JP7445250B2 - Expression vector and method for producing target protein - Google Patents
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Description
本発明は、魚類に目的タンパク質を発現させるためのベクターに関する。さらに、このベクターを用いる目的タンパク質の製造方法に関する。 The present invention relates to vectors for expressing target proteins in fish. Furthermore, the present invention relates to a method for producing a target protein using this vector.
組換えタンパク質の発現方法として、大腸菌や酵母等の微生物や、昆虫、哺乳動物の培養細胞による発現方法が知られている。しかし、微生物や昆虫による発現方法では、異種のタンパク質の正確な折り畳みや糖鎖修飾ができず、生物学的に不活性なタンパク質が得られることがある。このような不活性なタンパク質は、目的とする活性が得られないため、その機能や構造を解析することができない。また、哺乳動物の培養細胞等による発現方法では、正確な折り畳みや糖鎖修飾はできるものの、細胞の培養に時間がかかるため、大量のタンパク質を発現させるには、コストが非常に高くなるという問題があった。 As methods for expressing recombinant proteins, methods using microorganisms such as Escherichia coli and yeast, and cultured cells of insects and mammals are known. However, expression methods using microorganisms or insects may not allow accurate folding or glycosylation of heterologous proteins, resulting in biologically inactive proteins. Since such inactive proteins do not exhibit the desired activity, their functions and structures cannot be analyzed. In addition, although expression methods using cultured mammalian cells can achieve accurate folding and glycosylation, it takes time to culture the cells, making it extremely expensive to express a large amount of protein. was there.
受精卵に針を刺して遺伝子等を注入することで、目的とする組換えタンパク質等を製造する技術では、ゼブラフィッシュ等の小型魚卵の利用が有用であることが知られている。
例えば、特許文献1では、魚中でポリペプチドを発現するための発現構築物を用いて魚の胚外組織の細胞や胚組織の細胞中でVII因子、インターロイキン等のポリペプチドを発現する方法が開示されている。また、特許文献2では、特定のプロモーター配列を有するベクターを魚類の受精卵又は胚に導入することで組換えタンパク質を製造する方法が開示されている。
しかし、これらの方法によって目的とする組換えタンパク質を製造することはできるが受精卵1つあたりの発現量が十分とは言えず、実用量を得るには多くの受精卵を必要とする等の問題があった。
It is known that the use of eggs of small fish such as zebrafish is useful in the technology of producing a desired recombinant protein by inserting a gene or the like into a fertilized egg with a needle.
For example,
However, although it is possible to produce the desired recombinant protein using these methods, the amount of expression per fertilized egg is not sufficient, and many fertilized eggs are required to obtain a practical amount. There was a problem.
組み換えタンパク質を高発現させる方法として、特許文献3、4では、特定の配列を含むフラグメントを少なくとも2回タンデムに連結させたコンストラクトを含むDNAをベクターに組み込んで用いる方法や、遺伝子発現カセットを含む直列反復配列を作製し、これを遺伝子導入する方法等が開示されている。しかし、これらの方法はいずれも哺乳動物細胞を対象とするものであり、魚類を対象とするものではなかった。
そこで、本発明者らは実用量の目的タンパク質を、少量の魚類の受精卵や胚等を用いて短期間に製造することが可能なベクターや、このベクターを用いた目的タンパク質の製造方法の開発を試みた。
As methods for highly expressing recombinant proteins,
Therefore, the present inventors developed a vector that can produce a practical amount of the target protein in a short period of time using a small amount of fertilized fish eggs or embryos, and a method for producing the target protein using this vector. I tried.
本発明は、実用量の目的タンパク質を、少量の魚類の受精卵や胚等を用いて短期間に製造することが可能なベクターや、このベクターを用いた目的タンパク質の製造方法の提供を課題とする。 An object of the present invention is to provide a vector capable of producing a practical amount of a target protein in a short period of time using a small amount of fertilized fish eggs or embryos, and a method for producing the target protein using this vector. do.
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、プロモーター配列と、その下流に目的遺伝子を含む同一の遺伝子発現カセットが2回以上タンデムに連結された構造を含むベクターを作製し、本発明を完成するに至った。
本発明で作製したベクターを導入した受精卵や胚等では、1つあたりにおける目的タンパク質の発現量が増加するため、少量の受精卵や胚等の使用でも十分に実用量の目的タンパク質を得ることが可能となる。
このベクターを用いた本発明の目的タンパク質の製造方法では、目的タンパク質の製造にあたり必要とする受精卵等の数が減るため、従来の方法と比べて注入する遺伝子量も減らすことができ、これに伴って注入処理にかかる時間が短縮できるという利点がある。
As a result of intensive research to solve the above problems, the present inventors have developed a vector containing a structure in which a promoter sequence and the same gene expression cassette containing the target gene are linked in tandem two or more times downstream of the promoter sequence. The present invention has been completed.
In the fertilized eggs, embryos, etc. into which the vectors produced by the present invention have been introduced, the expression level of the target protein per individual increases, so it is possible to obtain a sufficient amount of the target protein for practical use even by using a small amount of fertilized eggs, embryos, etc. becomes possible.
