JP7394126B2 - ｉｎ ｖｉｖｏ全視野干渉顕微鏡を用いたイメージング方法およびシステム - Google Patents

Description

本明細書は、in vivo全視野干渉顕微鏡を用いたイメージング方法およびシステムに関する。これは、ランダムに動いている物体のin vivoイメージングに適用可能であり、特に、眼組織のin vivoイメージングに適用可能である。

２５年間にわたる開発の中で、光干渉断層法（ＯＣＴ）が強力なイメージング方法になってきた（例えば、"Optical Coherence Tomography - Technology and Applications" - Wolfgang Drexler - James G. Fujimoto - Editors - Springer 2015を参照のこと）。ＯＣＴは干渉技術であり、超音波イメージングの「光学版」とみなすことができる。ＯＣＴは幅広い分野で応用され、特に眼科、皮膚科、心血管分野、胃腸科などのバイオメディカル分野で応用されている。

in vivo（生体内）では組織が不随意に動いているが、これらの動きがすべてのＯＴＣ技術の歴史の中で常に課題となっていた。より正確には、従来の走査型ＯＣＴ画像では、動きがあると、ミスアライメント、シフト、ダブリングなどのアーチファクトが発生する。発生するアーチファクトのタイプは、画像の全画素を一度に取得せずにサンプルを点走査するＯＣＴの手法に関係している。

画像におけるこれらのモーションアーチファクトを回避したいという要望が動機となり、ＯＣＴの技術は、より高速なイメージングを達成すべく進歩し、結果的に、スペクトル領域ＯＣＴ（ＳＤ－ＯＣＴ）（例えば、L. An et al. "High speed spectral domain optical coherence tomography for retinal imaging at 500,000 A-lines per second" - Biomedical Optics Express 2, 2770 (2011)を参照のこと）や、最近ではＡ－スキャンレート３００，０００回／秒（１Ｄプロファイル）を上回る速度でイメージングが可能な波長掃引型ＯＣＴ（ＳＳ－ＯＣＴ）（例えば、B. Potsaid et al. "Ultrahigh speed 1050 nm swept source / Fourier domain OCT retinal and anterior segment imaging at 100,000 to 400,000 axial scans per second", Optics Express 18, 20029 (2010)を参照のこと）が生まれている。しかしながら、そのような走査速度であっても、ＯＣＴ画像は、in vivoモーションアーチファクトと無縁ではない。

モーションアーチファクトのない画像を得るという同じ目標に向けて、いくつかの刊行物や特許に、ソフトウェアベースの動き補償スキームやハードウェアベースの動き補償スキームが提案されている（例えば、M. Kraus et al. "Motion correction in optical coherence tomography volumes on a per A-scan basis using orthogonal scan patterns", Biomedical Optics Express 3, 1182 (2012)を参照のこと）。しかしながら、ハードウェアベースで対処をすると、装置がさらに複雑になり、かさばって高価になることも多い。一方、ソフトウェアベースでの対処は、サンプルや動きに特化しており、特定の物体にかぎった何種類かの動きしか補償することができない。

ＯＣＴの特別な例である全視野ＯＣＴ（ＦＦＯＣＴ）では、カメラを使用して、点走査や線走査を行わずに画像の全画素を同時に取得するため、上述したアーチファクトの影響を受けることはない。全視野ＯＣＴイメージング技術については、例えば、"Optical Coherence Tomography - Technology and Applications"(791～812頁)- Wolfgang Drexler - James G. Fujimoto - Editors - Springer 2015収載のF. Harms et al.著の記事「Full-field optical coherence tomography」に記載されている。また、フランス特許出願第ＦＲ２８１７０３０号にも全視野ＯＣＴイメージング技術が記載されている。

全視野ＯＣＴイメージング技術は、低コヒーレンス光源でサンプルに光をあてたときにサンプルから後方散乱される光の利用に基づいており、特に、in vivoサンプルの場合には、微細な細胞や組織構造から後方散乱される光を利用して成り立っている。この技術では、光源の低コヒーレンス性を利用して、サンプルの深さ方向の仮想スライスによって後方散乱される光を分離する。干渉計を用いることで、干渉現象によってサンプルの所与のスライスから選択的に生じる光を表す干渉信号を生成し、サンプルの残りの部分から生じる光を除去することができる。具体的には、１枚の２Ｄ ＦＦＯＣＴ画像を得るために、カメラで複数枚（通常は２～５枚）の直接画像を取得する。これらの直接画像は、干渉計の参照アームにピエゾ素子（ＰＺＴ）付きのミラーを正確に配置することで設定された特定の干渉位相で取得される。これらの直接画像を特定の位相で後処理することで、ＦＦＯＣＴ画像を取得することができる。

一般的なＯＣＴでは被写界深度を深くする必要性から比較的低開口数の対物レンズを用いるため、ＦＦＯＣＴでは、上述した走査アーチファクトの影響を受けないことに加えて、ＯＣＴよりも高開口数の対物レンズを用いることで横方向の高い解像度が得られる。また、安価で空間的にインコヒーレントな広帯域光源を用いることで、同等の軸方向解像度が得られる。

しかしながら、ＦＦＯＣＴの現行の２Ｄイメージングスキームは、静止したサンプル（または動きがないか動きが少ない瞬間のin vivoサンプル）において実用的なものである。なぜなら、サンプルの動きは、それがどのようなものであっても、あらかじめ定められた位相をシフトさせ、ＦＦＯＣＴ信号を劣化させる場合もあれば、ＦＦＯＣＴ画像を損なうことすらあり得るためである。また、捕捉した２Ｄ画像の位置（Ｘ、Ｙ、Ｚ）がわからなくなるため３Ｄ画像の構築ができず、３Ｄイメージングのスキームをin vivoイメージングに応用することもできない。その結果、現在までのところ、ＦＦＯＣＴの応用は、ほぼ完全に静止したex vivoサンプルに限られていた。

本明細書は、全視野光干渉断層法の利点を有すると同時に、常に動いているin vivo物体のイメージングが可能な装置および方法に関する。

第１の態様によれば、本明細書は、
散乱３次元サンプルのin vivo全視野干渉顕微鏡イメージングのための方法であって、
物体アームと、光学レンズおよび第１の反射面を有する参照アームと、を備える、全視野ＯＣＴイメージングシステムの干渉装置の、物体アームにサンプルを配置する工程と、
イメージングフィールドの各点において、イメージングフィールドの前記点に対応する第１の反射面の素子面上で入射光波が反射して得られる参照波と、所与の深さにあるサンプルのスライスのボクセルであって、イメージングフィールドの前記点に対応する前記ボクセルによって入射光波が後方散乱して得られる物体波と、の間の干渉を生じさせる工程と、
前記全視野ＯＣＴイメージングシステムの取得装置を用いて、イメージングフィールドの各点で生じた前記干渉に起因する、時間的に連続した複数の２次元干渉信号を取得する工程と、
各２次元干渉信号について、取得時刻を格納する工程と、２次元干渉信号の取得時刻ごとに、ＯＣＴイメージングシステムを用いて、前記全視野ＯＣＴイメージングシステムの前記第１の反射面とサンプルの両方の断面画像を提供する工程と、
サンプルの複数のスライスの複数のen face画像を、各々、所与の位相シフトを有する少なくとも２つの２次元干渉信号から決定する工程と、
前記少なくとも２つの２次元干渉信号のそれぞれの取得時にＯＣＴイメージングシステムによって提供される断面画像から、前記複数のスライスの各en face画像の深さを決定する工程と、
サンプルの前記複数のスライスの前記複数のen face画像と深さから、サンプルの３Ｄ画像を決定する工程と、
を含む、方法に関する。

