JP2007228814A - Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein - Google Patents

Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein Download PDF

Info

Publication number
JP2007228814A
JP2007228814A JP2006051076A JP2006051076A JP2007228814A JP 2007228814 A JP2007228814 A JP 2007228814A JP 2006051076 A JP2006051076 A JP 2006051076A JP 2006051076 A JP2006051076 A JP 2006051076A JP 2007228814 A JP2007228814 A JP 2007228814A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
gene
foreign protein
expression
sericin
producing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006051076A
Other languages
Japanese (ja)
Inventor
Takeshi Morita
健 守田
Takashi Tanaka
貴 田中
Shingo Hiramatsu
紳吾 平松
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toray Industries Inc
Original Assignee
Toray Industries Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toray Industries Inc filed Critical Toray Industries Inc
Priority to JP2006051076A priority Critical patent/JP2007228814A/en
Publication of JP2007228814A publication Critical patent/JP2007228814A/en
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a genetic engineering material for insects, which does not need use of a recombinant baculovirus and facilitates purification of objective protein and simultaneously to provide a method for producing a foreign protein by utilizing the genetic engineering material. <P>SOLUTION: A gene cassette for expression obtained by fusing a DNA sequence at the 5' terminal part of sericin gene and a DNA sequence at the 3' terminal part with a foreign protein gene is transferred to a silk gland cells or the like so as to produce a large amount of foreign protein in silk gland cells, in silk glands, especially in middle silk glands, further in a sericin layer of silk, By the new method, the foreign protein production technique is established by producing a foreign protein using silk glands without using a recombinant baculovirus. <P>COPYRIGHT: (C)2007,JPO&INPIT

Description

本発明は、昆虫細胞への遺伝子導入ベクターおよびそのベクターを用いて遺伝子導入された昆虫細胞、昆虫組織、昆虫を用いた外来タンパク質の製造方法に関する。さらに、本発明で得られる組換えカイコが産生した外来タンパク質を含む絹糸に関する。   The present invention relates to a gene introduction vector for insect cells, insect cells transfected with the vectors, insect tissues, and methods for producing foreign proteins using insects. Furthermore, the present invention relates to a silk thread containing a foreign protein produced by the recombinant silkworm obtained in the present invention.

遺伝子組換え技術を用いた外来タンパク質の生産は、様々な産業に利用されている。その宿主として主に大腸菌、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞などが用いられている。しかし、あらゆる外来タンパク質を効率よく生産できる宿主は開発されておらず、目的とするタンパク質ごとに生産系を構築することが必要であり、個々の宿主における外来タンパク質生産技術においてさらなる技術革新が望まれている。   Production of foreign proteins using gene recombination techniques is used in various industries. As the host, Escherichia coli, yeast, animal cells, plant cells, insect cells and the like are mainly used. However, no host capable of efficiently producing any foreign protein has been developed, and it is necessary to construct a production system for each target protein, and further technological innovation is desired in the foreign protein production technology for each host. ing.

大腸菌などの細菌または酵母の系では、翻訳後修飾に問題があり、タンパク質を十分機能する形で合成できないことがある。また、動物細胞は、タンパク質を機能する形で合成できることが多いが、一般的に増殖させるのが困難で産生量も低く経済的ではない。   In bacterial or yeast systems such as E. coli, there are problems with post-translational modifications, and proteins may not be synthesized in a fully functional form. In addition, animal cells can often synthesize proteins in a functional form, but are generally difficult to grow and low in production and are not economical.

一方、昆虫または昆虫細胞を用いた遺伝子組み換えタンパク質の生産では、酵素や生理活性を持つ有用タンパク質等が、比較的安価に量産でき、動物に近いタンパク質の翻訳後修飾が得られることが知られている。具体的には、外来タンパク質遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを、昆虫または昆虫細胞に感染させる方法で、外来タンパク質が比較的安価に量産が可能であり、医薬品として製品化された生理活性タンパク質も知られている(特許文献1,2参照)。   On the other hand, in the production of genetically engineered proteins using insects or insect cells, it is known that useful proteins with enzymes and physiological activities can be mass-produced relatively inexpensively and post-translational modification of proteins close to animals can be obtained. Yes. Specifically, a method for infecting insects or insect cells with a baculovirus incorporating a foreign protein gene enables mass production of the foreign protein at a relatively low cost, and bioactive proteins that have been commercialized as pharmaceuticals are also known. (See Patent Documents 1 and 2).

しかし、従来の昆虫または昆虫細胞を用いた組換えタンパク質の生産技術では、外来遺伝子の導入に組換えウイルスを用いることから、安全性の点から、その不活性化や封じ込めが必要であるという課題がある。また、組換えウイルスをカイコに接種する方法では、組換えウイルスの接種が煩雑であり、目的とする外来タンパク質が体液中に産生されるため、目的の組換えタンパク質をカイコ体液由来の大量の夾雑タンパク質から精製することが必要であった。このため高純度な組換えタンパク質を得ることが困難であるという課題があった。   However, the conventional technology for producing recombinant proteins using insects or insect cells uses recombinant viruses for the introduction of foreign genes, so that inactivation and containment are necessary for safety reasons. There is. In addition, in the method of inoculating the silkworm with the recombinant virus, the inoculation of the recombinant virus is complicated and the target foreign protein is produced in the body fluid, so that the target recombinant protein is contaminated in large quantities derived from the silkworm body fluid. It was necessary to purify from the protein. For this reason, there existed a subject that it was difficult to obtain a highly purified recombinant protein.

一方、近年、昆虫染色体への外来遺伝子の組換えが試みられ、核多核体病ウイルスの一種であるAutographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)のDNAを用いて、カイコフィブロインL鎖遺伝子にクラゲ緑色蛍光タンパク質遺伝子を付加した融合遺伝子を、相同組み換えにより、カイコ染色体上に導入し、発現させる方法が開発され(非特許文献1参照)、その技術を用いたヒト・コラーゲン遺伝子を導入したカイコおよびその製造方法が開示されている(特許文献3参照)。しかし、上記のAcNPVを用いた昆虫染色体への外来タンパク質遺伝子の導入方法では、組換えバキュロウイルス(AcNPV)を用いることから、組換えウイルスの不活化や封じ込めの課題が依然として残っている。   On the other hand, in recent years, recombination of foreign genes into insect chromosomes has been attempted, and using the DNA of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV), a jellyfish green fluorescent protein for silkworm fibroin L chain gene. A method for introducing and expressing a fusion gene to which a gene has been added on a silkworm chromosome by homologous recombination has been developed (see Non-Patent Document 1), and a silkworm introduced with a human collagen gene using the technique and a method for producing the same Is disclosed (see Patent Document 3). However, in the method for introducing a foreign protein gene into an insect chromosome using AcNPV as described above, since a recombinant baculovirus (AcNPV) is used, there remain problems of inactivation and containment of the recombinant virus.

また最近、外来遺伝子を、鱗翅目昆虫由来のトランスポゾンであるpiggyBacを用いてカイコ染色体へ安定に導入し、その外来遺伝子がコードするタンパク質を発現させる方法が、クラゲ緑色蛍光タンパク質をモデルとして研究され、交配により子孫へと遺伝子が安定に伝わることも確認された(非特許文献2参照)。しかし、緑色蛍光タンパク質は、産生量が十分ではなく、かつ、カイコ全身に産生されるため、発現させた組換え型緑色蛍光タンパク質を高純度な形で回収するためには、高度な精製技術を必要とすることから、経済的に問題があった。   Recently, a method of stably introducing a foreign gene into a silkworm chromosome using piggyBac, a transposon derived from a lepidopteran insect, and expressing a protein encoded by the foreign gene was studied using a jellyfish green fluorescent protein as a model, It was also confirmed that the gene was stably transmitted to the offspring by crossing (see Non-Patent Document 2). However, since the amount of green fluorescent protein produced is not sufficient and is produced throughout the silkworm, advanced purification techniques must be used to recover the expressed recombinant green fluorescent protein in high purity. There was an economic problem because it was necessary.

また、フィブロインH鎖遺伝子の5’末端部分のDNA配列と3’末端部分のDNA配列を外来タンパク質遺伝子に融合させた発現用遺伝子カセットを絹糸腺細胞などに導入することで、大量の外来タンパク質を絹糸腺細胞内、絹糸腺細胞外、さらには絹糸のフィブロイン層にまで産生させることが可能となった(特許文献4参照)。しかしながら、外来タンパク質がフィブロイン層に産生されることから、フィブロイン層を覆っているセリシン層を除去した後に、フィブロイン層を可溶化した後に外来タンパク質を回収する必要があった。   In addition, by introducing a gene cassette for expression in which the DNA sequence of the 5 ′ end portion and the DNA sequence of the 3 ′ end portion of the fibroin H chain gene are fused to a foreign protein gene into silk gland cells, a large amount of foreign protein is converted into silk thread. Production was possible in glandular cells, outside the silk glandular cells, and even in the fibroin layer of silk (see Patent Document 4). However, since foreign protein is produced in the fibroin layer, it was necessary to recover the foreign protein after solubilizing the fibroin layer after removing the sericin layer covering the fibroin layer.

また最近、セリシン層を溶解して、ペプチド溶液を作製したり、それを用いて粉末化セリシンを作製する方法が報告されている(特許文献5、6参照)。しかし、これらは絹糸タンパク質(主にセリシン)を使用するためのものであり、絹糸中に存在する組換えタンパク質の回収・利用を想定したものではない。   Recently, a method has been reported in which a sericin layer is dissolved to prepare a peptide solution, or powdered sericin is prepared using the peptide solution (see Patent Documents 5 and 6). However, these are for the use of silk protein (mainly sericin), and are not intended for the recovery / utilization of the recombinant protein present in the silk thread.

すなわち、このような昆虫を宿主とした外来タンパク質の生産技術においては、組換えバキュロウイルスの不活化や封じ込めが必要であったり、絹糸のフィブロイン層から目的タンパク質を精製することが困難である、目的タンパク質の発現量が少ないなど、いくつかの課題がある。
特開昭61-9288号公報 特開昭61-9297号公報 特開2001-161214号公報 特開2004-254681号公報 特開平10-29909号公報 特開2001-39999号公報 ジーンズアンドデベロップメント(Genes and Development) 1999年、第13巻、p.511-516 ネイチャーバイオテクノロジー(Nature Biotechnology) 2000年、第18巻、p81-84
That is, in the foreign protein production technology using such insects as a host, it is necessary to inactivate and contain recombinant baculovirus, or it is difficult to purify the target protein from the fibroin layer of silk. There are several problems such as low protein expression.
JP 61-9288 JP 61-9297 JP 2001-161214 A Japanese Patent Laid-Open No. 2004-254681 Japanese Patent Laid-Open No. 10-29909 JP 2001-39999 Jeans and Development 1999, Vol. 13, pages 511-516 Nature Biotechnology 2000, Vol. 18, p81-84

昆虫を用いた組換え型タンパク質の生産技術は、精力的に研究されているが、外来タンパク質遺伝子を組み込んだ組換えバキュロウイルスの不活化や封じ込めの必要があり、また、組換えウイルスの接種が煩雑であるなどの課題がある。また、組換えバキュロウイルスを用いたカイコにおける外来タンパク質の生産では、大量の夾雑物を含む体液より目的タンパク質を抽出、精製することが困難であるという課題があった。   Recombinant protein production technology using insects has been energetically studied, but it is necessary to inactivate and contain recombinant baculoviruses that incorporate foreign protein genes. There are problems such as complexity. Further, in the production of foreign proteins in silkworms using recombinant baculoviruses, there has been a problem that it is difficult to extract and purify the target protein from body fluids containing a large amount of contaminants.

カイコ染色体に外来タンパク遺伝子を導入する組換えタンパク質の製造技術の検討が行われているが、目的の外来タンパク質の生産量は低く、また、カイコ組織や絹糸のフィブロイン層から目的タンパク質を精製することが困難であるという課題もある。   The production of recombinant proteins that introduce foreign protein genes into the silkworm chromosome has been studied, but the production of the target foreign protein is low, and the target protein must be purified from the silkworm tissue or silk fibroin layer. There is also a problem that is difficult.

本発明は、こうした状況に鑑み、組換えバキュロウイルスを用いる必要がなく、かつ、目的タンパク質の精製を容易にすることができる昆虫用の遺伝子工学材料を提供すると同時に、その遺伝子工学材料を利用した外来タンパク質の製造方法を提供することを課題としている。   In view of such circumstances, the present invention provides a genetic engineering material for insects that does not require the use of a recombinant baculovirus and can facilitate the purification of the target protein, and at the same time, utilizes the genetic engineering material. It is an object to provide a method for producing a foreign protein.

本発明者らは、絹タンパク質の20〜30%を占めるセリシン層に組換えタンパク質を産生させようと、鋭意検討した結果、絹糸腺で発現するプロモーターの下流にセリシン遺伝子の第1イントロンを含む5'末端部分の3'末端側に外来タンパク質遺伝子の5'末端側をアミノ酸フレームが一続きになるように連結した遺伝子カセットを絹糸腺細胞に導入することで、絹糸のセリシン層における外来タンパク質の産生量が飛躍的に向上することを見出した。   As a result of intensive studies to produce a recombinant protein in a sericin layer that occupies 20 to 30% of the silk protein, the present inventors include a first intron of the sericin gene downstream of the promoter expressed in the silk gland 5 The amount of foreign protein produced in the sericin layer of silk by introducing a gene cassette in which the 5 'end of the foreign protein gene is linked to the 3' end of the 'terminal portion so that the amino acid frame is continuous. Found a dramatic improvement.

すなわち、本発明者らは、セリシン遺伝子の5'末端部分のDNA配列を外来タンパク質遺伝子に融合させた発現用遺伝子カセットを絹糸腺細胞などに導入することで、大量の外来タンパク質を絹糸腺細胞内、絹糸腺特に中部絹糸線、および絹糸のセリシン層に大量に産生させることに成功した。組換えバキュロウイルスを用いることなく、また、絹糸腺を利用して外来タンパク質生産を生産させることにより、精製を容易にする外来タンパク質生産技術を確立することができた。特に、絹糸のセリシン層に外来タンパク質を産生させた場合、水、緩衝液、アルカリ性水溶液(好ましくは水を電気分解して作製したアルカリイオン水)などで可溶化することで、外来タンパク質を含むセリシン溶液を簡便に得ることができる。この外来タンパク質を含むセリシン溶液からは、他の夾雑タンパク質が少なく通常の精製技術を用いて、外来タンパク質を容易に回収することが可能である。   That is, the present inventors introduce a gene cassette for expression in which a DNA sequence of the 5 ′ end portion of the sericin gene is fused to a foreign protein gene into a silk gland cell, etc. It was successfully produced in large quantities in the gland, especially the middle silk wire, and the sericin layer of silk. It was possible to establish a foreign protein production technology that facilitates purification by using a silk gland to produce foreign protein without using a recombinant baculovirus. In particular, when a foreign protein is produced in the silk sericin layer, sericin containing the foreign protein is obtained by solubilization with water, buffer solution, alkaline aqueous solution (preferably alkaline ionized water produced by electrolyzing water), etc. A solution can be easily obtained. From the sericin solution containing the foreign protein, the foreign protein can be easily recovered by using a normal purification technique with few other contaminating proteins.

本発明は、以下の遺伝子カセット、ベクターなど昆虫での外来タンパク質生産に利用可能な遺伝子工学材料、形質転換体、その形質転換体を用いた外来タンパク質の製造方法および外来タンパク質を含む絹糸に関する。   The present invention relates to genetic engineering materials that can be used for the production of foreign proteins in insects, such as the following gene cassettes and vectors, transformants, methods for producing foreign proteins using the transformants, and silk threads containing foreign proteins.

1)(1)絹糸腺で発現するプロモーターと、
(2)前記(1)の下流に連結された、セリシン遺伝子の5’末端部分を外来タンパク質構造遺伝子の5’側に融合させた遺伝子とを含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
1) (1) a promoter expressed in the silk gland;
(2) A gene cassette for expression of a foreign protein, comprising a gene fused to the 5 ′ side of a foreign protein structural gene and linked to the downstream of (1) above.

2)前記セリシン遺伝子の5’末端部分が、セリシン遺伝子の第1エキソン、第1イントロン、第2エキソンの一部を含むことを特徴とする1)に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。   2) The gene cassette for expression of a foreign protein according to 1), wherein the 5 'end portion of the sericin gene contains a part of the first exon, the first intron, and the second exon of the sericin gene.

3)前記セリシンの第1エキソンと第2エキソンを合わせた部分が、セリシン遺伝子の分泌シグナル遺伝子領域であることを特徴とする2)の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。   3) The gene cassette for the expression of a foreign protein according to 2), wherein the portion of the sericin that combines the first exon and the second exon is a secretory signal gene region of the sericin gene.

4)前記1)〜3)のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる(1)絹糸腺プロモーターおよび/または(2)セリシン遺伝子の5’末端部分が実質的に同等の機能を有する範囲において1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。   4) The gene cassette for expressing a foreign protein according to any one of 1) to 3) above, wherein (1) the silk gland promoter and / or (2) 5 ′ of the sericin gene is contained in the gene cassette for expressing the foreign protein. A gene cassette for the expression of a foreign protein characterized by having one or several base additions, deletions, or substitutions with other bases within a range where the terminal portions have substantially the same function.

