 ng/mLのbFGFを添加した培地で1日培養した。その後、modified DMEM/F12に50 ng/mLのVEGFおよび25 ng/mLのBMP4を添加した培地で3日間培養した。この間、毎日培地交換を行った。5日目に、10μMのY-27632を1時間処理した細胞をTrypLTME Select（Gibco）で解離させ、3.5×104細胞/cm2で新しいゼラチンをコートした培養皿に継代し、modified Human endothelial SFM ｛Human Endothelial SFM (Gibco) ＋5% knockout serum replacement (Gibco)｝に50 ng/mLのVEGFと10 ng/mLのbFGFを添加した培地、もしくはmodified medium 200 ｛medium 200 (Gibco)＋5% knockout serum replacement XenoFree Medium (Gibco)＋1/10 ITS｝ に2.5μMのHydrocortisone、50 ng/mLのVEGFと10 ng/mLのbFGFを添加した培地にて分化誘導を行った。この間、毎日培地交換した。
（５）EPCsの純化
10μMのY-27632を1時間処理した分化8日目の細胞をTrypLETM Select (Gibco) で45～60秒間処理し、EPCs以外の細胞 (Extra cells) をある程度剥がし、培養皿を数回弾くように叩く (タッピングする) ことで完全にExtra cellsを剥がした。この時点で、培養皿の一番端の細胞が剥がれにくい場合、培養皿の端の細胞を一周円を描くように吸引した。その後PBSで3回以上洗い、再びTrypLETM Selectで6～12分間処理しEPCsを剥離した後、遠沈管に回収し、遠心操作 (1000rpm, 5min) を経て新しい培養皿に再播種した。
10μMのY-27632を1時間処理した分化8日目の細胞をTrypLETM Select (Gibco) で45～60秒間処理し、EPCs以外の細胞 (Extra cells) をある程度剥がし、培養皿を数回弾くように叩く (タッピングする) ことで完全にExtra cellsを剥がした。この時点で、培養皿の一番端の細胞が剥がれにくい場合、培養皿の端の細胞を一周円を描くように吸引した。その後PBSで3回以上洗い、再びTrypLETM Selectで6～12分間処理しEPCsを剥離した後、遠沈管に回収し、遠心操作 (1000rpm, 5min) を経て新しい培養皿に再播種した。
（６）分化細胞の培養
純化後の細胞はmodified Human endothelial SFMに10 ng/mLのEGFと20 ng/mLのbFGFにDMSO (DMSO群) もしくは10μMのY-27632、0.5μMのA 83-01、3μMのCHIR99021 (YAC群) を加えた培地で培養を行った。Xeno-free条件における培養にはmodified medium 200に2.5μMのヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）、10 ng/mLのEGFと20 ng/mLのbFGFを添加した培地にDMSOもしくはYACを添加したものを用いた。培地交換は播種してから1日目、3日目において行った。また、継代は3～5日間隔で行った。継代時はPBSで一回洗浄した後37℃においてTrypLETM Selectで5分以上処理し、細胞を剥離させた。その後、培地で細胞を15 mL チューブもしくは50 mLチューブに回収し、1,000 rpmで5分間遠心した。その後、培地を用いて再懸濁させ、VTN-Nをコートした培養皿に1.5×104 個/cm2で再播種した。細胞数のカウントはトリパンブルー染色を行い、Countess II (Invitrogen) で自動計測した。
純化後の細胞はmodified Human endothelial SFMに10 ng/mLのEGFと20 ng/mLのbFGFにDMSO (DMSO群) もしくは10μMのY-27632、0.5μMのA 83-01、3μMのCHIR99021 (YAC群) を加えた培地で培養を行った。Xeno-free条件における培養にはmodified medium 200に2.5μMのヒドロコルチゾン（Hydrocortisone）、10 ng/mLのEGFと20 ng/mLのbFGFを添加した培地にDMSOもしくはYACを添加したものを用いた。培地交換は播種してから1日目、3日目において行った。また、継代は3～5日間隔で行った。継代時はPBSで一回洗浄した後37℃においてTrypLETM Selectで5分以上処理し、細胞を剥離させた。その後、培地で細胞を15 mL チューブもしくは50 mLチューブに回収し、1,000 rpmで5分間遠心した。その後、培地を用いて再懸濁させ、VTN-Nをコートした培養皿に1.5×104 個/cm2で再播種した。細胞数のカウントはトリパンブルー染色を行い、Countess II (Invitrogen) で自動計測した。
