JP7465517B2 - Ｉｆｉｔｍ５の変異に起因する骨形成不全症を治療するための医薬 - Google Patents

Description

本発明は、Ifitm5（IFITM5遺伝子）の変異によって発症する骨形成不全症を治療するための医薬に関する。

Ifitm5は、interferon induced transmembrane protein 5 (IFITM5)というタンパク質をコードする遺伝子であり、Brilと称されることもある。Ifitm5の遺伝子産物であるIFITM5は細胞膜に局在し、アミノ末端が細胞内に、カルボキシル末端が細胞外に位置する１回膜貫通タンパク質である（非特許文献１）。マウスのIFITM5では、アミノ末端から５２番目、５３番目、及び８６番目、ヒトのIFITM5では５０番目、５１番目及び８４番目にある３つのシステイン残基がパルミトイル化されており、内膜へのアンカーとしての役割を果たしている（非特許文献１）。マウスのIFITM5では５２番目と５３番目、ヒトのIFITM5では５０番目と５１番目のシステイン残基がIFITM5の細胞膜への局在と安定性に重要であることが報告されている（非特許文献１）。

IFITM5の機能に関しては長らく不明であったが、Ifitm5が骨芽細胞でのみ特異的に発現していること（非特許文献２及び３）、その発現時期が骨芽細胞の石灰化期と一致し、培養した骨芽細胞でIfitm5を過剰発現させると石灰化が促進されること（非特許文献２及び３）、培養した骨芽細胞でIfitm5の発現をshort hairpin RNAでノックダウンすると石灰化が抑制されること（非特許文献２）が報告され、これらの知見からIFITM5は骨形成の正の制御因子であると予想されていた。

しかしながら、本発明者らがIfitm5欠損マウスを作製し、その表現型を調べたところ、Ifitm5欠損マウスは稀に長管骨が屈曲する奇形を有する個体、あるいは骨密度が低下している個体が誕生するが、骨形態計測パラメーターの平均値は正常なマウスの骨と比較して大きな差異は認められなかった（非特許文献３）。このことから、個体レベルにおいてはIfitm5の発現がなくても、骨形成はほぼ正常に進行することが明らかとなった。

他方、異なる２つの研究グループが、２０１２年に、Ｖ型骨形成不全症の患者と正常な骨をもつ家族のエキソーム解析を行い、Ｖ型骨形成不全症の患者にはIfitm5の５’側上流の非翻訳領域にヘテロ点変異(c.-14C>T)があることを報告した（非特許文献４及び５）。その後、Ｖ型骨形成不全症患者におけるIfitm5のc.-14C>T変異が様々な研究グループからも報告され（非特許文献６～１５）、この変異がＶ型骨形成不全症の原因であることが判明した。Ifitm5のc.-14C>T変異は、Ifitm5のスタートコドンを上流側に移動させて新しいスタートコドンを作り、その結果、IFITM5のアミノ末端にメチオニン（Ｍ）－アラニン（Ａ）－ロイシン（Ｌ）－グルタミン酸（Ｅ）－プロリン（Ｐ）の５つのアミノ酸（ＭＡＬＥＰ）が付加される。すなわち、Ｖ型骨形成不全症はIFITM5のアミノ末端にこの５アミノ酸が付加された変異IFITM5（MALEP-IFITM5）が作られることによって発症すると考えられる。但し、その発症機構に関しては現在のところ不明である。

２０１４年には、Ifitm5のc.-14C>T変異によるＶ型骨形成不全症よりも深刻な症状を示す骨形成不全症患者からIfitm5の翻訳領域の変異が新たに発見された（非特許文献１７～１９）。この変異は常染色体優性de novo変異 (c.119C>T)で、４０番目のセリンがロイシンに置換される(p.S40L)。この変異をもつ患者は、長管骨の屈曲、低身長、内反肢、脊椎圧迫、脊柱側弯症を示す。また、青色強膜があり、歯芽形成不全も認められる。C119C>T変異をもつIfitm5の産物(IFITM5-S40L)では、システイン残基のパルミトイル化が認められず、膜への局在が阻害されるが、それがどのように発症に関与しているのかは不明である。

２０１８年にIfitm5にc.-14C>T変異をもつゲノム編集マウスに関する論文が発表されたが、Ifitm5にc.-14C>T変異をもつマウスは周産期致死であった（非特許文献２０）。この論文では、Ifitm5にc.-14C>T変異をもつ周産期致死であったゲノム編集マウスの胎仔は、頭蓋骨の石灰化が不十分で、長管骨が短く屈曲し、肋骨も脆弱で、全身にわたって深刻な骨異常があることが報告されている。また、c.-14C>T変異をもつIfitm5をI型コラーゲンのプロモーターで発現させたトランスジェニックマウスに関する論文も発表されており、このトランスジェニックマウスも周産期致死であり、胎仔はIfitm5にc.-14C>T変異をもつゲノム編集マウスの胎仔と同様の骨異常をもつことが報告されている（非特許文献２１）。

ＷＯ２０１６／１２１６８０Ａ ＥＰ１８４１６２Ａ ＥＰ３２３０４２Ａ ＥＰ４２３７１４Ａ ＥＰ４２７６８０Ａ ＥＰ４６５４２６Ａ ＥＰ４８０６２３Ａ ＥＰ５３２０８８Ａ ＥＰ５３２０８９Ａ ＥＰ５６９３３７Ａ ＥＰ６２６３８５Ａ ＷＯ８９／０５３０３Ａ ＷＯ９３／０５０５８Ａ ＷＯ９６／３１５１４Ａ ＷＯ９１／１３８８９Ａ ＷＯ９１／１９４９５Ａ ＷＯ９３／５０５９Ａ ＷＯ２００７／０３２７７７Ａ ＵＳ３９２９９９２Ａ ＷＯ９４／９０１０Ａ ＵＳ５２５８３８９Ａ

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ヒトでは、上記の通り、変異Ifitm5を有する骨形成不全症を患う患者が存在する。日本では、骨形成不全症を患う患者は６０００人程度、その中でIfitm5のc.-14C>T変異をもつ骨形成不全症患者は３００人程度と推定され、その他の変異Ifitm5をもつ骨形成不全症患者の数は不明である。残念ながら、Ifitm5の変異により発症する骨形成不全症の有効な治療法は現在のところ存在せず、当該疾患の治療法の確立が強く望まれる。
本発明は、このようなIfitm5の変異が原因で発症する骨形成不全症を治療するための医薬を初めて提供する。

ＦＫ５０６（商品名タクロリムス）およびラパマイシン（商品名シロリムス）は、従来、免疫抑制剤として広く利用されている化合物である。ＦＫ５０６は、マクロライド系の免疫抑制剤として知られるが、細胞内でＦＫＢＰ１２と複合体を形成し、この複合体がカルシニューリンと結合することによって転写因子であるＮＦＡＴの脱リン酸化を阻害することが知られている（例えば、非特許文献２３）。また、ＮＦＡＴはＯｓｔｒｉｘと協調して骨芽細胞の分化を誘導し、骨形成を促進することが報告されており（非特許文献２４）、Ifitm5の転写は、プロモーター部位のＣｐＧ脱メチル化によって転写因子であるＧＬＩ２、Ｓｐ１、Ｓｐ３およびＯｓｔｅｒｉｘがプロモーター部位へ結合することによって起こることが報告されている（非特許文献２２）。また、FK506が、Bone Morphogenetic Protein-2（BMP2; 骨形成タンパク質-2）という骨芽細胞の分化と石灰化を誘導するタンパク質の働きを増強するという報告がある（非特許文献２５）。ただし、FK506のこの作用については、BMP2又は骨原性細胞とともに投与しなければ石灰化を増強する効果がないことが報告されている（非特許文献２６乃至２８）。また、FK506をマウスに投与すると海綿骨の減少が観察され、骨減少症の症状を示したという報告もある（非特許文献２４）。
ラパマイシンは、放線菌であるStreptomyces hydroscopicsが産生するマクロライド化合物の一種であり、免疫抑制作用、平滑筋増殖抑制作用、抗癌作用、さらに寿命延長作用など様々な薬効を有することが知られている。ラパマイシンは細胞分裂や細胞の生存、成長の調節に重要な役割を果たすセリン・トレオニンキナーゼであるmTOR（mammalian target of rapamycin）の活性を阻害することが知られている。ラパマイシンおよびその類似体は、進行性骨化性線維異形成症の予防および治療に有効であることが報告されている（特許文献１、非特許文献２９）
しかし、これらの化合物のIfitm5又は変異Ifitm5との関連について報告するものはなかった。

本発明者は、上述の課題を解決すべく検討する中で、意外にも従来免疫抑制剤として用いられていた上述の化合物の単独投与（BMP2又は骨原性細胞の投与を伴わない）で変異Ifitm5に起因する疾患の症状（骨の脆弱化、骨塩量の低減、異所性の骨化や仮骨の過剰形成、又は骨変形など）を改善し得ることを見出し、本発明に想到した。
すなわち、本発明は、以下の医薬組成物を提供する。
［１］変異Ifitm5を有する患者の骨形成不全症を治療するための医薬組成物であって、
下記式（I）

、又は下記式（ＩＶ）


の化合物を含む、医薬組成物。
［２］前記患者は、ヒトである、［１］に記載の医薬組成物。
［３］前記変異Ifitm5は、c.-14C>T変異、又はc.119C>T変異を含む、［１］又は［２］に記載の医薬組成物。
［４］式（I）の化合物を含み、低減した骨塩量を改善するための、［１］乃至［３］の何れかに記載の医薬組成物。