5)前記1)〜4)のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる(1)絹糸腺プロモーター部分および/または(2)セリシン遺伝子の5’末端部分に代えて、該部分とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子であって、該部分と実質的に同等の機能を有する遺伝子を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。   5) The gene cassette for expressing a foreign protein according to any one of 1) to 4) above, wherein (1) the silk gland promoter portion and / or (2) 5 of the sericin gene is contained in the gene cassette for expressing the foreign protein. 'A gene cassette for expression of a foreign protein characterized in that it has a gene that hybridizes with the part under stringent conditions instead of the terminal part and has a function substantially equivalent to that part.

6)前記絹糸腺で発現するプロモーターが、セリシン遺伝子のプロモーター、フィブロインL鎖遺伝子のプロモーター及びフィブロインH鎖遺伝子のプロモーターのうちから選ばれる少なくとも一つのプロモーターであることを特徴とする1)〜5)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。   6) The promoter expressed in the silk gland is at least one promoter selected from a promoter of a sericin gene, a promoter of a fibroin L chain gene, and a promoter of a fibroin H chain gene 1) to 5) The gene cassette for expressing a foreign protein according to any one of the above.

7)外来タンパク質発現遺伝子カセットの下流に、セリシン遺伝子のポリA付加領域、フィブロインL鎖遺伝子のポリA付加領域およびフィブロインH鎖遺伝子のポリA付加領域のうちから選ばれる少なくとも一つのポリA付加領域が存在することを特徴とする1)〜6)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。   7) At least one poly A addition region selected from the poly A addition region of the sericin gene, the poly A addition region of the fibroin L chain gene, and the poly A addition region of the fibroin H chain gene downstream of the foreign protein expression gene cassette The gene cassette for expression of a foreign protein according to any one of 1) to 6), wherein

8)前記1)〜6)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットの両側に、1対のピギーバック(piggyBac)トランスポゾンの逆位反復配列が存在することを特徴とする昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセット。   8) An insect having a pair of piggyBac transposon inverted repeats on both sides of the foreign protein expression gene cassette according to any one of 1) to 6) above A gene cassette for gene transfer into the cell chromosome.

9)前記1)〜8)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用発現ベクター。   9) An insect cell expression vector comprising the foreign protein expression gene cassette according to any one of 1) to 8) above.

10)前記8)に記載の昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用遺伝子導入ベクター。   10) A gene introduction vector for insect cells comprising the gene cassette for gene introduction into the chromosome of insect cells described in 8) above.

11) 前記1)〜8)のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットが染色体に導入されており、かつ、絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生する能力を持つ組換えカイコ。   11) A recombinant silkworm in which the gene cassette for expressing a foreign protein according to any one of 1) to 8) is introduced into a chromosome and has the ability to produce a foreign protein in a silk gland or silk thread.

12)前記11)に記載の組換えカイコが産生する外来タンパク質を含む絹糸。   12) A silk thread containing a foreign protein produced by the recombinant silkworm described in 11) above.

13)前記9)または10)に記載の昆虫細胞用遺伝子導入ベクターを昆虫細胞へ導入することを特徴とする外来タンパク質の製造方法。   13) A method for producing a foreign protein, which comprises introducing the gene transfer vector for insect cells according to 9) or 10) above into insect cells.

14)昆虫細胞が鱗翅目昆虫由来であることを特徴とする12)に記載の外来タンパク質の製造方法。   14) The method for producing a foreign protein according to 12), wherein the insect cells are derived from lepidopterous insects.

15)昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)由来であることを特徴とする13)に記載の外来タンパク質の製造方法。   15) The method for producing a foreign protein according to 13), wherein the insect cells are derived from Bombyx mori.

16)昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)の絹糸腺細胞であることを特徴とする14)に記載の外来タンパク質の製造方法。   16) The method for producing a foreign protein according to 14), wherein the insect cell is a silk gland cell of Bombyx mori.

17)ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースのDNA転移活性を利用して、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製し、得られた組換えカイコの絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生させた後、その絹糸腺または絹糸から外来タンパク質を回収することを特徴とする13)に記載の外来タンパク質の製造方法。   17) Using the DNA transfer activity of the piggyBac transposase, a recombinant silkworm in which a gene cassette for expression of a foreign protein is incorporated into a chromosome is prepared, and the foreign protein is added to the silk gland or silk of the resulting recombinant silkworm. The method for producing a foreign protein according to 13), wherein the foreign protein is recovered from the silk gland or silk thread after the production of.

18)昆虫細胞用遺伝子導入ベクターと、ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースを産生するDNAもしくはRNAを同時にカイコ卵にマイクロインジェクションすることによって該外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製することを特徴とする17)に記載の外来タンパク質製造方法。   18) A recombinant silkworm in which a gene cassette for expression of a foreign protein is integrated into a chromosome by microinjecting a gene transfer vector for insect cells and a DNA or RNA producing piggyBac transposase into a silkworm egg simultaneously. 17) The method for producing a foreign protein according to 17).

19)前記12)に記載の絹糸を水溶液で懸濁し、セリシン層を溶解した水溶液中から有用タンパク質を回収することを特徴とする外来タンパク質製造方法。   19) A method for producing a foreign protein, characterized in that the useful protein is recovered from an aqueous solution in which the silk thread described in 12) is suspended in an aqueous solution and the sericin layer is dissolved.

20)水溶液が水、または緩衝液、もしくはアルカリ性水溶液から選ばれる一種以上であることを特徴とする19)に記載の外来タンパク質製造方法。   20) The method for producing a foreign protein according to 19), wherein the aqueous solution is at least one selected from water, a buffer solution, or an alkaline aqueous solution.

21)アルカリ性水溶液が水を電気分解して陰極近傍の水溶液を集めたアルカリイオン水であることを特徴とする20)記載の外来タンパク質製造方法。   21) The method for producing a foreign protein according to 20), wherein the alkaline aqueous solution is alkaline ionized water obtained by electrolyzing water and collecting an aqueous solution near the cathode.

22) 上記記載の水溶液が界面活性剤を含むことを特徴とする19)〜21)のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。   22) The method for producing a foreign protein according to any one of 19) to 21), wherein the aqueous solution described above contains a surfactant.

23)絹糸を溶解した水溶液から、カラムクロマトグラフィーを用いて外来タンパク質を回収することを特徴とする19)から22)のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。   23) The method for producing a foreign protein according to any one of 19) to 22), wherein the foreign protein is recovered from the aqueous solution in which the silk thread is dissolved by using column chromatography.

24) 外来タンパク質が、水溶液に可溶性であることを特徴とする11)から23)のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。   24) The method for producing a foreign protein according to any one of 11) to 23), wherein the foreign protein is soluble in an aqueous solution.

25) 外来タンパク質がサイトカイン、抗原タンパク質のいずれかであることを特徴とする11)から24)のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。   25) The method for producing a foreign protein according to any one of 11) to 24), wherein the foreign protein is either a cytokine or an antigen protein.

26) サイトカインがインターフェロン、抗原タンパク質がウイルス抗原タンパク質であることを特徴とする25)記載の外来タンパク質製造方法。   26) The method for producing a foreign protein according to 25), wherein the cytokine is interferon and the antigenic protein is a viral antigenic protein.

セリシン遺伝子の5'末端部分のDNA配列を外来タンパク質遺伝子に融合させた発現用遺伝子カセットを絹糸腺細胞などに導入することで、大量の外来タンパク質を絹糸腺細胞内、絹糸腺特に中部絹糸線、さらには絹糸のセリシン層にまで産生させることが可能となった。この新手法により、組換えバキュロウイルスを用いることなく、絹糸腺を利用して外来タンパク質生産を生産させることで精製の容易な外来タンパク質生産技術を確立した。   By introducing a gene cassette for expression in which the DNA sequence of the 5 'end of the sericin gene is fused to a foreign protein gene into a silk gland cell, a large amount of the foreign protein can be introduced into the silk gland cell, especially the silk gland, It has become possible to produce even a silk sericin layer. By this new method, we established a foreign protein production technology that can be easily purified by using the silk gland to produce foreign protein without using recombinant baculovirus.

本発明において、「外来タンパク質の発現用遺伝子カセット」とは、昆虫細胞に導入された場合その外来タンパク質構造遺伝子がコードするタンパク質が発現されるために必要なDNAのセットをいう。この外来タンパク質発現カセットは、外来タンパク質構造遺伝子とその遺伝子の発現を促進するプロモーターを含む。通常はさらに、ターミネーター、ポリA付加領域を含み、好ましくはプロモーター、外来タンパク質構造遺伝子、ターミネーター、ポリA付加領域の全てを含む。さらにプロモーターとの間に外来タンパク質構造遺伝子に結合した分泌シグナル遺伝子を含んでいてもよい。ポリA付加配列との間にも任意の遺伝子配列を連結しても良い。また人工的に設計、合成された遺伝子配列を連結することもできる。   In the present invention, the “gene cassette for expressing a foreign protein” refers to a set of DNAs necessary for expressing a protein encoded by a foreign protein structural gene when introduced into an insect cell. The foreign protein expression cassette includes a foreign protein structural gene and a promoter that promotes the expression of the gene. Usually, it further contains a terminator and a poly A addition region, preferably a promoter, a foreign protein structural gene, a terminator, and a poly A addition region. Furthermore, a secretory signal gene linked to a foreign protein structural gene may be included between the promoter and the promoter. An arbitrary gene sequence may be linked to the poly A addition sequence. In addition, artificially designed and synthesized gene sequences can be linked.

また、「遺伝子導入用遺伝子カセット」とは、両側に1対のピギーバック(piggyBac)トランスポゾンの逆位反復配列を有する外来タンパク質の発現用遺伝子カセットであり、かつ、ピギーバック(piggyBac)トランスポゼーズの作用により昆虫細胞染色体へ導入されるDNAセットをいう。本発明において、「昆虫細胞用発現ベクター」とは外来タンパク質の発現用遺伝子カセットまたは遺伝子導入用遺伝子カセットを含み、昆虫細胞に導入された際に、外来タンパク質を発現させるために必要なDNAのセットをいう。また、本発明において、「昆虫細胞用遺伝子導入ベクター」とは外来タンパク質の発現用遺伝子カセットまたは遺伝子導入用遺伝子カセットを含み、両端に1対のピギーバックトランスポゾンの逆位反復配列を有し、かつ、ピギーバックトランスポゼースの作用により昆虫細胞染色体へ導入されるDNAセットをいう。   In addition, the “gene cassette for gene introduction” is a gene cassette for expression of a foreign protein having a pair of inverted piggyback transposon pairs on both sides, and piggyBac transposase. The DNA set introduced into the insect cell chromosome by the action of In the present invention, the term “insect cell expression vector” includes a gene cassette for expression of a foreign protein or a gene cassette for gene introduction, and a set of DNA necessary for expressing the foreign protein when introduced into an insect cell. Say. In the present invention, the “insect cell gene transfer vector” includes a gene cassette for expression of a foreign protein or a gene cassette for gene transfer, and has a pair of inverted piggyback transposon inverted sequences at both ends, and This refers to a DNA set that is introduced into insect cell chromosomes by the action of piggyback transposase.

本発明において使用されるDNAを取得する方法に特に制限はない。既知の遺伝子情報に基づき、PCR(polymerase chain reactiion)法を用いて必要な遺伝子領域を増幅取得する方法、既知の遺伝子情報に基づきゲノムライブラリーやcDNAライブラリーより相同性を指標としてスクリーニングする方法などが挙げられる。本発明においては、これらの遺伝子は遺伝的多型性や変異剤などを用いた人為的変異処理による変異型も含む。遺伝的多型性とは遺伝子上の自然突然変異により遺伝子の塩基配列が一部変化しているものをいう。   There is no particular limitation on the method for obtaining the DNA used in the present invention. A method to amplify and acquire necessary gene regions using PCR (polymerase chain reactiion) method based on known gene information, a method to screen homology from genomic libraries and cDNA libraries based on known gene information, etc. Is mentioned. In the present invention, these genes include genetic polymorphisms and mutants obtained by artificial mutation treatment using mutation agents. A genetic polymorphism is one in which the base sequence of a gene is partially changed due to a natural mutation on the gene.

外来タンパク質発現カセットにおけるプロモーターは特に限定されないが、外来タンパク質遺伝子の発現を促進する活性の高いものが好ましい。例えば、特開平6-261770号公報や特開昭62-285787号公報に記載されているショウジョウバエの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターやカイコアクチン遺伝子のプロモーター(Nature Biotechnology 18,81-84,2000)などが挙げられるが、フィブロインH鎖遺伝子のプロモーター(GenBank登録番号V00094の塩基番号255〜574番目、GenBank登録番号AF226688の塩基番号62118〜62437番目)、フィブロインL鎖遺伝子のプロモーター(Gene, 100:151-158:GenBank登録番号M76430)、セリシン遺伝子のプロモーター(GenBank登録番号AB007831の塩基番号599〜1656番目)などカイコ絹糸腺細胞中で高い転写促進活性を有するプロモーターが好適である。   The promoter in the foreign protein expression cassette is not particularly limited, but a promoter having high activity for promoting the expression of the foreign protein gene is preferable. For example, the Drosophila heat shock protein gene promoter and the silkworm actin gene promoter (Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000) described in JP-A-6-261770 and JP-A-62-285787 Examples include promoters of fibroin heavy chain genes (base numbers 255 to 574 of GenBank accession number V00094, base numbers 62118 to 62437 of GenBank accession number AF226688), promoters of fibroin light chain genes (Gene, 100: 151-158). : GenBank accession number M76430), promoters of sericin genes (base numbers 599 to 1656 of GenBank accession number AB007831) and other promoters having high transcription promoting activity in silkworm silk gland cells are suitable.

「外来タンパク質構造遺伝子」とは、遺伝子を発現させようとする宿主細胞が有しない遺伝子のことであり、宿主細胞が本来産生しないタンパク質をコードしている遺伝子のことであり、特に限定されない。産業的価値から考えて、ヒトやほ乳類が産生するタンパク質、例えば、成長ホルモン、サイトカイン、増殖因子および細胞骨格タンパク質の遺伝子などが挙げられる。また、微生物、植物または昆虫などが産生する酵素や種々タンパク質の遺伝子なども本発明の範囲に含まれる。   The “foreign protein structural gene” is a gene that is not possessed by the host cell that is to express the gene, and is a gene that encodes a protein that is not originally produced by the host cell, and is not particularly limited. In view of industrial value, proteins produced by humans and mammals such as genes for growth hormones, cytokines, growth factors and cytoskeletal proteins can be mentioned. In addition, enzymes produced by microorganisms, plants or insects, genes of various proteins, and the like are also included in the scope of the present invention.

本発明における外来タンパク質発現用遺伝子カセットにおいて、セリシン遺伝子の5’末端部分は、プロモーターによる外来タンパク質の発現を増強する作用を有するDNA配列であり、セリシン遺伝子の第1エキソンと第1イントロン全長またはその一部および第2エキソンの一部を含むDNA配列である。本発明においてセリシン遺伝子の5’末端部分が、組換え個体において中後部絹糸腺での遺伝子の発現、転写を促進することが明らかとなった。こうした遺伝子の転写活性を促進する領域は、種々の方法により改変されても、その基本的な活性を保持することが十分に認識されている。   In the gene cassette for foreign protein expression in the present invention, the 5 ′ end portion of the sericin gene is a DNA sequence having an action of enhancing the expression of the foreign protein by the promoter, and the first exon and the first intron of the sericin gene or the full length thereof. A DNA sequence comprising a portion and a portion of the second exon. In the present invention, it has been clarified that the 5'-terminal portion of the sericin gene promotes gene expression and transcription in the middle posterior silk gland in the recombinant individuals. It is well recognized that these regions that promote the transcriptional activity of genes retain their basic activity even if they are modified by various methods.

遺伝子の転写活性を促進するセリシン遺伝子の5’末端部分に、実質的に同等の機能を有する範囲において、人為的、自然発生的のいずれを問わず、1または2以上の塩基の付加または欠失、もしくは他の塩基への置換を生じたDNAを用いることもできる。「1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換」とは、基本となる塩基配列に比較して1または2以上の塩基が付加または欠失、もしくは1または2以上の塩基が他の塩基に置換といった変異が存在するが、基本となる無変異配列と同等の機能を保持していることを意味する。   Addition or deletion of one or two or more bases, whether artificially or naturally occurring, to the 5 ′ end of the sericin gene that promotes the transcriptional activity of the gene, regardless of whether it has substantially the same function Alternatively, DNA in which substitution with another base has occurred can also be used. "Addition or deletion of one or several bases or substitution with other bases" means that one or more bases are added or deleted or one or more bases compared to the base sequence This means that there is a mutation such that one of the bases is replaced with another base, but it has the same function as the basic non-mutated sequence.

この場合の実質的に同等の機能とは、カイコ絹糸腺細胞中で高い転写促進活性を表す。1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換の手段は自体は公知であり、例えば、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、またはポリメラーゼ連鎖増幅法(PCR)を単独または適宜組み合わせて行うことができる。例えば亜硫酸水素ナトリウムを用いた化学的な処理によりシトシン塩基をウラシル塩基に置換する方法や、マンガンを含む反応液中でPCRを行い、DNA合成時のヌクレオチドの取り込みの正確性を低くする方法、部位特異的変異導入のための市販されている各種キットを用いることもできる。   The substantially equivalent function in this case represents a high transcription promoting activity in silkworm silk gland cells. Means for addition, deletion or substitution with one or several bases are known per se, such as random mutagenesis, site-directed mutagenesis, gene homologous recombination, or polymerase The chain amplification method (PCR) can be performed alone or in appropriate combination. For example, a method of replacing cytosine bases with uracil bases by chemical treatment with sodium bisulfite, a method of reducing the accuracy of nucleotide incorporation during DNA synthesis by performing PCR in a reaction solution containing manganese Various commercially available kits for introducing specific mutations can also be used.