（７）Cell Titer Glo 2.0 アッセイ
Cell Titer Glo 2.0 アッセイは送付マニュアルに従い行った。発光度はSynergy HTX Gen5にてGainをオートにして測定した。また、測定には分化11日目の細胞を48ウェルプレートに0.5×103個/cm2で播種し、3日間培養した細胞を用いた。
Cell Titer Glo 2.0 アッセイは送付マニュアルに従い行った。発光度はSynergy HTX Gen5にてGainをオートにして測定した。また、測定には分化11日目の細胞を48ウェルプレートに0.5×103個/cm2で播種し、3日間培養した細胞を用いた。
（８）血管新生アッセイ（チューブフォーメーションアッセイ）
分化8日目に選択的に取得した内皮細胞を300μLのマトリゲルがコートされた24ウェルプレートに7.5×104個 (通常条件時) もしくは1×105個 (Xeno-free条件時) 播種した。培地としてmodified Human Endothelial SFMに50 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのEGF、20 ng/mLのbFGFを添加したもの (通常条件時)、もしくはmodified medium 200に2.5μMのHydrocortisoneと50 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのEGF、20 ng/mLのbFGFを添加したもの (Xeno-free条件時) を用いた。20時間経過後、終濃度2μMのCalcein-AM (生細胞観察試薬) を30分間反応させ、細胞形態を顕微鏡にて観察した。8日目以降の細胞は上記と同じ条件で0.5×105～1×105個の細胞を播種した。なお、20時間の培養には、それぞれの条件において直前まで維持培養に用いていた培地 (成長因子、低分子化合物を含む) に50 ng/mLのVEGFを新たに添加したものを用いた。
分化8日目に選択的に取得した内皮細胞を300μLのマトリゲルがコートされた24ウェルプレートに7.5×104個 (通常条件時) もしくは1×105個 (Xeno-free条件時) 播種した。培地としてmodified Human Endothelial SFMに50 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのEGF、20 ng/mLのbFGFを添加したもの (通常条件時)、もしくはmodified medium 200に2.5μMのHydrocortisoneと50 ng/mLのVEGF、10 ng/mLのEGF、20 ng/mLのbFGFを添加したもの (Xeno-free条件時) を用いた。20時間経過後、終濃度2μMのCalcein-AM (生細胞観察試薬) を30分間反応させ、細胞形態を顕微鏡にて観察した。8日目以降の細胞は上記と同じ条件で0.5×105～1×105個の細胞を播種した。なお、20時間の培養には、それぞれの条件において直前まで維持培養に用いていた培地 (成長因子、低分子化合物を含む) に50 ng/mLのVEGFを新たに添加したものを用いた。
（９）免疫染色法
96ウェルプレート上の細胞を室温において4％パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、グリシン含有PBSで2回洗浄後、室温で25分間、0.1％のトリトンx-100を含むPBSで透過処理した。5％ロバ血清を用いて室温で20分間ブロッキングした後、一次抗体を室温で2時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、室温で二次抗体を200倍希釈で60分間反応させた。この時各染色試薬であるDAPIも同時に反応 (終濃度1μg/mL) させた。その後3回PBSで洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステム (パーキンエルマー社) にて解析した。CD31及びCD144陽性細胞の割合は輝度が一定以上ある細胞/全細胞数をオペレッタの解析システムにより自動算出した。1ウェルにおける6視野の平均陽性細胞数を算出し、それを3ウェル分 (n=3) 行った。
96ウェルプレート上の細胞を室温において4％パラホルムアルデヒド中で15分間固定し、グリシン含有PBSで2回洗浄後、室温で25分間、0.1％のトリトンx-100を含むPBSで透過処理した。5％ロバ血清を用いて室温で20分間ブロッキングした後、一次抗体を室温で2時間反応させた。PBSで3回洗浄した後、室温で二次抗体を200倍希釈で60分間反応させた。この時各染色試薬であるDAPIも同時に反応 (終濃度1μg/mL) させた。その後3回PBSで洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステム (パーキンエルマー社) にて解析した。CD31及びCD144陽性細胞の割合は輝度が一定以上ある細胞/全細胞数をオペレッタの解析システムにより自動算出した。1ウェルにおける6視野の平均陽性細胞数を算出し、それを3ウェル分 (n=3) 行った。