変異Ifitm5に起因する骨形成不全症の治療は、長期間の投与による治療が想定されるため、治療薬の副作用が深刻な問題に成り得る。この点、ＦＫ５０６（商品名タクロリムス）およびその類似体、あるいはラパマイシン（商品名シロリムス）およびその類似体は、免疫抑制剤として臓器移植治療を受けた患者に長期間使用されている。従って、移植患者の管理に精通している医師のもとで、適切な投薬が行われた場合、これらの免疫抑制剤は長期間使用しても生活の質（ＱＯＬ）を維持できるものと推定される。かくして、本発明により、患者のＱＯＬを維持しながらIfitm5の変異によって引き起こされる骨形成不全症の治療が可能と成り得る。

ここで本願明細書における「骨形成不全症（Osteogenesis imperfecta）」の分類について言及する。
骨形成不全症は、全身の骨脆弱性による易骨折性や進行性の骨変形に加え、様々な程度の結合組織症状を示す先天性疾患である。骨の脆弱化は、通常、骨塩量の低減を含み、結合組織症状には、異所性の骨化や仮骨の過剰形成が含まれる。骨形成不全症については、Sillenceらが、臨床症状の特徴及び重症度によって４つに分類していたが、これらに疾患の原因遺伝子も考慮した分類がなされるようになり、現在まで少なくとも１８の異なるタイプが知られている（非特許文献１６）。本願明細書で「骨形成不全症」の分類又は型に言及する際、この拡大された分類法に従って説明する。
この拡大された分類法におけるＶ型骨形成不全症は、常染色体優性の骨形成不全症で、Ifitm5のc.-14C>T変異を特徴とし、他の骨形成不全症と異なり、前腕骨間膜の石灰化および仮骨の過剰形成によって特徴づけられるが、患者間によって症状の深刻さは幅広い。前腕骨間膜の石灰化は、ほぼすべての患者に認められ、前腕の回外・回内の制限を伴う。仮骨の過剰形成は骨折の治癒過程で起こるが、すべての患者には見られない。また、多くの患者で橈骨骨頭の脱臼があり、これは肘の変形の原因となる。骨の脆弱性に伴う骨折の回数については顕著な多様性があり、また、自力で歩行可能な患者から、車いすを必要とする患者まで多様である。
Ｖ型骨形成不全症が他の骨形成不全症と最も異なる点は、Ｖ型骨形成不全症では骨化の減衰による骨の脆弱性とともに異所性の骨化および/あるいは仮骨の過剰形成という、骨形成の減少と骨形成の促進の症状が起こることである。骨形成に関する正と負の制御が同じ患者内で起こるメカニズムは不明である。
Ifitm5のc.119C>T変異を有する骨形成不全症は、その症状がserpinfに変異を有することを特徴とするＶＩ型骨形成不全症の症状に類似するが、何れの型に属するかは定まっていない。

図１は、ＦＫ５０６を０、５、１０、２０又は４０μ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１よる石灰化の経時変化を示す。各培地では、アリザリンレッドによりカルシウムを染色している。 図２は、ＦＫ５０６を０、５、１０、２０又は４０μ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の増殖の経時変化を示す。縦軸は、播種した時の細胞数を１としたときの相対値を示す。 図３は、ＦＫ５０６を０、５、１０、２０又は４０μ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＩｆｉｔｍ５発現量の経時変化を示す。 図４は、ＦＫ５０６を０、５、１０、２０又は４０μ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＢｇｌａｐ２発現量の経時変化を示す。 図５は、ＦＫ５０６を０、５、１０、２０又は４０μ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＩｂｓｐ発現量の経時変化を示す。 図６は、ＦＫ５０６を０、５、１０、２０又は４０μ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＣｏｌ１ａ１発現量の経時変化を示す。 図７は、ラパマイシンを０、２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１よる石灰化の経時変化を示す。各培地では、アリザリンレッドによりカルシウムを染色している。 図８は、ラパマイシンを０、２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の増殖の経時変化を示す。縦軸は、播種したときの細胞数を１とした時の相対値を示す。 図９は、ラパマイシンを０、２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＩｆｉｔｍ５発現量の経時変化を示す。 図１０は、ラパマイシンを０、２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＢｇｌａｐ２発現量の経時変化を示す。 図１１は、ラパマイシンを０、２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＩｂｓｐ発現量の経時変化を示す。 図１２は、ラパマイシンを０、２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１のＣｏｌ１ａ１発現量の経時変化を示す。 図１３は、ＦＫ５０６を０、５又は１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２よる石灰化の経時変化を示す。各培地では、アリザリンレッドによりカルシウムを染色している。 図１４は、ＦＫ５０６を０、５又は１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＩｆｉｔｍ５発現量の経時変化を示す。 図１５ ＦＫ５０６を０、５、１０ μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＢｇｌａｐ２発現量の経時変化 図１６は、ＦＫ５０６を０、５又は１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＩｂｓｐ発現量の経時変化を示す。 図１７は、ＦＫ５０６を０、５又は１０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＣｏｌ１ａ１発現量の経時変化を示す。 図１８は、ラパマイシンを０、２００又は４００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２よる石灰化の経時変化を示す。各培地では、アリザリンレッドによりカルシウムを染色している。 図１９は、ラパマイシンを０、２００又は４００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＩｆｉｔｍ５発現量の経時変化を示す。 図２０は、ラパマイシンを０、２００又は４００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＢｇｌａｐ２発現量の経時変化を示す。 図２１は、ラパマイシンを０、２００又は４００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＩｂｓｐ発現量の経時変化を示す。 図２２は、ラパマイシンを０、２００又は４００ｎｍｏｌ／ｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２のＣｏｌ１ａ１発現量の経時変化を示す。 図２３は、ＦＫ５０６を０、５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス頭蓋骨骨芽細胞よる石灰化の経時変化を示す。各培地では、アリザリンレッドによりカルシウムを染色している。 図２４は、ＦＫ５０６を０、５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス頭蓋骨骨芽細胞のＩｆｉｔｍ５発現量の経時変化を示す。 図２５は、ＦＫ５０６を０、５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス頭蓋骨骨芽細胞のＢｇｌａｐ２発現量の経時変化を示す。 図２６は、ＦＫ５０６を０、５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス頭蓋骨骨芽細胞のＩｂｓｐ発現量の経時変化を示す。 図２７は、ＦＫ５０６を０、５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度になるように添加した分化培地で培養したマウス頭蓋骨骨芽細胞のＣｏｌ１ａ１発現量の経時変化を示す。 図２８は、ゲノム編集によって創出したＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウス及び野生型マウスの骨格のμＣＴ像を示す。左上図は背中側から見た出生直後の野生型マウスの骨格である。左下図は側面から見た出生直後の野生型マウスの骨格である。中央上図は背中側から見た出生直後のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスの骨格である。中央下図は側面から見たｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスの骨格である。左図と中央図のマウスは同腹仔である。右図は左図および中央図のマウスとは異なる母マウスから誕生したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスの骨格を示す。右上図は背中側から見た出生直後のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスの骨格である。右下図は側面から見たｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスの骨格である。中央図および右図のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスは周産期致死であった。 図２９は、Ｋ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウス、ＦＫ５０６を胎仔（Ｅ１４．５の胚）に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウス、及び野生型（ＷＴ）のマウスの肋骨および胸椎のμＣＴ像を示す。上段は背中側から見た出生直後の各マウスの骨格を示す。中段は背中側から見た各マウスの肋骨および胸椎を示す。下図は側面から見た出生直後の各マウスの骨格を示す。右の３つはＦＫ５０６を胎仔（Ｅ．１４．５の胚）に直接投与した出生直後のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスのμＣＴ像である。これら３匹のヘテロ接合体マウスでは、ＦＫ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスよりも肋骨が太い。ＦＫ５０６の投与の有無にかかわらず、ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異をヘテロ接合で有するマウスは周産期致死であった。 図３０は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの全身骨格の骨塩量を示す。 左から、ＷＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウス；ＭＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス；ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスである。 図３１は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの肋骨および胸椎の骨塩量を示す。左から、ＷＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウス；ＭＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していないＩｆｉｔｍ５ ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス；ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスである。 図３２は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの肋骨および胸椎のμＣＴ像を示す。上から、Ａは、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウスのμＣＴ像であり；Ｂは、ＦＫ５０６を投与していないＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像であり；Ｃは、ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像である。 図３３は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの頭蓋骨の骨塩量を示す。左から、ＷＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウスであり；ＭＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していないＩｆｉｔｍ５ ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスであり；ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスである。 図３４は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの頭蓋骨のμＣＴ像および骨塩量を示す。上から、Ａは、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウスのμＣＴ像であり；Ｂは、ＦＫ５０６を投与していないＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像であり；Ｃは、ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像である。各画像の下の数値は、塩量を示す。 図３５は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの脛骨および腓骨の骨塩量を示す。左から、ＷＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウスであり；ＭＴ／－は、ＦＫ５０６を投与していないＩｆｉｔｍ５ ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスであり；ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスである。 図３６は、野生型新生仔マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のＩｆｉｔｍ５のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの脛骨および腓骨のμＣＴ像および骨塩量を示す。上から、Ａは、ＦＫ５０６を投与していない野生型新生仔マウスのμＣＴ像であり；Ｂは、ＦＫ５０６を投与していないＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像であり；Ｃは、ＭＴ／＋は、ＦＫ５０６を妊娠１４．５日目の母マウスの子宮から胎仔に直接投与し、誕生したＩｆｉｔｍ５ｃ－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像である。各画像の下の数値は、塩量を示す。 図３７は、野生型の出産直後のマウス、ラパマイシンを投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、ラパマイシンを胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、およびラパマイシンを胎仔に直接投与し生存した野生型の出産直後のマウスの全身骨格のμＣＴ像を示す。上段は背中側から見た出生直後の各マウスの骨格を示す。下図は側面から見た出生直後の各マウスの骨格を示す。 いちばん左は野生型の出産直後のマウスであり、左から２番目はラパマイシンを投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスのμＣＴ像である。右から２番目はラパマイシンを胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスであり、いちばん右はラパマイシンを胎仔に直接投与し生存した野生型の出産直後のマウスのμＣＴ像である。 図３８は、野生型の出産直後のマウス、ラパマイシンを投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、ラパマイシンを胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、およびラパマイシンを胎仔に直接投与し生存した野生型の出産直後のマウスの全身骨格の骨塩量を示す。左からＷＴ/投与なしは野生型の出産直後のマウスであり、ＭＴ/投与なしはラパマイシンを投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスであり、ＭＴ/ラパマイシン投与はラパマイシンを胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスであり、ＷＴ/ラパマイシン投与はラパマイシンを胎仔に直接投与し生存した野生型の出産直後のマウスである。