例えばサムブルック等編[モレキュラークローニング、ア ラボラトリーマニュアル 第2版]コールドスプリングハーバーラボラトリー、1989、村松正實編[ラボマニュアル遺伝子工学]丸善株式会社、1988、エールリッヒ、HE.編[PCRテクノロジー、DNA増幅の原理と応用]ストックトンプレス、1989等の成書に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができる。この場合の実質的に同等の機能とは、カイコ絹糸腺細胞中での高い転写活性や転写促進活性を表す。   For example, edited by Sambrook et al. [Molecular Cloning, Laboratory Manual 2nd Edition] Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, edited by Masami Muramatsu [Lab Manual Genetic Engineering] Maruzen Co., Ltd., 1988, Ehrlich, HE. Chapter [PCR Technology, Principle and Application of DNA Amplification] It can be carried out according to the method described in the book of Stockton Press, 1989, etc., or by modifying those methods. In this case, the substantially equivalent function represents a high transcription activity or transcription promotion activity in silkworm silk gland cells.

具体的には、5令2日目のカイコ後部絹糸腺もしくは中部絹糸腺において、変異配列をもつ組換えカイコでの外来タンパク質遺伝子の転写量が、カイコアクチン遺伝子もしくはフィブロインH鎖遺伝子もしくはフィブロインL鎖遺伝子もしくはセリシン遺伝子の転写量のいずれかとくらべて0.1〜1倍の範囲内にあることが、ノーザン解析により確認されることを示す。好ましくはフィブロインH鎖遺伝子の転写量と比較して、0.1〜1倍の範囲内にあることが望ましい。   Specifically, in the silkworm posterior silk gland or the middle silk gland on the 2nd day of the 5th day, the transcription amount of the foreign protein gene in the recombinant silkworm having the mutated sequence is the silkworm actin gene, fibroin H chain gene or fibroin L chain. It shows that it is confirmed by Northern analysis that it is within the range of 0.1 to 1 times as much as the transcription amount of the gene or sericin gene. Preferably, it is within the range of 0.1 to 1 times the amount of transcription of the fibroin heavy chain gene.

転写量の比較には、BIORAD社製モレキュラーイメージャーFXProを用いることで、アマシャムファルマシア社製Gene Images Random-Prime Labelling and Detection Systemで標識、検出したシグナルを、定量的に検出、比較することができる。このとき、外来タンパク質遺伝子検出プローブと、カイコアクチン遺伝子もしくはフィブロインH鎖遺伝子もしくはフィブロインL鎖遺伝子もしくはセリシン遺伝子検出プローブの検出感度が同程度になるよう、あらかじめプローブ量、ハイブリダイズ条件、検出条件を確定する。その条件を用い、外来タンパク質遺伝子検出プローブと、比較するカイコアクチン遺伝子もしくはフィブロインH鎖遺伝子もしくはフィブロインL鎖遺伝子もしくはセリシン遺伝子検出プローブを混合しハイブリダイズし、検出、比較を行う。   For comparison of transcription amount, the molecular imager FXPro manufactured by BIORAD can be used to quantitatively detect and compare signals detected and detected by Gene Images Random-Prime Labeling and Detection System manufactured by Amersham Pharmacia. . At this time, the probe amount, hybridization conditions, and detection conditions are determined in advance so that the detection sensitivity of the foreign protein gene detection probe and the silkworm actin gene, fibroin H chain gene, fibroin L chain gene, or sericin gene detection probe are comparable. To do. Using the conditions, the foreign protein gene detection probe and the chicoactin gene or fibroin H chain gene or fibroin L chain gene or sericin gene detection probe to be compared are mixed and hybridized for detection and comparison.

また、同じく実質的に同等の機能を有する範囲において、セリシン遺伝子の5’末端部分の相同配列がストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAを用いることもできる。1本鎖DNAは相同性の程度によって相手鎖とハイブリダイズする。このとき、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーをより厳密に設定することによって、より相同性の高い配列を特定することができる。ストリンジェント条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程における塩濃度(ホルムアミド等)の濃度、温度条件によって規定される。詳しくは、米国特許No.6,100,037に詳しく記載されている。このようなストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションスクリーニングによって特定されるDNAは、相同性のレベルにおいて70%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上である。   Similarly, a DNA in which the homologous sequence at the 5 'end of the sericin gene hybridizes under stringent conditions as long as it has substantially the same function. Single-stranded DNA hybridizes with the partner strand depending on the degree of homology. At this time, by setting the stringency of the hybridization conditions more strictly, a sequence having higher homology can be specified. Stringent conditions are defined by the salt concentration (formamide, etc.) concentration and temperature conditions in the hybridization and washing steps. Details are described in detail in US Pat. No. 6,100,037. The DNA identified by the hybridization screening under such stringent conditions is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more at the level of homology.

前記第2エキソンの3'側に外来タンパク質構造遺伝子の5'側をアミノ酸フレームが一続きとなるように融合させることによって、外来タンパク質の産生量を向上させることができるが、第2エキソン部分を長くしすぎると目的とする外来タンパク質のN末端側に余分なアミノ酸残基が付加されるため、目的とする外来タンパク質の構造や活性が失われる場合もあるので、目的に応じて適切な長さとすることが必要である。   The amount of exogenous protein produced can be improved by fusing the 3 ′ side of the second exon with the 5 ′ side of the foreign protein structural gene so that the amino acid frame is continuous. If the length is too long, an extra amino acid residue is added to the N-terminal side of the target foreign protein, and the structure and activity of the target foreign protein may be lost. It is necessary to.

多くの場合、第2エキソン部分は、セリシン遺伝子の分泌シグナル遺伝子の直後もしくは数アミノ酸残基までとすることで好適な結果を得ることができる。   In many cases, a favorable result can be obtained by setting the second exon portion immediately after the secretion signal gene of the sericin gene or up to several amino acid residues.

タンパク質産生量の比較には、BIORAD社製モレキュラーイメージャーFXProを用いることで、アマシャムファルマシア社製ECL Western Blotting Detection Systemで検出した外来タンパク質由来のシグナルを検出、比較することができる。   For comparison of protein production, signals from foreign proteins detected by ECL Western Blotting Detection System manufactured by Amersham Pharmacia can be detected and compared by using Molecular Imager FXPro manufactured by BIORAD.

ポリA領域についても特に制限はないが、フィブロインH鎖、フィブロインL鎖、セリシンなど絹糸腺で大量に発現しているタンパク質遺伝子のポリA領域が好適に使用できる。   The poly A region is not particularly limited, but a poly A region of a protein gene that is expressed in a large amount in the silk gland such as fibroin H chain, fibroin L chain, sericin can be preferably used.

本発明におけるベクターとは、環状DNA構造または線状DNA構造を有するものをいう。特に、大腸菌内でも複製可能で、かつ、環状DNA構造を持つベクターが好適に使用できる。このベクターには、形質転換体の選抜を容易にする目的で、抗生物質耐性遺伝子、クラゲ由来蛍光緑色タンパク質遺伝子などマーカー遺伝子を組み込んでおくこともできる。   The vector in the present invention means a vector having a circular DNA structure or a linear DNA structure. In particular, a vector that can replicate in E. coli and has a circular DNA structure can be preferably used. For the purpose of facilitating selection of transformants, a marker gene such as an antibiotic resistance gene or a jellyfish-derived fluorescent green protein gene can be incorporated into this vector.

本発明で使用する昆虫細胞とは特に限定されるものではないが、好ましくは鱗翅目昆虫、より好ましくはカイコガ(Bombyx mori)由来細胞、さらに好ましくはカイコ絹糸腺細胞またはカイコガ(Bombyx mori)の卵に含まれる細胞である。絹糸腺細胞においては、セリシンタンパク質の合成が盛んで、かつ、取り扱いが容易なカイコ5令幼虫の中部絹糸腺細胞が好適である。   The insect cells used in the present invention are not particularly limited, but are preferably lepidopterous insects, more preferably cells derived from Bombyx mori, more preferably silkworm silk gland cells or Bombyx mori eggs. It is a contained cell. Among the silk gland cells, the middle silk gland cells of the silkworm 5th instar larvae which are active in the synthesis of sericin protein and are easy to handle are suitable.

昆虫細胞へ外来タンパク質の発現用遺伝子カセットおよびベクターを導入する方法には、特に制限はない。昆虫培養細胞への導入方法としては、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーションによる方法、リポソームを用いる方法、遺伝子銃を用いる方法、マイクロインジェクションする方法などを用いることができるが、カイコ絹糸腺細胞への導入においては、例えばカイコ5令幼虫の体内から取り出した中部絹糸腺組織に対して遺伝子銃を用いることによって簡便に遺伝子を導入することが可能である。   There is no particular limitation on the method for introducing a gene cassette and vector for expression of a foreign protein into insect cells. As an introduction method into insect cultured cells, calcium phosphate method, electroporation method, liposome method, gene gun method, microinjection method, etc. can be used, but in introduction into silkworm silk gland cells, For example, a gene can be easily introduced into a middle silk gland tissue taken out from the body of a silkworm fifth-instar larva by using a gene gun.

遺伝子銃による中部絹糸腺への遺伝子導入は、例えば、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを含むベクターをコーティングした金粒子を、バイオラッド社のパーティクルガン(型番:PDS−1000/He)を用いて、寒天プレートなどに固定した中部絹糸腺へ、1,100〜1,800psiのHeガス圧で噴射させることによって可能である。   Gene transfer to the middle silk gland using a gene gun, for example, by using a particle gun (model number: PDS-1000 / He) of Bio-Rad, gold particles coated with a vector containing a gene cassette for expression of a foreign protein, This can be achieved by spraying the middle silk gland fixed to an agar plate or the like with a He gas pressure of 1,100 to 1,800 psi.

カイコガ(Bombyx mori)の卵に含まれる細胞に遺伝子を導入する場合には、マイクロインジェクションする方法が好適である。ここで卵にマイクロインジェクションを行う場合、卵中の細胞に直接マイクロインジェクションする必要はなく、卵中にマイクロインジェクションするだけで遺伝子を導入することが可能である。   When a gene is introduced into cells contained in Bombyx mori eggs, a microinjection method is preferred. Here, when microinjection is performed on an egg, it is not necessary to perform microinjection directly on cells in the egg, and it is possible to introduce a gene simply by microinjection into the egg.

本発明の「遺伝子導入用遺伝子カセット」を有するベクターをカイコガ(Bombyx mori)の卵にマイクロインジェクションすることで、本発明の「外来タンパク質の発現用遺伝子カセット」が染色体に導入された組換えカイコを取得することが可能である。例えば、田村らの方法(Nature Biotechnology 18,81-84,2000)に従って、「遺伝子導入用遺伝子カセット」を有するベクターとカイコアクチンプロモーター制御下にピギーバック(PiggyBac)トランスポゼーセス遺伝子を配置したプラスミドを、同時にカイコガの卵にマイクロインジェクションし、孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫(G0)を群内で掛け合わせて次世代(G1)カイコ幼虫を得る。   The vector having the “gene cassette for gene transfer” of the present invention is microinjected into the eggs of Bombyx mori, so that the recombinant silkworm in which the “gene cassette for expressing foreign protein” of the present invention is introduced into the chromosome can be obtained. It is possible to obtain. For example, according to the method of Tamura et al. (Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000), a vector having a “gene transfer gene cassette” and a plasmid in which a PiggyBac transposase gene is placed under the control of a silkwormctin promoter At the same time, microinjection is performed on silkworm eggs, and hatched larvae are bred, and the resulting adult worms (G0) are crossed within a group to obtain next-generation (G1) silkworm larvae.

組換えカイコは、このG1世代において通常1〜2%の頻度で出現する。組換えカイコの選抜は、G1世代カイコの組織の一部からDNAを取り出し、外来タンパク質遺伝子を基に設計したプライマーを用いてPCRによって行うことができる。または、予め「遺伝子導入用遺伝子カセット」内に、カイコ細胞で発現可能なプロモータ下流に連結した緑色蛍光タンパク質(例えば、GFPおよびその類縁体)をコードする遺伝子を導入しておけば、G1世代のカイコ、例えば1令幼虫について紫外線下で緑色蛍光を発する個体を選抜することで組換えカイコの選抜が容易に行える。   Recombinant silkworms usually appear at a frequency of 1-2% in this G1 generation. The selection of recombinant silkworms can be performed by PCR using DNA extracted from a part of the tissue of G1 generation silkworms and using primers designed based on foreign protein genes. Alternatively, if a gene encoding a green fluorescent protein (for example, GFP and its analog) linked downstream of a promoter that can be expressed in silkworm cells is introduced into a “gene cassette for gene introduction” in advance, the G1 generation By selecting an individual that emits green fluorescence under ultraviolet light for silkworms, for example, 1st instar larvae, it is possible to easily select recombinant silkworms.

緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を連結する、カイコ細胞で発現可能なプロモーターとして、たとえば特開平6−261770号公報や特開昭62−285787号公報に記載されているショウジョウバエの熱ショックタンパク質遺伝子のプロモーターやカイコアクチン遺伝子のプロモーター(Nature Biotechnology 18,81-84,2000)、ショウジョウバエの視神経で発現することが知られている3xP3プロモーターなどが挙げられる。好ましくはカイコアクチン遺伝子のプロモーター(Nature Biotechnology 18,81-84,2000)もしくは3xP3プロモーターが用いられる。   Examples of promoters that can be expressed in silkworm cells, linking genes encoding green fluorescent proteins, such as the Drosophila heat shock protein gene promoter described in JP-A-6-261770 and JP-A-62-285787. And the promoter of the silkworm actin gene (Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000) and the 3xP3 promoter known to be expressed in the Drosophila optic nerve. Preferably, the promoter of the silkworm actin gene (Nature Biotechnology 18, 81-84, 2000) or the 3xP3 promoter is used.

そのほかに、カイコ細胞で発現可能なプロモーターとして、カイコ絹糸腺細胞中で高い転写促進活性を有するプロモーター、たとえばフィブロインH鎖遺伝子のプロモーター(GenBank登録番号V00094の塩基番号255〜574番目、GenBank登録番号AF226688の塩基番号62118〜62437番目)、フィブロインL鎖遺伝子のプロモーター(Gene, 100:151-158:GenBank登録番号M76430)、セリシン遺伝子のプロモーター(GenBank登録番号AB007831の塩基番号599〜1656番目)を選択することも可能である。   In addition, as a promoter that can be expressed in silkworm cells, a promoter having high transcription promoting activity in silkworm silk gland cells, for example, a fibroin H chain gene promoter (base numbers 255 to 574 of GenBank accession number V00094, GenBank accession number AF226688 Base number 62118-62437), fibroin L chain gene promoter (Gene, 100: 151-158: GenBank accession number M76430), sericin gene promoter (base numbers 599-1656 of GenBank accession number AB007831) Is also possible.

しかし、本発明に従って、カイコ絹糸腺細胞中で高い転写促進活性を有するプロモーターに緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子に連結した場合、カイコ絹糸腺細胞中で緑色蛍光タンパク質が大量に生産されることから、絹糸腺および絹糸中に、目的外来蛋白質に加えて緑色蛍光蛋白質が産生される。この場合、目的外来タンパク質を絹糸線および絹糸から精製、回収する時に、緑色蛍光蛋白質は、きょう雑タンパク質として、目的外来タンパク質の精製、回収を困難にする。また、緑色蛍光タンパク質が絹糸の物性に、強伸度の低下など望まない性質を与える可能性が考えられる。   However, when linked to a gene encoding green fluorescent protein to a promoter having high transcription promoting activity in silkworm silk gland cells according to the present invention, a large amount of green fluorescent protein is produced in silkworm silk gland cells. In addition, in the silk thread, a green fluorescent protein is produced in addition to the target foreign protein. In this case, when the target foreign protein is purified and recovered from the silk wire and silk thread, the green fluorescent protein is difficult to purify and recover the target foreign protein as a contaminating protein. In addition, there is a possibility that the green fluorescent protein may give unwanted properties such as a decrease in the strength and elongation to the physical properties of the silk thread.

また、「外来タンパク質の発現用遺伝子カセット」が染色体に導入された組換えカイコを取得する目的で、「遺伝子導入用遺伝子カセット」を有するベクターをカイコガ(Bombyx mori)の卵にマイクロインジェクションするにあたり、ピギーバック(PiggyBac)トランスポゼーセスタンパク質を同時にマイクロインジェクションすることによっても、上記と同様にして組換えカイコを取得することが可能である。   In addition, for the purpose of obtaining a recombinant silkworm in which a `` gene cassette for expression of a foreign protein '' is introduced into a chromosome, when microinjecting a vector having a `` gene cassette for gene introduction '' into an egg of Bombyx mori, Recombinant silkworms can also be obtained in the same manner as described above by simultaneously microinjecting PiggyBac transposase proteins.