（１０）アセチル化LDL取り込み試験
分化10日目の細胞にDilで標識されたアセチル化LDLを終濃度10μg/mLで5時間反応させ、その後、Hoechist33342を30分反応させ、培地で4回洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて解析した。アセチル化LDL陽性細胞の割合は輝度が一定以上ある細胞/全細胞数をオペレッタの解析システムにより自動算出した。1ウェルにおける6視野の平均陽性細胞数を算出し、それを3ウェル分 (n＝3) 行った。
分化10日目の細胞にDilで標識されたアセチル化LDLを終濃度10μg/mLで5時間反応させ、その後、Hoechist33342を30分反応させ、培地で4回洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて解析した。アセチル化LDL陽性細胞の割合は輝度が一定以上ある細胞/全細胞数をオペレッタの解析システムにより自動算出した。1ウェルにおける6視野の平均陽性細胞数を算出し、それを3ウェル分 (n＝3) 行った。
（１１）β-ガラクトシダーゼの検出
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal (Dojindo)を用いて送付マニュアルに従ってβ-ガラクトシダーゼを検出した。96ウェルプレートに細胞を播種し、3日間培養した後、培地で1回洗浄し、Barifomycin A1 working solutionを1000倍希釈した培地 (50μl) 中で1時間反応させた。その後それぞれのウェルにSPiDER β-Gal working solution (1/1000量) と Hoechist 33342 (終濃度10μg/mL) を添加した培地 (50μl) を加え、30分培養した。その後、培地で2回洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて解析した。β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合は輝度が一定以上ある細胞/全細胞数をオペレッタの解析システムにより自動算出した。1ウェルにおける6視野の平均陽性細胞数を算出し、それを3ウェル分 (n＝3) 行った。
Cellular Senescence Detection Kit - SPiDER-βGal (Dojindo)を用いて送付マニュアルに従ってβ-ガラクトシダーゼを検出した。96ウェルプレートに細胞を播種し、3日間培養した後、培地で1回洗浄し、Barifomycin A1 working solutionを1000倍希釈した培地 (50μl) 中で1時間反応させた。その後それぞれのウェルにSPiDER β-Gal working solution (1/1000量) と Hoechist 33342 (終濃度10μg/mL) を添加した培地 (50μl) を加え、30分培養した。その後、培地で2回洗浄し、オペレッタハイコンテンツイメージングシステムにて解析した。β-ガラクトシダーゼ陽性細胞の割合は輝度が一定以上ある細胞/全細胞数をオペレッタの解析システムにより自動算出した。1ウェルにおける6視野の平均陽性細胞数を算出し、それを3ウェル分 (n＝3) 行った。
（１２）RNA 抽出
Agencourt（登録商標）RNAdvanceTM Tissue Kitの添付マニュアルに従い抽出した。
Agencourt（登録商標）RNAdvanceTM Tissue Kitの添付マニュアルに従い抽出した。
（１３）逆転写反応
相補的DNA (cDNA)の合成は、ReverTra Ace（登録商標）qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
相補的DNA (cDNA)の合成は、ReverTra Ace（登録商標）qPCR RT Master Mixを使用し、添付マニュアルに従い行った。
（１４）RT-q PCR法
RT-q PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてHPRTを用いて補正した
RT-q PCRはKAPA SYBR Fast qPCR Kitを用い、cDNAを鋳型にして、反応は添付マニュアルに従い行った。結果は内在性コントロールとしてHPRTを用いて補正した
本検討で使用したマーカー遺伝子の特徴を以下に示す。
PECAM1 (CD31)：代表的な血管内皮細胞マーカー
CD34：造血系細胞、血管内皮前駆細胞マーカー
CDH5 (VE-Cadherin)：カドヘリンファミリーに属する接着分子であり、血管内皮細胞に発現する
