JP7443240B2 - 非天然nkg2d受容体に結合する非天然nkg2dリガンドの改変a1-a2ドメイン - Google Patents
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Description
発明の分野
本出願は、一般に、非天然NKG2D受容体の非天然外部ドメインに特異的に結合するNKG2Dリガンドの改変α1-α2ドメインを含むポリペプチドであって、異種分子がNKG2Dリガンドの改変α1-α2ドメインに結合しているポリペプチドの産生に関する。
NKG2Dは、ナチュラルキラー(NK)細胞および特定のT細胞の表面上にII型ホモダイマー内在性タンパク質として発現される活性化受容体である。主に、ストレスを受けている細胞の表面上で発現されているその8つの天然リガンドの1つに結合したときに、NKG2DはNK細胞を活性化して、ストレスを受けた細胞を傷害し、または、T細胞上の場合、リガンドに占有されたNKG2DはT細胞を同時刺激して、そのエフェクター機能を実行する。ヒト天然NKG2Dの外部ドメイン、その可溶性天然リガンドのいくつか、および、いくつかの場合、可溶性リガンドおよび受容体外部ドメインの結合複合体について、三次元構造が解明されている。NKG2Dリガンドのモノマーα1-α2ドメインは、天然NKG2Dホモダイマーの2つの外部ドメインに特異的に結合する。
免疫系のナチュラルキラー(NK)細胞および特定の(CD8+αβおよびγδ)T細胞は、ヒトおよび他の哺乳動物において、新生物および感染細胞に対する第一線の生得的な防御として重要な役割を有している(Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49)。NK細胞および特定のT細胞は、標的細胞の認識および病態細胞に対する生得的な防御の活性化を担う顕著なホモダイマー表面免疫受容体であるNKG2Dをその表面上に示す(Lanier, LL, 1998. NK cell receptors. Ann. Rev. Immunol. 16: 359-393; Houchins JP et al. 1991. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells. J. Exp. Med. 173: 1017-1020; Bauer, S et al., 1999. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science 285: 727-730)。ヒトNKG2D分子は、その8つの異なる同族リガンドに結合するC型レクチン様細胞外(外部)ドメインを有しており、最も研究されているリガンドは84%配列同一または相同のモノマーMICAおよびMICB(主要組織適合性複合体(MHC)クラスI鎖関連糖タンパク質(MIC)の多型アナログ)である(Weis et al. 1998. The C-type lectin superfamily of the immune system. Immunol. Rev. 163: 19-34; Bahram et al. 1994. A second lineage of mammalian MHC class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al. 1996a. Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogenetics 44: 80-81; Bahram and Spies TA. 1996. Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43: 230-233)。MICAおよびMICBの非病態的発現は、腸上皮、ケラチノサイト、内皮細胞および単球に制限されているが、これらのMICタンパク質の異常な表面発現が、増殖、酸化および熱ショックのような多くの型の細胞ストレスに応答して生じ、そして細胞に病態的として印を付す(Groh et al. 1996. Cell stress-regulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93: 12445-12450; Groh et al. 1998. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal γδ T cells. Science 279: 1737-1740; Zwirner et al. 1999. Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol. 60: 323-330)。MICタンパク質の病態的発現はまた、いくつかの自己免疫疾患に関与しているようである(Ravetch, JV and Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290: 84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40: 18-34)。多型MICAおよびMICBのようなNKG2Dリガンドの差次的調節は、所望されない攻撃から健常細胞を依然として防御しながら広範な緊急の合図を同定しそれに応答するための手段を免疫系に提供するために重要である(Stephens HA, (2001) MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol. 22: 378-85; Spies, T. 2008. Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol. 9: 1013-1015)。