ピギーバック(PiggyBac)トランスポゾンとは両端に13塩基対の逆位配列と、内部に約2.1k塩基対のORFを有するDNAの転位因子である。本発明において使用されるピギーバック(PiggyBac)トランスポゾンは特に限定されないが、例えばTrichoplusia ni cell line TN-368、Autographa californica NPV(AcNPV)、Galleria mellonea NPV(GmMNPV)由来のものを用いることができる。好ましくはTrichoplusia ni cell line TN-368由来ピギーバック(PiggyBac)の一部を持つプラスミドpHA3PIGとpPIGA3GFP(Nature biotechnology 18,81-84,2000)を用いて、その遺伝子およびDNA転移活性を有するピギーバックトランスポゼースを調製することができる。   The PiggyBac transposon is a DNA transposable element having an inverted sequence of 13 base pairs at both ends and an ORF of about 2.1 k base pairs inside. The piggyback transposon used in the present invention is not particularly limited. For example, those derived from Trichoplusia ni cell line TN-368, Autographa californica NPV (AcNPV), and Galleria mellonea NPV (GmMNPV) can be used. Preferably, using a plasmid pHA3PIG and pPIGA3GFP (Nature biotechnology 18,81-84,2000) having a part of PiggyBac derived from Trichoplusia ni cell line TN-368, the piggyback transposase having the gene and DNA transfer activity Can be prepared.

本発明で用いられる遺伝子組換えカイコとは、外来タンパク質遺伝子がカイコ染色体に導入されたカイコのことであり、そのカイコ染色体DNAを常法に従って制限酵素処理したのち、常法に従って標識した外来タンパク質遺伝子をプローブとしてサザンブロッティングを行う時、ポジティブなシグナルを与えるカイコのことである。外来タンパク質遺伝子が導入される染色体上の遺伝子座位は、カイコの発生、分化、成長を阻害しない部位であれば特に制限はない。組換えカイコは、その絹糸腺細胞、絹糸腺内腔、および、絹糸中に外来タンパク質を産生する能力を有している。また、組換えカイコは、正常に発育し、交配が可能であり、導入された外来タンパク質遺伝子を安定に保有し、かつ子孫に伝えることが可能である。   The transgenic silkworm used in the present invention is a silkworm in which a foreign protein gene has been introduced into the silkworm chromosome, and the foreign protein gene labeled with the conventional method after treating the silkworm chromosomal DNA with a restriction enzyme according to a conventional method. This is a silkworm that gives a positive signal when Southern blotting is performed using as a probe. The gene locus on the chromosome into which the foreign protein gene is introduced is not particularly limited as long as it does not inhibit the development, differentiation, and growth of silkworm. Recombinant silkworms have the ability to produce foreign proteins in their silk gland cells, silk gland lumen, and silk. Recombinant silkworms can grow normally and can be mated, and can stably carry the introduced foreign protein gene and transmit it to offspring.

従って、組換えカイコを継代し頭数を増やすことで、外来タンパク質の生産量を容易にスケールアップすることが可能である。交配において、野生型のカイコと交配させることで、外来タンパク質の産生量を向上させることも可能である。この場合、目的の外来タンパク質遺伝子が導入されたカイコを適宜選抜しながら継代していく必要が生じる。この場合、任意の組織から得られた細胞のDNAを用いて、組換えカイコ選抜に使用したマーカー遺伝子や外来タンパク質遺伝子の存在や構造を、PCR、サザンブロッティング法などで解析することで、容易に組換えカイコの遺伝子を継承した子孫を判別することが可能である。   Therefore, it is possible to easily scale up the amount of foreign protein produced by subculturing recombinant silkworms and increasing the number of heads. In the mating, it is possible to improve the production amount of the foreign protein by mating with a wild type silkworm. In this case, it is necessary to subculture while appropriately selecting silkworms into which the target foreign protein gene has been introduced. In this case, using the DNA of cells obtained from any tissue, the presence and structure of marker genes and foreign protein genes used for selection of recombinant silkworms can be easily analyzed by PCR, Southern blotting, etc. It is possible to discriminate offspring that have inherited the gene of the recombinant silkworm.

本発明の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを導入された昆虫細胞やカイコ絹糸腺は、それぞれ培養に適した培養液で培養することで、その培養上清や細胞中に外来タンパク質を産生することが可能である。例えば、本発明の発現用遺伝子カセットを導入されたカイコ卵巣由来細胞であるBmN細胞は、TC−100培地(ファーミンジェン社製)で、27℃で培養することで、培養3から4日で、目的とする外来タンパク質を産生する。また、カイコ後部絹糸腺は、例えば5令幼虫から無菌的に摘出したのち、インセクト・グレース培地中で、25℃で培養することで、外来タンパク質を産生する。絹糸腺でタンパク産生を行う場合は、培地中の溶存酸素濃度を高く維持することが好適であり、また、培地中に蓄積する低分子のタンパク質合成を阻害する因子を、例えば、限外濾過膜などで除去しながら培養することが好適であり、長時間のタンパク合成が可能となる。   Insect cells and silkworm silk glands introduced with the gene cassette for expression of the foreign protein of the present invention can be produced in culture supernatants and cells by culturing them in a culture solution suitable for each culture. Is possible. For example, BmN cells, which are silkworm ovary-derived cells into which the gene cassette for expression of the present invention has been introduced, are cultured in TC-100 medium (manufactured by Pharmingen) at 27 ° C., so that they can be cultured in 3 to 4 days. To produce the desired foreign protein. Further, the silkworm posterior silk gland, for example, is aseptically extracted from 5th instar larvae and then cultured at 25 ° C. in an insect grace medium to produce a foreign protein. When protein production is performed in the silk gland, it is preferable to maintain a high dissolved oxygen concentration in the medium, and a factor that inhibits low-molecular protein synthesis that accumulates in the medium is, for example, an ultrafiltration membrane. It is preferable to cultivate while removing the protein, etc., and protein synthesis for a long time is possible.

本発明で得られる組換えカイコは、通常のカイコと同様に飼育が可能であり、通常の条件で飼育することで外来タンパク質を産生させることが可能である。目的とする外来タンパク質に応じて、特に5令時期の培養温度、湿度、給餌条件などを最適化することで、外来タンパク質の産生量を向上させることも可能である。   The recombinant silkworm obtained in the present invention can be bred in the same manner as a normal silkworm, and foreign proteins can be produced by bred under normal conditions. Depending on the target foreign protein, it is also possible to improve the production amount of the foreign protein, particularly by optimizing the culture temperature, humidity, feeding conditions, etc. at the age of 5 years.

本発明のセリシン遺伝子の5'末端部分を融合させた外来タンパク遺伝子を導入した組換えカイコは、その繭中に目的とする外来タンパク質を大量に産生することが可能となる。得られた繭から、目的外来タンパク質を容易に精製、回収することが可能となる。また、産生させた外来タンパク質の機能によっては、得られた外来タンパク質を含む絹糸を、各種の産業用途で、そのままの形態、または、一部加工した形態で利用することができる。   A recombinant silkworm introduced with a foreign protein gene fused with the 5 ′ end of the sericin gene of the present invention can produce a large amount of the desired foreign protein in its cage. The target foreign protein can be easily purified and recovered from the obtained koji. Moreover, depending on the function of the produced foreign protein, the obtained silk thread containing the foreign protein can be used in various industrial applications as it is or in a partially processed form.

カイコ絹糸はフィブロイン層とその表面を覆うようにあるセリシン層により形成されている。セリシン層は比較的可溶性が高いため本発明で得られる組換えカイコの絹糸腺または絹糸より、簡便な抽出操作によって、外来タンパク質を得ることができる。外来タンパク質を、絹糸腺または絹糸から抽出するために使用する溶媒については特に制限はないが、多くの場合、水または水溶液が好ましい。抽出に使用する水溶液は、外来タンパク質の抽出を促進させるために適切な溶質を含むことが可能である。例えば、緩衝液などを使用することができる。種類としては酢酸、クエン酸、ホウ酸、酒石酸、リン酸緩衝液などを用いることができる。また、pHも特に限定はなく、目的とする外来タンパク質の機能を失活させないpHであれば、任意のpHを用いることができる。好ましくはpH8〜13のアルカリ性水溶液がよい。アルカリ性水溶液には水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化カルシウム、炭酸ナトリウム、アンモニア水、炭酸水素ナトリウム、水酸化マグネシウム、水酸化バリウム、水酸化銅、水酸化鉄などを使用することができる。なかでもpH8〜11のアルカリイオン水がよい。アルカリイオン水とは、水を電気分解して陰極近傍の液を回収することにより作製したアルカリ性水溶液である。   Silkworm silk is formed by a fibroin layer and a sericin layer covering the surface. Since the sericin layer is relatively highly soluble, a foreign protein can be obtained from the silk gland or silk of the recombinant silkworm obtained by the present invention by a simple extraction operation. Although there is no restriction | limiting in particular about the solvent used in order to extract a foreign protein from a silk gland or a silk thread, In many cases, water or aqueous solution is preferable. The aqueous solution used for extraction can contain a suitable solute to facilitate the extraction of foreign proteins. For example, a buffer solution can be used. As types, acetic acid, citric acid, boric acid, tartaric acid, phosphate buffer and the like can be used. The pH is not particularly limited, and any pH can be used as long as it does not deactivate the function of the target foreign protein. An alkaline aqueous solution having a pH of 8 to 13 is preferable. Sodium hydroxide, potassium hydroxide, calcium hydroxide, sodium carbonate, aqueous ammonia, sodium hydrogen carbonate, magnesium hydroxide, barium hydroxide, copper hydroxide, iron hydroxide and the like can be used for the alkaline aqueous solution. Of these, alkaline ionized water having a pH of 8 to 11 is preferable. Alkaline ion water is an alkaline aqueous solution prepared by electrolyzing water and collecting the liquid near the cathode.

また上記記載の水溶液に表面張力を弱めることができる界面活性剤を含有して用いることも可能である。界面活性剤は、イオン性界面活性剤と非イオン性界面活性剤とに大別される。イオン性界面活性剤は、さらに陰イオン性(アニオン性)界面活性剤、陽イオン性(カチオン性)界面活性剤、両性界面活性剤とに分けられる。陰イオン性(アニオン性)界面活性剤には、アルキル硫酸ナトリウム、塩化ステアリルジメチルベンジルアンモニウム、石鹸(アルカリ金属の高級脂肪酸塩)、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエーテルリン酸、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテルリン酸、ヤシ油脂肪酸メチルタウリンナトリウム、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウロイルサルコシンナトリウム、ラウロイルメチルβ-アラニンナトリウム液、ラウロイルメチルタウリンナトリウムなどがある。また陽イオン性(カチオン性)界面活性剤には、エチル硫酸ラノリン脂肪酸アミノプロピルエチルジメチルアンモニウム、塩化アルキルトリメチルアンモニウム、塩化ジアルキルジメチルアンモニウム、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウムなどがある。また両性界面活性剤には、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン液、2-アルキル-N-カルボキシメチル-N-ヒドロ岸エチルイミダゾリニウムベタイン、ラウリルジメチルアミノ酢酸ベタインなどがある。非イオン性界面活性剤としては、ジメチコンコポリオール、ショ糖脂肪酸エステル、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビット、ベミュレン、ポリメチルポリシロキサン共重合体、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンステアリルエーテル、ポリオキシエチレンステアリン酸アミド、ポリオキシエチレンセチルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、ポリグリセリン脂肪酸エステル、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノアウテアリン酸エチレングリコール、モノステアリン酸プロビレングリコール、モノステアリン酸ポリオキシエチレングリセリン、モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリエチレングリコール、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビットなどがある。どの種類の界面活性剤でも使用可能であるが、イオン性界面活性剤の陰イオン界面活性剤を使用するのが好ましい。   Moreover, it is also possible to use the above-mentioned aqueous solution containing a surfactant capable of weakening the surface tension. Surfactants are roughly classified into ionic surfactants and nonionic surfactants. The ionic surfactant is further classified into an anionic (anionic) surfactant, a cationic (cationic) surfactant, and an amphoteric surfactant. Anionic (anionic) surfactants include sodium alkyl sulfate, stearyldimethylbenzylammonium chloride, soap (higher fatty acid salt of alkali metal), sodium polyoxyethylene alkyl ether sulfate, polyoxyethylene alkyl ether phosphate, poly Examples include oxyethylene alkylphenyl ether phosphoric acid, coconut oil fatty acid methyl taurine sodium, lauryl sulfate triethanolamine, sodium lauryl sulfate, lauroyl sarcosine sodium, lauroyl methyl β-alanine sodium solution, and lauroyl methyl taurine sodium. Cationic (cationic) surfactants include ethyl lanolin sulfate fatty acid aminopropylethyldimethylammonium chloride, alkyltrimethylammonium chloride, dialkyldimethylammonium chloride, distearyldimethylammonium chloride, stearyltrimethylammonium chloride, benzalkonium chloride, Examples include benzethonium chloride. Amphoteric surfactants include alkyldiaminoethylglycine hydrochloride solution, 2-alkyl-N-carboxymethyl-N-hydrokishi ethylimidazolinium betaine, lauryldimethylaminoacetic acid betaine, and the like. Nonionic surfactants include dimethicone copolyol, sucrose fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitol tetraoleate, bemulene, polymethylpolysiloxane copolymer, polyoxyethylene octylphenyl ether, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, Polyoxyethylene stearyl ether, polyoxyethylene stearamide, polyoxyethylene cetyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyglycerin fatty acid ester, polyoxyethylene sorbitan monooleate, ethylene glycol monoautearate, monostearic acid Propylene glycol, polyoxyethylene glyceryl monostearate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, poly monopalmitate Carboxymethyl sorbitan, polyethylene glycol monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monolaurate, and the like monolaurate polyoxyethylene sorbit. Any type of surfactant can be used, but it is preferred to use an anionic surfactant that is an ionic surfactant.

上記界面活性剤の使用量は水溶液に対して、0.1%(w/vol)〜5%(w/vol)程度であることが好ましい。   The amount of the surfactant used is preferably about 0.1% (w / vol) to 5% (w / vol) with respect to the aqueous solution.

抽出された外来タンパク質を、単離・精製するための方法に特に限定はなく、通常の蛋白質の精製方法を用いることができる。例えば、限外濾過、ゲル濾過、透析、塩析等による脱塩、濃縮を組み合わせることによって精製し単離することができる。また目的とする有用蛋白質が本来有する機能を指標としながら、シリカゲル担体、イオン交換性担体、ゲル濾過担体、キレート性担体、色素担持担体等を用いたカラムクロマトグラフィーによって精製し単離することができる。中でもイオン交換性担体を用いるのがよい。例えば、イヌパルボウイルスVP2抗原は、イヌパルボウイルスVP2の遺伝子を導入したカイコの絹糸腺または繭糸に、アルカリ性イオン水を加えホモジナイズして得られる可溶性画分に回収することができる。さらに、得られた抽出液を、例えばブルーセファロース担体に吸着させ、洗浄後、塩類を含む緩衝液で溶出することにより、イヌパルボウイルスVP2抗原の純度を上げることができる。   There is no particular limitation on the method for isolating and purifying the extracted foreign protein, and a normal protein purification method can be used. For example, it can be purified and isolated by combining desalting and concentration by ultrafiltration, gel filtration, dialysis, salting out, and the like. In addition, it can be purified and isolated by column chromatography using a silica gel carrier, an ion exchange carrier, a gel filtration carrier, a chelating carrier, a dye carrier, etc., with the function of the intended useful protein as an index. . Among these, an ion exchange carrier is preferably used. For example, the canine parvovirus VP2 antigen can be recovered in a soluble fraction obtained by homogenizing a silk gland or silk thread of a silkworm introduced with a canine parvovirus VP2 gene by adding alkaline ionized water. Furthermore, the purity of the canine parvovirus VP2 antigen can be increased by adsorbing the obtained extract on, for example, a blue sepharose carrier, washing, and eluting with a buffer containing salts.

このように製造される外来タンパク質については、特に限定はないが水溶液に対して可溶性であるタンパク質が望ましい。たとえばサイトカインが好ましい。サイトカインとは細胞の増殖・分化・機能発現を行い、構造や作用機構などで様々な種類に分類できる。代表的なものにインターフェロンなどがある。また、ワクチンの抗原タンパク質も好ましい。ワクチンの抗原タンパク質とは、動物に対して抗原性を有し、動物体内に投与されたときに、それに対する抗体の産生や細胞性免疫を誘導するもの、またウイルス、微生物、寄生虫、腫瘍、その他動物由来のタンパク質であり、それに起因する疾病の予防または治癒が期待できるものであり、アミノ酸組成や分子量、糖鎖の有無は問題とはならず、どのようなタンパク質、ペプチドでも使用できる。このように製造されたタンパク質は、従来の他の製造方法で製造されたサイトカインやワクチンの抗原タンパク質と同様に、医薬用途や各種の測定、診断用途に用いることができる。この場合、各種添加剤を加えた混合物として使用してもよい。また、サイトカインやワクチンの抗原タンパク質を発現したカイコの組織、もしくは繭糸は、そのまま、もしくは加工して、医療用または衣料用の繊維として用いることができる。また、酵素類を発現した組換えカイコの組織もしくは絹糸は、そのまま酵素反応に使用することも可能である。   The foreign protein thus produced is not particularly limited, but a protein that is soluble in an aqueous solution is desirable. For example, cytokines are preferred. Cytokines perform cell proliferation, differentiation, and functional expression, and can be classified into various types according to structure and action mechanism. Typical examples include interferon. Also preferred are antigenic proteins of the vaccine. Antigen proteins of vaccines are those that have antigenicity to animals and induce antibody production and cellular immunity when administered into animals, as well as viruses, microorganisms, parasites, tumors, It is a protein derived from other animals and can be expected to prevent or cure diseases caused by the protein. Amino acid composition, molecular weight, and the presence or absence of sugar chains are not a problem, and any protein or peptide can be used. The protein produced in this way can be used for pharmaceutical use, various measurements, and diagnostic use, as in the case of cytokine and vaccine antigen proteins produced by other conventional production methods. In this case, you may use as a mixture which added various additives. Silkworm tissues or silkworms expressing cytokine or vaccine antigen proteins can be used as medical or clothing fibers as they are or after being processed. Moreover, the recombinant silkworm tissue or silk thread expressing the enzymes can be used for the enzymatic reaction as it is.