vWF：代表的な血管内皮細胞マーカー
FLK1：代表的な中胚葉～血管内皮細胞マーカー
OCT4：代表的な未分化マーカー
BRACHYURY：代表的な中胚葉マーカー
PECAM1 (CD31)：代表的な血管内皮細胞マーカー
CD34：造血系細胞、血管内皮前駆細胞マーカー
CDH5 (VE-Cadherin)：カドヘリンファミリーに属する接着分子であり、血管内皮細胞に発現する
vWF：代表的な血管内皮細胞マーカー
FLK1：代表的な中胚葉～血管内皮細胞マーカー
OCT4：代表的な未分化マーカー
BRACHYURY：代表的な中胚葉マーカー
（１５）フローサイトメトリーによる純度の測定
純化後のEPCs(分化14日目)を懸濁した培地が入った15 mLチューブを100×gで5分間遠心し、培地を吸引した。その後、1 mLの4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。100×gで5分間遠心し、4%パラホルムアルデヒドを吸引し、冷やしたメタノールを用いて10分間室温にて透過処理を行なった。固定した細胞を100×gで5分間遠心し、5 mLのFlow Cytometry Staining Bufferにて再懸濁し、100×gで5分間遠心した。Flow Cytometry Staining Buffer を吸引した後に、50μLのFlow Cytometry Staining BufferにFITC-PECAM1 (10倍希釈)およびPE-CD34 (10倍希釈) を添加した溶液を添加し、1.5 mLチューブに移し、1時間4℃で回転させた。その後、100×gで4℃で5分間遠心し、1回Flow Cytometry Staining Bufferで洗浄し、500 μLのFlow Cytometry Staining Bufferに懸濁させ、CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc.) にて解析した。
尚、以下の抗体を使用した。
PE-CD34抗体（Beckman Coulter, Inc. IM1459U）
FITC-PECAM1（Beckman Coulter, Inc. IM1431U）
純化後のEPCs(分化14日目)を懸濁した培地が入った15 mLチューブを100×gで5分間遠心し、培地を吸引した。その後、1 mLの4%パラホルムアルデヒドで10分間固定した。100×gで5分間遠心し、4%パラホルムアルデヒドを吸引し、冷やしたメタノールを用いて10分間室温にて透過処理を行なった。固定した細胞を100×gで5分間遠心し、5 mLのFlow Cytometry Staining Bufferにて再懸濁し、100×gで5分間遠心した。Flow Cytometry Staining Buffer を吸引した後に、50μLのFlow Cytometry Staining BufferにFITC-PECAM1 (10倍希釈)およびPE-CD34 (10倍希釈) を添加した溶液を添加し、1.5 mLチューブに移し、1時間4℃で回転させた。その後、100×gで4℃で5分間遠心し、1回Flow Cytometry Staining Bufferで洗浄し、500 μLのFlow Cytometry Staining Bufferに懸濁させ、CytoFLEX (Beckman Coulter, Inc.) にて解析した。
尚、以下の抗体を使用した。
PE-CD34抗体（Beckman Coulter, Inc. IM1459U）
FITC-PECAM1（Beckman Coulter, Inc. IM1431U）
（１６）細胞の凍結融解
分化細胞の凍結はTC Protector、CELLBANKER、STEM-CELLBANKER (DMSO含有)もしくはCell Reservoir One (DMSO含有)を用いて行なった。各保存液にて再懸濁後、-80℃のディープフリーザーにて1時間凍結した。融解時は37℃の温浴にて半融解させ、あらかじめ温めておいた15 mLチューブもしくは50 mLチューブに入った10 mLの培地の中から1 mLを取り、半融解の細胞懸濁液に注ぎ、完全に融解させた後、チューブに戻し、100×gで5分間遠心した。その後、培地を吸引した後に新しい培地で懸濁し、その後の実験に使用した。解凍した細胞を播種する際には2×104個/cm2の細胞を播種した。
分化細胞の凍結はTC Protector、CELLBANKER、STEM-CELLBANKER (DMSO含有)もしくはCell Reservoir One (DMSO含有)を用いて行なった。各保存液にて再懸濁後、-80℃のディープフリーザーにて1時間凍結した。融解時は37℃の温浴にて半融解させ、あらかじめ温めておいた15 mLチューブもしくは50 mLチューブに入った10 mLの培地の中から1 mLを取り、半融解の細胞懸濁液に注ぎ、完全に融解させた後、チューブに戻し、100×gで5分間遠心した。その後、培地を吸引した後に新しい培地で懸濁し、その後の実験に使用した。解凍した細胞を播種する際には2×104個/cm2の細胞を播種した。