本明細書において、「en face画像」とは、物体アーム（サンプルアームともいう）の光軸に垂直な平面（「Ｘ－Ｙ」平面）で決定される画像である。本明細書では、「en face画像」を「Ｘ－Ｙ画像」または「ＦＦＯＣＴ信号」とも称する。

「断面画像」とは、物体アームの光軸を含む平面で決定される画像（１Ｄまたは２Ｄ）である。本明細書では、断面画像を「Ｘ－Ｚ画像」とも称するが、特定の平面に限定されるものではなく、「Ｘ－Ｙ」平面に垂直であるどの平面で決定されてもよい。

本明細書における「光学レンズ」とは、光の屈折によって光を集束または分散させるあらゆる光学装置をいう。したがって、「光学レンズ」には、他のイメージングシステム（例えば、顕微鏡対物レンズ）として、両方の従来の光学レンズ（凸レンズ、平凸レンズ、ダブレットなど）も包含される。

このように記載されるイメージング方法によって、自然な動きのあるin vivoサンプルのイメージングの場合でも、ＦＦＯＣＴイメージングシステムによるイメージングの対象となるスライスの深さを正確に決定することが可能になる。これは、ＦＦＯＣＴイメージングシステムを用いる２次元干渉画像の取得と、ＯＣＴイメージングシステムによって提供される断面画像の取得とを、同時に行うことで可能になる。

このように、物体のin vivoでの自然な動きを３Ｄイメージングに利用することが可能であり、ほとんどの方法が排除しようとしたり克服しようとしたりする効果を有効利用していることを意味する。

１つ以上の実施形態によれば、サンプルの前記複数のスライスの各en face画像について深さを決定することは、ＯＣＴイメージングシステムによって提供される断面画像におけるサンプルの少なくとも１つの特定の構造と前記第１の反射面との相対的な軸方向位置を決定することを含む。

実際には、サンプルの複数のスライスの複数のen face画像は、サンプルの探索されたボリューム内で決定されてもよい。スライスのen face画像の深さは、検出された参照ミラーのピークの軸方向の位置と、任意のサンプルのピークの軸方向の位置との差から、ＯＣＴ画像から決定される。サンプルのどのピークを使用するかは重要ではないが、通常、最も明るいピークを使用すればよい。しかしながら、１つのボリュームの取得を通して同一のサンプルピークが使用されるため、en faceスライスの相対的な深さは正しく、３Ｄ画像を決定することができる。

１つ以上の実施形態によれば、前記全視野ＯＣＴイメージングシステムおよび前記ＯＣＴイメージングシステムは可動式プラットフォームに搭載され、この方法は、前記複数のen face画像を決定するために、前記プラットフォームを少なくとも物体アームの光軸（Ｚ）に沿って移動させることをさらに含む。

１つ以上の実施形態によれば、この方法は、物体アームの光軸に垂直な複数の方向（Ｘ、Ｙ）のうちの少なくとも１つに沿って前記プラットフォームを移動させることをさらに含む。これにより、断面画像を軸方向および横方向に重ねることができ、より大きな３Ｄボリュームを形成することが可能となる（例えば、画像レジストレーションによって）。

１つ以上の実施形態によれば、前記物体アームは可動式プラットフォームに搭載され、この方法は、前記複数のen face画像を決定するために、物体アームの光軸に沿って前記プラットフォームを移動させることをさらに含む。

１つ以上の実施形態によれば、サンプルのin vivoでの自然な動きが、前記複数のen face画像を決定するために使用される。前記物体アームのプラットフォームまたは前記全視野ＯＣＴイメージングシステムおよび前記ＯＣＴイメージングシステムのいずれも移動させる必要がない。

１つ以上の実施形態によれば、例えば角膜のイメージングの場合、物体アームは、光学レンズ、例えば顕微鏡対物レンズをさらに備える。このような光学レンズの焦点深度は、眼の焦点深度よりもはるかに浅い。その結果、サンプルアームとサンプルの相対的な位置が変化したときに、この方法は、デフォーカスを補正するために、すなわち、サンプルアームの顕微鏡対物レンズの焦点深度内にコヒーレンス面を維持するために、前記参照アームの光軸に沿って参照アームを移動させることをさらに含む。実際のところ、例えば空気と目のように、１つの媒体から２つ目の媒体に移動するとき、焦点と両アームの光路が等しくなる位置との間にシフトが現れる。このデフォーカスを補正する必要がある。

１つ以上の実施形態によれば、例えば網膜のイメージングの場合、焦点深度が深く、サンプルアームとサンプルの相対的な位置が変化しても、デフォーカスを補正する必要がない。

１つ以上の実施形態によれば、この方法は、前記少なくとも２つの２次元干渉信号の間の前記位相シフトを提供するために、全視野ＯＣＴイメージングシステムの参照アームの前記第１の反射面の位置をずらすことをさらに含む。これらの実施形態では、少なくとも２つの２次元干渉信号の取得時間中、サンプルの自然な動きが遅いことを想定している。一般的な取得時間は１～１０ｍｓである。

１つ以上の実施形態によれば、この方法は、取得装置によって取得された前記時間的に連続した複数の２次元干渉信号において、前記位相シフトを有する前記少なくとも２次元干渉信号を選択することをさらに含み、位相シフトは、サンプルのin vivoでの動きに起因する。

ここでも、in vivoサンプルの自然な動きがen faceイメージングに使用されており、ほとんどの方法が排除しようとしたり克服しようとしたりする効果を有効利用していることを意味する。

本明細書の第１の態様によるイメージング方法の異なる実施形態を、互いに組み合わせることができる。

第２の態様によれば、本明細書は、第１の態様による方法の１つ以上の実施形態を実施するために構成された、散乱３次元サンプルのin vivo全視野干渉顕微鏡イメージングのためのシステムに関する。