In the method for producing the target protein of the present invention using this vector, the number of fertilized eggs etc. required for producing the target protein is reduced, so the amount of gene to be injected can be reduced compared to conventional methods. Accordingly, there is an advantage that the time required for the injection process can be shortened.
すなわち、本発明は、次の（１）～（７）のベクターや目的タンパク質の製造方法等に関する。
（１）魚類に目的タンパク質を発現させるためのベクターであって、プロモーター配列と、その下流に目的遺伝子を含む同一の遺伝子発現カセットが2回以上タンデムに連結された構造を含むベクター。
（２）遺伝子発現カセットがタグ切断配列及びタグ配列を含む上記（１）に記載のベクター。
（３）遺伝子発現カセットがさらにシグナル配列を含む上記（１）又は（２）に記載のベクター。
（４）魚類がゼブラフィッシュである上記（１）～（３）のいずれかに記載のベクター。
（５）上記（１）～（４）のいずれかに記載のベクターを魚類の受精卵又は胚に導入する工程を含む目的タンパク質の製造方法。
（６）魚類がゼブラフィッシュである上記（５）に記載の製造方法。
（７）上記（１）～（４）のいずれかに記載のベクターが導入されたトランスジェニック魚類。
That is, the present invention relates to the following methods (1) to (7) for producing vectors and target proteins.
(1) A vector for expressing a target protein in fish, which includes a promoter sequence and a structure in which the same gene expression cassette containing the target gene is linked in tandem two or more times downstream of the promoter sequence.
(2) The vector according to (1) above, wherein the gene expression cassette includes a tag cleavage sequence and a tag sequence.
(3) The vector according to (1) or (2) above, wherein the gene expression cassette further includes a signal sequence.
(4) The vector according to any one of (1) to (3) above, wherein the fish is a zebrafish.
(5) A method for producing a target protein, which includes the step of introducing the vector according to any one of (1) to (4) above into a fertilized egg or embryo of a fish.
(6) The production method according to (5) above, wherein the fish is zebrafish.
(7) A transgenic fish into which the vector described in any one of (1) to (4) above has been introduced.
本発明のベクターにより、実用量の目的タンパク質を少量の魚類の受精卵や胚等を用いて短期間に製造することが可能となる。
また、本発明の製造方法では生物学的に活性な（ネイティヴな）タンパク質を製造できることから、本発明の製造方法によって、ゲノムライブラリーなどにおいて塩基配列は既知であるが、構造や機能が未知なタンパク質を目的タンパク質として製造し、解析することにより、有用なタンパク質のスクリーニングを行うことも容易となる。
The vector of the present invention makes it possible to produce a practical amount of a target protein in a short period of time using a small amount of fertilized fish eggs, embryos, etc.
In addition, since the production method of the present invention can produce biologically active (native) proteins, the production method of the present invention can be used to produce proteins whose base sequences are known but whose structure and function are unknown, such as in genome libraries. By producing and analyzing a protein as a target protein, it becomes easy to screen for useful proteins.
本発明の「ベクター」とは、魚類において目的タンパク質を発現できるベクターであって、プロモーター配列とその下流に目的遺伝子を含む「遺伝子発現カセット」を含み、この同一の「遺伝子発現カセット」が2回以上タンデムに連結された構造を含むベクターのことを言うことをいう。
「同一の遺伝子発現カセット」とは、同一のプロモーター配列及び同一の目的遺伝子を含む遺伝子発現カセットのことを言う。ここで、同一のプロモーター配列とは、プロモーターをコードする塩基配列として特定した配列と完全に一致する配列であることが好ましいが、90％以上の同一性を有する配列、さらに好ましくは95％以上の同一性を有する配列であればよく、一部が欠失、置換等された配列であっても、同様のプロモーター機能を発揮できる配列も含み得る。
また、同一の目的遺伝子も目的タンパク質をコードする塩基配列として特定した配列と完全に一致する配列であることが好ましいが、90％以上の同一性を有する配列、さらに好ましくは95％以上の同一性を有する配列であればよく、一部が欠失、置換等された配列であっても、同様の性質を有するタンパク質をコードし得る配列も含み得る。
The "vector" of the present invention is a vector capable of expressing a target protein in fish, and includes a promoter sequence and a "gene expression cassette" containing the target gene downstream thereof, and this same "gene expression cassette" is used twice. This refers to a vector containing structures connected in tandem.
"Identical gene expression cassettes" refer to gene expression cassettes containing the same promoter sequence and the same gene of interest. Here, the same promoter sequence is preferably a sequence that completely matches the sequence identified as the nucleotide sequence encoding the promoter, but it is preferably a sequence that has 90% or more identity, more preferably 95% or more identity. Any sequence may be used as long as it has identity, and may include sequences that can exhibit similar promoter functions even if they are partially deleted or substituted.