以下に実施例を示し、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例の記載に限定されるものではない。   Examples Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to the description of these examples.

実施例1. Bombyx mori genomic DNAの調製
5齢3日目のカイコを解剖し、中部絹糸腺組織を取り出した。1×SSCで洗浄した後、DNA 抽出バッファー(50mM Tris-HCl pH8.0, 1mM EDTA pH8.0, 100mM NaCl)200μlを加えた。Proteinase K(final 200μg/ml)を加えて組織をグラインダーで充分すりつぶし、更にDNA抽出バッファーを350μl、10%SDS 60μlを加え混合後、50℃2時間保温した。Tris-HCl飽和フェノールpH8.0 500μlを加え10分混合後、10,000rpm 5分 4℃にて遠心分離し上清を回収した。
Example 1. Preparation of Bombyx mori genomic DNA
The silkworms at 5 days of age were dissected and the middle silk gland tissue was removed. After washing with 1 × SSC, 200 μl of DNA extraction buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 100 mM NaCl) was added. Proteinase K (final 200 μg / ml) was added and the tissue was thoroughly ground with a grinder. Further, 350 μl of DNA extraction buffer and 60 μl of 10% SDS were added and mixed, and then incubated at 50 ° C. for 2 hours. Tris-HCl saturated phenol pH 8.0 500 μl was added and mixed for 10 minutes, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. to recover the supernatant.

上清に等量のフェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコール(25:24:1)を加え混合後、遠心分離した。再度フェノール/クロロフォルム/イソアミルアルコールを加え、遠心分離後上清を回収した。等量のクロロフォルム/イソアミルアルコール(24:1)を加え混合後、遠心分離した上清に再度クロロフォルム/イソアミルアルコールを加え、遠心分離後上清を回収した。得られた上清に1/10量の3M 酢酸ナトリウム(pH5.2)を加え混合し、更に2.5倍量の冷エタノールを加え-80℃にて30分静置後、15,000rpm 10分 4℃にて遠心分離しgenomic DNAを沈殿させた。70%エタノールでDNAの沈殿を洗浄した後、風乾させた。RNase入り滅菌水で100μg/mlとなるように溶解、希釈しgenomic DNA溶液を調製した。   An equal amount of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25: 24: 1) was added to the supernatant, mixed, and then centrifuged. Phenol / chloroform / isoamyl alcohol was added again, and the supernatant was recovered after centrifugation. After adding an equal amount of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) and mixing, chloroform / isoamyl alcohol was added again to the centrifuged supernatant, and the supernatant was recovered after centrifugation. 1/10 volume of 3M sodium acetate (pH 5.2) was added to the resulting supernatant and mixed, and 2.5 times the amount of cold ethanol was added and left at -80 ° C for 30 minutes, then 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. The mixture was centrifuged to precipitate genomic DNA. The DNA precipitate was washed with 70% ethanol and then air-dried. A genomic DNA solution was prepared by dissolving and diluting with RNase-containing sterile water to 100 μg / ml.

実施例2. 遺伝子の調製
用いた遺伝子は既知の配列を利用して、その両端配列のプライマーを作製し、適当なDNAソースを鋳型としてPCRを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。
Example 2 Preparation of Gene The gene used was obtained by preparing a primer at both ends using a known sequence and performing PCR using an appropriate DNA source as a template. A restriction enzyme cleavage site was added to the end of the primer for later gene manipulation.

セリシンプロモーター(GeneBank登録番号AB007831の塩基番号599〜1656番目:以下P領域)は、Bombyx mori genomic DNAを鋳型に、プライマー1(配列番号1)とプライマー2(配列番号2)の2種類のプライマーを用いたPCRにより取得した。   The sericin promoter (base number 599 to 1656th of GeneBank registration number AB007831: P region) is composed of Bombyx mori genomic DNA as a template and two primers, primer 1 (SEQ ID NO: 1) and primer 2 (SEQ ID NO: 2). Obtained by PCR used.

セリシンプロモーター・セリシン遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域(以下SP領域)は、Bombyx mori genomic DNAを鋳型に、プライマー3(配列番号3)とプライマー4(配列番号4)の2種類のプライマーを用いたPCRにより取得した。   The sericin promoter, sericin gene first exon, first intron, and second exon region (hereinafter referred to as SP region) are two types, primer 3 (SEQ ID NO: 3) and primer 4 (SEQ ID NO: 4), using Bombyx mori genomic DNA as a template. It acquired by PCR using the primer of.

ネコインターフェロンーω遺伝子(GeneBank登録番号S62636の塩基番号9〜593番目:以下IC領域)はネコインターフェロンーω遺伝子をコードするバキュロウイルスrBNV100を鋳型にプライマー5(配列番号5)とプライマー6(配列番号6)の2種類のプライマーを用いてPCRにより取得した。rBNV100は、例えばE.Coli(pFeIFN1)(微工研条寄第1633号)から抽出したプラスミドからネコインターフェロンーωの遺伝子を切り出して、カイコのクローニングベクター(T.Horiuchiら、Agric.Biol.Chem.,51,1573-1580,1987)に連結して作製した組換えプラスミドとカイコ多核体病ウイルスDNAとを、カイコ樹立細胞にコ・トランスフェクションして作製することができる。   The feline interferon-ω gene (base numbers 9 to 593 of GeneBank registration number S62636: IC region hereinafter) is primer 5 (SEQ ID NO: 5) and primer 6 (SEQ ID NO: 5) using baculovirus rBNV100 encoding the feline interferon-ω gene as a template. It was obtained by PCR using the two types of primers of 6). rBNV100 is obtained by, for example, cutting out the feline interferon-ω gene from a plasmid extracted from E. Coli (pFeIFN1) (Microtechnical Research Institute No. 1633), and then cloning a silkworm cloning vector (T. Horiuchi et al., Agric. ., 51, 1573-1580, 1987) and a silkworm polynuclear disease virus DNA can be produced by co-transfecting silkworm established cells.

セリシンポリAシグナル領域(GeneBank登録番号AF226688の塩基番号79099〜79995番目:以下SA領域)は、Bombyx mori genomic DNAを鋳型に、プライマー7(配列番号7)とプライマー8(配列番号8)の2種類のプライマーを用いたPCRにより取得した。   There are two types of sericin poly A signal region (GeneBank accession number AF226688, nucleotide numbers 79099-79995: the SA region): Bombyx mori genomic DNA as a template, primer 7 (SEQ ID NO: 7) and primer 8 (SEQ ID NO: 8) It acquired by PCR using the primer of.

これらの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動し、それぞれP領域では約0.3kbp、SP領域では約3.5kbp.、IC領域では約580bp.、SA領域では約0.9bpのDNA断片を常法に従って抽出、調製した。これらのDNA断片をポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造(株)製)によりリン酸化した後、HincIIで切断後脱リン酸化処理したpUC19ベクターに宝酒造(株)のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃、終夜反応を行い、連結した。これらを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体にPCR断片が挿入されていることを、得られたコロニーを前述と同じ条件でPCRすることによって確認し、PCR断片の挿入されたプラスミドを常法によって調製した。これらのプラスミドをシークエンスすることにより、得られた断片がそれぞれの遺伝子の塩基配列であることを確認した。   These reaction solutions were electrophoresed on a 1% agarose gel, and DNA fragments of about 0.3 kbp in the P region, about 3.5 kbp. In the SP region, about 580 bp in the IC region, and about 0.9 bp in the SA region were used in a conventional method. Extracted and prepared according to These DNA fragments were phosphorylated with a polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.), then cleaved with HincII and then dephosphorylated with a DNA ligation kit Ver. 2 of Takara Shuzo Co., Ltd. at 16 ° C. The reaction was performed overnight and ligated. Using these, E. coli was transformed according to a conventional method, and it was confirmed by PCR that the obtained colony was inserted into the obtained transformant under the same conditions as described above. The inserted plasmid was prepared by a conventional method. By sequencing these plasmids, it was confirmed that the fragments obtained were the base sequences of the respective genes.

実施例3. 遺伝子導入用プラスミドの作製
遺伝子導入用プラスミドには、トランスポゾンpiggyBacの一対の逆向き反復配列の間に、ネコインターフェロン−ω遺伝子の発現カセットを挿入した遺伝子構造を含むプラスミドを用いた。
Example 3 Production of Plasmid for Gene Introduction A plasmid containing a gene structure in which an expression cassette for a feline interferon-ω gene was inserted between a pair of inverted repeats of transposon piggyBac was used as a gene introduction plasmid.

すなわち、米国特許第6218185号に開示されるプラスミドp3E1.2よりtransposaseをコードする領域を取り除き、そのBgl II部位およびHpa I部位を平滑化しネコインターフェロン−ω遺伝子の発現カセットを挿入した。   That is, the transposase-encoding region was removed from plasmid p3E1.2 disclosed in US Pat. No. 6,218,185, its Bgl II site and Hpa I site were smoothed, and an expression cassette for the feline interferon-ω gene was inserted.

本実施例における遺伝子発現カセットの構成は、セリシンプロモーター・ネコインターフェロンーω・セリシンポリAシグナル領域(P・IC・SA)、もしくはセリシンプロモーター・セリシン遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域・ネコインターフェロンーω・セリシンポリAシグナル領域(SP・IC・SA)である。   The gene expression cassette in this example consists of a sericin promoter / cat interferon-ω / sericin poly A signal region (P / IC / SA) or a sericin promoter / sericin gene first exon / first intron / second exon region. -Cat interferon-ω-Sericin poly A signal region (SP, IC, SA).

以下に具体的な方法を示す。   A specific method is shown below.

P・IC・SAコンストラクトの作製は以下の手法により行った。実施例2で調製したネコインターフェロンーω(IC領域)を持つプラスミドをSal IとHind IIIにより切断し、ここにセリシンプロモーターを持つプラスミドからSal IとHind IIIにより切り出した約1kbp.断片(P領域)を挿入した。さらにこれをBamH Iにより切断し、ここにセリシンポリAシグナル領域を持つプラスミドからBamH Iにより切り出した約0.9kbp.断片(SA領域)を挿入した。このP・IC・SAを持つプラスミドをAsc Iで切断し、切り出した約2.5kbp断片を宝酒造(株)T4 DNA Polymeraseにより平滑化したものと、p3E1.2をBgl II、Hpa Iで切断し、750bpの遺伝子断片を除去後、平滑化、脱リン酸化処理したものとを連結し、P・IC・SA遺伝子カセットを含む遺伝子導入用コンストラクトを作製した。   The P / IC / SA construct was prepared by the following method. The plasmid having feline interferon-ω (IC region) prepared in Example 2 was digested with Sal I and Hind III, and about 1 kbp. Fragment (P region) excised from the plasmid with sericin promoter by Sal I and Hind III. ) Was inserted. Further, this was cleaved with BamH I, and about 0.9 kbp. Fragment (SA region) cut out with BamH I from a plasmid having a sericin poly A signal region was inserted therein. This plasmid having P, IC, and SA was digested with Asc I, and the excised about 2.5 kbp fragment was blunted with Takara Shuzo T4 DNA Polymerase, and p3E1.2 was digested with Bgl II and Hpa I. After removing the gene fragment of 750 bp, the gene fragment that had been smoothed and dephosphorylated was ligated to produce a gene introduction construct containing the P • IC • SA gene cassette.

SP・IC・SAコンストラクトの作製は以下の手法により行った。実施例2で調製したネコインターフェロンーω(IC領域)を持つプラスミドをSal IとHind IIIにより切断し、ここにセリシンプロモーター・セリシン遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域を持つプラスミドからSal IとHind IIIにより切り出した約3.5kbp.断片(SP領域)を挿入した。   The SP / IC / SA construct was prepared by the following method. The plasmid having the cat interferon-ω (IC region) prepared in Example 2 was cleaved with Sal I and Hind III, and the plasmid containing the sericin promoter / sericin gene first exon / first intron / second exon region An approximately 3.5 kbp fragment (SP region) excised with Sal I and Hind III was inserted.

さらにこれをBamH Iにより切断し、ここにセリシンポリAシグナル領域を持つプラスミドからBamH Iにより切り出した約0.9kbp.断片(SA領域)を挿入した。このSP・IC・SAを持つプラスミドをAsc Iで切断し、切り出した約5kbp断片を宝酒造(株)T4 DNA Polymeraseにより平滑化したものと、p3E1.2をBgl II、Hpa Iで切断し、750bpの遺伝子断片を除去後、平滑化、脱リン酸化処理したものとを連結し、SP・IC・SA遺伝子カセットを含む遺伝子導入用コンストラクトを作製した。
P・IC・SA遺伝子導入用コンストラクト、SP・IC・SA遺伝子導入用コンストラクトをQIAGEN Plasmid Maxi Kitを用い、添付のプロトコールに従って精製した。
Further, this was cleaved with BamH I, and about 0.9 kbp. Fragment (SA region) cut out with BamH I from a plasmid having a sericin poly A signal region was inserted therein. This SP / IC / SA-containing plasmid was digested with Asc I, and the excised approximately 5 kbp fragment was blunted with Takara Shuzo T4 DNA Polymerase, and p3E1.2 was digested with Bgl II and Hpa I to obtain 750 bp. After the gene fragment was removed, the gene fragment was smoothed and dephosphorylated and ligated to produce a gene introduction construct containing the SP / IC / SA gene cassette.
The P / IC / SA gene introduction construct and the SP / IC / SA gene introduction construct were purified using the QIAGEN Plasmid Maxi Kit according to the attached protocol.

実施例4 ピギーバックトランスポゼースタンパク質の調製
(1)遺伝子のクローニングおよび発現ベクターの作製
ピギーバックトランスポゼース遺伝子のクローニングには、米国特許6218185号公報で開示されているピギーバックトランスポゼース遺伝子の塩基配列を参考にオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。
Example 4 Preparation of piggyback transposase protein (1) Gene cloning and expression vector preparation For piggyback transposase gene cloning, an oligo was used with reference to the nucleotide sequence of the piggyback transposase gene disclosed in US Pat. No. 6,218,185. Nucleotide primers were synthesized. A restriction enzyme cleavage site was added to the end of the primer for later gene manipulation.

ピギーバックトランスポゼースタンパク質遺伝子のクローニングには、プライマー9(配列番号9)とプライマー10(配列番号10)の2種類のプライマーを用い、米国特許6218185号公報により開示されるプラスミドp3E1.2をテンプレートとして用いたPCRにより取得した。   For cloning the piggyback transposase protein gene, two types of primers, primer 9 (SEQ ID NO: 9) and primer 10 (SEQ ID NO: 10), were used, and the plasmid p3E1.2 disclosed in US Pat. No. 6,218,185 was used as a template. Obtained by PCR.

PCRは0.2mlのミクロ遠心チューブを用い、鋳型DNAを10ng、各プライマーを50pmol、添付の10×PCRバッファーを10μl、1mM MgCl、0.2mM dNTPs、2単位KODplusとなるように各試薬を加え、全量を100μlとした。DNAの変性条件を94℃、30秒、プライマーのアニーリング条件を60℃、30秒、DNAプライマーの伸長反応条件を72℃、3分の各条件でBioRad社のサーマルサイクラーを用い、30サイクル反応させた。この反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動し、約1.8kbpのDNA断片を常法に従って抽出、調整した。 PCR was performed using a 0.2 ml microcentrifuge tube, 10 ng of template DNA, 50 pmol of each primer, 10 μl of the attached 10 × PCR buffer, 1 mM MgCl 2 , 0.2 mM dNTPs, and 2 units of KODplus were added to each reagent. The total volume was 100 μl. Use a BioRad thermal cycler for 30 cycles under conditions of DNA denaturation at 94 ° C for 30 seconds, primer annealing at 60 ° C for 30 seconds, and DNA primer extension at 72 ° C for 3 minutes. It was. This reaction solution was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 1.8 kbp was extracted and prepared according to a conventional method.

このDNA断片をポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造(株)製)によりリン酸化した後、HincIIで切断後脱リン酸化処理したpUC19ベクターに宝酒造(株)のDNAライゲーションキットVer.2を用いて16℃、終夜反応を行い、連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体にPCR断片が挿入されていることを、得られたコロニーを前述と同じ条件でPCRすることによって確認し、PCR断片の挿入されたプラスミドを常法によって調整した。このプラスミドをシークエンスすることにより、得られた断片が遺伝子の塩基配列であることを確認した。   This DNA fragment was phosphorylated with a polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.), cleaved with HincII, and then dephosphorylated with the pUC19 vector using Takara Shuzo Co., Ltd. DNA Ligation Kit Ver. 2 at 16 ° C. overnight. Reactions were performed and ligated. Using this, Escherichia coli was transformed according to a conventional method, and it was confirmed by PCR that the obtained colony was inserted into the obtained transformant under the same conditions as described above. The inserted plasmid was prepared by a conventional method. By sequencing this plasmid, it was confirmed that the obtained fragment was the base sequence of the gene.