本発明は、上述の通り、ＦＫ５０６若しくはその類似体またはラパマイシン若しくはその類似体を含む、Ifitm5の変異に起因する骨形成不全症を治療するため医薬組成物に関する。

Ifitm5は、IFITM5というタンパク質をコードする遺伝子であり、ヒトIfitm5のエクソン部分（イントロンを除いた領域）の塩基配列は、配列番号１に示す通りであり、37番目から435番目までの塩基配列がIFITM5のコード配列である。
また、マウスIfitm5のＤＮＡ配列は、のエクソン部分（イントロンを除いた領域）の塩基配列は、配列番号２に示す通りであり、35番目から439番目までの塩基配列がIFITM5のコード配列である。関連ゲノム情報は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/387733及びhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/73835参照。

ＦＫ５０６及びその類似体としては、下記式（Ｉ）

［式中、
Ｒ^１～Ｒ^６は、各々独立して、水素原子又はＣ_１－６アルキル基を示すか、または
Ｒ^１及びＲ^２、Ｒ^３及びＲ^４、Ｒ^５及びＲ^６のそれぞれの対は、各々独立して、結合しているそれぞれの炭素原子どうしの間でもうひとつの結合を形成し、
Ｒ^７は、水素原子、ヒドロキシ基、保護されたヒドロキシ基、又はＣ_１－６アルコキシ基を示すか、またはＲ^１と一緒にオキソ基を形成してもよく、
Ｒ^８およびＲ^９は、独立して、水素原子又はヒドロキシ基を示し、
Ｒ^１０は、水素原子、Ｃ_１－６アルキル基、１以上のヒドロキシ基によって置換されたＣ_１－６アルキル基、Ｃ_１－６アルケニル基、１以上のヒドロキシ基によって置換されたＣ_１－６アルケニル基、またはオキソ基によって置換されたアルキル基を示し、
Ｘ^１及びＸ^２は、各々独立して、水素原子又はヒドロキシ基（好ましくは、両方とも水素原子）であるか、Ｘ^１及びＸ^２が一緒に、オキソ基、又は式：ＣＨ_２Ｏ-で表わされる基を示し、
Ｙ^１及びＹ^２は、各々独立して、水素原子又はヒドロキシ基（好ましくは、両方とも水素原子）であるか、Ｙ^１及びＹ^２が一緒に、オキソ基、又は式：Ｎ-ＮＲ^１１Ｒ^１２もしくはＮ-ＯＲ^１３で表わされる基（式中、Ｒ^１１およびＲ^１２は独立して水素原子、Ｃ_１－６アルキル基、アリール基またはトシル基を）を示し、
Ｒ^１３～Ｒ^１９、Ｒ^２２およびＲ^２３は独立して水素原子またはＣ_１－６アルキル基を示し、
Ｒ^２４は、
（ａ）３，４‐ジオキソ－シクロへキシル基、
（ｂ）３-Ｒ^２０-４－Ｒ^２１-シクロへキシル基、
式中、
Ｒ^２０は、ヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、または－ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３であり、
Ｒ^２１は、ヒドロキシ、－ＯＣＮ、アルコキシ、適当な置換基を有していてもよいへテロアリールオキシ、－ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、保護されていてもよいヒドロキシ、クロロ、ブロモ、ヨード、アミノオキザリルオキシ、アジド基、ｐ-トリルオキシチオカルボニルオキシ、またはＲ^２５Ｒ^２６ＣＨＣＯＯ-（式中、Ｒ^２５は所望により保護されていてもよいヒドロキシ基、またはアミノ基であり、Ｒ^２６は水素原子またはメチルであり、或いはＲ^２５とＲ^２６は一緒になって、エポキシド環の酸素原子を形成してよい）であり、または
（ｃ）シクロペンチル基であって、メトキシメチル、所望により保護されたヒドロキシメチル、アシルオキシメチル（アシル部分は、所望により４級化されていてもよいジメチルアミノ基またはエステル化されていてもよいカルボキシ基）、保護されていてもよい１以上のアミノ基および／またはヒドロキシ基、またはアミノオキザリルオキシメチルで置換されており、好ましくは、２-ホルミルーシクロペンチル基であり、
ｎは、１または２を表わし、
Ｙ^１、Ｙ^２、Ｒ^１０およびＲ^２３は或いはＲ^１０およびＲ^２３は、それらが結合している炭素原子と一緒になって、窒素原子、硫黄原子及び／又は酸素原子を含有する飽和若しくは不飽和の５員若しくは６員の複素環基を表わしていてもよく、この複素環基は、アルキル基、ヒドロキシ基、アルコキシ基、ベンジル基、式：－ＣＨ_２Ｓｅ（Ｃ_６Ｈ₅）で表わされる基、および１以上のヒドロキシ基によって置換されたアルキル基から選ばれる１以上の基によって置換されていてもよい］
で表されるマクロクロライド系の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグが挙げられる。

「アルキル基」および「アルコキシ基」のアルキル部分の好ましい例としては、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ネオペンチル、へキシル等が挙げられ、メチル、エチル、プロピルがより好ましい。
「アルケニル基」の好ましい例としては、例えばビニル、プロぺニル（アリル）、ブテニル、メチルプロぺニル、ペンテニル、へキセニル等が挙げられ、ビニル、プロぺニル（アリル）、ブテニルがより好ましい。
「アリール基」の好ましい例としては、フェニル、トリル、キシリル、クメニル、メシチル、ナフチル等が挙げられ、フェニルが好ましい。

「保護された」および「保護されてもよい」置換基における好ましい保護基としては、
例えば、メチルチオメチル、エチルチオメチル、プロピルチオメチル、イソプロピルチオメチル、ブチルチオメチル、イソブチルチオメチル、へキシルチオメチル等の１（Ｃ_１－６アルキルチオ）Ｃ_１－６アルキル基、好ましくはＣ_１－４アルキルチオメチル基；
例えば、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリル、第三級ブチル－ジメチルシリル、トリ第三級ブチルシリル等のトリＣ_１－６アルキルシリル；
例えば、メチル-ジフェニルシリル、エチル－ジフェニルシリル、プロピノレ－ジフェニルシリル、第三級ブチル-ジフェニルシリル等のＣ_１－６アルキルジアリールシリル、好ましくは、トリＣ_１－４アルキルシリル基およびＣ_１－４アルキルジフェニルシリル基、特に好ましくは、第三級ブチル－ジメチルシリル基および第三級プチル－ジフェニルシリル基；
カルボン酸、スルホン酸およびカルバミン酸から誘導される脂肪族アシル基、
芳香族アシル基および芳香族基で置換された脂肪族アシル基等のアシル基などが挙げられる。

「脂肪族アシル基」としては、例えば、カルボキシを有してもよいＣ_１－４アルカノイル基、シクロアルキル部分にＣ_１－４アルキルを２個有するシクロＣ_５－６アルコキシＣ_１－４アルカノイル基、カンファースルホニル基、カルボキシＣ_１－４アルキルカルバモイル基、トリＣ１－４アルキルシリルＣ_１－４アルコキシカルボニルＣ_１－４アルキルカルバモイル基、ニトロ基を１個または２個有していてもよいベンゾィル基、ハロゲンを有するベンゼンスルホニル基、Ｃ_１－４アルコキシとトリハロＣ_１－４アルキルを有するフェニルＣ_１－４アルカノイル基が挙げられ、より好ましくは、アセチル、カルボキシプロピオニル、メンチルオキシアセチノレ、カンファースルホニル、ベンゾイル、ニトロベンゾイル、ジニトロベンゾイル、ヨードベンゼンスルホニルおよび２-トリフルオロメチル－２-メトキシ－２－フェニルアセチルが挙げられる。

「窒素原子、硫黄原子及び／又は酸素原子を含有する飽和若しくは不飽和の５員若しくは６員の複素環基」の好ましい例としては、ピロリル基、テトラヒドロフリル基等が挙げられる。
「適当な置換基を有していてもよいへテロアリール」部分としては、例えば、１－ヒドロキシエチルインドール－５-イルが好ましい。