２．結果・考察
（１）EPCsへの分化誘導
まず我々は過去の報告 (Sriram G. et al, Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions, Stem Cell Research & Therapy. 2015;6:261) をもとに、1日目まで5μMのCHIR99021で処理し、2日目まで50 ng/mlのbFGFで処理することで中胚葉へと分化誘導し、分化2日目から5日目において25 ng/mLのBMP4と50 ng/mLのVEGFでEPCsへの方向付けを行なった（図１Ａ）。なお、培地はmodified DMEM/F12を用いた。
（１）EPCsへの分化誘導
まず我々は過去の報告 (Sriram G. et al, Efficient differentiation of human embryonic stem cells to arterial and venous endothelial cells under feeder- and serum-free conditions, Stem Cell Research & Therapy. 2015;6:261) をもとに、1日目まで5μMのCHIR99021で処理し、2日目まで50 ng/mlのbFGFで処理することで中胚葉へと分化誘導し、分化2日目から5日目において25 ng/mLのBMP4と50 ng/mLのVEGFでEPCsへの方向付けを行なった（図１Ａ）。なお、培地はmodified DMEM/F12を用いた。
その後、分化5日目から分化8日目において10 ng/mLのbFGFと50 ng/mLのVEGFを添加したmodified human endothelial SFM中でさらに成熟したEPCsへと分化誘導した。分化前 (iPSCs)、分化2日目、5日目、8日目の細胞の遺伝子発現量をRT-qPCRにて解析したところ、未分化マーカーであるOCT4が経時的に下がり、中胚葉マーカーであるBRACHYURYは分化2日目でピークとなった。また、血管内皮前駆細胞マーカーであるCD34は5日目でピークになり、成熟血管内皮細胞マーカーであるPECAM1 (CD31) が5日目、8日目で著しく上昇していることから、本プロトコールによってEPCsへの分化誘導が進んでいることが確認できた（図１Ｂ）。
分化8日目で明らかに形態が異なる2種類のポピュレーションが観察された。一つは典型的な内皮細胞の特徴である紡錘形の細胞であり、もう一つの細胞 (Extra cells) はそれとは明らかに異なる形態を取っていた（図１Ｃ）。我々は2つの細胞群で接着能力に差があることを利用し、先にExtra cellsのみを剥がし、その後EPCsを剥がし継代するという手法を編み出した（図１Ｃ、図２Ａ）。
（２）血管内皮前駆細胞の純化
37℃においてTrypLETM Selectで45～60秒間処理し、extra cellsが剥がれてきたところで培養皿を数回タッピングし、extra cellsを完全に剥離した。その後3回以上PBSで洗い、接着している紡錘形の細胞を再びTrypLETM Selectで剥離し、新しい培養皿に播種した（図２Ａ）。
37℃においてTrypLETM Selectで45～60秒間処理し、extra cellsが剥がれてきたところで培養皿を数回タッピングし、extra cellsを完全に剥離した。その後3回以上PBSで洗い、接着している紡錘形の細胞を再びTrypLETM Selectで剥離し、新しい培養皿に播種した（図２Ａ）。
続いて分化8日目、分化10日目の細胞(Non Purified EPCs: NP-EPCs)と純化した細胞 (Purified EPCs: P-EPCs) のタンパク質発現を免疫染色法によって検討したところ、CD31、VE-Cadherinの細胞膜上への局在が確認された。さらに、血管内皮前駆細胞マーカーであるCD34の発現も確認された。また、NP-EPCsではCD31、VE-Cadherin、CD34が発現していない細胞 (Extra cells) が存在したが、セレクション後の細胞は一面の細胞が血管内皮(前駆)細胞マーカーを発現していたことから、NP-EPCsと比較してP-EPCsは高純度であることが確認された（図２Ｃ）。続いて実際にどれほど純化されているかを確認するため、CD31、VE-Cadherin、CD34の陽性細胞数をCD31、CD144、CD34の発現を指標に算出したところ、NP-EPCsと比較してP-EPCsで格段に高い値を示した。P-EPCsの純度は90％以上と推定された。一方、分化14日目の純化細胞（P-EPCs）の純度をフローサイトメトリーで確認した結果、その純度は98.45%であった。即ち、極めて高純度の細胞が得られていた（図７）。