In addition, it is preferable that the same target gene has a sequence that completely matches the sequence specified as the base sequence encoding the target protein, but it is preferable that the sequence has 90% or more identity, more preferably 95% or more identity. The sequence may be any sequence as long as it has the same properties, and may include sequences that can encode proteins with similar properties even if they are partially deleted or substituted.
「プロモーター配列」とは、「目的遺伝子」の発現を制御する配列のことを言い、このような制御配列は「目的遺伝子」の発現を制御し得るものであればよい。例えば、Ef1αの全部又は一部をコードする塩基配列を挙げることができ、CMVの全部又は一部をコードする塩基配列等であってもよく、さらに、その他の従来知られている他の制御配列であってもよい。
また、「目的遺伝子」とは、発現、製造の対象となる「目的タンパク質」をコードする遺伝子のことを言い、発現、製造させたいタンパク質の生物学的に活性な（ネイティヴな）完全な形態で発現され得る全てをコードする塩基配列であってもよく、この一部をコードする塩基配列であっても良い。また、誘導体等の変異体をコードするものであってもよく、ネイティヴなものとは1以上のアミノ酸において異なるポリペプチドをコードするものであってもよい。このような「目的遺伝子」として、例えばFeutin-Aの全部又は一部をコードする塩基配列を挙げることができる。
これらの「プロモーター配列」及び「目的遺伝子」は、「遺伝子発現カセット」にDNA又はRNAのいずれの形で含まれていてもよいが、DNAであることが好ましく、特にゲノムDNA又はcDNAであることが好ましい。
A "promoter sequence" refers to a sequence that controls the expression of a "target gene," and any such control sequence may be used as long as it can control the expression of the "target gene." For example, a base sequence encoding all or part of Ef1α may be mentioned, a base sequence encoding all or part of CMV, etc., and other conventionally known control sequences. It may be.
In addition, "target gene" refers to a gene that encodes a "target protein" to be expressed and manufactured, and is a biologically active (native) complete form of the protein that is to be expressed and manufactured. It may be a base sequence that encodes all that can be expressed, or a base sequence that encodes a part of it. Furthermore, it may encode a variant such as a derivative, or it may encode a polypeptide that differs from the native one in one or more amino acids. Such a "target gene" can include, for example, a base sequence encoding all or part of Feutin-A.
These "promoter sequence" and "target gene" may be included in the "gene expression cassette" in the form of either DNA or RNA, but preferably DNA, especially genomic DNA or cDNA. is preferred.
本発明の「遺伝子発現カセット」はさらにタグ切断配列及びタグ配列を含むものであることが好ましく、シグナル配列を含むものであることがより好ましい。また、これらの配列に加えて、目的タンパク質の製造に有用なその他の配列を含むものであっても良い。
ここで「タグ配列」とは、目的タンパク質の発現を検出し、回収及び／又は精製するための塩基配列のことを言う。この「タグ配列」には、従来知られているいずれのタンパク質をコードするものも用いることができるが、例えばGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ：Glutathione S-transferase)、GFP（緑色蛍光タンパク質：Green Fluorescent Protein)、EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)、His-tag、FLAG-tag糖結合ドメイン、多糖結合ドメイン、レクチン、タンパク質相互作用ドメイン、核酸結合ドメイン等の全部又は一部をコードする塩基配列を挙げることができる。
また、「タグ切断配列」とは、タグが結合した状態で製造された目的タンパク質から、タグを切断するためのタンパク質の全部又は一部をコードする塩基配列のことを言う。このような「タグ切断配列」がコードするタンパク質には、従来知られているいずれのタンパク質をコードするものも用いることができるが、例えば、HRV3C等を挙げることができる。
The "gene expression cassette" of the present invention preferably further includes a tag cleavage sequence and a tag sequence, and more preferably a signal sequence. Furthermore, in addition to these sequences, it may contain other sequences useful for producing the target protein.
Here, the term "tag sequence" refers to a base sequence for detecting, recovering, and/or purifying the expression of a target protein. This "tag sequence" can be one that encodes any conventionally known protein, such as GST (Glutathione S-transferase), GFP (Green Fluorescent Protein), etc. ), EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein), His-tag, FLAG-tag sugar binding domain, polysaccharide binding domain, lectin, protein interaction domain, nucleic acid binding domain, etc. can.
Furthermore, the term "tag cleavage sequence" refers to a base sequence that encodes all or part of a protein to be used to cleave a tag from a target protein produced with a tag attached thereto. The protein encoded by such a "tag cleavage sequence" can be any conventionally known protein, and examples include HRV3C.
「シグナル配列」は、目的タンパク質をコードする目的遺伝子の翻訳効率を増大することができるタンパク質の全部又は一部をコードする塩基配列のことを言う。このような「シグナル配列」には、従来知られているいずれのものも用いることができるが、例えば、3´から核酸コード配列に機能可能なように結合したポリアデニル化（ポリA）シグナル、例えばSV40ポリAシグナルあるいはチヌークサーモンポリAシグナル等が挙げられる。 A "signal sequence" refers to a base sequence that encodes all or part of a protein that can increase the translation efficiency of a target gene that encodes a target protein. Such a "signal sequence" can be any conventionally known sequence, but includes, for example, a polyadenylation (polyA) signal operably linked from the 3' to the nucleic acid coding sequence, e.g. Examples include SV40 polyA signal or Chinook salmon polyA signal.