このプラスミドを、NcoI、およびBamHIで消化し、得られた1.8kbpのNcoI/BamHI断片を、予めNcoI、およびBamHIで消化しておいたpTV118N(宝酒造(株)製)のNcoI/BamHI間隙に常法に従ったライゲーション反応により挿入し、得られたプラスミドをpTV−piggyと命名した。このプラスミドを導入した大腸菌を培養することで、ピギーバックトランスポゼースタンパク質のN末端アミノ酸配列に10個のヒスジチン残基が付加された分子量約70kDaの組換えピギーバックトランスポゼースタンパク質を生産することができる。   This plasmid was digested with NcoI and BamHI, and the resulting 1.8 kbp NcoI / BamHI fragment was always inserted into the NcoI / BamHI gap of pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.) previously digested with NcoI and BamHI. The resulting plasmid was inserted by a ligation reaction according to the method, and the resulting plasmid was named pTV-piggy. By culturing Escherichia coli into which this plasmid has been introduced, a recombinant piggyback transposase protein having a molecular weight of about 70 kDa in which 10 histidine residues have been added to the N-terminal amino acid sequence of the piggyback transposase protein can be produced.

(2)組換えピギーバックトランスポゼースタンパク質の産生
pTV−piggyでE.coli BL21株をアンピシリン耐性に形質転換し、得られた形質転換体をそれぞれBL21−piggy株と命名した。
(2) Production of recombinant piggyback transposase protein E. coli BL21 strain was transformed to ampicillin resistance with pTV-piggy, and the resulting transformants were named BL21-piggy strain, respectively.

次にBL21−piggy株で、組換えピギーバックトランスポゼースタンパク質を産生させた。まず、BL21−piggy株を50μg/mlのアンピシリンナトリウムを含んだ滅菌LB培地(Sambrook, J. et al., 2001、Molecular Cloning 3rd. edition, Cold Spring Harbor Lab. Press)(LB-amp培地)5mlに1白金耳植菌し、37℃で24時間振とうして前培養を行った。   Next, recombinant piggyback transposase protein was produced in BL21-piggy strain. First, BL21-piggy strain was sterilized LB medium (Sambrook, J. et al., 2001, Molecular Cloning 3rd. Edition, Cold Spring Harbor Lab. Press) containing 50 μg / ml ampicillin sodium (LB-amp medium) 5 ml. One platinum ear was inoculated and pre-cultured by shaking at 37 ° C. for 24 hours.

この前培養液をLB-amp培地50mlに全量植菌し、37℃、振幅30cmで、180rpmの条件下で3時間培養した後に1mM IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactoside)添加し、更に4時間培養した。対照実験として、BL21をpTV118Nで形質転換した形質転換体を対照として用い同様の培養を行った。こうして得られた菌体を集め、5mlのTBS緩衝液(宝酒造製)に再懸濁後、超音波破砕および遠心分離により細胞破砕液を調製した。この細胞破砕液をSDS-PAGEで分画し、Penta-His Antibody抗体(QIAGEN社製)でウエスタンブロッティングを行った結果、BL21−piggy株由来の細胞破砕液から、分子量約70kDaの組み換えピギーバックトランスポゼースタンパク質を検出した。   Inoculate the entire volume of this preculture in 50 ml of LB-amp medium, incubate for 3 hours at 37 ° C, amplitude 30 cm, and 180 rpm, then add 1 mM IPTG (isopropyl-1-thio-β-D-galactoside). The culture was further continued for 4 hours. As a control experiment, the same culture was performed using a transformant obtained by transforming BL21 with pTV118N as a control. The bacterial cells thus obtained were collected and resuspended in 5 ml of TBS buffer (Takara Shuzo), and then a cell disruption solution was prepared by ultrasonic disruption and centrifugation. This cell lysate was fractionated by SDS-PAGE and subjected to Western blotting with Penta-His Antibody antibody (QIAGEN). As a result, a recombinant piggyback transposase with a molecular weight of about 70 kDa was obtained from the cell lysate derived from BL21-piggy strain. Protein was detected.

(3)組換えピギーバックトランスポゼースタンパク質の精製
この組み換えタンパク質は、N末端アミノ酸配列に10個のヒスチジン残基があることから、ニッケルイオンとの相互作用を利用した精製を行った。
(3) Purification of recombinant piggyback transposase protein Since this recombinant protein has 10 histidine residues in the N-terminal amino acid sequence, it was purified using interaction with nickel ions.

まず、10mlのキレーティング セファロース ファースト フロー(Chilating Sepharose Fast Flow)担体(アマシャム バイオサイエンス社製)を充填したカラムシステムを構築した。このカラムに50mlの50mM 硫酸ニッケル水溶液、50mlのTBS緩衝液の順で流した後、(2)と同様の方法で得られたBL21−piggy株の500ml培溶液由来の50ml細胞破砕液を流した。その後、100mlの5mM イミダゾールを含むTBS緩衝液、100mlの50mM イミダゾールを含むTBS緩衝液をこの順序で流した。更に50mlの600mM イミダゾールを含むTBS緩衝液を流した。カラムに流した各々の緩衝液を(2)と同様の方法でウエスタンブロッティングを行ったところ、600mM イミダゾールを含むTBS緩衝液に約70kDaタンパク質を検出した。また、カラムに流した各々の緩衝液をSDS-PAGEし、クマシーブリリアントブルーで染色したところ、600mM イミダゾールを含むTBS緩衝液から、約70kDaの単一バンドを検出し、この精製タンパク質は組換えピギーバックトランスポゼースタンパク質であることを確認した。透析によりイミダゾールを除去した後、ウシ血清アルブミンを標準タンパク質として、Pierce社 BCA試薬を用いてタンパク質濃度を定量した。   First, a column system packed with 10 ml of a chelating Sepharose Fast Flow carrier (Amersham Biosciences) was constructed. After flowing 50 ml of 50 mM nickel sulfate aqueous solution and 50 ml of TBS buffer in this order, 50 ml cell disruption solution derived from 500 ml culture solution of BL21-piggy strain obtained by the same method as (2) was passed. . Thereafter, 100 ml of TBS buffer containing 5 mM imidazole and 100 ml of TBS buffer containing 50 mM imidazole were run in this order. An additional 50 ml of TBS buffer containing 600 mM imidazole was run. Western blotting was performed on each buffer solution applied to the column in the same manner as in (2). As a result, about 70 kDa protein was detected in a TBS buffer solution containing 600 mM imidazole. In addition, when each buffer solution passed through the column was subjected to SDS-PAGE and stained with Coomassie Brilliant Blue, a single band of about 70 kDa was detected from the TBS buffer containing 600 mM imidazole. It was confirmed to be a back transposase protein. After removing imidazole by dialysis, protein concentration was quantified using Pierce BCA reagent with bovine serum albumin as a standard protein.

実施例5. 遺伝子組換えカイコの作製
実施例3に記載の遺伝子導入用プラスミドと実施例4に記載ピギーバックトランスポゼースタンパク質を各200μg/ml含んだ0.5mMリン酸バッファー(pH7.0)・5mMKCl溶液を調製し、3〜20nlを 産卵後4時間以内のカイコ卵500個に対してマイクロインジェクションした。
Example 5. Preparation of transgenic silkworm 0.5 mM phosphate buffer (pH 7.0) / 5 mM KCl solution containing 200 μg / ml each of the plasmid for gene transfer described in Example 3 and the piggyback transposase protein described in Example 4 And 3-20 nl were microinjected into 500 silkworm eggs within 4 hours after laying eggs.

そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫(G0)を群内で掛け合わせ得られた次世代(G1)を4齢時にその体液を注射用針(21G)で採取し、PCRにより遺伝子の導入をスクリーニングした。PCRは配列番号5および配列番号6のプライマーを用いて宝酒造(株)製のPremix Taqにより行った。すなわち、Premix Taqを最終濃度2倍希釈、プライマーそれぞれ0.5μMとなるように調製した液を20μLずつ分注し、体液を0.5〜2μL加え、DNAの変性条件を94℃、30秒、プライマーのアニーリング条件を55℃、30秒、DNAプライマーの伸長反応条件を72℃、1分の各条件でBioRad社のサーマルサイクラーを用い、30サイクル反応させた。これらの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動し、約580bpのDNA断片が確認されたものを、遺伝子導入陽性と判断した。その結果、染色体中にネコインターフェロンω遺伝子の発現カセットが導入された遺伝子組換えカイコが得られた。   The larvae hatched from the silkworm eggs are reared, and the next generation (G1) obtained by multiplying the obtained adult worms (G0) within the group is collected with the injection needle (21G) at the age of four, and PCR is performed. To screen for gene transfer. PCR was performed with Premix Taq manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6. In other words, 20 μL of Premix Taq diluted to a final concentration of 2 × and each primer adjusted to 0.5 μM was dispensed, 0.5 to 2 μL of body fluid was added, DNA denaturation conditions were 94 ° C., 30 seconds, primer annealing The reaction was carried out for 30 cycles using a BioCycle thermal cycler under conditions of 55 ° C. for 30 seconds and DNA primer extension conditions of 72 ° C. for 1 minute. These reaction solutions were electrophoresed on a 1% agarose gel, and those in which a DNA fragment of about 580 bp was confirmed were judged as gene transfer positive. As a result, a transgenic silkworm having a feline interferon ω gene expression cassette introduced into the chromosome was obtained.

実施例6. ウエスタン解析による絹糸中の組換えタンパク質の測定
絹糸への外来タンパク質すなわちネコインターフェロンωの分泌を調べた。
非形質転換カイコ、形質転換カイコ(P・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコ、SP・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭を各10mg量り採り、絹糸(フィブロイン層、セリシン層)を完全に溶解する60%リチウムチオシアネイト(LiSCN)4mlを加え攪拌後、終夜室温に静置し繭を溶解した。これを8M尿素・2%SDS・5%2-メルカプトエタノールで10培希釈したものをサンプルとし、、ECL PlusTM Western blotting Kit (アマシャムファルマシア社製)を用い、添付のプロトコールに従ってネコインターフェロンの検出を行った。その結果をモレキュラーイメージャー(BioRad社製)を用いてシグナル強度を測定し、濃度既知のネコインターフェロンのシグナル強度と比較しタンパク質含量を測定した。また、非形質転換カイコ、形質転換カイコ(P・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコ、SP・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭に、リン酸ナトリウムバッファーを添加してセリシン層のみを可溶化し、これをサンプルとして同様にウエスタンブロッティング法でネコインターフェロンの検出を行った。
Example 6: Measurement of recombinant protein in silk by Western analysis The secretion of a foreign protein, namely cat interferon ω, into silk was examined.
Weigh 10 mg each of non-transformed silkworms, transformed silkworms (P / IC / SA gene-introduced transformed silkworms, SP / IC / SA gene-introduced silkworm), and complete the silk thread (fibroin layer, sericin layer) 4 ml of dissolved 60% lithium thiocyanate (LiSCN) was added and stirred, and then allowed to stand overnight at room temperature to dissolve the soot. The sample was diluted 10 times with 8M urea, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol, and the cat interferon was detected using the ECL PlusTM Western blotting Kit (Amersham Pharmacia) according to the attached protocol. It was. The signal intensity was measured using a molecular imager (manufactured by BioRad), and the result was compared with the signal intensity of feline interferon with a known concentration to determine the protein content. In addition, sodium phosphate buffer can be added to the cocoons of non-transformed silkworms and transformed silkworms (P, IC, SA gene-introduced transgenic silkworms, SP, IC, SA gene-introduced silkworms) to allow only the sericin layer. The cat interferon was detected by Western blotting in the same manner as a sample.

その結果非形質転換カイコおよびP・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコの繭からはシグナルが検出されなかったのに対しSP・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコの繭からはシグナルが検出され、ネコインターフェロンタンパク質が絹糸中へと分泌されていることが確認できた。またその含量はSP・IC・SA形質転換カイコでは約0.8〜2.0%であった。これはカイコ一頭当たりの重量に換算すると0.4〜2mgであった。この結果を図1に示す。また、セリシン層のみを可溶化し、可溶性画分と不溶性画分に分画したところ、可溶性画分にネコインターフェロンタンパク質が確認できた。この結果を図2に示す。   As a result, no signal was detected from the silkworm of the non-transformed silkworm and the silkworm transformed with the P • IC • SA gene, whereas the signal was detected from the silkworm of the silkworm transformed with the SP • IC • SA gene. It was confirmed that the interferon protein was secreted into the silk thread. The content was about 0.8 to 2.0% for SP, IC and SA transformed silkworms. This was 0.4 to 2 mg in terms of weight per silkworm. The result is shown in FIG. Further, when only the sericin layer was solubilized and fractionated into a soluble fraction and an insoluble fraction, feline interferon protein was confirmed in the soluble fraction. The result is shown in FIG.

実施例7.ウエスタン解析による中部絹糸腺組織中の組換えタンパク質の発現解析
非形質転換カイコ、形質転換カイコ(P・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコ、SP・IC・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の中部絹糸腺組織を回収し、組織中でのネコインターフェロンωの発現をウエスタン解析により調べた。カイコ中部絹糸腺を100mMリン酸ナトリウムバッファー(pH7.0)中でホモジナイズし、遠心分離後上清を回収しサンプルとし、ECL PlusTM Western blotting Kit (アマシャムファルマシア社製)を用い、添付のプロトコールに従ってネコインターフェロンの検出を行った。すなわち、ブロッティングしたメンブレンをブロッキング溶液(5%スキムミルク・0.1%Tween20・PBS)中で4℃終夜ブロッキングした。
Example 7 Expression analysis of recombinant protein in middle silk gland tissue by Western analysis Middle silk gland of non-transformed silkworm, transformed silkworm (P, IC, SA gene-introduced silkworm, SP, IC, SA gene-introduced silkworm) The tissue was collected, and the expression of cat interferon ω in the tissue was examined by Western analysis. Homogenize the silkworm middle silk gland in 100 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0), collect the supernatant after centrifugation, and use the ECL PlusTM Western blotting Kit (manufactured by Amersham Pharmacia) as a sample according to the attached protocol. Interferon was detected. That is, the blotted membrane was blocked overnight at 4 ° C. in a blocking solution (5% skim milk / 0.1% Tween 20 / PBS).

メンブレンをTPBS(0.1%Tween20・PBS)で2回洗浄し、TPBSで1000倍希釈した抗ネコインターフェロン抗体で室温1時間処理した。メンブレンをTPBSで2回洗浄し、更にTPBSで5分間3回洗浄した。その後TPBSで10000倍希釈した後、HRPラベル抗ラビットIgG抗体で室温1時間処理した。メンブレンをTPBSで2回洗浄し、更にTPBSで5分間3回洗浄した後、ECL PlusTM Western blotting Detection System(アマシャムファルマシア社製)の検出試薬(溶液A+溶液B)を加えた。発光をHyperfilmTMECLTM に露光、現像した。シグナルの比較には、BIORAD社製モレキュラーイメージャーFXProを用いた。   The membrane was washed twice with TPBS (0.1% Tween20 · PBS) and treated with an anti-cat interferon antibody diluted 1000 times with TPBS for 1 hour at room temperature. The membrane was washed twice with TPBS, and further washed 3 times with TPBS for 5 minutes. Thereafter, the resultant was diluted 10,000 times with TPBS, and then treated with an HRP-labeled anti-rabbit IgG antibody for 1 hour at room temperature. The membrane was washed twice with TPBS, and further washed 3 times with TPBS for 5 minutes, and then a detection reagent (solution A + solution B) of ECL Plus ™ Western blotting Detection System (Amersham Pharmacia) was added. Luminescence was exposed and developed in HyperfilmTM ECLTM. For comparison of signals, a molecular imager FXPro manufactured by BIORAD was used.

その結果非形質転換カイコおよびP・IC・SAコンストラクト導入形質転換カイコの中部絹糸腺組織からはシグナルが検出されなかったのに対し、SP・IC・SAコンストラクト導入形質転換カイコの絹糸腺組織からはシグナルが検出された。本実験の結果から、カイコ中部絹糸腺細胞内でのタンパク質の合成もしくは遺伝子発現の飛躍的な向上に、セリシンプロモーター以外の領域すなわちセリシン遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域が重要な役割を果たしている事が再確認された。   As a result, no signal was detected in the middle silk gland tissue of the non-transformed silkworm and the transformed silkworm introduced with the P / IC / SA construct, whereas the silk gland tissue of the transformed silkworm with the SP / IC / SA construct introduced A signal was detected. Based on the results of this experiment, regions other than the sericin promoter, ie, the first exon, first intron, and second exon region, play an important role in dramatically improving protein synthesis or gene expression in the middle silk gland cells of the silkworm. It was reconfirmed that

実施例8.抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)の遺伝子の調製
用いた遺伝子は既知の配列を利用して、その両端配列のプライマーを作製し、適当なDNAソースを鋳型としてPCRを行うことにより取得した。プライマーの端には後の遺伝子操作のために制限酵素切断部位を付加した。
Example 8. Preparation of gene for antigen protein (canine parvovirus VP2) The gene used was obtained by preparing primers at both ends using a known sequence and performing PCR using an appropriate DNA source as a template. did. A restriction enzyme cleavage site was added to the end of the primer for later gene manipulation.