続いてP-EPCsが血管内皮細胞としての機能を持つかどうかを確認するため、アセチル化LDLの取り込み試験を行った。その結果、大部分の細胞がアセチル化LDLの取り込み能を保持していた（図２Ｅ）。続いて、マトリゲルを利用したチューブフォーメーションアッセイを行なったところ、血管様構造が観察された（図２Ｅ）。以上からP-EPCsは血管内皮細胞としての機能を有していることが確認できた。
一方、別のiPS細胞（606A1株及び648A1株）から同様の方法で分化させたEPCsについても純化した場合（P）と純化していない場合（NP）の間でタンパク質発現を比較した結果、純化によって高純度の細胞が得られていることが確認され（図８Ａ）、汎用性の高さが裏付けられた。また、606A1株由来のEPCsと648A1株由来のEPCsは、アセチル化LDLの取り込み能を保持しているとともに（図８Ｂ）、チューブフォーメーションアッセイでは血管様構造の形成能を示し（図８Ｃ）、血管内皮細胞としての機能を発揮した。
（３）Xeno-free条件での高純度EPCsの作製
続いて血管内皮前駆細胞が再生医療への応用が期待されていることから、異種由来成分不含 (Xeno-free) 条件での分化誘導を試みた。具体的には、5日目から8日目までの培養に用いる培地をmodified human endothelial SFMからmodified Medium 200にヒドロコルチゾンを添加したものに変更し、コート剤をゼラチンからVTN-Nに変更した（図３Ａ）。この条件下において分化8日目に純化作業を経たXF-EPCsは通常プロトコールと比較して血管内皮細胞関連遺伝子群の発現量がほぼ同等であった（図３Ｂ）。さらに、CD31、CD144、CD34の発現が確認され、純度も通常プロトコールと同様に高値であることがわかった（図３Ｃ）。また、血管内皮細胞の機能の一つであるアセチル化LDLの取り込み能（図３Ｄ）やチューブ形成能も有していた（図３Ｅ）。以上よりXeno-free条件下においてもEPCsへの分化が可能であるとともに、細胞種間の接着能力の差を利用した純化法が適用可能であることが示された。
続いて血管内皮前駆細胞が再生医療への応用が期待されていることから、異種由来成分不含 (Xeno-free) 条件での分化誘導を試みた。具体的には、5日目から8日目までの培養に用いる培地をmodified human endothelial SFMからmodified Medium 200にヒドロコルチゾンを添加したものに変更し、コート剤をゼラチンからVTN-Nに変更した（図３Ａ）。この条件下において分化8日目に純化作業を経たXF-EPCsは通常プロトコールと比較して血管内皮細胞関連遺伝子群の発現量がほぼ同等であった（図３Ｂ）。さらに、CD31、CD144、CD34の発現が確認され、純度も通常プロトコールと同様に高値であることがわかった（図３Ｃ）。また、血管内皮細胞の機能の一つであるアセチル化LDLの取り込み能（図３Ｄ）やチューブ形成能も有していた（図３Ｅ）。以上よりXeno-free条件下においてもEPCsへの分化が可能であるとともに、細胞種間の接着能力の差を利用した純化法が適用可能であることが示された。
（４）iPS細胞由来EPCsの拡大培養法の確立
作製したiPS細胞由来EPCsの増殖能に改善の余地があることがわかった。従って、我々はEPCsの増殖能をあげるため、コストが安く、扱いが容易な低分子化合物に焦点を当ててEPCs増殖能の向上に有効な方法を模索した。我々はマウス肝細胞に未分化性を獲得させ、増殖能もあげる3つの低分子化合物の組み合わせ (ROCK阻害剤であるY-27632、GSK3β阻害剤であるCHIR99021、TGFβ阻害剤であるA 83-01) に着目した。Y-27632にはiPS細胞由来ECsの増殖能をあげる働きがあり、TGFβ阻害剤ではA-8301の類似化合物であるSB43152がES細胞由来ECsの増殖能を上げるとういう報告がある。さらに、CHIR99021はHUVECsの増殖能をあげるという報告が存在する。そこで、単独群、2化合物群、3化合物群 (YAC群) 全ての組み合わせで検討を行った。その結果、YAC群のEPCsが最も高い増殖能を示した（図４Ａ）。またDMSO群とYAC群を維持継代していくとYAC群でより長く増殖能を保ったまま継代でき、なおかつ、血管内皮前駆細胞としての表現型が保たれることが確認できた（図４Ｂ、４Ｃ）。また、YAC群ではDMSO群と比較して細胞老化が少ないことが確認できた（図４Ｄ）。更に、YAC群（分化39日目）ではHUVECと比較して血管内皮前駆細胞マーカーCD34を高発現していた（図９）。