１つ以上の実施形態によれば、第２の態様によるシステムは、
サンプルのen face画像を提供するための全視野ＯＣＴイメージングシステムと、
ＯＣＴイメージングシステムと、
処理装置と、を備え、
前記全視野ＯＣＴシステムは、
前記サンプルを受けるように意図された物体アームと、光学レンズおよび第１の反射面を含む参照アームと、を備える干渉装置と、
取得装置と、を備え、
前記物体アームと前記参照アームとは、ビームスプリッターによって分離され、
干渉装置は、サンプルが干渉装置の物体アームに接して配置されているときに、イメージングフィールドの各点において、イメージングフィールドの前記点に対応する第１の反射面の素子面での入射光波の反射によって得られる参照波と、所与の深さにあるサンプルのスライスのボクセルであって、前記イメージングフィールドの前記点に対応する前記ボクセルによる入射光波の後方散乱によって得られる物体波との間の干渉を生じさせるように適合され、
取得装置は、イメージングフィールドの各点で生じた干渉に起因する時間的に連続した複数の２次元干渉信号を取得するように構成され、
ＯＣＴイメージングシステムは、前記２次元干渉信号の取得と同時に、前記全視野ＯＣＴイメージングシステムの前記第１の反射面とサンプルの両方の断面画像を提供するためのものであり、
処理装置は、
サンプルの複数のスライスの複数のen face画像を、各々、所与の位相シフトを有する少なくとも２つの２次元干渉信号から決定し、
前記２つの２次元干渉信号のそれぞれの取得時にＯＣＴイメージングシステムによって提供される断面画像から、前記複数のスライスの各en face画像の深さを決定し、
サンプルの前記複数のスライスの前記複数のen face画像と深さから、サンプルの３Ｄ画像を決定するように構成されている。

このイメージング方法について述べた利点は、本明細書の第２の態様によるイメージングシステムに置き換えることができる。

１つ以上の実施形態によれば、全視野ＯＣＴイメージングシステムの参照アームの前記第１の反射面は、前記少なくとも２次元干渉信号間の前記光路差を提供するように位置シフトされる。

１つ以上の実施形態によれば、全視野ＯＣＴイメージングシステムの参照アームの前記第１の反射面は固定され、処理装置はさらに、取得装置によって取得された前記時間的に連続した複数の２次元干渉信号において、前記所与の光路差を有する前記少なくとも２次元干渉信号を選択するように構成され、前記光路差は、サンプルのin vivoでの動きに起因する。

１つ以上の実施形態によれば、全視野ＯＣＴイメージングシステムの前記物体アームは、光学レンズをさらに備える。

１つ以上の実施形態によれば、参照アームおよび／または物体アームの前記光学レンズは、顕微鏡対物レンズである。

１つ以上の実施形態によれば、全視野ＯＣＴイメージングシステムの前記参照アームおよび／または物体アームは、前記全視野ＯＣＴイメージングシステムの干渉装置の前記ビームスプリッターに対して（前記参照アームおよび物体アームの各光軸に沿って）移動可能である。

１つ以上の実施形態によれば、システムは、可動式プラットフォームをさらに備え、前記全視野ＯＣＴイメージングシステムおよび前記ＯＣＴイメージングシステムは、前記可動式プラットフォームに搭載されている。

１つ以上の実施形態によれば、ＯＣＴイメージングシステムは、スペクトル領域ＯＣＴイメージングシステムまたは波長掃引型ＯＣＴイメージングシステムまたは時間領域ＯＣＴイメージングシステムである。

本明細書によるイメージングシステムの異なる実施形態を、互いに組み合わせることができる。

また、本明細書の様々な態様の異なる特徴および実施形態を、互いに組み合わせることができる。

上記にて提示したイメージング技術の他の利点および特徴については、図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むことで、明らかになるであろう。
図１Ａは、本明細書の実施形態によるシステムのスキームである。 図１Ｂは、本明細書の実施形態によるシステムのスキームである。 図１Ｃは、本明細書の実施形態による、ＯＣＴ光源およびＦＦＯＣＴ光源の例示的な光源スペクトルと、システムのフィルタでそのようなスペクトルの一部を遮断することを示す。 図１Ｄは、本明細書の実施形態による、ＯＣＴ光源およびＦＦＯＣＴ光源の例示的な光源スペクトルと、システムのフィルタでそのようなスペクトルの一部を遮断することを示す。 図２Ａは、本明細書によるイメージング方法の実施形態の流れ図である。 図２Ｂは、図２Ａに示す実施形態のうちのいくつかの工程を説明するための画像である。 図３Ａは、本明細書によるイメージング方法の別の実施形態の流れ図である。 図３Ｂは、図３Ａに示す実施形態のうちのいくつかの工程を説明するための画像である。 図４Ａは、本明細書によるイメージングシステムの例示的なＯＣＴイメージングシステムを用いて得られた参照ミラー（サンプルが見えない状態）の断面画像の一例である。 図４Ｂは、図４Ａの垂直線に沿った強度の変化の曲線を表す。 図５Ａは、本明細書によるイメージングシステムの例示的なＯＣＴイメージングシステムを用いて得られた参照ミラー（角膜サンプルが見える状態）の断面画像の一例である。 図５Ｂは、図５Ａの垂直線に沿った強度の変化の曲線を表す。 図６は、in vivoでの動きによる必要な位相シフトを示すグラフである。 図７は、自然な眼の動きによる位相シフトを用いて取得した、in vivoヒト角膜の深部層のＦＦＯＣＴ画像を示す（参照ミラーの移動なし）。 図８は、異なるカメラ露光時間で、自然な眼の動きによる位相シフトを用いて取得したin vivoヒト角膜（基質）の深部層のＦＦＯＣＴ画像を示す（参照ミラーの移動なし）。

システム
図１Ａおよび図１Ｂに、本明細書によるin vivo全視野干渉顕微鏡を用いたイメージングシステムの２つの実施形態１０１、１０２をそれぞれ示す。システム１０１は、動いているin vivoサンプル、特にin vivoの眼の前部１１（角膜）であるがこれに限定されるものではないサンプル、の３Ｄイメージングのための方法の実施に適している。また、システム１０２は、動いているin vivoサンプル、特にin vivoの眼の後部１３（網膜）であるがこれに限定されるものではないサンプル、の３Ｄイメージングのための方法の実施に適している。

図１Ａに示すシステム１０１は、全視野ＯＣＴ（「ＦＦＯＣＴ」）イメージングシステム１３０および光干渉断層（「ＯＣＴ」）イメージングシステム１１０の２つのイメージングシステムと、少なくとも１つの処理装置１６０とを備える。ＦＦＯＣＴイメージングシステムでは、動いているin vivoサンプル１１の「en face」画像すなわち、サンプルの深部画像を取得することができ、光干渉断層（「ＯＣＴ」）イメージングシステム１１０では、軸（Ｚ）方向の、例えば光軸に沿った、サンプルの位置に関する情報が提供される。また、システム１０１はさらに、ＦＦＯＣＴイメージングシステム１３０およびＯＣＴイメージングシステム１１０が搭載された、例えば１つ以上のモータを有する可動式のプラットフォーム１５０を含んでもよい。可動式プラットフォーム１５０によって、ＦＦＯＣＴイメージングシステムおよびＯＣＴイメージングシステムを、互いに直交するＸ、Ｙ、Ｚの全ての方向にまとめて平行移動させることができる。