ＦＫ５０６及びその類似体は、より好ましくは、下記式（II）

［式中、
Ｒ^１０はメチル、エチル、プロピルまたはアリル基であり、
Ｘは、（水素原子、水素原子）またはオキソ基であり、
Ｒ^２４は、３-Ｒ^２０-４-Ｒ^２１-シクロへキシル基
式中、
Ｒ^２０は、ヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、またはＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３であり、
Ｒ^２１はヒドロキシ、－ＯＣＮ、アルコキシ、適当な置換基を有していてもよいへテロアリールオキシ、-ＯＣＨ_２ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、保護されたヒドロキシ、クロ口、ブロモ、ヨード、アミノオキザリルオキシ、アジド基、ｐ-トリルオキシチオカルボニルオキシ、またはＲ^２５Ｒ^２６ＣＨＣＯＯ-（式中、Ｒ^２５は所望により保護されていてもよいヒドロキシ基またはアミノ基であり、Ｒ^２６は水素原子またはメチルである）、或いは
Ｒ^２０とＲ^２１は一緒になって、エポキシド環の酸素原子を形成し、
ｎは、１または２で示される］
で表されるマクロクロライド系の化合物、その医薬的に許容される塩、溶媒和物又はプロドラッグが挙げられる。

中でも、ＦＫ５０６は既に臨床での多くの使用実績があるため好ましい。ＦＫ５０６は、下記式（III）

［化学名：17－アリル－1，14－ジヒドロキシ－12－[2－(4－ヒドロキシ－3‐メトキシシクロへキシル）－1－メチルビニル]－23，25－ジメトキシ－13，19，21，27－テトラメチル－11，28－ジオキサ－4－アザトリシクロ[22.3.1.0.1^4,9]オクタコス－18－エン－2，3，10，16－テトラオン］
で表される。

ＦＫ５０６又はその類似体の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、アジピン酸、グルコン酸、グルコヘプト酸、グルクロン酸、テレフタル酸、メタンスルホン酸、乳酸、馬尿酸、１，２－エタンジスルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、オレイン酸、パモ酸、ポリガラクツロン酸、ステアリン酸、タンニン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、硫酸ラウリルエステル、硫酸メチル、ナフタレンスルホン酸、スルホサリチル酸等の有機酸との塩；臭化メチル、ヨウ化メチル等との四級アンモニウム塩；臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲンイオンとの塩等が挙げられる。

ＦＫ５０６若しくはその類似体又は薬学的に許容されるこれらの塩は、水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。このような溶媒としては、例えば、水、エタノール等が挙げられる。
ＦＫ５０６若しくはその類似体又は薬学的に許容されるこれらの塩には幾何異性体又は光学異性体が存在し得、これら異性体も本発明の有効成分と成り得る。また、ＦＫ５０６若しくはその類似体又は薬学的に許容されるこれらの塩にプロトン互変異性が存在する場合には、これら互変異性体も本発明の有効成分に成り得る。

ＦＫ５０６、又はその類似体若しくは異性体又は薬学的に許容されるこれらの塩については、特許文献２乃至１７等に詳細に記載されており、その薬理活性についても確認されている。FK506又はその類似体のプロドラッグについては、例えば、特許文献１８、及び、特許文献３０に詳細に記載されており、本発明の医薬組成物は、これら化合物を有効成分とすることもできる。具体的には、デキストリンとの結合体、例えばアミノ基を導入したＦＫ５０６等とカルボキシル基を導入したデキストランとをアミド結合して得られるデキストリンとの結合体、或いはアセチル、エタノイル、ピバロイル、ピバロイルオキシメチル、アセトキシジメチル、フタリジル、メトキシジメチル、インダニル等の生理条件下で加水分解されるエステルを挙げることができる。

ラパマイシン及びその類似体としては、下記式（ＩＶ）

［式中、
Ｒ^３１は、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルケニル、Ｃ_１－６アルキニル、ヒドロキシＣ_１－６アルキル、ヒドロキシＣ_１－６アルケニル、ヒドロキシＣ_１－６アルキニル、アリール、チオＣ_１－６アルキル、アリールＣ_１－６アルキル、ヒドロキシアリールＣ_１－６アルキル、ヒドロキシアリール、ジヒドロキシＣ_１－６アルキル、ヒドロキシＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル、ヒドロキシＣ_１－６アルキルアリールＣ_１－６アルキル、ジヒドロキシＣ_１－６アルキルアリールＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシアリールＣ_１－６アルキル、ハロＣ_１－６アルキル、ハロアリール、ハロアリールＣ_１－６アルキル、アシルオキシＣ_１－６アルキル、アミノＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルキルアミノＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミドＣ_１－６アルキル、アシルアミドＣ_１－６アルキル、アリールスルホンアミドＣ_１－６アルキル、アリル、ジヒドロキシＣ_１－６アルキルアリル、ジオキソラニルアリル、カルボＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルおよびＣ_１－６アルキルシリルから選択され、
Ｒ^３２は、式Ｖまたは式ＶＩ

(式中、
Ｒ^４３は、Ｈ、Ｃ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルケニル、Ｃ_１－６アルキニル、アリール、チオＣ_１－６アルキル、アリールＣ_１－６アルキル、ヒドロキシアリールＣ_１－６アルキル、ヒドロキシアリール、ヒドロキシＣ_１－６アルキル、ジヒドロキシＣ_１－６アルキル、ヒドロキシＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル、ヒドロキシＣ_１－６アルキルアリールＣ_１－６アルキル、ジヒドロキシＣ_１－６アルキルアリールＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキル、アシルオキシＣ_１－６アルキル、アミノＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルキルアミノＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシカルボニルアミドＣ_１－６アルキル、アシルアミドＣ_１－６アルキル、アリールスルホンアミドＣ_１－６アルキル、アリル、ジヒドロキシＣ_１－６アルキルアリル、ジオキソラニルアリル、カルボＣ_１－６アルコキシＣ_１－６アルキルおよびＣ_１－６アルキルシリルから選択され、
Ｒ^４４は、Ｈ、Ｃ_１－３アルキルまたはＲ^３３と一緒になってＣ_２－６アルキレンを形成し、
Ｒ^４５は、置換または非置換アシル、オキシメチル、イミノメチルまたはジオキシメチリンである）
であり、
Ｒ^３３～Ｒ^４２は、各々独立して、水素原子又はＣ_１－６アルキル基を示し、
ＸおよびＹは、各々独立してＯ、(Ｈ、ＯＨ)および(Ｈ、Ｃ_１－４アルコキシ)から選択され、
「アルキル」、「アルコキシ」のアルキル部分、「アルケニル」、及び「アリール」の好ましい例は、ＦＫ５０６及びその類似体の「アルキル基」、「アルコキシ基」のアルキル部分、「アルケニル基」及び「アリール基」と同様であり、「アルキニル基」の好ましい例としては、例えばエチニル基、プロピニル基、１－ブチニル基、２－ブチニル基、ペンチニル基、ヘキシニル基等が挙げられる。］
で表されるマクロクロライド系の化合物、その医薬的に許容される塩又はプロドラッグが挙げられる。

式（ＩＶ）中、
Ｒ^３１がベンジル、オルト－Ｃ_１－６アルコキシベンジル、クロロベンジルおよび(所望によりヒドロキシ置換)Ｃ_２－６アルキニルから選択される基であり、
Ｒ^３２が式Ｖであり、
Ｒ^３３～Ｒ^４２は、各々独立して、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ^４３が、Ｈ、ヒドロキシＣ_１－６アルキル、Ｃ_１－６アルコキシアルキル、ヒドロキシＣ_１－６アルコキシアルキル、アシルアミノＣ_１－６アルキルおよびアミノＣ_１－６アルキルから選択される基であり、
Ｒ^４４がメチルであり、
ＸおよびＹがそれぞれ独立してＯ、または(Ｈ、ＯＨ)である化合物がより好ましい。

ラパマイシン及びその類似体の具体例としては、例えば、特許文献１９乃至２１に記載されている化合物を挙げることができ、中でも、ラパマイシン（シロリムス、テムシロリムス（ＣＣＩ７７９）、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、リダフォロリムス（デフォロリムス／ＡＰ－２３５７３）、ＴＡＦＡ９３、ウミロリムス、オルコロリムス、ゾタロリムス（ＡＢＴ５７８）及びこれらの塩又はプロドラッグが好ましく、特に、以下の式（ＶＩＩ）で表されるラパマイシンは、既に臨床での多くの使用実績があり、安全性及び投与スケジュールなど詳細な検討がなされているため、骨形成不全症への適用においてもその知見を利用できるため好ましい。

ラパマイシン又はその類似体の薬学的に許容される塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸等の無機酸との塩；酢酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、クエン酸、酒石酸、アジピン酸、グルコン酸、グルコヘプト酸、グルクロン酸、テレフタル酸、メタンスルホン酸、乳酸、馬尿酸、１，２－エタンジスルホン酸、イセチオン酸、ラクトビオン酸、オレイン酸、パモ酸、ポリガラクツロン酸、ステアリン酸、タンニン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、硫酸ラウリルエステル、硫酸メチル、ナフタレンスルホン酸、スルホサリチル酸等の有機酸との塩；臭化メチル、ヨウ化メチル等との四級アンモニウム塩；臭素イオン、塩素イオン、ヨウ素イオン等のハロゲンイオンとの塩等が挙げられる。

ラパマイシン若しくはその類似体又は薬学的に許容されるこれらの塩は、水和物又は溶媒和物の形態をとっていてもよい。このような溶媒としては、例えば、水、エタノール等が挙げられる。
ラパマイシン若しくはその類似体又は薬学的に許容されるこれらの塩には幾何異性体又は光学異性体が存在し得、これら異性体も本発明の有効成分と成り得る。また、ＦＫ５０６若しくはその類似体又は薬学的に許容されるこれらの塩にプロトン互変異性が存在する場合には、これら互変異性体も本発明の有効成分に成り得る。