実施例1.不活性NKG2D外部ドメインを作製するためのヒトNKG2D受容体のチロシン152のアラニンへの(Y152A)およびチロシン199のフェニルアラニンへの(Y199F)の改変
ヒトNKG2Dにおけるチロシン152またはチロシン199(NKG2D外部ドメインの75位および122位と同等)における変異(図1A、配列番号17)が天然リガンドMICAへの結合を大いに低下させ得ることが他者によって実証されている(David J. Culpepper, Michael K. Maddox, Andrew B. Caldwell, and Benjamin J. McFarland. Systematic mutation and thermodynamic analysis of central tyrosine pairs in polyspecific NKG2D receptor interactions. Mol Immunol. 2011 January; 48(4): 516-523)。本発明者らは、いずれかのチロシン残基の変異はNKG2Dがその天然リガンドに結合する能力に大いに影響を及ぼすが、チロシン152(Y152)およびチロシン199(Y199)の両方における同時変異は全てのネイティブリガンドを係合させる受容体の能力を実質的に消失させるであろうと推論した。それゆえ、本発明者らは、いかなる天然リガンドをも係合させることができない単一および二重両方の変異バリアントを同定する目的で、個別のおよび組み合わせのY152およびY199置換の探索およびその生化学的挙動に関するそれらの特徴付けに努めた。良好に発現およびアセンブルもされるバリアントに特に着目した。なぜならこれらは、分析のためにより容易に産生され得る不活性リガンドであることを意味したからである。
ヒトIgG1に融合した非天然MicAバリアントを生成するために、例えば、MICwed(配列番号79)およびMIC25(配列番号81)のα1-α2ドメインをコードするDNAポリヌクレオチドを、ヒトIgG1の、C末端κ軽鎖(配列番号84)への融合のためのAPTSSSGGGGSリンカー、またはC末端重鎖(配列番号82)への融合のためのGGGSリンカーのいずれかをコードするポリヌクレオチドもまた導入するプライマーを使用してPCR増幅した。さらに、重鎖のCH2ドメイン中に、全てのFcγR受容体への結合を低下させ、従って、抗体依存性細胞傷害(ADCC)機能を消失させる2つの変異、D265A/N297A(Kabat番号付け)を導入した(Shields et al., 2001 JBC, 276:6591-6604)。GPI結合なしの野生型ULBP2(ULBP2.wt)のα1-α2ドメインをコードするポリヌクレオチド(配列番号12)を同様にクローン化し、そしてリンカーおよびIgG1重鎖または軽鎖をコードするDNAポリヌクレオチドと融合させた。これらの二重特異性抗体(単数で「MicAbody(商標)」、複数で「MicAbodies」と称する)は、融合α1-α2ドメインについて二価である。eNKG2D操作を探索する目的でMicAbodyを生成するために使用した抗体の例としては、限定するものではないが、トラスツズマブ(配列番号94および96)ならびにリツキシマブ(配列番号98および100)が挙げられ、これらをその後それぞれ「トラスツズマブ-MicAbody」(例えば、配列番号102および104)ならびに「リツキシマブ-MicAbody」(例えば、配列番号106)と称した。融合構築物を、Gibson cloning(New England Biolabs Inc., Ipswich, MA)を介して個別にpD2610-V12(ATUM, Newark, CA)中に挿入した。特異的抗原を認識する所定の抗体のために、重鎖をコードするプラスミドおよび天然または非天然いずれかのNKG2Dリガンドに融合した軽鎖をコードするプラスミドを、Expi293(商標)細胞(ThermoFisher Scientific, Waltham, MA)における一過性発現のために同時トランスフェクトした。あるいは、天然または非天然いずれかのNKG2Dリガンドに融合した重鎖をコードするプラスミドおよび軽鎖のためのプラスミドを同時トランスフェクトした。分泌された二重特異性抗体をプロテインAアフィニティクロマトグラフィー(cat. no. 20334, Pierce Biotechnology, Rockford, IL)によって精製し、溶出された材料をAkta Pur Superdexカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって特徴付けし、そして必要に応じて分画を行った。さらに、融合重鎖および融合軽鎖種の予想分子量を確認するために、精製されたサンプルに対してSDS-PAGE分析を行った。