イヌパルボウイルスVP2遺伝子(GeneBank登録番号AB128923の塩基番号1〜1755番目:以下VP2領域)はイヌパルボウイルスVP2遺伝子をコードするCanine parvovirusを鋳型にプライマー11(配列番号11)とプライマー12(配列番号12)の2種類のプライマーを用いてPCRにより取得した。   The canine parvovirus VP2 gene (base numbers 1 to 1755 of GeneBank accession number AB128923: VP2 region) is primer 11 (SEQ ID NO: 11) and primer 12 (SEQ ID NO: 12) using Canine parvovirus encoding canine parvovirus VP2 gene as a template. ) Was obtained by PCR using two types of primers.

反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動し、VP2領域は約1700bpのDNA断片を常法に従って抽出、調製した。このDNA断片をポリヌクレオチドキナーゼ(宝酒造(株)製)によりリン酸化した後、HincIIで切断後脱リン酸化処理したpUC19ベクターに宝酒造(株)のDNA Ligation Kit Ver.2を用いて16℃、終夜反応を行い、連結した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体にPCR断片が挿入されていることを、得られたコロニーを前述と同じ条件でPCRすることによって確認し、PCR断片の挿入されたプラスミドを常法によって調製した。このプラスミドをシークエンスすることにより、得られた断片がそれぞれの遺伝子の塩基配列であることを確認した。   The reaction solution was electrophoresed on a 1% agarose gel, and a DNA fragment of about 1700 bp was extracted from the VP2 region according to a conventional method. This DNA fragment was phosphorylated with a polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.), then cleaved with HincII, and then dephosphorylated with the pUC19 vector using Takara Shuzo Co., Ltd. DNA Ligation Kit Ver. 2 at 16 ° C. overnight. Reactions were performed and ligated. Using this, E. coli was transformed according to a conventional method, and it was confirmed by PCR that the obtained colony was inserted into the resulting transformant under the same conditions as described above. The inserted plasmid was prepared by a conventional method. By sequencing this plasmid, it was confirmed that the obtained fragment was the base sequence of each gene.

実施例9. 遺伝子導入用プラスミドの作製
遺伝子導入用プラスミドには、トランスポゾンpiggyBacの一対の逆向き反復配列の間に、イヌパルボウイルスVP2遺伝子の発現カセットを挿入した遺伝子構造を含むプラスミドを用いた。
すなわち、米国特許第6218185号に開示されるプラスミドp3E1.2よりtransposaseをコードする領域を取り除き、そのBgl II部位およびHpa I部位を平滑化しイヌパルボウイルスVP2遺伝子の発現カセットを挿入した。
Example 9 Preparation of Plasmid for Gene Introduction A plasmid containing a gene structure in which an expression cassette for canine parvovirus VP2 gene was inserted between a pair of inverted repeats of transposon piggyBac was used as a gene introduction plasmid.
That is, the transposase-encoding region was removed from plasmid p3E1.2 disclosed in US Pat. No. 6,218,185, its Bgl II site and Hpa I site were smoothed, and an expression cassette for canine parvovirus VP2 gene was inserted.

本実施例における遺伝子発現カセットの構成は、セリシンプロモーター・イヌパルボウイルスVP2・セリシンポリAシグナル領域(P・VP2・SA)、もしくはセリシンプロモーター・セリシン遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域・イヌパルボウイルスVP2・セリシンポリAシグナル領域(SP・VP2・SA)である。
以下に具体的な方法を示す。
The gene expression cassette in this example consists of a sericin promoter / canine parvovirus VP2 / sericin poly A signal region (P / VP2 / SA), or a sericin promoter / sericin gene first exon / first intron / second exon region. It is a canine parvovirus VP2 / sericin poly A signal region (SP / VP2 / SA).
A specific method is shown below.

P・VP2・SAコンストラクトの作製は以下の手法により行った。実施例8で調製したイヌパルボウイルスVP2(VP2領域)を持つプラスミドをSal IとHind IIIにより切断し、ここにセリシンプロモーターを持つプラスミドからSal IとHind IIIにより切り出した約1kbp.断片(P領域)を挿入した。さらにこれをBamH Iにより切断し、ここにセリシンポリAシグナル領域を持つプラスミドからBamH Iにより切り出した約0.9kbp.断片(SA領域)を挿入した。このP・VP2・SAを持つプラスミドをAsc Iで切断し、切り出した約2.5kbp断片を宝酒造(株)T4 DNA Polymeraseにより平滑化したものと、p3E1.2をBgl II、Hpa Iで切断し、750bpの遺伝子断片を除去後、平滑化、脱リン酸化処理したものとを連結し、P・VP2・SA遺伝子カセットを含む遺伝子導入用コンストラクトを作製した。   The P · VP2 · SA construct was produced by the following method. The plasmid having the canine parvovirus VP2 (VP2 region) prepared in Example 8 was cleaved with Sal I and Hind III, and about 1 kbp. Fragment (P region) excised from the plasmid with sericin promoter by Sal I and Hind III. ) Was inserted. Further, this was cleaved with BamH I, and about 0.9 kbp. Fragment (SA region) cut out with BamH I from a plasmid having a sericin poly A signal region was inserted therein. This plasmid having P · VP2 · SA was digested with Asc I, and the excised approximately 2.5 kbp fragment was blunted with Takara Shuzo T4 DNA Polymerase, and p3E1.2 was digested with Bgl II and Hpa I. After removing the gene fragment of 750 bp, the resulting product was ligated with the smoothed and dephosphorylated product to prepare a gene introduction construct containing the P • VP2 • SA gene cassette.

SP・VP2・SAコンストラクトの作製は以下の手法により行った。実施例7で調製したイヌパルボウイルスVP2(VP2領域)を持つプラスミドをSal IとHind IIIにより切断し、ここにセリシンプロモーター・セリシン遺伝子第一エキソン・第一イントロン・第二エキソン領域を持つプラスミドからSal IとHind IIIにより切り出した約3.5kbp.断片(SP領域)を挿入した。   The SP, VP2, and SA constructs were produced by the following method. The plasmid having the canine parvovirus VP2 (VP2 region) prepared in Example 7 was cleaved with Sal I and Hind III, and the plasmid containing the sericin promoter, sericin gene first exon, first intron, and second exon region. An approximately 3.5 kbp fragment (SP region) excised with Sal I and Hind III was inserted.

さらにこれをBamH Iにより切断し、ここにセリシンポリAシグナル領域を持つプラスミドからBamH Iにより切り出した約0.9kbp.断片(SA領域)を挿入した。このSP・VP2・SAを持つプラスミドをAsc Iで切断し、切り出した約7kbp断片を宝酒造(株)T4 DNA Polymeraseにより平滑化したものと、p3E1.2をBgl II、Hpa Iで切断し、750bpの遺伝子断片を除去後、平滑化、脱リン酸化処理したものとを連結し、SP・VP2・SA遺伝子カセットを含む遺伝子導入用コンストラクトを作製した。   Further, this was cleaved with BamH I, and about 0.9 kbp. Fragment (SA region) cut out with BamH I from a plasmid having a sericin poly A signal region was inserted therein. This plasmid having SP, VP2, and SA was cleaved with Asc I, and the excised approximately 7 kbp fragment was blunted with Takara Shuzo T4 DNA Polymerase, and p3E1.2 was cleaved with Bgl II and Hpa I to obtain 750 bp. After the gene fragment was removed, the gene fragment was smoothed and dephosphorylated and ligated to prepare a gene introduction construct containing the SP / VP2 / SA gene cassette.

P・VP2・SA遺伝子導入用コンストラクト、SP・VP2・SA遺伝子導入用コンストラクトをQIAGEN Plasmid Maxi Kitを用い、添付のプロトコールに従って精製した。   The P / VP2 / SA gene introduction construct and the SP / VP2 / SA gene introduction construct were purified using QIAGEN Plasmid Maxi Kit according to the attached protocol.

実施例10. 遺伝子組換えカイコの作製
実施例9に記載の遺伝子導入用プラスミドと実施例4に記載のピギーバックトランスポゼースタンパク質を各200μg/ml含んだ0.5mMリン酸バッファー(pH7.0)・5mMKCl溶液を調製し、3〜20nlを産卵後4時間以内のカイコ卵500個に対してマイクロインジェクションした。
Example 10. Production of transgenic silkworm 0.5 mM phosphate buffer (pH 7.0), 5 mM KCl containing 200 μg / ml each of the plasmid for gene transfer described in Example 9 and the piggyback transposase protein described in Example 4. A solution was prepared, and 3 to 20 nl was microinjected into 500 silkworm eggs within 4 hours after laying eggs.

そのカイコ卵より孵化した幼虫を飼育し、得られた成虫(G0)を群内で掛け合わせ得られた次世代(G1)を4齢時にその体液を注射用針(21G)で採取し、PCRにより遺伝子の導入をスクリーニングした。PCRは配列番号11および配列番号12のプライマーを用いて宝酒造(株)製のPremix Taqにより行った。すなわち、Premix Taqを最終濃度2倍希釈、プライマーそれぞれ0.5μMとなるように調製した液を20μLずつ分注し、体液を0.5〜2μL加え、DNAの変性条件を94℃、30秒、プライマーのアニーリング条件を55℃、30秒、DNAプライマーの伸長反応条件を72℃、2分の各条件でBioRad社のサーマルサイクラーを用い、30サイクル反応させた。これらの反応液を1%アガロースゲルにて電気泳動し、約1700bpのDNA断片が確認されたものを、遺伝子導入陽性と判断した。その結果、染色体中にイヌパルボウイルスVP2遺伝子の発現カセットが導入された遺伝子組換えカイコが得られた。   The larvae hatched from the silkworm eggs are reared, and the next generation (G1) obtained by multiplying the obtained adult worms (G0) within the group is collected with the injection needle (21G) at the age of four, and PCR is performed. To screen for gene transfer. PCR was performed with Takara Shuzo Co., Ltd. Premix Taq using the primers of SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12. In other words, 20 μL of Premix Taq diluted to a final concentration of 2 × and each primer adjusted to 0.5 μM were dispensed, 0.5 to 2 μL of body fluid was added, DNA denaturation conditions were 94 ° C., 30 seconds, primer annealing The reaction was carried out for 30 cycles using a thermal cycler manufactured by BioRad under the conditions of 55 ° C. for 30 seconds and DNA primer extension conditions of 72 ° C. for 2 minutes. These reaction solutions were electrophoresed on a 1% agarose gel, and those in which a DNA fragment of about 1700 bp was confirmed were judged to be gene transfer positive. As a result, transgenic silkworms in which the expression cassette of canine parvovirus VP2 gene was introduced into the chromosome were obtained.

実施例11. ウエスタン解析による絹糸中の組換えタンパク質の測定
絹糸への外来タンパク質すなわち抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)の分泌を調べた。
非形質転換カイコ、形質転換カイコ(P・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコ、SP・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭を各10mg量り採り、絹糸(フィブロイン層、セリシン層)を完全に溶解する60%リチウムチオシアネイト(LiSCN)4mlを加え攪拌後、終夜室温に静置し繭を溶解した。これを8M尿素・2%SDS・5%2-メルカプトエタノールで10培希釈したものをサンプルとし、ECL PlusTM Western blotting Kit (アマシャムファルマシア社製)を用い、添付のプロトコールに従って抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)の検出を行った。その結果をモレキュラーイメージャー(BioRad社製)を用いてシグナル強度を測定し、濃度既知の抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)のシグナル強度と比較しタンパク質含量を測定した。また、非形質転換カイコ、形質転換カイコ(P・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコ、SP・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭に、PBSを添加してセリシン層のみを可溶化し、これをサンプルとして同様にウエスタンブロッティング法でイヌパルボウイルスVP2の検出を行った。
Example 11 Measurement of Recombinant Protein in Silk by Western Analysis The secretion of a foreign protein, ie, an antigen protein (canine parvovirus VP2), into silk was examined.
Weigh 10 mg each of non-transformed silkworms, transformed silkworms (P / VP2 / SA gene-introduced transformed silkworms, SP / VP2 / SA gene-introduced silkworms), and complete the silk thread (fibroin layer, sericin layer) 4 ml of dissolved 60% lithium thiocyanate (LiSCN) was added and stirred, and then allowed to stand overnight at room temperature to dissolve the soot. This was diluted with 10M with 8M urea, 2% SDS, 5% 2-mercaptoethanol as a sample, and using ECL Plus ™ Western blotting Kit (Amersham Pharmacia), antigen protein (canine parvovirus VP2) according to the attached protocol ) Was detected. The signal intensity was measured using a molecular imager (manufactured by BioRad), and the result was compared with the signal intensity of an antigen protein (canine parvovirus VP2) with a known concentration to determine the protein content. In addition, PBS is added to the cocoons of non-transformed silkworms and transformed silkworms (P · VP2 · SA gene-introduced transformed silkworms, SP · VP2 · SA gene-introduced silkworms) to solubilize only the sericin layer, Using this as a sample, canine parvovirus VP2 was similarly detected by Western blotting.

その結果非形質転換カイコおよびP・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコの繭からはシグナルが検出されなかったのに対しSP・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコの繭からはシグナルが検出され、抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)が絹糸中へと分泌されていることが確認できた。またその含量はSP・VP2・SA形質転換カイコでは約0.1〜1.2%であった。これはカイコ一頭当たりの重量に換算すると0.1〜1.2mgであった。この結果を図3に示す。また、セリシン層のみを可溶化処理し、可溶性画分と不溶性画分に分画したところ、可溶性画分に抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)が確認できた。この結果を図4に示す。   As a result, no signal was detected from the cocoons of non-transformed silkworms and P · VP2 · SA gene-introduced silkworms, whereas signals were detected from the cocoons of SP · VP2 · SA gene-introduced silkworms. It was confirmed that the protein (canine parvovirus VP2) was secreted into the silk thread. The content was about 0.1 to 1.2% for SP, VP2, and SA transformed silkworms. This was 0.1 to 1.2 mg in terms of weight per silkworm. The result is shown in FIG. Further, when only the sericin layer was solubilized and fractionated into a soluble fraction and an insoluble fraction, an antigen protein (canine parvovirus VP2) was confirmed in the soluble fraction. The result is shown in FIG.

実施例12.絹糸中からの組換えタンパク質の抽出
絹糸から下記の方法で外来タンパク質すなわち抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)の抽出・回収を実施した。絹糸(セリシン層)が解け、外来タンパク質が回収できる溶媒として以下に示す水溶液を用いた。
Example 12 Extraction of Recombinant Protein from Silk Thread A foreign protein, ie, an antigen protein (canine parvovirus VP2) was extracted and collected from silk by the following method. An aqueous solution shown below was used as a solvent that can dissolve silk thread (sericin layer) and recover foreign protein.

絹糸(フィブロイン層、セリシン層)を完全に溶解する水溶液:60%LiSCN水溶液
セリシン層のみを溶解する水溶液:リン酸水溶液(緩衝液)、1%SDS水溶液、アルカリイオン水
上記水溶液各100mLに、形質転換カイコ(SP・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭を1g量り採り、室温で12時間攪拌しながら溶解させた。溶解液を一部とり、ECL PlusTM Western blotting Kit (アマシャムファルマシア社製)を用い、添付のプロトコールに従って抗原タンパク質(イヌパルボウイルスVP2)の検出を行った。その結果をモレキュラーイメージャー(BioRad社製)を用いてシグナル強度を測定した。また、非形質転換カイコの繭に、絹糸(フィブロイン層、セリシン層)を完全に溶解する60%LiSCN水溶液で可溶化し、これをサンプルとして同様にウエスタンブロッティング法でイヌパルボウイルスVP2の検出を行った。その結果を図5、表1に示す。
Aqueous solution that completely dissolves silk thread (fibroin layer, sericin layer): 60% LiSCN aqueous solution Aqueous solution that dissolves only sericin layer: phosphoric acid aqueous solution (buffer solution), 1% SDS aqueous solution, alkaline ionized water 1 g of the transformed silkworm (SP / VP2 / SA gene-introduced transgenic silkworm) was weighed and dissolved while stirring at room temperature for 12 hours. A part of the lysate was taken, and antigen protein (canine parvovirus VP2) was detected using ECL Plus ™ Western blotting Kit (Amersham Pharmacia) according to the attached protocol. The signal intensity was measured using a molecular imager (BioRad). In addition, silkworms (fibroin layer, sericin layer) are completely solubilized in the silkworms of non-transformed silkworms, and canine parvovirus VP2 is similarly detected by Western blotting using this as a sample. It was. The results are shown in FIG.

Figure 2007228814
Figure 2007228814

図5、表1の結果から、アルカリイオン水で溶解させたものがもっともセリシン層を溶解し、外来タンパク質の抽出が高いことが判明した。   From the results shown in FIG. 5 and Table 1, it was found that those dissolved in alkaline ionized water most dissolved the sericin layer and the extraction of foreign proteins was high.

評価方法は、形質転換カイコ(SP・VP2・SA遺伝子導入形質転換カイコ)の繭を絹糸(フィブロイン層、セリシン層)を完全に溶解する60%LiSCN溶液で可溶化したサンプルのシグナル強度を+++、非形質転換カイコの繭を絹糸(フィブロイン層、セリシン層)を完全に溶解する60%LiSCN水溶液で可溶化したサンプルのシグナル強度を−として、その他のサンプルのシグナル強度を相対的に示した。   In the evaluation method, the signal intensity of a sample obtained by solubilizing silkworms (fibroin layer, sericin layer) of a silkworm (SP · VP2 · SA gene-introduced transformed silkworm) with a 60% LiSCN solution that completely dissolves silkworms (++, The signal intensity of the other samples was shown as relative, with the signal intensity of the sample obtained by solubilizing the silkworm of non-transformed silkworm with 60% LiSCN aqueous solution completely dissolving silk thread (fibroin layer, sericin layer) as-.