ラパマイシン、又はその類似体若しくは異性体又は薬学的に許容されるこれらの塩については、米国特許第３，９２９，９９２号、５，３６２，７１８号、米国特許第５，３６２，７１８号、米国特許第５，６６５，７７２号、米国特許第７，０９１，２１３号、国際公開第９９／１５５３０号等に詳細に記載されており、その薬理活性についても確認されている。ラパマイシン、又はその類似体のプロドラッグについては、例えば特許文献１８に詳細に記載されており、本発明の医薬組成物は、これら化合物を有効成分とすることもできる。具体的には、アセチル、エタノイル、ピバロイル、ピバロイルオキシメチル、アセトキシジメチル、フタリジル、メトキシジメチル、インダニル等の生理条件下で加水分解されるエステルを挙げることができる。

本発明の実施形態において、上述した各種有効成分を組み合わせる事もでき、医薬組成物中に２種以上の有効成分を含有させてもよく、個々の有効成分を含む医薬組成物を調製して、２種以上の医薬組成物を併用してもよい。この際、個々の医薬組成物は、投与時に混合した後に投与しても良いし、個々の医薬組成物を同じ時間帯で別々に投与してもよいし、個々の医薬組成物を異なる時間で投与してもよい。

本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、若しくは皮下注射、局所的、経直腸的、経皮的、脊髄内的又は経鼻的）に投与することができる。経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤等が挙げられる。非経口投与のための剤型としては、例えば、注射用水性剤、注射用油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤等が挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、医薬分野において通常使用される無毒性かつ不活性な担体又は添加剤を含有することができる。

医薬用担体としては、通常、医薬分野において常用され、かつ有効成分と反応しない物質が用いられ、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤等の医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤が用いられる。
錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤の製造に用いられる医薬用担体の具体例としては、乳糖、トウモロコシデンプン、白糖、マンニトール、硫酸カルシウム、及び結晶セルロース等の賦形剤、カルメロースナトリウム、変性デンプン、及びカルメロースカルシウム等の崩壊剤、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、及びポリビニルピロリドン等の結合剤、並びに、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、及び硬化油等の滑沢剤が挙げられる。錠剤は、カルナウバロウ、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、ヒドロキシプロピルメチルフタレート、セルロースアセテートフタレート、白糖、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、及びリン酸カルシウム等のコーティング剤を用い、周知の方法でコーティングしてもよい。
坐剤の基剤の具体例としては、カカオ脂、飽和脂肪酸グリセリンエステル、グリセロゼラチン、マクロゴールが挙げられる。坐剤製造にあたっては、必要に応じて界面活性剤、保存剤等を添加することができる。
液剤は、通常、有効成分を注射用蒸留水に溶解して調製してもよいが、必要に応じて溶解補助剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤等を添加することができる。

本発明の医薬組成物における有効成分の含有量は、有効成分の種類、並びにその剤形及び投与形態に応じて異なるが、通常、医薬組成物中０．０５～１０質量％であることが好ましく、０．１～５質量％であることがより好ましい。医薬組成物が液剤である場合、有効成分のモル濃度は、０．１～１００ｍＭであることが好ましく、０．５～５０ｍＭであることがより好ましい。

本発明の医薬組成物の用量は、投与の目的、投与方法、投与対象の状況（性別、年齢、体重、病状等）によって異なるが、ヒトに対して投与される場合、例えば、０．０１ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇから１００ｍｇの有効成分が、投与されるように用いられる。また一実施形態として、ヒトに対して投与される場合、０．０１ｍｇから１０００ｍｇ、好ましくは０．１ｍｇから１００ｍｇ、より好ましくは１ｍｇから１０ｍｇの有効成分が、１日１回、毎日投与されるように用いられる。上記式（I）又は（IV）の化合物を有効成分とする医薬組成物については、多くの臨床実績があり、これを参考に用量を決めることが好ましい。

治療対象は、Ifitm5の変異を有する動物である。通常、周産期致死に至らなかった哺乳動物が対象となり、Ifitm5の変異を有するヒトに対して好適に用いられる。特に治療法の確立が喫緊の課題であるIfitm5の変異に起因する骨形成不全症、より具体的にはc.-14C>T変異（Ｖ型骨形成不全症）又はc.119C>T変異に起因する骨形成不全症への適用が望まれる。後述する実施例に示す通り、ＦＫ５０６またはその類似体は、特に骨塩量を改善する点で優れた効果を発揮し、一部の個体では、骨変形を改善する効果も確認されている。また、ラパマイシン及びその類似体は、特に、異所性の骨化や仮骨の過剰形成を改善することが期待される。

以下、実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

［実施例１］マウス骨芽様細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の増殖、石灰化および骨形成関連遺伝子に対するＦＫ５０６の影響

（実験方法）
マウス骨芽様細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１を増殖培地（１０％ fetal bovine serum、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むα-Modified Eagle’s Medium）に分散させ、１２ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ（１０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２）添加し、３７℃で培養した。２日後に、ＤＭＳＯに溶解したＦＫ５０６（Invivogen）を添加した分化培地（増殖培地にアスコルビン酸とβ－グリセロリン酸をそれぞれ５０μｇ／ｍｌおよび２ｍｍｏｌ／ｌになるように添加して調製）に交換し、さらに１９日間培養した。対照群は、ＤＭＳＯを０．２４％になるように添加した分化培地に交換し、１９日間培養した。対照群、ＦＫ５０６添加群およびラパマイシン添加群は３日毎に新しい培地に交換した。

石灰化の程度はアリザリン染色によって調べた。細胞をＰＢＳ（１ｍｌ）で３回洗浄した後、７０％エタノール（１ｍｌ）を加えて室温で１５分間、細胞を固定した。その後、細胞を水で３回洗浄し、１％ Alizarin red S (Wako Chemical)溶液を５００μｌ加えた。室温で３０分間インキュベーションした後、水で３回洗浄してリン酸カルシウムの結節を検出した。

細胞の増殖はＷＳＴ ａｓｓａｙ（DOJINDO）によって行った。アッセイは、キット説明書に従って測定した。

Ｉｆｉｔｍ５、Ｂｇｌａｐ２、ＩｂｓｐおよびＣｏｌ１ａ１の遺伝子発現量を調べるため、以下の方法でＲＮＡを抽出し精製した。
培養した細胞をＰＢＳで２回洗浄した後、ＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene）を８００μｌ添加した。ピペッティングして細胞を破壊した後、この溶液を１．５ｍｌチューブに移し、２５℃で１５分間静置した。このチューブにクロロホルムを２００μｌ加え、４℃で５分間静置した後、１２，０００ｘｇで１５分間、４℃で遠心した。回収した上澄みの水層に、２－プロパノールを上澄みの水層と同量加え、４℃で一晩静置した。この溶液を１２，０００ｘｇで２０分間、４℃で遠心した後、上澄みを除去し、７０％エタノールを加えた。さらにこの溶液を１２，０００ｘｇで２０分間、４℃で遠心した後、上澄みを除去し、核酸の沈殿を風乾した。この沈殿はＤＥＰＣ処理水１６．５μｌに溶解した。
核酸の沈殿を溶解したＤＥＰＣ処理水に２μｌの１０×DNase I buffer(Takara)および０．５ｕｌのRNase inhibitor (Takara)を加えた後、DNaseI(Takara)を１μｌ（２Ｕ）を加えてピペッティングし、３７℃で３０分間インキュベートすることによってＤＮＡを分解した。
ＲＮＡを精製するために、ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡ溶液にAgencourt RNAClean XP (Beckman)を２０ｕＬ加え、マグネットプレート上で２５℃で５分間静置して磁気ビーズを沈降させ、上澄みを除去した。チューブに残ったリング状に配置した磁気ビーズに２００μｌの７０％エタノールを加え、３０秒後に７０％エタノールを除去した。これを３回行った後、２５℃で１０分間乾燥させた。乾燥したリング状に配置した磁気ビーズに１０μｌのＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅの水を加え、ピペッティングした後、２５℃で５分間静置して溶液を回収した。
回収した精製ＲＮＡの０．５μｇを、PrimeScript RT reagent Kit（Takara）により逆転写し、ｃＤＮＡとした。このｃＤＮＡにLight Cycler 480 SYBR Green I Master（Roche）の試薬を説明書の指示に従って添加し、リアルタイム定量ＰＣＲ（LightCycler480, Roche）によって遺伝子発現量の解析を行った。各遺伝子のリアルタイム定量ＰＣＲのためのプライマー配列を表１に示す。