天然(野生型)NKG2Dおよび非天然eNKG2Dタンパク質の細胞外ドメインへのα1-α2バリアントの結合親和性を、プレートベースのELISA法を使用して分析した。SEC分画された天然Fc-NKG2Dおよび非天然Fc-eNKG2D融合物の各々を、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)中1μg/mLのコーティング濃度を使用して、Nunc Maxisorp 96ウェルプレート(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)の別々のウェル上に一晩4℃でコートした。プレートを3回PBS/0.05%Tween-20(PBS-T)中で20~22℃で洗浄し、そしてPBS中0.5%ウシ血清アルブミン(PBS-B)を用いて2時間20~22℃でブロッキングした。MicAbodyを、プレートに結合した天然または非天然Fc-NKG2D融合物に対して60分間20~22℃でPBS/0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)/0.05%Tween-20(PBS-BT)中でタイトレートし、3回PBS-Tで20~22℃で洗浄し、結合した二重特異性タンパク質をPBS-BT中のHRP結合抗ヒトκ(Abcam, Cambridge MA)を使用して検出し、1-Step(商標)Ultra TMB ELISA Substrate Solution(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)を用いて発色させた。ULBP2.wtリツキシマブ-MicAbody(配列番号98および106)の結合は、野生型NKG2DとeNKG2Dバリアントとを、後者に対する結合の低下で判別し、そしてリガンドバリアント(MICwed(配列番号96および102)ならびにMIC25(配列番号96および104))は、リガンド結合が消滅したeNKG2Dバリアントの同定においてより厳密であった。3つ全ての二重特異性リガンドに対する各々のeNKG2Dバリアントについての結合挙動によって、野生型およびバリアントリガンドの結合における最大の低下を導いたNKG2D改変の組み合わせが明らかとなり、そしてリード不活性NKG2Dバリアントの選択が可能になった。
本発明者らは、Fc-NKG2D AF(配列番号48)受容体への選択的結合を示す直交性非天然α1-α2ドメインを操作するために、ファージディスプレイを用いた。出発点として、天然野生型NKG2D(NKG2D.wt)外部ドメインに対する高い親和性を有する非天然ULBP2.R80W α1-α2ドメイン(図1B;配列番号108)を、さらなる変異誘発およびファージディスプレイによるスクリーニングのための親ドメインとして選択した。ジスルフィド結合の潜在性を除くためにさらにC8S変異を有するULBP2.R80Wのα1-α2ドメイン(配列番号108)について合成DNAライブラリーを生成した。結合状態で天然NKG2D受容体上のY152位およびY199位に近接して配置されるリガンドのアミノ酸残基のコドンをNNKコドンに置換した;ライブラリーは154~159位におけるNNKコドンからなった(図1B、配列番号110)。ライブラリーを、M13ファージのpIIIマイナーコートタンパク質への融合物としてクローン化し、そして変異誘発されたα1-α2ドメインバリアントを提示するファージ粒子を標準的な方法に従ってSS320 E.coli細胞中で産生した(Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011))。これらのα1-α2ファージディスプレイライブラリーを、非ビオチン化天然Fc-NKG2D.wt競合タンパク質の存在下でビオチン化Fc-NKG2D.AFタンパク質に結合したファージクローンを選択的に捕捉することによって、非天然NKG2D.AF受容体に対する高結合親和性についてソートした。非ビオチン化天然Fc-NKG2Dの濃度を漸増させながら競合選択を複数回繰り返すことによって選択的クローンを富化した。
NKG2D.Y152A(以降NKG2D.YAという)受容体への選択的結合を有する直交性非天然α1-α2ドメインを操作するためのファージディスプレイを、上記のように出発点として非天然ULBP2.R80W α1-α2ドメイン(配列番号108)を用いて行った。α1-α2ファージディスプレイライブラリーを、非ビオチン化天然Fc-NKG2D.wt(配列番号40)競合タンパク質の存在下でビオチン化Fc-NKG2D.YA(配列番号41)タンパク質に結合したファージクローンを選択的に捕捉することによって、非天然Fc-NKG2D.YA受容体に対する高結合親和性についてパニングした。さらなるファージクローン検証研究によって、Fc-NKG2D.wtに対比してFc-NKG2D.YAに優先的な結合を有するバリアントが同定された(図12)。例えば、ULBP2.S3(配列番号127)は、ELISAおよびOctet分析(両方ともモノマーのHisタグ付加および二重特異性抗体融合フォーマットで)によって、天然NKG2D.wtと比較して非天然NKG2D.YAへの選択的結合を一貫して示した。このことは、非天然NKG2D受容体(実施例4におけるNKG2D.AFに対して、この場合はNKG2D.YA)への高親和性結合を有する非天然直交性α1-α2ドメインの発明の異なる形態を表す。さらに、直交性α1-α2ドメインの抗体ポリペプチドへの融合物は、その選択的結合特性を保持しており、そしてこれを、抗体のような融合異種ペプチドによって決定される特異的分子に向けて非天然NKG2D受容体を選択的に再方向付けするために使用した。