図１ＡのＦＦＯＣＴイメージングシステム１３０は、前記少なくとも１つの処理装置１６０に接続された取得装置１３８と干渉装置１４５とを備える。

一実施形態によれば、干渉装置１４５は、例えば無偏光スプリッターキューブなどのビームスプリッター素子１３５を含み、これによって、光軸Δ_Ｒを有する参照アーム１４６と、光軸Δ_Ｏを有する物体アーム１４７の２本のアームを形成することが可能となる。図１Ａでは、物体アームの光軸Δ_ＯがＺ軸を規定し、参照アームの光軸Δ_ＲがＸ軸を規定している。参照アーム１４６は反射面１３３を有する。反射面１３３は平面であってもよく、例えば、金属ミラー、ニュートラルデンシティ（ＮＤ）フィルターガラス、あるいは単なるガラス板である。物体アーム１４７は、動作時に３次元散乱サンプル１１を受けるよう意図され、そのボリュームの断層画像を作成することが望まれる。

図１Ａの実施形態では、反射面１３３は位相変調のためのピエゾステージ（ＰＺＴ）１３２に取り付けられているが、本明細書による方法の一実施形態においてこのような位相変調を使用してもよいし、さらに以下に説明するように、別の実施形態においてこれを使用しなくてもよい。

干渉装置は、一方では、空間的にインコヒーレントな光源であるか低コヒーレンスの光源である光源１４１により放射された光が参照アーム１４６の反射面１３３の各素子面で反射して得られる参照波と、他方では、同一の光源から放射された光がサンプルの深さ方向にサンプル１１のスライスの各ボクセルで後方散乱して得られる物体波と、の間の光学的干渉を発生させるように適合されており、サンプル１１は物体アーム１４７と接して配置され、前記ボクセルと前記素子面とがイメージングフィールドの同一点に対応している。

光源１４１は、空間的にインコヒーレントであって時間的に低コヒーレンス（実際には１～２０マイクロメートルの範囲内）の光源であり、例えば、熱光源（例えば、ハロゲンランプ）またはＬＥＤである。１つ以上の例示的な実施形態によれば、光源１４１は、図１Ａの例のようにＦＦＯＣＴイメージングシステム１３０の一部を形成してもよいし、イメージングシステムの外部の要素であってもよく、ＦＦＯＣＴイメージングシステム１３０は光源から放射される光波と協働するように構成されている。光学系１４０を用いて、コーラーのような照明を実現してもよい。動作時、光源１４１から放射された光は、ダイクロイックミラー１３９で反射し、干渉装置１４５のビームスプリッター素子１３５に到達する。

取得装置１３８は、基準波と物体波との間の干渉に起因する少なくとも１つの２次元干渉信号の取得を可能にする。

取得装置１３８は、例えば、ＣＣＤ（Charge-Coupled Device（電荷結合素子））またはＣＭＯＳ（Complementarity metal-oxide-semiconductor（相補型ＭＯＳ））カメラタイプのイメージセンサである。この取得装置は、高速、例えば１００Ｈｚと１０００Ｈｚとの間、あるいはそれより高い周波数、で画像を取得することができる。調査対象となるサンプルのダイナミクス、より具体的にはサンプル内の動きのダイナミクスに応じて、数Ｈｚから数ＫＨｚまで動作するカメラを使用することが可能である。

処理装置１６０は、サンプルスライスの少なくとも１つの画像を生成するために、取得装置１３８によって取得された少なくとも１つの２次元干渉信号を処理する少なくとも１つの工程および／または本明細書によるイメージング方法のうちの少なくとも１つに従った画像生成の少なくとも１つの工程を実行するように構成されている。

一実施形態では、処理装置１６０は、特に、取得装置１３８によって取得された少なくとも１つの２次元干渉信号を処理する少なくとも１つの工程および／または本明細書によるイメージング方法のうちの少なくとも１つに従った画像計算の少なくとも１つの工程の実行を制御するために、デジタル画像を格納するための第１のメモリＣＭ１（図示せず）と、プログラム命令を格納するための第２のメモリＣＭ２（図示せず）と、この第２のメモリＣＭ２に格納されたプログラム命令を実行できるデータプロセッサと、を備えるコンピューティングデバイスである。

この処理装置を、当該処理装置のために本明細書に記載された１つ以上の機能を実現するのに適した電子部品を含む集積回路の形で製造することも可能である。また、処理装置１６０を、１つ以上の物理的に異なるデバイスによって実現することも可能である。

図１Ａの例では、干渉装置はリニク干渉計であり、参照アームと物体アームにそれぞれ配置された２つの光学レンズ１３４、１４２、例えば顕微鏡対物レンズを含む。顕微鏡対物レンズ１３４、１４２は、開口数が比較的高い（一般に約０．３）ものであってもよく、同時に比較的大きな視野（一般に約１ｍｍ）を提供する。このため、参照アームの対物レンズ１３４の焦点に反射面１３３が位置し、物体アームの対物レンズ１４２の焦点にサンプル１１が位置するように意図されている。より具体的には、対物レンズ１４２の焦点にサンプルの着目する層が位置するように意図されている。本明細書による方法の実施のために、他のタイプの干渉計を想定することができ、特にマイケルソン干渉計を想定することができるが、これに限定されるものではない。

図１Ａの例では、物体アーム１４７の顕微鏡対物レンズ１４２は、前記物体アームの光軸（Ｚ軸）の方向に沿って、すなわちサンプル１１に近づいたり遠ざかったりして移動可能な電動プラットフォーム１４３に搭載されている。また、参照アーム１４６の反射面１３３および顕微鏡対物レンズ１３４は、いずれも別の電動プラットフォーム１３１に搭載されており、前記参照アームの光軸（Ｘ軸）の方向に沿って移動可能となっている。

干渉計１４５の出力には、光学スペクトルフィルタ１３６と光学レンズ１３７とが設けられていてもよく、光学レンズは、例えば、焦点距離が取得装置１３８によるサンプル１１の適切なサンプリングを可能にするように適合され、２つの対物レンズの焦点に位置する面と取得装置１３８の検出面との共役を可能にするアクロマティックダブレットである。このようにして、取得装置１３８は、干渉装置によって生成された干渉信号を取得する。顕微鏡の対物レンズ１３４および１４２によって許容される解像度を制限しないために、光学部品１３７の焦点距離については、シャノンサンプリング基準に沿うように選択される。光学部品１３７の焦点距離は、例えば数百ミリメートル、一般に３００ｍｍである。