（実験結果）
ＦＫ５０６の濃度の違いによる分化培地での細胞増殖能を図１に示す。各遺伝子の発現量はＧａｐｄｈの発現量との比として表した。
ＦＫ５０６の濃度が４０μｇ／ｍｌにおいてはＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞は死滅したが、５、１０及び２０μｇ／ｍｌの濃度においては対照（０μｇ／ｍｌ）とほぼ同様の増殖能を示した。これらの濃度において、細胞は５日以内にほぼコンフルエントに達した。
分化培地での石灰化に及ぼすＦＫ５０６の濃度の影響を図２に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）においては５日目以降に石灰化した。ＦＫ５０６を添加した分化培地においては、５および１０μｇ／ｍｌの添加で１９日目に若干の石灰化が観察されたが、２０μｇ／ｍｌでは石灰化はほとんど観察されなかった。
分化培地でのＩｆｉｔｍ５発現に及ぼすＦＫ５０６の濃度の影響を図３に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）においては、石灰化が始まる前の５日目においてＩｆｉｔｍ５の発現量が増加し、１６日目まで高い発現量を維持したが、１９日目において発現量は低下した。一方、ＦＫ５０６を５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した分化培地においては、５日目でＩｆｉｔｍ５の発現の増加が観察されたが、発現量は対照に比べて約５０％であった。５日目以降においてはＩｆｉｔｍ５の発現量は低下した。Ｉｆｉｔｍ５発現量に及ぼすＦＫ５０６濃度の影響については、有意差は観察されなかった。
オステオカルシンの遺伝子であるＢｇｌａｐ２、および骨シアロタンパク質の遺伝子であるＩｂｓｐの発現を石灰化のマーカーとして用いた。図４に示すように、対照（０μｇ／ｍｌ）におけるＢｇｌａｐ２の発現量は、石灰化が始まる前の５日目では低いが、石灰化が始まった７日目には増加し、１９日目まで高い発現量を維持した。一方、ＦＫ５０６を５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した分化培地においては、Ｂｇｌａｐ２発現量の大きな増加は観察されなかった。また、図５に示すように、対照（０μｇ／ｍｌ）におけるＩｂｓｐ発現量は、石灰化が始まる前の５日目において増加し、１９日目まで高い発現量を維持していた。一方、ＦＫ５０６を５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した分化培地においては、Ｉｂｓｐ発現量の大きな増加は観察されなかった。
さらに、骨基質であるＩ型コラーゲンの遺伝子Ｃｏｌ１ａ１の発現量の変化を図６に示す。ＦＫ５０６を５、１０又は２０μｇ／ｍｌの濃度で添加した分化培地において、Ｃｏｌ１ａ１の発現量は培養全期間を通して対照（０μｇ／ｍｌ）の５０％以下であった。
これらの結果は、ＦＫ５０６は骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の増殖には影響しないが、石灰化を抑制し、Ｉｆｉｔｍ５の発現を抑制するとともに、オステオカルシン、骨シアロタンパク質及びＩ型コラーゲンの産生を抑制することを示している。

［実施例２］マウス骨芽様細胞株ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の増殖、石灰化および骨形成関連遺伝子に対するラパマイシンの影響
ＦＫ５０６に代え、ラパマイシンを所定量用いた以外は、実施例１の実験方法と同様にして、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の増殖、石灰化および骨形成関連遺伝子の発現に及ぼすラパマイシンの影響を調べた。
ラパマイシンの濃度の違いによる分化培地でのＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の増殖特性を図７に示す。対照（０ｎｍｏｌ／ｌ）では、５日以内にＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞がコンフルエントに達するのに対し、ラパマイシンを２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌ添加した分化培地では、５日目以降に増殖し始め、９～１２日でコンフルエントに達した。
分化培地での石灰化に及ぼすラパマイシンの濃度の影響を図８に示す。対照（０ｎｍｏｌ／ｌ）においては５日目以降に石灰化した。一方、ラパマイシンを２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度で添加した分化培地では、１４日目以降に石灰化した。
分化培地でのＩｆｉｔｍ５発現に及ぼすラパマイシンの濃度の影響を図９に示す。対照（０ｎｍｏｌ／ｌ）においては、石灰化が始まる前の５日目においてＩｆｉｔｍ５の発現量が増加し、１６日目まで高い発現量を維持したが、１９日目において発現量は低下した。一方、ラパマイシンを２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度で添加した分化培地では、石灰化が起こっていない９日目にＩｆｉｔｍ５の発現量は増加し、その発現量は１９日目までほぼ一定であった。また、ラパマイシンを添加したときのＩｆｉｔｍ５の発現量は、対照（０ｎｍｏｌ／ｌ）での発現量に比べ、顕著に低かった。
分化培地でのＢｇｌａｐ２発現に及ぼすラパマイシンの濃度の影響を図１０に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）におけるＢｇｌａｐ２の発現量は、石灰化が始まる前の５日目では低いが、石灰化が始まった７日目には増加し、１９日目まで高い発現量を維持した。一方、ラパマイシンを２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度で添加した分化培地では、石灰化が観察された１６日目と１９日目でＢｇｌａｐ２の発現が観察されたが、その発現量は対照の５０％程度であった。
分化培地でのＩｂｓｐ発現に及ぼすラパマイシンの濃度の影響を図１１に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）におけるＩｂｓｐの発現量は、石灰化が始まる前の５日目において増加し、１９日目まで高い発現量を維持していた。一方、ラパマイシンを２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度で添加した分化培地では、石灰化が観察された１６日目と１９日目でＩｂｓｐの発現量は増加したが、その発現量は対照の３０％程度であった。
骨基質であるＩ型コラーゲンの遺伝子Ｃｏｌ１ａ１の発現量の変化を図１２に示す。ラパマイシンを２００、４００、８００又は１２００ｎｍｏｌ／ｌの濃度で添加した分化培地において、Ｃｏｌ１ａ１の発現量は培養全期間を通して対照の３０～５０％程度であった。
これらの結果は、ラパマイシンはマウス骨芽様細胞ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１の増殖を遅延させ、それに伴い石灰化も遅延し、石灰化前および石灰化期においてＩｆｉｔｍ５の発現を抑制するとともに、石灰化期においてオステオカルシン、骨シアロタンパク質及びＩ型コラーゲンの産生量も低下させることを示唆している。

［実施例３］ヒト骨肉腫解剖株Ｓａｏｓ－２の増殖、石灰化および骨形成関連遺伝子に対するＦＫ５０６の影響
（実験方法）
ヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２を１０％ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ'ｓ５Ａ培地に分散させ、１２ウェルプレートの各ウェルに１ｍｌ（３０，０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２）添加し、３７℃で培養した。３日後に、ＤＭＳＯに溶解したＦＫ５０６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を含む分化培地（ＭｃＣｏｙ‘ｓ５Ａ培地に１０^－８Ｍデキサメタゾン、５０μｇ／ｍＬアスコルビン酸、１０ｍＭβ－グリセロリン酸を添加）に交換し、８日間培養した。対照群は、ＤＭＳＯを０．２４％になるように添加した分化培地に交換した。対照群、ＦＫ５０６添加群は３日毎に新しい培地に交換した。
石灰化の測定および遺伝子発現解析のためのＲＮＡ抽出方法は、実施例１と同様な方法で行った。リアルタイム定量ＰＣＲのための遺伝子のプライマー配列を表２に示す。

（実験結果）
分化培地でヒト骨肉腫細胞株Ｓａｏｓ－２の石灰化に及ぼすＦＫ５０６の濃度の影響を図１３に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）においては２日目から石灰化が開始され８日目には全面がアリザリンで染色された。ＦＫ５０６を添加した分化培地においては、５および１０μｇ／ｍｌの添加で２日目から石灰化が開始され、８日目には、対照群より若干染色の度合いが低いが培養皿全面がアリザリンで染色された。この結果は、ヒト骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ－２においては、ＦＫ５０６は石灰化に大きな影響を与えないことを示している。
Ｉｆｉｔｍ５発現に及ぼすＦＫ５０６の影響を図１４に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）においては、４日目からＩｆｉｔｍ５の発現量が増加した。一方、ＦＫ５０６を５、１０μｇ／ｍｌの濃度で添加した分化培地においては、４日目以降においてもＩｆｉｔｍ５の発現量はほとんど増加しなかった。この結果は、ヒト骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ－２においては、ＦＫ５０６はＩｆｉｔｍ５の発現を抑制する効果が大きいことを示している。
石灰化のマーカーとして用いられているオステオカルシン遺伝子Ｂｇｌａｐ２および骨シアロタンパク質遺伝子Ｉｂｓｐの発現に及ぼすＦＫ５０６の影響をそれぞれ図１５および図１６に示す。ＦＫ５０６を分化培地に添加したときのＢｇｌａｐ２の発現レベルは、培養期間を通して対照と変わらなかった。また、Ｉｂｓｐの発現量は、ＦＫ５０６を添加した場合、対照の発現量よりも低くなることはなかった。
骨基質であるＩ型コラーゲンの遺伝子Ｃｏｌ１ａ１の発現量の変化を図１７に示す。ＦＫ５０６を添加した場合のＣｏｌ１ａ１の発現量は、培養期間を通して対照と同等であった。
これらの結果は、ヒト骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ－２において、ＦＫ５０６はＩｆｉｔｍ５の発現を抑制するが、石灰化に大きな影響を及ぼさず、石灰化期においてオステオカルシン、骨シアロタンパク質及びＩ型コラーゲンの産生量を低下させないことを示唆している。

［実施例４］ヒト骨肉腫解剖株Ｓａｏｓ－２の増殖、石灰化および骨形成関連遺伝子に対するラパマイシンの影響
ＦＫ５０６に代え、ラパマイシン（ナカライテスク）を所定量用いた以外は、実施例３に示した実験方法と同様にして、ヒト骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ－２の石灰化および骨形成関連遺伝子に及ぼすラパマイシンの影響を調べた。
分化培地での石灰化に及ぼすラパマイシン濃度の影響を図１８に示す。ラパマイシンを添加したときの石灰化の程度は、対照に比べて若干低下した。
Ｉｆｉｔｍ５、Ｂｇｌａｐ２、ＩｂｓｐおよびＣｏｌ１ａ１の発現に及ぼすラパマイシンの影響をそれぞれ図１９、２０、２１及び２２に示す。実施例３に示したＦＫ５０６と同様に、ラパマイシンもＩｆｉｔｍ５の発現量を抑制するが、Ｂｇｌａｐ２、Ｉｂｓｐ及びＣｏｌ１ａ１の発現量には影響を与えなかった。
これらの結果は、ヒト骨肉腫細胞株であるＳａｏｓ－２において、ラパマイシンはＩｆｉｔｍ５の発現を抑制するが、石灰化に大きな影響を及ぼさず、石灰化期においてオステオカルシン、骨シアロタンパク質及びＩ型コラーゲンの産生量を低下させないことを示唆している。