このような本発明の「ベクター」は、複製可能なベクター、例えば複製可能な発現ベクターであることが好ましい。本発明で設計したベクターを、細菌宿主細胞又は酵母宿主細胞のような宿主細胞中で複製することで、魚類への安定した導入が可能となる。
さらに本発明の「ベクター」は、ベクターが導入された形質転換体を同定するために、マーカー遺伝子として、例えばアンピシリン耐性遺伝子やネオマイシン耐性遺伝子、又は酵母形質転換体の選択を可能とするためのマーカー遺伝子を含むことが好ましい。
Such a "vector" of the present invention is preferably a replicable vector, such as a replicable expression vector. By replicating the vector designed in the present invention in host cells such as bacterial host cells or yeast host cells, stable introduction into fish becomes possible.
Furthermore, the "vector" of the present invention can be used as a marker gene, for example, an ampicillin resistance gene or a neomycin resistance gene, or a marker to enable selection of yeast transformants, in order to identify transformants into which the vector has been introduced. Preferably, it contains a gene.
本発明の「同一の遺伝子発現カセットが2回以上タンデムに連結された構造を含むベクター」の作製にあたり、「遺伝子発現カセット」を挿入するためのベースとして使用するベクターは、魚類に目的タンパク質を製造させることができるベクターであればいずれのものを用いることもできる。ベクターは直線形態のものであってもよく、環状形態のものであってもよい。このようなベクターとして、例えばpUC19ベクター（タカラバイオ株式会社）等を挙げることができる。
ベクターを「同一の遺伝子発現カセットが2回以上タンデムに連結された構造」とするにあたり、挿入される「遺伝子発現カセット」間の塩基配列の長さには制限がなく、挿入された「遺伝子発現カセット」が発現し得ればよい。また、「遺伝子発現カセット」の挿入にあたり、In-Fusion技術、Ligation技術等のいずれの技術をも用いることができる。
本発明の「ベクター」は遺伝子発現カセッットが2回以上タンデムに連結された構造であればよく、3回以上、4回以上、5回以上さらには6回以上タンデムに連結された構造であることが好ましい。
In producing the "vector containing a structure in which the same gene expression cassette is linked two or more times in tandem" of the present invention, the vector used as a base for inserting the "gene expression cassette" is used to produce the target protein in fish. Any vector can be used as long as it can cause Vectors may be in linear or circular form. Examples of such vectors include pUC19 vector (Takara Bio Inc.).
When making a vector "a structure in which the same gene expression cassettes are connected in tandem two or more times," there is no limit to the length of the base sequence between the inserted "gene expression cassettes."cassette" can be expressed. In addition, any technology such as In-Fusion technology or Ligation technology can be used to insert the "gene expression cassette".
The "vector" of the present invention may have a structure in which gene expression cassettes are linked in tandem two or more times, three or more times, four or more times, five or more times, furthermore, six or more times. is preferred.
本発明の「魚類」は、魚類に該当するものであればいずれのものも用いることができるが、硬骨魚類が好ましく、分類としては、Cyprinidae、Cichlidae、Salmonidae、Claridae、Siluridae及びIctaluridae等の硬骨魚類が挙げられる。
特に好ましい魚の種類としては、コイ（例えばCyprinus carpio）、ゼブラフィッシュ（Danino rerio）、アフリカナマズ（Clarias gariepinus）、テラピア(Oreochronis niloticus)、タイセイヨウサケ(Salmo salar)、ニジマス(Oncorhyncus mykiss)、及びメダカ(Oryzias latipes)が挙げられる。
As the "fish" of the present invention, any fish can be used as long as it corresponds to fish, but teleost fishes are preferable, and the classification includes teleost fishes such as Cyprinidae, Cichlidae, Salmonidae, Claridae, Siluridae, and Ictaluridae. can be mentioned.
Particularly preferred fish species include carp (e.g. Cyprinus carpio), zebrafish (Danino rerio), African catfish (Clarias gariepinus), tilapia (Oreochronis niloticus), Atlantic salmon (Salmo salar), rainbow trout (Oncorhyncus mykiss), and killifish. (Oryzias latipes).