以下でさらに説明するように、光学スペクトルフィルタ１３６は、好都合なことに光源１４１の波長を透過させる一方で、ＯＣＴ光源１１２の波長を遮断する。

分散を補償するために、ガラス板あるいは、いわゆる分散補償ブロック（図１Ａには図示せず）をアームのそれぞれに設けてもよい。

ＯＣＴイメージングシステム１１０は、空間的にコヒーレントな光源１１２と、検出器１１３と、ＯＣＴイメージングシステムの干渉装置の参照アームと物体アームを規定するビームスプリッター素子１１４を有する干渉装置と、を備える。一般に、空間的にコヒーレントな光源１１２は、例えばスペクトル領域ＯＣＴまたは時間領域ＯＣＴの場合にはスーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）、あるいは掃引レーザー光源とすることができる。一般に、検出器１１３は、入射光パワーを電気信号に直接変換するデバイス、例えば、時間領域ＯＣＴまたは波長掃引型ＯＣＴの場合はフォトダイオード、空間領域ＯＣＴの場合は分光器とすることができる。

光源１１２からの光は、コリメートされてファイバー１１８に入り、ビームスプリッター素子１１４によって２本のファイバー１２１（物体アーム）および１２０（参照アーム）に分割される。動作時、ファイバー１２０を通った後、光は、レンズ１１５、回転可能な分散補償板１１６を通過し、反射面１１７、例えばメタライズドミラーに達する。ファイバー１２１を通った後、光は、ビームを２Ｄ（Ｘ－Ｙ）方向に走査することができる横方向走査機構１１１に達する。その後、光ビームは光学フィルタ１２２を通過し、ダイクロイックミラー１３９を通過し、ビームスプリッター１３５によってＦＦＯＣＴ参照アーム１４６とＦＦＯＣＴサンプルアーム１４７に分割される。

光学フィルタ１２２は、ＯＣＴ光源１１２から放射された光ビームを、ＯＣＴ参照アーム、ＦＦＯＣＴ参照アームおよびＦＦＯＣＴサンプルアームの両方で伝搬させるが、ＦＦＯＣＴ光源１４１からの光を遮断するように選択されている。一方、光学フィルタ１３６は、ＯＣＴ光源１１２から放射された光ビームを遮断し、ＦＦＯＣＴ光源からの光を通過させる。

光学フィルタ１２２、１３６の機能について、図１Ｃおよび図１Ｄとの関連でさらに説明する。図１Ｃに示す例では、光学フィルタ１２２は、ＦＦＯＣＴイメージングシステムで使用される最大波長λ_{ＦＦＯＣＴｍａｘ}を超える所与の波長λ_{Ｆｉｌｔｅｒ１２２}未満のＯＣＴ光源１１２の波長を遮断（破線）することができる。一方、図１Ｄに示すように、ＦＦＯＣＴイメージングシステムの光学フィルタ１３６は、ＦＦＯＣＴイメージングシステムで使用される前記最大波長λ_{ＦＦＯＣＴｍａｘ}を超える所与の波長λ_{Ｆｉｌｔｅｒ１３６}を超えるＯＣＴ光源の波長を遮断することができる。その結果、ＯＣＴ光はどれも取得装置１３８に到達しない。

言うまでもなく、図１Ｃおよび図１Ｄは、光学フィルタ１２２、１３６の機能の一例を示すにすぎない。ＯＣＴ光がどれも取得装置１３８に到達しないようにする限り、他の多くの構成が可能である。

予備的な工程では、ビームスプリッター１１４からミラー１１７までのＯＣＴアーム（参照アーム）の光路長を、ビームスプリッター１１４からＦＦＯＣＴ参照アーム１４６のミラー１３３までの光路長と一致させてもよい。ＯＣＴアームとＦＦＯＣＴ参照アームの光路の一致は、簡単な方法で実現することができる。リアルタイムで、ＯＣＴ画像に注目する。ＦＦＯＣＴ参照アームのミラーがＯＣＴ画像上に見えない場合、ＯＣＴシステムとＦＦＯＣＴシステムの参照アームは一致していない。ＦＦＯＣＴ参照アームのミラーがＯＣＴ画像上に見えるようになるまで、ＯＣＴイメージングシステムの参照アームを伸ばす。

動作時、ＦＦＯＣＴイメージングシステムの参照アーム１４６の反射面１３３からの後方反射光が、ビームスプリッター１３５においてサンプルの異なる層からの後方反射光と結合する。ビームスプリッター１３５で光を再び２つの部分に分け、反射部分が（図１Ｄに関連して説明したように）フィルタ１３６によって遮断され、透過部分は、ダイクロイックミラー１３９、フィルタ１２２、ファイバー１２１を通過する。そして、この光ビームがファイバー１２０からの後方反射光と混ざり、ファイバー１１９を通過した後、検出器１１３により集められる。検出器１１３、例えば分光器は、イメージング対象となる物体の異なる深さにおける反射率に関する情報を含む、いわゆるＡ－ｓｃａｎ（１Ｄプロファイル）を記録するように構成されている。さらに、これは、ＦＦＯＣＴイメージングシステムの参照アーム１４６の参照ミラー１３３の位置に関する情報を収集する。走査機構１１１でビームを走査することで、２Ｄおよび３Ｄの反射率画像を取得することができる。

ＯＣＴイメージングシステムは、スペクトル領域ＯＣＴ（検出器１１３は分光器である）であってもよいが、時間領域ＯＣＴや波長掃引型ＯＣＴであってもよい。

また、ＯＣＴイメージングシステムによって、サンプルの連続したいくつかの位置とそれらの間の時間間隔に基づいて、サンプルの速度に関する情報を提供してもよい。サンプルの瞬間的な速度に関する情報は、サンプルの将来の動きを予測するのに役立つ場合がある（例えば、最初の瞬間にサンプルがＺ方向に急速に動いている場合、次の瞬間にも同じ方向に動き続けると予想することができる）。

以下でさらに説明するように、本明細書による方法の実施形態では、サンプル１１の異なる複数の着目層の位置と、ＦＦＯＣＴイメージングシステムの参照アーム１４６の参照ミラー１３３の位置とに関する情報を得るために、上述のＯＣＴイメージングシステムを使用する。

図１Ｂに示すシステム１０２は、図１Ａのシステムとわずかに差があるだけで同様のものである。図１Ｂの実施形態では、ＦＦＯＣＴイメージングシステムのサンプルアーム１４７の顕微鏡対物レンズの役割は、眼の角膜１１と水晶体１２によって果たされる。さらに、眼によって導入される収差と分散ミスマッチを補正するために、例えば液体レンズなどの適応レンズ１４８および回転ガラス板１４９を参照アームに挿入してもよい。眼の水晶体１２は一般に焦点深度が深いため、図１Ａに示す装置とは対照的に、深さの異なる網膜層のイメージングについては、デフォーカスを補正せず、したがって参照アーム１４６を移動させることなく行うことができる。他のすべての態様については、図１Ａに示す実施形態のシステムと同様のシステムであってもよい。