作製したiPS細胞由来EPCsの増殖能に改善の余地があることがわかった。従って、我々はEPCsの増殖能をあげるため、コストが安く、扱いが容易な低分子化合物に焦点を当ててEPCs増殖能の向上に有効な方法を模索した。我々はマウス肝細胞に未分化性を獲得させ、増殖能もあげる3つの低分子化合物の組み合わせ (ROCK阻害剤であるY-27632、GSK3β阻害剤であるCHIR99021、TGFβ阻害剤であるA 83-01) に着目した。Y-27632にはiPS細胞由来ECsの増殖能をあげる働きがあり、TGFβ阻害剤ではA-8301の類似化合物であるSB43152がES細胞由来ECsの増殖能を上げるとういう報告がある。さらに、CHIR99021はHUVECsの増殖能をあげるという報告が存在する。そこで、単独群、2化合物群、3化合物群 (YAC群) 全ての組み合わせで検討を行った。その結果、YAC群のEPCsが最も高い増殖能を示した（図４Ａ）。またDMSO群とYAC群を維持継代していくとYAC群でより長く増殖能を保ったまま継代でき、なおかつ、血管内皮前駆細胞としての表現型が保たれることが確認できた（図４Ｂ、４Ｃ）。また、YAC群ではDMSO群と比較して細胞老化が少ないことが確認できた（図４Ｄ）。更に、YAC群（分化39日目）ではHUVECと比較して血管内皮前駆細胞マーカーCD34を高発現していた（図９）。
（５）Xeno-free条件下におけるY-27632、A 83-01及びCHIR99021の組み合わせの効果
分化8日目の純化後のXF-EPCsを3日間YAC非存在下 (DMSO群)又は存在下 (YAC群) で培養したところ、YAC群はDMSO群と比較して細胞数が明らかに増加していた（図５）。即ち、Xeno-free条件下でもYACの細胞増殖効果が得られた。
分化8日目の純化後のXF-EPCsを3日間YAC非存在下 (DMSO群)又は存在下 (YAC群) で培養したところ、YAC群はDMSO群と比較して細胞数が明らかに増加していた（図５）。即ち、Xeno-free条件下でもYACの細胞増殖効果が得られた。
（６）Y-27632、A 83-01及びCHIR99021を培地から除去した際の細胞増殖率の検討
YACを培地から除去すると、亢進していた増殖能が再び低下することから（図６）、YACによって刺激されたEPCsが、がん細胞に見られる特徴である自律的な増殖能を獲得した細胞でないことが確認された。よってYACによって増殖させたEPCsは再生医療などに用いることが可能であると考えられる。
YACを培地から除去すると、亢進していた増殖能が再び低下することから（図６）、YACによって刺激されたEPCsが、がん細胞に見られる特徴である自律的な増殖能を獲得した細胞でないことが確認された。よってYACによって増殖させたEPCsは再生医療などに用いることが可能であると考えられる。
（７）凍結融解がEPCsに与える影響
分化11日目の細胞を凍結融解処理に供し、凍結融解が細胞に与える影響を検討した（図１０Ａ）。凍結融解処理を行った細胞（凍結細胞）と凍結処理を行っていない細胞（非凍結細胞）は同等の生存率を示し（図１０Ｂ）、各マーカーの発現も両者の間で有意差は認められなかった（図１０Ｃ）。また、免疫染色の結果（図１１Ａ、Ｂ）、アセチル化LDL取り込み試験（図１１Ｃ）及びチューブフォーメーションアッセイの結果（図１１Ｄ）から、凍結細胞と非凍結細胞は血管内皮細胞として同等の機能を有することが示された。
分化11日目の細胞を凍結融解処理に供し、凍結融解が細胞に与える影響を検討した（図１０Ａ）。凍結融解処理を行った細胞（凍結細胞）と凍結処理を行っていない細胞（非凍結細胞）は同等の生存率を示し（図１０Ｂ）、各マーカーの発現も両者の間で有意差は認められなかった（図１０Ｃ）。また、免疫染色の結果（図１１Ａ、Ｂ）、アセチル化LDL取り込み試験（図１１Ｃ）及びチューブフォーメーションアッセイの結果（図１１Ｄ）から、凍結細胞と非凍結細胞は血管内皮細胞として同等の機能を有することが示された。
３．結論
本検討では、分化終期におけるヒトiPS細胞由来EPCsとその他の細胞の接着能力の差を利用することで、セルソーター、磁気ビーズを用いることなく簡便かつダメージレスに高純度のEPCsを単離することができた。さらに、複数の低分子化合物を組み合わせて添加することによってEPCsの増殖能を飛躍的に上昇させることに成功した。また、得られたEPCsは凍結融解処理後もその機能を保持していた。この事実は、その特性を維持させた状態で細胞の凍結保存が可能であることを示し、実用上の意義が極めて大きい。本結果は、再生医療への応用などの様々な用途が考えられるヒトiPS細胞由来血管内皮前駆細胞の安定供給に大きく寄与することが予想される。
本検討では、分化終期におけるヒトiPS細胞由来EPCsとその他の細胞の接着能力の差を利用することで、セルソーター、磁気ビーズを用いることなく簡便かつダメージレスに高純度のEPCsを単離することができた。さらに、複数の低分子化合物を組み合わせて添加することによってEPCsの増殖能を飛躍的に上昇させることに成功した。また、得られたEPCsは凍結融解処理後もその機能を保持していた。この事実は、その特性を維持させた状態で細胞の凍結保存が可能であることを示し、実用上の意義が極めて大きい。本結果は、再生医療への応用などの様々な用途が考えられるヒトiPS細胞由来血管内皮前駆細胞の安定供給に大きく寄与することが予想される。