本発明の「目的タンパク質の製造方法」とは、発現、製造の対象とするタンパク質を「目的タンパク質」としてこのタンパク質をコードする塩基配列の全部又は一部を組み込んだ本発明の「ベクター」を、魚類の受精卵又は胚に導入することで発現させ、回収及び／又は精製することをいう。
このような本発明の「目的タンパク質の製造方法」は、本発明の「ベクター」を「魚類の受精卵又は胚に導入する工程」を含む製造方法であればよく、その他、目的タンパク質の製造に有用な工程をさらに含むものであっても良い。
ベクターの導入には、一般的に行われているいずれの導入方法も利用することができる。例えばベクターをレトロウイルス粒子、ラムダウイルス粒子にパッケージして、これを細胞中に移入することができる。また、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、バイオリスティック法（例えばタングステンボンバードメント）により、あるいは裸の核酸ベクターもしくは構築物を溶液中の細胞と接触させることにより導入することができる。このうち、マイクロインジェクションによる導入が特に好ましい。
本発明の製造方法に使用する受精卵又は胚は、魚類であればいずれのものでも用いることができる。マイクロインジェクションにより本発明のベクターを導入する場合、受精の前、受精後、卵割後の二細胞、四細胞、もしくは八細胞期に行うことができる。
The "method for producing a protein of interest" of the present invention refers to the "vector" of the present invention in which the protein to be expressed and produced is the "protein of interest" and all or part of the base sequence encoding this protein is incorporated. It is expressed by introducing it into fertilized eggs or embryos of fish, and then recovering and/or purifying it.
Such a "method for producing the target protein" of the present invention may be any production method that includes "a step of introducing the vector" of the present invention into a fertilized egg or embryo of fish, and any other method for producing the target protein may be used. It may further include useful steps.
Any commonly used introduction method can be used to introduce the vector. For example, vectors can be packaged into retroviral particles, lambdavirus particles, and transferred into cells. It can also be introduced by microinjection, electroporation, calcium phosphate precipitation, biolistic methods (eg, tungsten bombardment), or by contacting the naked nucleic acid vector or construct with cells in solution. Among these, introduction by microinjection is particularly preferred.
The fertilized eggs or embryos used in the production method of the present invention can be any type of fish. When introducing the vector of the present invention by microinjection, it can be carried out at the two-cell, four-cell, or eight-cell stage before fertilization, after fertilization, or after cleavage.
本発明の製造方法によって得られた目的タンパク質の回収には、一般的に行われているいずれの回収方法も利用することができる。例えば、タンパク質の発現が確認された組織等を切り出し、そこから回収する方法や、ウェスタンブロッティングにおいてタンパク質の発現が確認された領域を切り出し、そこから抽出する方法などが挙げられる。
さらに回収したタンパク質の精製では、従来知られているいずれの精製方法でも行うことができる。従来知られている精製方法としては、カラムクロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーが挙げられ、これらを用いることによりタンパク質の精製ができる。市販のアフィニティークロマトグラフィーとしては、GSTtrap HPやHisTrap HP（いずれもアマシャムバイオサイエンス製）等が挙げられる。
製造された目的タンパク質はF0世代の胚から回収することもできるが、魚類成体から回収してもよい。
Any commonly used recovery method can be used to recover the target protein obtained by the production method of the present invention. Examples include a method in which a tissue or the like in which protein expression has been confirmed is cut out and recovered from there, a method in which a region in which protein expression has been confirmed in Western blotting is cut out, and extraction is carried out from there.
Furthermore, the recovered protein can be purified by any conventionally known purification method. Conventionally known purification methods include column chromatography and affinity chromatography, and proteins can be purified using these methods. Examples of commercially available affinity chromatography include GSTtrap HP and HisTrap HP (both manufactured by Amersham Biosciences).
The produced target protein can be recovered from F0 generation embryos, but may also be recovered from adult fish.
本発明の「トランスジェニック魚類」とは、本発明の遺伝子発現カセットが2回以上タンデムに連結された構造を含むベクターが導入されてなる魚類のことをいう。 The "transgenic fish" of the present invention refers to fish into which a vector containing a structure in which the gene expression cassette of the present invention is tandemly linked two or more times has been introduced.
以下、本発明の実施例を示すが、本発明はこれらによって制限されない。 Examples of the present invention will be shown below, but the present invention is not limited thereto.
［実施例１］
遺伝子発現カセットの調製
１．遺伝子発現カセットA
ゼブラフィッシュのefla1遺伝子（配列番号1）をプロモーター配列とし、この下流に目的遺伝子としてFeutin-A遺伝子（配列番号2）を組み込み、遺伝子発現カセットAとした。
２．遺伝子発現カセットB
遺伝子発現カセットAにおいて、目的遺伝子の下流にHRV3C遺伝子（配列番号3）をタグ切断配列として組み込み、さらにその下流に3xFLAG（登録商標）遺伝子（配列番号4）をタグ配列として組み込み、遺伝子発現カセットBとした。
３．遺伝子発現カセットC
遺伝子発現カセットAにおいて、目的遺伝子の下流にSV40PA遺伝子（配列番号5）をシグナル配列として組み込み、遺伝子発現カセットC1とした。
また、遺伝子発現カセットBにおいて、タグ配列の下流にSV40PA遺伝子（配列番号5）を組み込み、遺伝発現カセットC2とした。
[Example 1]
Preparation of
The zebrafish efla1 gene (SEQ ID NO: 1) was used as a promoter sequence, and the Feutin-A gene (SEQ ID NO: 2) was inserted as a target gene downstream of this to form gene expression cassette A.