３Ｄイメージング方法
図２Ａは、本明細書によるイメージング方法の実施形態の流れ図である。この方法は、例えば、図１Ａに示すようなシステムを用いて実施することができる。表記の方法は、動いているin vivoサンプル、特にin vivoの眼の前部１１（角膜）であるがこれに限定されるものではないin vivoサンプルの３Ｄイメージングに適している。

図２Ｂは、ＯＣＴイメージングシステムとＦＦＯＣＴイメージングシステムの両方によって図２Ａに示す異なる工程で取得された画像を示す。

図２Ａおよび図２Ｂの工程は、３Ｄ画像の取得を示している。

工程２０１では、ＯＣＴイメージングシステムとＦＦＯＣＴイメージングシステムの２つの装置からの画像が取得および表示される。ＦＦＯＣＴ画像については、さらに以下に説明するように、変調ＰＺＴまたは静的ＰＺＴのどちらかによって得ることができる。図２Ｂにおける対応する工程２０１では、ＯＣＴ画像２２１には、ＦＦＯＣＴイメージングシステムの参照アームのミラー１３３が表示される。画像２２２および２２８には、まだデフォーカス補正がなされていないまたは／およびサンプルアームと参照アームの光路が一致していないため、カメラノイズだけが存在する。

工程２０３では、ＯＣＴ画像に角膜層が見えるか否かが確認される。

ＮＯの場合、図２Ｂの画像２２６に示すように、装置１５０全体を、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に沿って移動させることができる（工程２０４）。例えば、必要な層が画面上で観察されるまで、オペレータによって移動させることが可能である。

ＹＥＳの場合、図２Ｂの画像２２７に示すように、装置１５０全体をＸ軸およびＺ軸に沿って移動させることにより、参照ミラー１３３のＯＣＴ画像を角膜層（参照角膜層）と重ね合わせることができる（工程２０５）。参照角膜層は、どの層であってもよいが、一般に明るいピークを提供する層を選択すればよい。図２Ｂにおいて、画像２２９は、参照角膜層の画像と重なる参照ミラーの画像を示している。同時に、デフォーカス補正が行われていないがゆえ、ぼやけたＦＦＯＣＴ画像２３０をみることが出来る。

ＦＦＯＣＴ画像単独では、画像が捕捉されたサンプルにおける位置に関する情報が全く含まれていない。ＯＣＴイメージングシステム１１０は、ＦＦＯＣＴと併用され、捕捉された画像のＸ、Ｙ、Ｚ座標を提供することによって、この不足分を補う。２ＤのＦＦＯＣＴ画像のスタックには各々の位置が付随しており、これらの画像をひとまとめにして３Ｄ画像を形成することができる。以下、より正確に、３Ｄ画像取得２０９の方法について説明する。

第１の実施の形態（２１０）では、モータによって顕微鏡対物レンズ１４２だけをサンプルアーム１４７の下に移動させる。同時に、サンプルアーム１４７と参照アーム１４６との間の光路のミスマッチを補正するために、参照アーム１４６をビームスプリッター１３５から離れる方向（またはビームスプリッターに近づく方向）に移動させる。

第２の実施の形態（２１１）では、モータ１０１によって装置１５０全体をサンプル１１に近づく方向に（またはサンプルから離れる方向に）移動させる。同時に、サンプルアーム１４７と参照アーム１４６との間の光路のミスマッチを補正するために、参照アーム１４６をビームスプリッター１３５からから離れる方向（またはビームスプリッターに近づく方向）に移動させる。

第３の実施の形態（２１２）では、サンプルアーム１４７と参照アーム１４６との間の光学的ミスマッチ（デフォーカス）を補正するために、参照アーム１４６だけをビームスプリッター１３５から離れる方向に移動させる。参照アームの移動範囲については、瞬間的なサンプル位置（またはサンプルにおける深さ）に依存する。サンプルの位置（または深さ）の変化は、サンプルのin vivoでの動きにのみ左右される。

すべての実施の形態において、サンプルにおける異なる深さのスライスそれぞれのen face画像が、以下で説明する方法に従って記録される。同時に、各２Ｄ画像に対応するスライスの位置（Ｘ、Ｙ、Ｚ）がＯＣＴイメージングシステム１１０によって記録される。各２Ｄ画像の位置情報を持つことで、３Ｄ画像を形成するために２Ｄ画像を再配置することができる。

各スライスのen face画像が取得された時刻を格納する（２１３）ことにより、各スライスの深さの決定がなされる。必要に応じて取得を停止する（２１４）。工程２１５では、格納されている異なる時刻のＯＣＴ画像からの位置情報を用いて、２Ｄ ＯＣＭ画像すなわちＦＦＯＣＴ装置によって得られた画像を再配置し、３Ｄ角膜画像を形成する。

図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂに、位置検出に用いられる２Ｄ断面画像と１Ｄ画像（Ａスキャン）の例を示す。

図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂは、ＦＦＯＣＴイメージング装置によるイメージングの対象となるスライスの深さを決定するために、ＯＣＴイメージングシステムをどのように用いるか、を示している。また、デフォーカスの補正についても示している。

図４Ａおよび図４Ｂは、サンプルが導入されていないときにＯＣＴイメージングシステムを用いて得られた２Ｄ断面画像および対応するプロファイル（Ａ－スキャン）をそれぞれ示す。図５Ａおよび図５Ｂは、サンプルがサンプルアームに導入され、ＯＣＴイメージング装置の視野内にある場合に、ＯＣＴイメージングシステムを用いて得られた２Ｄ断面画像および対応するプロファイルをそれぞれ示す。スライスの深さは、デフォーカス補正されていない基準位置を基準に測定されており、図４Ａ、図４Ｂ、図５Ａ、図５Ｂでは、深さ０における黒い縦線に対応する）。例えば、基準となる層は角膜の最上層である。

画像２３１では、角膜の一番上の層（角膜を括弧で示す）が参照ミラー（矢印で示す）と重なっている。この位置は、図４Ａ、図５Ａの「０」の位置、すなわち角膜最上層の位置とデフォーカス補正されていない参照ミラーの位置との差がゼロに等しい場合に対応する。その結果、デフォーカス補正は行われず、角膜表面の画像２３２が得られる。

画像２３３では、デフォーカス補正されていない参照アーム位置に対して、角膜上層が（画像上で）上にシフトされる。その結果、ゼロではない深さが測定される。この深さに基づいて、デフォーカス補正されていない基準位置から参照アームが（画像上で）下にシフトされる。その結果、角膜層からの画像２３４が得られる。これは、ＯＣＴ画像においては参照ミラー画像と重なることになる。