そこで、アルカリイオン水で得られた抽出液を、限外ろ過膜を用いて濃縮し、20mMリン酸緩衝にバッファー交換を行った。その溶液をブルーセファロース担体に吸着させ、20mMリン酸緩衝で洗浄後、塩化ナトリウムを含む20mMリン酸緩衝液で溶出することにより、イヌパルボウイルスVP2抗原を高純度に得ることができた。図6に銀染色解析の結果を示す。   Therefore, the extract obtained with alkaline ionized water was concentrated using an ultrafiltration membrane, and the buffer was exchanged with 20 mM phosphate buffer. The solution was adsorbed on a blue sepharose carrier, washed with 20 mM phosphate buffer, and eluted with 20 mM phosphate buffer containing sodium chloride, whereby canine parvovirus VP2 antigen could be obtained with high purity. FIG. 6 shows the result of silver staining analysis.

セリシン遺伝子の5'末端部分のDNA配列を外来タンパク質遺伝子に融合させた発現用遺伝子カセットを絹糸腺細胞などに導入することで、大量の外来タンパク質を絹糸腺細胞内、絹糸腺特に中部絹糸線、さらには絹糸のセリシン層にまで産生させることが可能となった。この新手法により、組換えバキュロウイルスを用いることなく、絹糸腺を利用して外来タンパク質生産を生産させることで精製の容易な外来タンパク質生産技術を確立した。   By introducing a gene cassette for expression in which the DNA sequence of the 5 'end of the sericin gene is fused to a foreign protein gene into a silk gland cell, a large amount of the foreign protein can be introduced into the silk gland cell, especially the silk gland, It has become possible to produce even a silk sericin layer. By this new method, we established a foreign protein production technology that can be easily purified by using the silk gland to produce foreign protein without using recombinant baculovirus.

図1は、絹糸への組換えタンパク質の産生をウエスタン解析により解析した図であり、電気泳動を示す図面代用写真である。FIG. 1 is a view obtained by analyzing the production of a recombinant protein on silk by Western analysis, and is a drawing-substituting photograph showing electrophoresis. 図2は、絹糸のセリシン層のみを可溶化したサンプルをウエスタン解析により解析した図であり、電気泳動を示す図面代用写真である。FIG. 2 is a view obtained by analyzing a sample in which only a sericin layer of silk thread is solubilized by Western analysis, and is a drawing-substituting photograph showing electrophoresis. 図3は、絹糸への組換えタンパク質の産生をウエスタン解析により解析した図であり、電気泳動を示す図面代用写真である。FIG. 3 is a view obtained by analyzing the production of a recombinant protein on silk by Western analysis, and is a drawing-substituting photograph showing electrophoresis. 図4は、絹糸のセリシン層のみを可溶化したサンプルをウエスタン解析により解析した図であり、電気泳動を示す図面代用写真である。FIG. 4 is a diagram in which a sample in which only the sericin layer of silk thread is solubilized is analyzed by Western analysis, and is a drawing-substituting photograph showing electrophoresis. 図5は、絹糸のセリシン層を可溶化し組換えタンパク質の抽出をウエスタン解析により解析した図であり、電気泳動を示す図面代用写真である。FIG. 5 is a drawing obtained by solubilizing the sericin layer of silk thread and analyzing the extraction of the recombinant protein by Western analysis, and is a drawing-substituting photograph showing electrophoresis. 図6は、絹糸のセリシン層を可溶化し組換えタンパク質の抽出した水溶液をカラムクロマトグラフィーで精製し銀染色により解析した図であり、電気泳動を示す図面代用写真である。FIG. 6 is a drawing substituting a photograph showing electrophoresis by purifying an aqueous solution obtained by solubilizing a silk sericin layer and extracting a recombinant protein by column chromatography and silver staining.

Claims (26)

(1)絹糸腺で発現するプロモーターと、
(2)前記(1)の下流に連結された、セリシン遺伝子の5’末端部分を外来タンパク質構造遺伝子の5’側に融合させた遺伝子とを含む外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。
(1) a promoter expressed in the silk gland;
(2) A gene cassette for expression of a foreign protein, comprising a gene fused to the 5 ′ side of a foreign protein structural gene and linked to the downstream of (1) above.
前記セリシン遺伝子の5’末端部分が、セリシン遺伝子の第1エキソン、第1イントロン、第2エキソンの一部を含むことを特徴とする請求項1に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。 The gene cassette for expression of a foreign protein according to claim 1, wherein the 5 'end portion of the sericin gene includes a part of the first exon, the first intron, and the second exon of the sericin gene. 前記セリシンの第1エキソンと第2エキソンを合わせた部分が、セリシン遺伝子の分泌シグナル遺伝子領域であることを特徴とする請求項2記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。 The gene cassette for expression of a foreign protein according to claim 2, wherein the portion of the sericin that combines the first exon and the second exon is a secretory signal gene region of the sericin gene. 請求項1〜3のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる(1)絹糸腺プロモーターおよび/または(2)セリシン遺伝子の5’末端部分が実質的に同等の機能を有する範囲において1個もしくは数個の塩基の付加、欠失もしくは他の塩基への置換を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。 The gene cassette for the expression of a foreign protein according to any one of claims 1 to 3, wherein (1) the silk gland promoter and / or (2) the 5 'end portion of the sericin gene contained in the gene cassette for the expression of the foreign protein A gene cassette for expression of a foreign protein characterized by having one or several base additions, deletions or substitutions with other bases within a range having substantially equivalent functions. 請求項1〜4のいずれかに記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットにおいて、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットに含まれる(1)絹糸腺プロモーター部分および/または(2)セリシン遺伝子の5’末端部分に代えて、該部分とストリンジェントな条件でハイブリダイズする遺伝子であって、該部分と実質的に同等の機能を有する遺伝子を有することを特徴とする外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。 The gene cassette for expressing a foreign protein according to any one of claims 1 to 4, wherein (1) the silk gland promoter portion and / or (2) the 5 'end portion of the sericin gene contained in the gene cassette for expressing the foreign protein Alternatively, a gene cassette for expression of a foreign protein comprising a gene that hybridizes with the portion under stringent conditions and has a function substantially equivalent to the portion. 前記絹糸腺で発現するプロモーターが、セリシン遺伝子のプロモーター、フィブロインH鎖遺伝子のプロモーターおよびフィブロインL鎖遺伝子のプロモーターのうちから選ばれる少なくとも一つのプロモーターであることを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。 6. The promoter expressed in the silk gland is at least one promoter selected from a promoter of a sericin gene, a promoter of a fibroin H chain gene, and a promoter of a fibroin L chain gene. A gene cassette for expression of a foreign protein according to claim 1. 外来タンパク質発現遺伝子カセットの下流に、セリシン遺伝子のポリA付加領域、フィブロインH鎖遺伝子のポリA付加領域およびフィブロインL鎖遺伝子のポリA付加領域のうちから選ばれる少なくとも一つのポリA付加領域が存在することを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセット。 At least one poly A addition region selected from the poly A addition region of the sericin gene, the poly A addition region of the fibroin H chain gene, and the poly A addition region of the fibroin L chain gene exists downstream of the foreign protein expression gene cassette. The gene cassette for expression of a foreign protein according to any one of claims 1 to 6. 請求項1〜7のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットの両側に、1対のピギーバック(piggyBac)トランスポゾンの逆位反復配列が存在することを特徴とする昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセット。 A chromosome of an insect cell, characterized in that a pair of piggyBac transposon inverted repeats are present on both sides of the foreign protein expression gene cassette according to any one of claims 1 to 7. Gene cassette for gene transfer into 請求項1〜8のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用発現ベクター。 An insect cell expression vector comprising the foreign protein expression gene cassette according to any one of claims 1 to 8. 請求項8に記載の昆虫細胞の染色体への遺伝子導入用遺伝子カセットを含むことを特徴とする昆虫細胞用遺伝子導入ベクター。 A gene transfer vector for insect cells comprising the gene cassette for gene transfer into the chromosome of insect cells according to claim 8. 請求項1〜8のいずれか1項に記載の外来タンパク質の発現用遺伝子カセットが染色体に導入されており、かつ、絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生する能力を持つ組換えカイコ。 A recombinant silkworm, wherein the gene cassette for expression of a foreign protein according to any one of claims 1 to 8 is introduced into a chromosome and has the ability to produce a foreign protein in a silk gland or silk thread. 請求項11に記載の組換えカイコが産生する外来タンパク質を含む絹糸。 The silk thread containing the foreign protein which the recombinant silkworm of Claim 11 produces. 請求項9または10に記載の昆虫細胞用遺伝子導入ベクターを昆虫細胞へ導入することを特徴とする外来タンパク質の製造方法。 A method for producing a foreign protein, which comprises introducing the gene introduction vector for insect cells according to claim 9 or 10 into insect cells. 昆虫細胞が鱗翅目昆虫由来であることを特徴とする請求項12に記載の外来タンパク質の製造方法。 The method for producing a foreign protein according to claim 12, wherein the insect cell is derived from a lepidopterous insect. 昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)由来であることを特徴とする請求項13に記載の外来タンパク質の製造方法。 The method for producing a foreign protein according to claim 13, wherein the insect cells are derived from Bombyx mori. 昆虫細胞がカイコガ(Bombyx mori)の絹糸腺細胞であることを特徴とする請求項14に記載の外来タンパク質の製造方法。 15. The method for producing a foreign protein according to claim 14, wherein the insect cells are silk gland cells of Bombyx mori. ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースのDNA転移活性を利用して、外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製し、得られた組換えカイコの絹糸腺または絹糸に外来タンパク質を産生させた後、その絹糸腺または絹糸から外来タンパク質を回収することを特徴とする請求項13に記載の外来タンパク質の製造方法。 Using the DNA transfer activity of piggyback (posyBac) transposase, create a recombinant silkworm that incorporates a gene cassette for the expression of a foreign protein into the chromosome, and produce the foreign protein in the silk gland or silk of the resulting recombinant silkworm The method for producing a foreign protein according to claim 13, wherein the foreign protein is recovered from the silk gland or silk thread after the treatment. 昆虫細胞用遺伝子導入ベクターと、ピギーバック(piggyBac)トランスポゼースを産生するDNAもしくはRNAを同時にカイコ卵にマイクロインジェクションすることによって外来タンパク質の発現用遺伝子カセットを染色体に組み込んだ組換えカイコを作製することを特徴とする請求項17に記載の外来タンパク質製造方法。 Gene transfer vector for insect cells and DNA or RNA producing piggyback (posyBac) transposase are simultaneously microinjected into silkworm eggs to produce recombinant silkworms that incorporate a gene cassette for expression of foreign proteins into the chromosome. The method for producing a foreign protein according to claim 17, wherein 請求項12に記載の絹糸を水溶液で懸濁し、セリシン層が溶解した水溶液中から有用タンパク質を回収することを特徴とする外来タンパク質製造方法。 A method for producing a foreign protein, wherein the silk protein according to claim 12 is suspended in an aqueous solution, and useful proteins are recovered from the aqueous solution in which the sericin layer is dissolved. 水溶液が水、または緩衝液、もしくはアルカリ性水溶液から選ばれる一種以上であることを特徴とする請求項19に記載の外来タンパク質製造方法。 The method for producing a foreign protein according to claim 19, wherein the aqueous solution is one or more selected from water, a buffer solution, and an alkaline aqueous solution. アルカリ性水溶液が水を電気分解して陰極近傍の水溶液を集めたアルカリイオン水であることを特徴とする請求項20記載の外来タンパク質製造方法。 21. The method for producing a foreign protein according to claim 20, wherein the alkaline aqueous solution is alkaline ionized water obtained by electrolyzing water and collecting an aqueous solution near the cathode. 上記記載の水溶液が界面活性剤を含むことを特徴とする請求項19〜21のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。 The method for producing a foreign protein according to any one of claims 19 to 21, wherein the aqueous solution described above contains a surfactant. 絹糸を溶解した水溶液から、カラムクロマトグラフィーを用いて外来タンパク質を回収することを特徴とする請求項19から22のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。 The method for producing a foreign protein according to any one of claims 19 to 22, wherein the foreign protein is recovered from the aqueous solution in which the silk thread is dissolved by using column chromatography. 外来タンパク質が、水溶液に可溶性であることを特徴とする請求項11から23のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。 The method for producing a foreign protein according to any one of claims 11 to 23, wherein the foreign protein is soluble in an aqueous solution. 外来タンパク質がサイトカイン、抗原タンパク質のいずれかであることを特徴とする請求項11から24のいずれか1項記載の外来タンパク質製造方法。 The method for producing a foreign protein according to any one of claims 11 to 24, wherein the foreign protein is either a cytokine or an antigen protein. サイトカインがインターフェロン、抗原タンパク質がウイルス抗原タンパク質であることを特徴とする請求項25記載の外来タンパク質製造方法。 The method for producing a foreign protein according to claim 25, wherein the cytokine is interferon and the antigen protein is a viral antigen protein.
JP2006051076A 2006-02-27 2006-02-27 Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein Pending JP2007228814A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006051076A JP2007228814A (en) 2006-02-27 2006-02-27 Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2006051076A JP2007228814A (en) 2006-02-27 2006-02-27 Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2007228814A true JP2007228814A (en) 2007-09-13

Family

ID=38550036

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006051076A Pending JP2007228814A (en) 2006-02-27 2006-02-27 Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP2007228814A (en)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009225781A (en) * 2008-02-29 2009-10-08 Neosilk Co Ltd Method for producing glycoprotein characterized by sugar chain structure using silkworm
CN103651273A (en) * 2013-12-30 2014-03-26 盐城工学院 Perinereis aibuhitensis accumulated-water-free saturated wet soil cultivation method
JP2014200194A (en) * 2013-04-04 2014-10-27 浜松ホトニクス株式会社 Method for collecting organelle or protein from cell
CN107446953A (en) * 2017-07-17 2017-12-08 福建农林大学 A kind of method using PCR primer restraint insect gene expression

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009225781A (en) * 2008-02-29 2009-10-08 Neosilk Co Ltd Method for producing glycoprotein characterized by sugar chain structure using silkworm
JP2014012024A (en) * 2008-02-29 2014-01-23 Meneki Seibutsu Kenkyusho:Kk Method for producing glycoprotein having characteristic sugar chain structure by using silkworm
JP2014200194A (en) * 2013-04-04 2014-10-27 浜松ホトニクス株式会社 Method for collecting organelle or protein from cell
CN103651273A (en) * 2013-12-30 2014-03-26 盐城工学院 Perinereis aibuhitensis accumulated-water-free saturated wet soil cultivation method
CN107446953A (en) * 2017-07-17 2017-12-08 福建农林大学 A kind of method using PCR primer restraint insect gene expression
CN107446953B (en) * 2017-07-17 2020-09-15 福建农林大学 Method for inhibiting insect gene expression by using PCR product

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20200097760A (en) CPF1-related method and composition for gene editing
KR100689932B1 (en) Process for Producing Physiologically Active Protein Using Genetically Modified Silkworm
CN1150804A (en) Fibroblast growth factor-10
CN1139871A (en) Novel apopotsis-modulating proteins, DNA encoding the proteins and methods of use thereof
d'Archivio et al. Genetic engineering of Trypanosoma (Dutonella) vivax and in vitro differentiation under axenic conditions
EP1391509A1 (en) Transformed silkworm producing human collagen
JP2007228814A (en) Gene cassette for expressing foreign protein and method for producing foreign protein
Sarmasik et al. Bactericidal activity of cecropin B and cecropin P1 expressed in fish cells (CHSE-214): application in controlling fish bacterial pathogens
CN1371390A (en) Human G-protein coupled receptor
Zhang et al. Transgenic characterization of two silkworm tissue‐specific promoters in the haemocyte plasmatocyte cells
CN1083527A (en) Recombinant entomopoxvirus
JP4353754B2 (en) Gene transfer vector to insect and gene product production method
JP6436908B2 (en) Exogenous gene expression vector, transformant discrimination marker and transformant
CN115362370A (en) Novel insecticidal toxin receptors and methods of use
JP2005097229A (en) Method for producing vaccine and antigen protein
Lee et al. Gene Expression of Cotesiaplutellae Bracovlrus EP1-like Protein (CpBV-ELP1) in Parasitized Diamondback Moth, Plutellae xylostella
JP2003325188A (en) Cytokine gene recombinant silkworm and method for producing the protein
WO2016125885A1 (en) Cell death-inducing vector and site-specific cell death-inducing silkworm system having same
JP6044974B2 (en) Recombinant silkworm nuclear polyhedrosis virus vector
Tao et al. Expression of apalbumin1 of Apis cerana cerana in the larvae of silkworm, Bombyx mori
JP4273230B2 (en) Gene replacement vectors targeting birds and uses thereof
CN1129666C (en) Human tissue inhibitor of metalloproteinase -4
JP2007176831A (en) Manufacturing method of useful protein
JP3530495B2 (en) Ecdysteroid 22 oxidase from Pseudomonas oryzae and molting hormone inactivation system using it
JP2007222106A (en) Expression cassette used for producing recombinant protein in silkworm