2. Gene expression cassette B
In gene expression cassette A, the HRV3C gene (SEQ ID NO: 3) is incorporated as a tag cleavage sequence downstream of the gene of interest, and further downstream of that, the 3xFLAG (registered trademark) gene (SEQ ID NO: 4) is incorporated as a tag sequence, and gene expression cassette B And so.
3. Gene expression cassette C
In gene expression cassette A, the SV40PA gene (SEQ ID NO: 5) was incorporated as a signal sequence downstream of the gene of interest, creating gene expression cassette C1.
Furthermore, in gene expression cassette B, the SV40PA gene (SEQ ID NO: 5) was incorporated downstream of the tag sequence, resulting in gene expression cassette C2.
［実施例２］
発現プラスミドベクターの構築
１．pUpZef-EGFP-pZef-Feutin-A-HRV3C-3xFLAG（登録商標）ベクターの構築
pUC19ベクター（タカラバイオ株式会社）のpUC Origin、Ampicillin resistance geneと表１に記載の各プライマーを使用して、In-Fusion技術により発現プラスミドベクターとしてpUpZef-EGFP-pZef-Feutin-A-HRV3C-3xFLAG（登録商標）ベクター（以下、ベクターAと示す場合がある）を構築した。
ベクターAは2つのef1a1(zEF1A)プロモーター領域により、EGFPとC末端に3xFLAG(登録商標）を融合したFetuin-A（目的タンパク質）をそれぞれ転写し得た。C末端に3xFLAG(登録商標）遺伝子を融合したFetuin-A遺伝子（目的遺伝子）は制限酵素SfiIにより切り出し可能であり、Fetuin-A遺伝子に替わって他のタンパク質をコードする目的遺伝子を組み込むことができるよう設計された。なお、Transposable element などの転移性因子の構成要素は含まれていない。
図1にベクターA構築の概要を示し、図2、図3－1～3－8にベクターAの概要を示した。また、ベクターAの全塩基配列を配列番号6に示した。
[Example 2]
Construction of
pUpZef-EGFP-pZef-Feutin-A-HRV3C-3xFLAG was expressed as an expression plasmid vector by In-Fusion technology using pUC Origin of pUC19 vector (Takara Bio Inc.), Ampicillin resistance gene and each primer listed in Table 1. (registered trademark) vector (hereinafter sometimes referred to as vector A) was constructed.
Vector A was able to transcribe EGFP and Fetuin-A (target protein) in which 3xFLAG (registered trademark) was fused to the C-terminus, respectively, using the two ef1a1 (zEF1A) promoter regions. The Fetuin-A gene (target gene), which has the 3xFLAG (registered trademark) gene fused to its C-terminus, can be excised with the restriction enzyme SfiI, and a target gene encoding another protein can be inserted in place of the Fetuin-A gene. It was designed like that. Note that components of transposable elements such as transposable elements are not included.
Figure 1 shows an outline of the construction of Vector A, and Figure 2 and Figures 3-1 to 3-8 show outlines of Vector A. Additionally, the entire base sequence of Vector A is shown in SEQ ID NO: 6.
２．タンデムベクターの作製
次の手順により、遺伝子発現カセットが2回タンデムに連結された構造を含むベクター（2連タンデムベクター）及び3回タンデムに連結された構造を含むベクター（3連タンデムベクター）を作製した。参考として、3連タンデムベクターの模式図を図4に示した。
なお、作製した各ベクターは遺伝子発現カセットが2回又は3回連結されているかを遺伝子の挿入に使用した制限酵素サイトPac1とNde1又はPac1とNot1で再度切断して遺伝子の長さから確認するとともに、1塩基レベルの変異の有無をDNAシーケンスサービスにより確認した。
2. Production of tandem vectors A vector containing a structure in which gene expression cassettes are linked in tandem twice (double tandem vector) and a vector containing a structure in which gene expression cassettes are linked in tandem three times (triple tandem vector) are produced using the following steps. did. For reference, a schematic diagram of the triple tandem vector is shown in Figure 4.
In addition, in each of the created vectors, whether the gene expression cassette is ligated twice or thrice is checked by cutting again with the restriction enzyme sites Pac1 and Nde1 or Pac1 and Not1 used for gene insertion, and checking from the length of the gene. The presence or absence of mutations at the single base level was confirmed using a DNA sequencing service.
１）2連タンデムベクター
（１）発現カセットの調製
ベクターAよりefla1遺伝子（配列番号1）、Feutin-A遺伝子（配列番号2）、HRV3C遺伝子（配列番号3）、3xFLAG(登録商標）遺伝子（配列番号4）及びSV40PA遺伝子（配列番号5）を含む領域を制限酵素サイトBgl2で切り出した。
この切断断片を鋳型として5‘末端にPac1とIn-Fusion用配列（配列番号11）、3’末端にNde1とIn-Fusion用配列（配列番号12）を付加することで挿入用の発現カセットC2を調製した。
（２）2連タンデムベクターの作製
ベクターAを制限酵素サイトPac1とNde1で切断し、上記（１）で調製した発現カセットC2をIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用いてつなぎ合わせることで発現カセットC2が2連に並ぶベクター（以下、ベクターBと示す場合がある）を作製した。
1) Preparation of double tandem vector (1) expression cassette From vector A, efla1 gene (SEQ ID NO: 1), Feutin-A gene (SEQ ID NO: 2), HRV3C gene (SEQ ID NO: 3), 3xFLAG (registered trademark) gene (SEQ ID NO: 2), No. 4) and the SV40PA gene (SEQ ID No. 5) were excised using the restriction enzyme site Bgl2.