画像２３５では、前の工程と同様にしてすべてが繰り返される。角膜は再び上にシフトされ、参照アームがミラーとともに再び下にシフトされる。その結果、角膜深部からのＦＦＯＣＴ画像２３６が得られる。

上述した実施形態については、動いているin vivoサンプル、特にin vivoの眼の前部の、イメージングに用いることが提案されている。

以下に説明する方法の実施形態は、様々なin vivoサンプルのイメージングにも使用可能であるが、特に、in vivoの眼の後部に焦点が当てられている。図３Ａは、本明細書によるイメージング方法の実施形態の流れ図である。この方法は、例えば、図１Ｂに示すようなシステムを用いて実施することができる。表記の方法は、動いているin vivoサンプル、特にin vivoの眼の後部１３（網膜）であるがこれに限定されるものではないin vivoサンプル、のイメージングに適している。

図３Ｂは、ＯＣＴイメージングシステムとＦＦＯＣＴイメージングシステムの両方によって図３Ａに示す異なる工程で取得された画像を示す。

工程３０１では、取得が開始され（取得は、画像を得るための処理を含む）、ＯＣＴイメージングシステムとＦＦＯＣＴイメージングシステムの２つの装置からの画像が表示される。ＦＦＯＣＴでの取得は、後述するように、変調ＰＺＴまたは静的ＰＺＴのどちらかによって行うことができる。工程３０３では、ＯＣＴ画像で網膜層が見えるか否かが確認される。画像３２２および３２６には、まだデフォーカス補正がなされていないまたは／およびサンプルアームと参照アームの光路が一致していないため、カメラノイズだけが存在する。

ＮＯの場合、図３Ｂの画像３２４に示すように、装置１５０全体を、Ｘ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に沿って移動させる（工程３０４）。ＹＥＳの場合、図３Ｂの画像３２５に示すように、装置１５０全体をＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸に沿って移動させることにより、参照ミラー１３３のＯＣＴ画像を着目する網膜層と重ね合わせる（工程３０５）。

その段階で、ＯＣＴ画像３２７または３２９、図３Ｂおよび対応するＦＦＯＣＴ画像３２８、３３０に示されているように、ミラー１３３と網膜層のいずれかとの間で光路長が一致する。

その後、３Ｄ画像取得３０９が開始される。

第１の実施態様（３１０）では、参照アーム１４６だけをモータによって下に移動させる。

第２の実施態様（３１１）では、モータ１０１によって装置１５０全体をサンプル１１に近づく方向に（またはサンプルから離れる方向に）移動させる。

第３の実施態様では、いずれのモータも動かされず、サンプルのin vivoでの動きによって３Ｄスタックの作製が実現される。

図２Ａおよび図２Ｂについては、動いているin vivoサンプルの２Ｄ断面画像それぞれが、上述の方法に従って記録される。サンプルのin vivoでの動きを利用する場合、サンプルの一般的な動きの周波数で最大のＦＦＯＣＴ信号が得られるように装置を調整することができる。同時に、各２Ｄ画像に対応するサンプルの位置（Ｘ、Ｙ、Ｚ）がＯＣＴイメージングシステム１１０によって記録される（図３Ｂの工程３１３、３１４、３１５および対応する画像３３１～３３６）。各２Ｄ画像の位置情報を持つことで、３Ｄ画像を形成するために２Ｄ画像を再配置することができる。

en face画像の決定
直接カメラ画像からＦＦＯＣＴ画像を抽出するためには、位相シフトのスキームが必要である。

本明細書の第１の実施形態では、標準的なＦＦＯＣＴ画像検索方法が使用され、その方法に従って、ピエゾ素子（ＰＺＴ）１３２を変調することによって位相シフトが行われる。この実施形態は、（一般的な画像取得時間でのサンプルの動きが＜＜π位相シフトになるはずの）ゆっくりと動くサンプルの場合、あるいは、高速で動くサンプルでの動きのない瞬間に有用である。スキームに応じて、２つ、４つまたは５つの直接画像から、ＦＦＯＣＴ画像を抽出することができる。

例えば、直接画像が２つである場合、次のようになる。

位相シフトした２つの画像は、次のようになる。

この２つの画像を減算してモジュールを取ると、ＦＦＯＣＴ画像すなわち「ＦＦＯＣＴ信号」が得られる。

２つの連続した直接カメラフレーム間の位相シフトがπに等しい（２位相シフトスキームの場合）ことで、可能な限り高いＦＦＯＣＴ信号を得ることができる。

本明細書の第２の実施形態では、使用される画像検索方法は、サンプルのin vivoでの自然な動きに依存している。

出願人らは、例えば眼組織のイメージング用途において、自然な眼球運動が原因で連続する直接画像間に位相変化が生じ、これがＦＦＯＣＴ画像を抽出するのに十分な大きさになり得ることを示した。より正確には、出願人らは、in vivoのヒトの目の動きを測定し、カメラの露光時間が例えば１ｍｓ～１０ｍｓの範囲に設定されている（すなわち、２つの連続したカメラフレームが、それぞれ２～２０ｍｓで取得される）場合、連続したカメラフレーム間に目の動きによって誘導される位相シフトは、０～±３０ラジアン（すなわち±１０πに相当する）のうちのいずれかの値を取り得ることを示した。より一般的には、in vivoでの動きによって、連続した直接カメラ画像間に位相変化が生じ得る。これらの位相変化を利用して、ＦＦＯＣＴ画像を抽出することができる。この方法によれば、２つ、４つまたは５つの直接画像からＦＦＯＣＴ画像を抽出することができるが、スキームによっては、この順序に限定されない。以下、２つの直接画像に対するＦＦＯＣＴ抽出方法を例にあげて説明するが、本発明は二画像スキームだけに限定されるものではなく、あらゆるＦＦＯＣＴ画像検索スキームに適用可能である。

そして、２つの直接画像が得られる。

２つの画像を減算して式を単純化すると、次のようになる。

図６では、高いＦＦＯＣＴ信号を得るためには、位相シフトが十分に大きいことが求められるだけでなく、カメラが複数のフレームを取得している間に位相シフトが生じなければならないことが示されている（図６では２フレームの例が示されている）。サンプルのin vivoでの動きの瞬間的な速度を知ることで、平均π位相シフトを得るのに必要な時間間隔を見つけることができる。直接画像のスタックを記録することができ、高いＦＦＯＣＴ信号を得るために、π位相シフトに対応する２つのフレームをスタックから抽出して処理することが可能である。この方法は、例えば、眼のイメージングに用いることができる。眼の動きが２つの連続する直接カメラ画像間の誘導された位相シフトが（通常、心拍のような大きなスパイクからの）ラジアンより小さいようなものである場合、これらの２つの画像間の位相シフトは、ＦＦＯＣＴ画像を得るのに十分である。さらに、カメラの有用な（π位相シフトのある）直接画像の数を増やすために、in vivoサンプルの動きの一般的な速度に応じて、カメラの取得速度と光源の波長を調整することができる。最大ＦＦＯＣＴ信号が得られるサンプルの速度が達成される。