［実施例５］マウス頭蓋由来骨芽細胞の増殖、石灰化および骨形成関連遺伝子に対するＦＫ５０６の影響

（実験方法）マウス頭蓋由来骨芽細胞(コスモバイオ、#OBC11: Lot No.SBL C_OBM)を増殖培地（コスモバイオ、ＯＢＣＭ）に２．５３×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように分散し、２４ウェルプレートの各ウェルに細胞を分散した増殖培地を５００μＬ入れて３７℃で培養した。５日後にＤＭＳＯに溶解したＦＫ５０６を添加した分化培地（コスモバイオ、ＯＧＣＭＯ、Lot.SAI-DM-OG）と交換し３日毎にＦＫ５０６を含む新鮮な分化培地と交換した。ＦＫ５０６を含まない対照にはＤＭＳＯを０．２４％になるように添加した。アリザリン染色は実施例１に記載した方法で行った。また、Ｉｆｉｔｍ５、Ｂｇｌａｐ２、ＩｂｓｐおよびＣｏｌ１ａ１の各遺伝子発現も実施例１に記載した方法で行った。

（実験結果）
分化培地での石灰化に及ぼすＦＫ５０６の濃度の影響を図２３に示す。対照（０μｇ／ｍｌ）においては１１日目以降に石灰化が開始し、３５日目および３８日目でアリザリンによって染色されるカルシウムが顕著になった。一方、ＦＫ５０６を添加した分化培地においては、ＦＫ５０６の添加濃度が高くなるにしたがって、石灰化の程度が減少した。
Ｉｆｉｔｍ５の発現に及ぼすＦＫ５０６の影響を図２４に示す。Ｉｆｉｔｍ５の発現量は、ＦＫ５０６の添加濃度が高くなるにしたがって減少し、２０μｇ／ｍｌの添加量で強い発現抑制効果が観察された。
Ｉｆｉｔｍ５、Ｂｇｌａｐ２、ＩｂｓｐおよびＣｏｌ１ａ１の発現に及ぼすＦＫ５０６の影響をそれぞれ図２５、図２６及び図２７に示す。いずれの遺伝子の発現量もＦＫ５０６の添加濃度が高くなるにしたがって減少し、２０μｇ／ｍｌの添加量で強い発現抑制効果が観察された。

［実施例６］c.-14C>T変異をヘテロ接合で有するゲノム編集マウスの胎児に対するＦＫ５０６及びラパマイシンの影響

（実験方法）
Ｉｆｉｔｍ５にc.-14C>T変異を有するキメラマウスの作製
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスは日本クレア株式会社（CREA Japan Inc.）から購入した。Ｃａｓ９、ｃｒＲＮＡ－１、ｃｒＲＮＡ－２、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびsingle-stranded (ss) oligodeoxynucleotide（ODN）はＦａｓｍａｃ（Kanagawa, Japan）から購入した。ｃｒＲＮＡ－１、ｃｒＲＮＡ－２、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｓｓＯＤＮの塩基配列を表３に示す。太字と下線で示したアミノ酸が変異部分である。

過排卵を誘導するため、雌の４週齢のＣ５７ＢＬ／６ＪＪｃｌマウスにCARD HyperOva（登録商標、九動株式会社より購入）を１００μＬ／匹で腹腔内投与し、CARD HyperOva（登録商標）投与から４８時間後にｈＣＧ（あすか製薬株式会社より購入）を５ｕｎｉｔ／匹で腹腔内投与した。さらに、１５時間後、採取した卵管の卵管膨大部を切開し、卵子隗をＨＴＦ培地（アーク・リソース株式会社より購入）に移した。一方、１０週齢の雄マウスの精巣上体尾部から精子を採取し、ＦＥＲＴＩＵＰ（登録商標、マウス精子前培養液、九動株式会社より購入）中で精子を３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で１時間前培養した。卵子隗を入れたＨＴＦ中に前培養した精子を入れ、体外受精を開始した。体外受精開始から５時間後に雄性前核、雌性前核の両方が観察される胚を選別し、エレクトロポレーション（電圧：２２５Ｖ、パルス幅：０．５および１．０ｍｓｅｃ、パルス間隔：５０ｍｓｅｃ、回数：４回；NEPA21 TypeII、ネッパジーン株式会社）により、Ｃａｓ９タンパク（最終濃度１００ｎｇ／μｌ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（最終濃度２００ｎｇ／μｌ）、ｃｒＲＮＡ（最終濃度２００ｎｇ／μｌ）、およびｓｓＯＤＮ（最終濃度２００ｎｇ／μｌ）を含む混合液（４０μｌ）を胚に導入した。エレクトロポレーションした胚はＫＳＯＭ培地（アーク・リソース株式会社より購入）に移し、一晩３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内で培養した。
エレクトロポレーションした受精卵の移植は、麻酔下で行った。膣栓確認当日の偽妊娠マウスを、塩酸メデトミジン（日本全薬工業株式会社より購入）、ミダゾラム（アステラス製薬株式会社より購入）、酒石酸ブトルファノール（Meiji Seikaファルマ株式会社より購入）で調製した３種混合麻酔薬を腹腔内投与して麻酔し、エレクトロポレーション後の２細胞期胚を経卵管壁卵管内胚移植法により移植した。胚移植後に塩酸アチパメゾール（日本全薬工業株式会社より購入）を腹腔内投与し、マウスを麻酔から覚醒した。胚移植日翌日を１日目として、１９日目にファウンダーマウス（Ｆ０マウス）の出産を確認した。誕生したＦ０マウスのモザイク率を調べるため、尾端からＤＮＡを回収し、次世代シーケンサーによってＩｆｉｔｍ５領域の塩基配列を解析して、ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異を確認した。

ヘテロ接合体マウスの作製並びにＦＫ５０６及びラパマイシンの投与
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスによって作製されたｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異を有する雄のキメラマウスを、雌の野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと交配させた。
受精後の雌のマウスの妊娠確認後、妊娠１４．５日目の母親マウスをペントバルビタールおよびイソフルランにより麻酔したのちに開腹し、子宮を通して胎児の腹腔に３３－ｇａｕｇｅシリンジにより直接ＦＫ５０６（FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation, Osaka, Japan）あるいはラパマイシン（LC Laboratories, MA, USA）を投与した。ＦＫ５０６は３０％エタノールに０．５ｍｇ／ｍｌの濃度となるように溶解した。ＦＫ５０６の胎仔の腹腔への投与量は、１ｍｇ／ｋｇとした。ラパマイシンの投与においては、エタノールに溶解したラパマイシン（２５ｍｇ／ｍｌ）を、５％ＰＥＧ４００および５％Ｔｗｅｅｎ８０を含む溶液で最終濃度が０．０３ｍｇ／ｍｌになるように希釈し、この溶液を１０μｌ（１．０ｍｇ／ｋｇ）投与した。胎仔への投与後、母親マウスの腹部を縫合し、自然出産させた。
死産したマウス及び誕生したマウスの尾端からＤＮＡを抽出し、Ｉｆｉｔｍ５領域の塩基配列をサンガー法によって以下に記載する手順で解析した。また、死産したマウス及び誕生したマウスの骨を、マイクロフォーカスＸ線ＣＴにより以下に記載する手順で観察した。

塩基配列の決定方法
Ｆ０マウスのＩｆｉｔｍ５領域の塩基配列は次世代シーケンサー（MiSeq、Illumina）により解析した。マウスの尾端を５ｍｍ切断し、３００μｌの２５ｍｍｏｌ／ｌＮａＣｌ溶液に入れ、９８℃で３０分間インキュベートしてＤＮＡを抽出した。抽出したＤＮＡはエタノールにより精製した後、ExTaq HS (TaKaRa)を用いて１ｓｔＰＣＲ（[94℃-2min]×1 cycle→[94℃-30sec,50℃-30sec,72℃-30sec]×20 cycles→[72℃-5min]×1 cycle→[4℃-∞]）を行った。この１^ｓｔＰＣＲに用いたプライマーは、
forward, 5’-acactctttccctacacgacgctcttccgatctCTGGTGGGTGGTCTACAGCCACTGC-3’（配列番号２７）;及び
reverse, 5’-tgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctAGGCAGCACAGATTCAGGTACATCG-3’（配列番号２８）
であった（小文字は２^ｎｄＰＣＲで増幅させるための配列）。このＰＣＲ産物をAgencourt AMPure XP（Beckman Coulter）により精製後、２^ｎｄＰＣＲ（[94℃-2min]×1 cycle→[94℃-30sec,60℃-30sec,72℃-30sec]×8 cycles→[72℃-5min]×1 cycle→[4℃-∞]）を行った。2^ndPCRに用いたプライマーは、
forward, 5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNACACTCTTTCCCTACACGACGC-3’（配列番号２９）;及び
reverse, 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACGTGTG-3’（配列番号３０）
であった（Nは各サンプルを識別するためのタグ配列）。得られたPCR産物はAgencourt AMPure XPで精製した後、MiSeq Reagent Kit v3 (Illumina)を用いて、MiSeq (Illumina)により塩基配列の解析を行った。
Ｆ１マウスのＩｆｉｔｍ５領域の塩基配列はサンガー法により解析した。尾端から抽出したＤＮＡは、
forward, 5’-CTGGTGGGTGGTCTACAGCCACTGC-3’ （配列番号３１）;
reverse, 5’-AGGCAGCACAGATTCAGGTACATCG-3’ （配列番号３２）
のプライマーを用いて、ＰＣＲ（[95℃-2min]×1 cycle→[98℃-10sec, 68℃-40sec]×35 cycles）で増幅した。増幅したＤＮＡの塩基配列は、Applied Biosystems BigDye Termination V3.1（Thermo Fisher Scientific）を用いて、Applied Biosystems 3730xl DNA analyzerで解析した。