Using this cleavage fragment as a template, we added Pac1 and In-Fusion sequences (SEQ ID NO: 11) to the 5' end and Nde1 and In-Fusion sequences (SEQ ID NO: 12) to the 3' end, creating an expression cassette C2 for insertion. was prepared.
(2) Preparation of double tandem vector Vector A was cut with the restriction enzyme sites Pac1 and Nde1, and the expression cassette C2 prepared in (1) above was used with the In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Takara Bio Inc.). A vector (hereinafter sometimes referred to as vector B) in which expression cassettes C2 are arranged in two rows was created by connecting the two expression cassettes C2 to each other.
２）3連タンデムベクター
（１）発現カセットの調製
上記１）（１）と同様に、各遺伝子を含む領域を制限酵素サイトBgl2で切り出した後、この切断断片を鋳型として5’末端と3’末端にPac1とIn-Fusion用配列（配列番号11）を付加することで挿入用の発現カセットC2を調製した。
（２）3連タンデムベクターの作製
上記１）（２）で作製したベクターBを制限酵素サイトNot1で切断し、上記（１）で調製した発現カセットC2をIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit（タカラバイオ株式会社）を用いてつなぎ合わせることで発現カセットC2が3連に並ぶベクター（以下、ベクターCと示す場合がある）を作製した。
2) Triple tandem vector (1) Preparation of expression cassette In the same way as in 1) (1) above, after cutting out the region containing each gene with the restriction enzyme site Bgl2, use this cut fragment as a template to connect the 5' end and 3' end. Expression cassette C2 for insertion was prepared by adding Pac1 and an In-Fusion sequence (SEQ ID NO: 11) to the end.
(2) Preparation of triple tandem vector The vector B prepared in 1) and (2) above was cut at the restriction enzyme site Not1, and the expression cassette C2 prepared in (1) above was added to the In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit. (Takara Bio Inc.) to create a vector (hereinafter sometimes referred to as vector C) in which expression cassettes C2 are arranged in three lines.
［実施例３］
目的タンパク質の製造
１．ゼブラフィッシュの成育
ゼブラフィッシュは水温28℃、明期14時間、暗期10時間で飼育されたものを使用した。受精卵は、任意に選んだ健康な雌雄数組が産んだ直後のものを採取し、飼育水をHoltfreter’s Solution(HS)（CaCl2 0.1ｇ, NaCl 3.5g, KCl 0.05g, NaHCO3 0.2gにdH2Oを加えて1Lとした）に置換して28℃で飼育した。
未受精卵は産卵前の胚と定義し、産卵期に入った雌の卵巣をHSで洗浄して採集した。また、12、24及び48hpfの胚は、採取時間の前後15分間を含む30分間以内に採取した受精卵を0hpfとして、HSにおいて28℃で飼育した場合の各時間後の胚と定義した。
[Example 3]
Production of
Unfertilized eggs were defined as embryos before spawning, and were collected by cleaning the ovaries of females that had entered the spawning period with HS. In addition, 12, 24, and 48 hpf embryos were defined as embryos after each hour when fertilized eggs collected within 30 minutes including 15 minutes before and after the collection time were taken as 0 hpf and reared at 28°C in HS.
２．発現プラスミドベクターの導入
上記1で得たゼブラフィッシュの0hpfの受精卵に、上記実施例2で作製した各発現プラスミドベクター（ベクターA,B,C）をマイクロインジェクションにより導入した。導入の際のベクターの濃度は0.02μg/μlに調製して行い、受精卵一個当たりに概ね50-200eggs/μlで行った。導入したゼブラフィッシュの受精卵はHS中、28℃で飼育し、抗FLAG(登録商標）抗体（SIGMA-ALDRICH）を用いてFACS（Light-CaptureII（アトー株式会社））によってFLAG(登録商標）の発現を確認した。
2. Introduction of Expression Plasmid Vectors Each of the expression plasmid vectors (vectors A, B, and C) prepared in Example 2 above was introduced into the 0 hpf fertilized zebrafish eggs obtained in 1 above by microinjection. The concentration of the vector at the time of introduction was adjusted to 0.02 μg/μl, and the concentration was approximately 50-200 eggs/μl per fertilized egg. The introduced fertilized zebrafish eggs were reared at 28°C in HS, and FLAG (registered trademark) was captured by FACS (Light-Capture II (ATTO Corporation)) using anti-FLAG (registered trademark) antibody (SIGMA-ALDRICH). Expression was confirmed.