本発明の調製方法は、簡便な操作にもかかわらず、高純度の血管内皮前駆細胞の調製を可能にする。高純度の血管内皮前駆細胞は薬物スクリーニングモデルの構築や臨床応用（冠動脈疾患や下肢虚血疾患等の治療や再生医療用の血管のin vitroでの構築等）等に有用である。本発明はこれらの用途への適用、応用が期待される。一方、本発明の拡大培養法は大量の血管内皮前駆細胞の調製を可能にするものであり、例えば、血管内皮前駆細胞の安定供給に貢献する。本発明の調製方法及び拡大培養法はいずれもXeno-free化に適し、特に血管内皮前駆細胞の臨床応用（再生医療等）への多大な貢献が期待される。
この発明は、上記発明の実施の形態及び実施例の説明に何ら限定されるものではない。特許請求の範囲の記載を逸脱せず、当業者が容易に想到できる範囲で種々の変形態様もこの発明に含まれる。本明細書の中で明示した論文、公開特許公報、及び特許公報などの内容は、その全ての内容を援用によって引用することとする。
Claims (11)
- 以下の工程（１）及び（２）を含む、血管内皮前駆細胞の調製方法：
（１）多能性幹細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程；
（２）工程（１）で得られた細胞集団を構成する血管内皮前駆細胞とその他の細胞の接着能力の差を利用して血管内皮前駆細胞を純化する工程であって、以下の工程（２－１）及び（２－２）からなる工程：
（２－１）第１細胞解離液を用いた第１剥離処理により前記その他の細胞を培養面から剥離し、除去する工程、
（２－２）第２細胞解離液を用いた剥離処理であって、前記第１剥離処理よりも細胞剥離効果が高い第２剥離処理により前記血管内皮前駆細胞を培養面から剥離し、回収する工程、
であり、
工程（２）では、ゼラチン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジンを１種類又は２種類以上、培養容器の表面にコートされた培養面を用い、
前記第１剥離処理と前記第２剥離処理が、以下の（ａ）と（ｄ）との中の一以上の条件を満たす、調製方法：
（ａ）第１剥離処理よりも第２剥離処理の方が処理時間が1.5倍～10倍長く、前記第１剥離処理に用いる第１細胞解離液と前記第２剥離処理に用いる第２細胞解離液とが同一の組成の細胞解離液であり、有効成分がトリプシン-EDTAおよびディスパーゼのうちの一つ以上である、
（ｄ）第１剥離処理に用いる第１細胞解離液よりも第２剥離処理に用いる第２細胞解離液の方が有効成分の作用が強く、第１細胞解離液の有効成分がコラゲナーゼおよびEDTAのうちの一つ以上であり、第２細胞剥離液の有効成分がトリプシン-EDTAおよびディスパーゼのうちの一つ以上である。 - 前記第１剥離処理が、工程（１）で得られた細胞集団の前記第１細胞解離液への
接触とそれに続くタッピング処理を含む、請求項１に記載の調製方法。 - 工程（１）が以下の工程（１－１）及び（１－２）からなる、請求項１又は２に記載の調製方法：
（１－１）多能性幹細胞を中胚葉へと分化させる工程；
（１－２）工程（１－１）で得られた細胞を血管内皮前駆細胞へと分化させる工程。 - 工程（１－２）における培養期間が2日間～14日間である、請求項３に記載の調製方法。
- 工程（１－２）の途中で、細胞接着性の強い培養面から細胞接着性の弱い培養面へ切り替え、
細胞接着性の強い前記培養面が基底膜成分又はその断片を表面にコートした培養面であり、細胞接着性の弱い前記培養面がゼラチン、ポリ-D-リジン及びポリ-L-リジンからなる群より選択される材料を表面にコートした培養面である、
請求項３又は４に記載の調製方法。 - 工程（１－２）が、以下の培養工程（１－２－１）と（１－２－２）を含む、請求項３又は４に記載の調製方法。：
（１－２－１）骨形成因子4及び血管内皮増殖因子の存在下での培養、
（１－２－２）塩基性線維芽細胞増殖因子及び血管内皮増殖因子の存在下での培養。 - 工程（１－２－１）の培養期間が1日間～7日間であり、工程（１－２－２）の培養期間が1日間～7日間である、請求項６に記載の調製方法。
- 工程（１－２－１）の培養に細胞接着性の強い培養面を用い、
工程（１－２－２）の培養に細胞接着性の弱い培養面を用い、
細胞接着性の強い前記培養面が基底膜成分又はその断片を表面にコートした培養面であり、細胞接着性の弱い前記培養面がゼラチン、ポリ-D-リジン及びポリ-L-リジンからなる群より選択される材料を表面にコートした培養面である、請求項７に記載の調製方法。 - 異種動物由来成分を含まない条件下で全ての工程が行われる、請求項１～８のいずれか一項に記載の調製方法。
- 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１～９のいずれか一項に記載の調製方法。
- 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項１０に記載の調製方法。
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