Ｘ線ＣＴ測定
マウスの骨の観察・計測にはマイクロフォーカスＸ線ＣＴ装置（株式会社島津製作所（京都府京都市）、ＳＭＸ－１６０ＣＴＳ）を用いた。低エネルギーＸ線を除去するために厚さ０．１ｍｍの真鍮板フィルターをセンサー前に装着した。測定サンプルのマウスは冷凍保存した死体で、脱脂綿に包んで姿勢を垂直に保持し、装置内にセットした。Ｘ線ＣＴ測定条件は、Ｘ線管電圧６０～８０ｋＶ、Ｘ線パワー１００、ＳＩＤ(Source Image Distance)２５０～３００ｍｍ、ＳＯＤ(Source Object Distance)１１０～１６０ｍｍ、ＣＴモードＣＯＮＥ ＣＴ／Ｎｏｒｍａｌ Ｓｃａｎ／Ｆｕｌｌ Ｓｃａｎ、Ｖｉｅｗ数１２００枚、スキャン平均回数１６回、スケーリングファクター１００、Ｘ・Ｙピクセル数１０２４、ピクセルサイズ２０～４０μｍ／ｐｉｘｅｌ、出力画像ファイル１６ビットＴＩＦＦで、マウスの全身をスキャンした。なお、いずれのサンプルもＣＴ値がサチュレーションしていないことを確認した。サンプル測定と同一の測定条件で標準物質のＸ線ＣＴ測定も実施した。標準物質にはラトックシステムエンジニアリング株式会社（東京都文京区）のBone Mineral Density (BMD)計測ファントムNo06-U5D1mmHを使用した。これはウレタン樹脂にハイドロキシアパタイト結晶を混合したファントム５種類から成り、ＢＭＤがそれぞれ１００、２００、３００、４００及び５００ｍｇ／ｃｍ^３である。ファントムの測定結果からＢＭＤとＣＴ値の対応について５点で回帰直線を求めて検量線とした。回帰直線のＲ^２はいずれも０．９９５以上であった。各サンプルのＸ線ＣＴ測定結果は対応する検量線を適用してＣＴ値を補正した。全身骨格の骨領域の抽出は、ＢＭＤ ９０ｍｇ／ｃｍ^３を閾値として二値化後、微小ノイズを除去するために半径２．０ピクセルの３Ｄ ｍｅｄｉａｎ ｆｉｌｔｅｒを適用することで行なった。ただし、一部の骨領域にはアーティファクトが認められたため手動で修正した。頭部および肋骨＋胸椎の骨領域は全身骨格の骨領域から手動で作成した。骨領域に含まれるピクセル数とピクセルサイズから骨体積を計算した。また、骨領域に含まれる各ピクセルの補正後ＣＴ値の合計値からＢＭＤの合計値を計算し、１ピクセル当たりの体積を乗じることで骨塩量を求めた。

ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異を有するキメラマウスの雄と野生型マウスの雌とを交配し、ＦＫ５０６もラパマイシンも投与せずに誕生したマウスには、死産した個体と生存した個体があった。遺伝子解析の結果、死産した個体はすべてｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスであり、生存した個体はすべて野生型であった。図２８に誕生直後の野生型マウスとｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの全身骨格のμＣＴ像を示す。ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスは、四肢が短く、大腿骨、脛骨、腓骨、橈骨、尺骨が屈曲し、肋骨は細く波打ち外側に広がる傾向があり、また、頭部の骨化が不十分であった。これらの骨異常の特徴は、非特許文献２０で報告されているゲノム編集で創出されたｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの特徴と同様であった。

ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスは周産期致死であったため、ヒトのＶ型骨形成不全症患者に診られる仮骨の過剰形成や異所性化、橈骨骨頭の脱臼などの症状を発症するのかどうかを調べることはできなかった。しかし、本試験でも、ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異がマウスの骨形態の異常の原因であることが確認された。

野生型の出産直後のマウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、ＦＫ５０６を胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの全身骨格のμＣＴ像を図２９に示す。ＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のマウスにおいても四肢および肋骨の変形は改善されなかった。しかしながら、肋骨がＦＫ５０６を投与していない周産期致死のマウスに比べて太くなっていることが観察された。そこで、ＦＫ５０６を胎児に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔の骨塩量を、野生型マウスおよびＦＫ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔と比較した。
図３０に、野生型マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの全身骨格の骨塩量を示す。ＦＫ５０６を胎仔に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔における骨塩量は、野生型マウスの骨塩量の７７％であったが、ＦＫ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの骨塩量よりも１．７倍（ｐ＝０．０１３）増加し、野生型マウスの骨塩量と有意差は観察されなかった。この結果より、胎仔へのＦＫ５０６の直接投与は、全身骨格の骨塩量を改善する効果があることがわかった。
図３１及び図３２に、野生型マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの肋骨および胸椎の骨塩量及びμＣＴ像を示す。ＦＫ５０６を胎仔に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔における肋骨および胸椎の骨塩量は、野生型マウスの骨塩量の７８％であったが、ＦＫ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの骨塩量よりも１．９倍（ｐ＝０．０１６）増加し、野生型マウスの肋骨および胸椎の骨塩量と有意差は観察されなかった。
図３３及び図３４に、野生型マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、及びＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの頭蓋骨の骨塩量を示す。ＦＫ５０６を胎仔に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔における頭蓋骨の骨塩量は、野生型マウスの骨塩量の５７％であったが、ＦＫ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの骨塩量よりも１．７倍（ｐ＝０．０１３）増加した。
図３５及び図３６に、野生型マウス、ＦＫ５０６を投与していない周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、ＦＫ５０６を胎仔に直接投与した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの脛骨および腓骨の骨塩量を示す。ＦＫ５０６を胎仔に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔における脛骨および腓骨の骨塩量は、野生型マウスの骨塩量の７５％であったが、ＦＫ５０６を投与していないｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの骨塩量よりも１．４５倍（ｐ＝０．０８０）増加した。また、ＦＫ５０６を胎仔に直接投与したｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウスの新生仔において、脛骨および腓骨の変形が改善される個体（図３６Cの右から3番目、および一番右）が観察された。
図３７に、野生型の出産直後のマウス、ラパマイシンを投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、ラパマイシンを胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、およびラパマイシンを胎仔に直接投与し生存した野生型の出産直後のマウスの全身骨格のμＣＴ像を示す。ラパマイシンを胎仔に直接投与したヘテロ接合体マウスも周産期致死であり、四肢および肋骨の変形は改善されなかった。
図３８に野生型の出産直後のマウス、ラパマイシンを投与していない周産期致死であったｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、ラパマイシンを胎仔に直接投与し死産した周産期致死のｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異のヘテロ接合体マウス、およびラパマイシンを胎仔に直接投与し生存した野生型の出産直後のマウスの全身骨格の骨塩量を示す。ラパマイシンを投与した周産期致死のヘテロ接合変異体マウスの全身骨格の骨塩量は、ラパマイシンを投与していないヘテロ接合変異体の５２％（ｐ＝０．００５５）まで減少していた。一方、ラパマイシンを投与した野生型マウスの出生直後の骨塩量は、ラパマイシンを投与していない野生型マウスの骨塩量と有意な差は観察されなかった。
骨塩量を増加させたＦＫ５０６はカルシニューリンを阻害するのに対し、ラパマイシンはmammalian target of rapamycin (mTOR) pathwayを阻害する免疫抑制剤である。ラパマイシンがヘテロ接合変異体の骨塩量のみを低下させたことは、ヘテロ接合変異体の骨形成は部分的にｍＴＯＲを介したシグナル伝達経路に依存していることを示唆している。一方、野生型マウスではラパマイシンによる骨塩量の低下が観察されなかったので、少なくとも胚発生過程においては、野生型マウスの骨形成におけるｍＴＯＲの関与は小さいと考えられる。進行性骨化性線維異形成症（fibrodysplasia ossificans progressiva; FOP）の異所性骨化を抑制する候補薬としてラパマイシンが同定されている（特許文献１及び非特許文献２９）。ＦＯＰでは、変異したＡＣＶＲ１（ＡＬＫ２としても知られる）にactivin-Aが結合することによりＢＭＰを介したシグナル経路が活性化し、ＥＮＰＰ２産生を誘導する。産生されたＥＮＰＰ２がmTORC1 signalingを活性化することによって異常な軟骨形成が起こり、その結果、異所性骨化が誘導される。Ｖ型骨形成不全症の特徴である前腕骨間膜の石灰化や仮骨の過剰形成がどのようなメカニズムで起こるのかは現在のところ不明である。野生型マウスの骨形成と異なり、ヘテロ接合変異体マウスの骨形成が部分的にmTORを介したシグナル伝達経路に依存しているという結果は、Ｖ型骨形成不全症に特徴的な異所性骨化や仮骨の過剰形成と関連している可能性が高い。

Claims (2)

1. ｃ．－１４Ｃ＞Ｔ変異を含む変異Ｉｆｉｔｍ５を有する患者の骨形成不全症を治療するための医薬組成物であって、
   下記式（ＩＩＩ）
   
   で表される化合物、その医薬的に許容される塩、これらの溶媒和物、或いはこれらとデキストリンとの結合体、およびこれらをアセチル化、エタノイル化、ピバロイル化、ピバロイルオキシメチル化、アセトキシジメチル化、フタリジル化、メトキシジメチル化、またはインダニル化したエステルから選択されるプロドラッグを含む、医薬組成物。
2. 前記患者はヒトである、請求項１に記載の医薬組成物。