３．目的タンパク質
１）発現量の確認
HUMAN FETUIN-A ELISA（UNITECH）を用いたELISA法によりEGFP発現卵に含まれるFetuin-Aの定量を行った。図5に標準曲線を示した。ODは波長450nmから波長630nmを引いた値を示した。
3. Target protein 1) Confirmation of expression level
Fetuin-A contained in EGFP-expressing eggs was quantified by ELISA using HUMAN FETUIN-A ELISA (UNITECH). Figure 5 shows the standard curve. The OD was the value obtained by subtracting the
２）結果
遺伝子発現カセットを1つしか含まないベクターAを導入した場合、受精卵1つあたりの目的タンパク質（Fetuin-A）の発現量が1.6ngであったのに比べて、2回以上タンデムに連結させた構造を含むベクター（ベクターB）を導入した場合は4.9ngであり、3回以上タンデムに連結させた構造を含むベクター（ベクターC）を導入した場合は16.4ngであった。
従って、この結果より、遺伝子発現カセットをベクターに2回以上複数含めば含むほど相乗的にタンパク質の発現量が増加することが示された。
2) Results When vector A containing only one gene expression cassette was introduced, the expression amount of the target protein (Fetuin-A) per fertilized egg was 1.6 ng; The amount was 4.9 ng when a vector containing a structure linked in tandem (vector B) was introduced, and it was 16.4 ng when a vector containing a structure linked in tandem three or more times (vector C) was introduced.
Therefore, this result showed that the more the gene expression cassette is included in the vector two or more times, the more the protein expression level increases synergistically.
本発明のベクターにより、実用量の目的タンパク質を、少量の魚類の受精卵や胚等を用いて短期間に製造することができる。また、本発明の製造方法により、ゲノムライブラリーなどにおいて塩基配列は既知であるが、構造や機能が未知なタンパク質を目的タンパク質として製造し、解析することにより、有用なタンパク質のスクリーニングを行うことも容易となる。 By using the vector of the present invention, a practical amount of the target protein can be produced in a short period of time using a small amount of fertilized fish eggs, embryos, etc. In addition, using the production method of the present invention, it is also possible to screen for useful proteins by producing and analyzing proteins whose base sequences are known but whose structures and functions are unknown, such as in genome libraries. It becomes easier.
Claims (2)
前記ベクターが上流から下流に向かって、プロモーター配列、目的遺伝子、タグ切断配列、タグ配列、シグナル配列の順序で含む、同一の遺伝子発現カセットが２回以上タンデムに連結された構造を含む、前記魚類における目的タンパク質の製造方法。 A method for producing a target protein in fish, comprising the step of introducing a vector into a fertilized egg or embryo of fish by microinjection ,
The above-mentioned fish, wherein the vector includes a promoter sequence, a target gene, a tag cleavage sequence, a tag sequence, and a signal sequence in the order of upstream to downstream, and the same gene expression cassette is linked two or more times in tandem. A method for producing a target protein.
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001501482A (en) | 1996-10-10 | 2001-02-06 | ユニバーシティー オブ サウサンプトン | Production of recombinant peptides by transgenic fish |
| JP2007143497A (en) | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Hiroshi Tamaru | Method for producing protein by fishes |
| JP2009515521A (en) | 2005-11-10 | 2009-04-16 | レセプター バイオロジックス， インコーポレイテッド | Methods for production of receptor and ligand isoforms |
| JP2010500967A (en) | 2006-07-20 | 2010-01-14 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | Methods, compositions, and kits for selective activation of protoxins through combinatorial targeting |
| JP2012157293A (en) | 2011-02-01 | 2012-08-23 | Hiroshima Univ | Method for highly expressing target gene by putting amplification structure of the same under control in mammalian cell |
| US20180305700A1 (en) | 2015-10-13 | 2018-10-25 | The Research Foundation For The State University Of New York | Cleavable fusion tag for protein overexpression and purification |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001501482A (en) | 1996-10-10 | 2001-02-06 | ユニバーシティー オブ サウサンプトン | Production of recombinant peptides by transgenic fish |
| JP2009515521A (en) | 2005-11-10 | 2009-04-16 | レセプター バイオロジックス， インコーポレイテッド | Methods for production of receptor and ligand isoforms |
| JP2007143497A (en) | 2005-11-29 | 2007-06-14 | Hiroshi Tamaru | Method for producing protein by fishes |
| JP2010500967A (en) | 2006-07-20 | 2010-01-14 | ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション | Methods, compositions, and kits for selective activation of protoxins through combinatorial targeting |
| JP2012157293A (en) | 2011-02-01 | 2012-08-23 | Hiroshima Univ | Method for highly expressing target gene by putting amplification structure of the same under control in mammalian cell |
| US20180305700A1 (en) | 2015-10-13 | 2018-10-25 | The Research Foundation For The State University Of New York | Cleavable fusion tag for protein overexpression and purification |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| FEBS Letters，1994年，Vol.348，pp.268-272 |
| Gene，1994年，Vol.147，pp.223-226 |
| Proc. Natl. Acad. Sci. USA，1995年，Vol.92，pp.6522-6526 |
Also Published As
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