CAR-T細胞療法を選択的に制御する手段が、毒性の軽減および腫瘍に対する効力改善のために非常に求められている(Gill and June, 前出)。CD16の外部ドメイン(これは、次いで、治療用モノクローナル抗体のFcドメインを介して係合されて、CAR-T標的化の抗体ベースの制御を可能にする)を使用してCARを開発する試みが以前になされた(Chang et al., 前出)。しかし、CD16ベースのCAR-T細胞は血液および組織中のほぼ全ての内在性抗体分子を認識し得、そしてこれらの細胞を制御するために使用される治療用抗体は、NK細胞、PMN、単球およびマクロファージ上の内在性CD16受容体からの競合に遭遇する。これらの特徴の両方は、それぞれオフ腫瘍(off-tumor)毒性および乏しい薬物動態の問題に寄与する。
Claims (15)
- 天然NKG2Dリガンド分子の改変α1-α2ドメインであって、ここで、該改変α1-α2ドメインが配列番号4に対する少なくとも90%の同一性を含むアミノ酸配列を含み、ここで、該配列番号4に対する少なくとも90%の同一性を含むアミノ酸配列において、配列番号4と比較して配列番号4の8位、80位、154位、155位、156位、157位、158位、および159位に対応する位置が置換されており、且つ、ここで、該配列番号4に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列が、以下の特徴のすべてを有する、改変α1-α2ドメイン:
配列番号4の80位に対応する位置のアミノ酸がWである;
配列番号4の154位に対応する位置のアミノ酸が、Tである;
配列番号4の155位に対応する位置のアミノ酸が、I、L、またはMである;
配列番号4の157位に対応する位置のアミノ酸が、Wである;
配列番号4の158位に対応する位置のアミノ酸が、Q、G、またはSである;および
配列番号4の159位に対応する位置のアミノ酸が、TまたはWである。 - 前記配列番号4に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号4と比較して配列番号4の8位および156位に対応する位置の1つ以上が置換されている、請求項1に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 配列番号111、113、115および117からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記配列番号4に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号4の8位に対応する位置のアミノ酸が、Sである、請求項3に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記配列番号4に対する少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号4の156位に対応する位置のアミノ酸が、LまたはMである、請求項2に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 結合した原子または結合した異種分子をさらに含む、請求項1に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記異種分子がペプチドまたはポリペプチドである、請求項6に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記ポリペプチドが、抗体、抗体フラグメント、サイトカイン、リンホカイン、またはホルモンである、請求項7に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記異種分子が、オリゴ糖、デンドリマー、ノッチン、ホルモン、核酸、または脂質である、請求項6に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 結合された哺乳動物細胞をさらに含む、請求項1に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記哺乳動物細胞がリンパ球またはマクロファージである、請求項10に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記哺乳動物細胞がヒトリンパ球またはヒトマクロファージである、請求項11に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 前記改変α1-α2ドメインが、結合された非天然NKG2D受容体外部ドメインを有する哺乳動物細胞と接触するときに、前記原子または異種分子が前記哺乳動物細胞に送達される、請求項6に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 非天然NKG2D外部ドメインを発現する細胞の増強された活性化を示し、その結果、細胞に送達された天然NKG2Dリガンドまたは天然もしくはネイティブα1-α2ドメインを有する二重特異性分子が示すより高い標的細胞傷害能力を示す細胞をもたらす、請求項13に記載の改変α1-α2ドメイン。
- 天然NKG2D外部ドメインを発現する細胞の活性化より高い非天然NKG2D外部ドメインを発現する細胞の活性化を示し、その結果、天然NKG2D外部ドメインを発現する細胞が示すより高い標的細胞傷害能力を示す非天然NKG2D外部ドメインを発現する細胞をもたらす、請求項13に記載の改変α1-α2ドメイン。
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