この式から、最初にサンプルのin vivoでの一般的な動きの速度νがわかっていれば、カメラの速度と光源の波長を調整して、サンプルの一般的な速度での直接画像間の平均π位相差（したがって、最良のＦＦＯＣＴ信号）を得ることができる。眼の動きが２つの連続する画像間の誘導された位相シフトが（通常、心拍のような大きなスパイクからの）ラジアンよりも小さいようなものである場合、標準的なＦＦＯＣＴの２つの位相画像が使用可能である。

２つの連続する直接画像は、次のとおりである。

２つの画像を減算して式を単純化すると、次のようになる。

図６の例では、ＦＦＯＣＴ画像を得るためには、少なくとも２つの直接画像を取得する必要があるが、これは、πに等しい画像間の平均位相シフト（グラフのＹ軸）を有する。サンプルの平均移動速度がわかっていれば、サンプルがπだけ移動するのに必要な時間がわかる（例えば、グラフ上では３．４ミリ秒となっている）。そのため、３．４ｍｓの時間で２つの画像を取得するようにカメラの取得速度を調整することができる。その結果、サンプルのみで位相シフトが行われることになる。

図７において、画像７１～７６はそれぞれ、in vivoのヒト角膜の上皮および涙液膜（７１）、上皮および基底膜下神経（７２）、前部、中部、後部間質（７３～７５）、内皮（７６）からの反射を示す。

図８は、異なるカメラ露光時間（したがって、それぞれ５５０フレーム／秒、３００フレーム／秒、２００フレーム／秒、１００フレーム／秒の異なるカメラフレームレート）を用いて取得した角膜の深部実質層の画像８１、８２、８３、８４を示している。画像は、図７と同じ条件、すなわち自然な眼の動きによってのみ位相がシフトされ、参照ミラーの移動が行われていない、連続した２次元干渉信号を用いて捕捉される。

本出願人は、このような実施形態により、非常に高品質な画像を取得することができ、カメラとピエゾの同期を必要とせずにシステムを大幅に簡素化できることを示している。

複数の詳細な例示の実施形態を用いて説明したが、本明細書による散乱３次元サンプルのin vivo全視野干渉顕微鏡イメージングのためのシステムおよび方法は、当業者には明らかな様々な変形、変更および改良を含んでおり、これらの様々な変形、変更および改良は、以下の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の範囲に包含されることが理解される。

Claims (16)

1. 散乱３次元サンプルのin vivo全視野干渉顕微鏡イメージングのための方法であって、物体アーム（１４７）と、光学レンズ（１３４）および第１の反射面（１３３）を有する参照アーム（１４６）と、を備える、全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の干渉装置の、前記物体アーム（１４７）にサンプルを配置する工程と、
   イメージングフィールドの各点において、前記イメージングフィールドの前記点に対応する前記第１の反射面（１３３）の素子面上で入射光波が反射して得られる参照波と、所与の深さにある前記サンプルのスライスのボクセルであって、前記イメージングフィールドの前記点に対応する前記ボクセルによって入射光波が後方散乱して得られる物体波と、の間の干渉を生じさせる工程と、
   前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の取得装置（１３８）を用いて、前記イメージングフィールドの各点で生じた前記干渉に起因する、時間的に連続した複数の２次元干渉信号を取得する工程と、
   各２次元干渉信号について、取得時刻を格納する工程と、
   前記２次元干渉信号の取得時刻ごとに、ＯＣＴイメージングシステム（１１０）を用いて、前記サンプルと前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記第１の反射面（１３３）の両方の断面画像（Ｘ－Ｚ）を提供する工程と、
   前記サンプルの複数のスライスの複数のen face画像（Ｘ－Ｙ）を、各々、所与の位相シフトを有する少なくとも２つの２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）から決定する工程と、
   前記２つの２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）のそれぞれの取得時に前記ＯＣＴイメージングシステム（１１０）によって提供される前記断面画像から、前記複数のスライスの各en face画像（Ｘ－Ｙ）の深さ（ｚ）を決定する工程と、
   前記サンプルの前記複数のスライスの前記複数のen face画像と深さから、前記サンプルの３Ｄ画像を決定する工程と、
   を含む、方法。
2. 前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）および前記ＯＣＴイメージングシステム（１１０）は可動式プラットフォーム（１５０）に搭載され、前記方法は、前記複数のen face画像（Ｘ－Ｙ）を決定するために、前記プラットフォーム（１５０）を少なくとも前記物体アームの光軸（Ｚ）に沿って移動させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記プラットフォーム（１５０）を、少なくとも前記物体アームの前記光軸に垂直な方向（Ｘ、Ｙ）に沿って移動させることをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記参照アーム（１４６）は可動式プラットフォーム（１３１）に搭載され、前記方法は、デフォーカスを補正するために、前記プラットフォーム（１３１）を移動させることをさらに含む、請求項２または３に記載の方法。
5. 前記物体アーム（１４７）は可動式プラットフォーム（１４３）に搭載され、前記方法は、前記複数のen face画像（Ｘ－Ｙ）を決定するために、前記物体アームの光軸（Ｚ）に沿って前記プラットフォーム（１４３）を移動させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記参照アーム（１４６）は可動式プラットフォーム（１３１）に搭載され、前記方法は、デフォーカスを補正するために、前記プラットフォーム（１３１）を移動させることをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記参照アーム（１４６）は可動式プラットフォーム（１３１）に搭載され、前記方法は、前記複数のen face画像（Ｘ－Ｙ）を決定すべく、デフォーカスを補正するために、前記参照アームの光軸（Ｘ）に沿って前記プラットフォーム（１３１）を移動させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記少なくとも２つの２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）間の前記位相シフトを提供するために、前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記参照アームの前記第１の反射面（１３３）の位置をずらすことをさらに含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記取得装置によって取得された前記時間的に連続した複数の２次元干渉信号において、前記位相シフトを有する前記少なくとも２つの２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）を選択することをさらに含み、前記位相シフトは、前記サンプルのin vivoでの動きに起因する、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 散乱３次元サンプルのin vivo全視野干渉顕微鏡イメージングのためのシステム（１０１、１０２）であって、
    前記サンプルのen face画像を提供するための全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）と、
    ＯＣＴイメージングシステム（１１０）と、
    処理装置（１６０）と、を備え、
    前記全視野ＯＣＴシステムは、
    前記サンプルを受けるように意図された物体アーム（１４７）と、光学レンズ（１３４）および第１の反射面（１３３）を含む参照アーム（１４６）と、を備える干渉装置と、
    取得装置（１３８）と、を備え、
    前記物体アーム（１４７）と前記参照アーム（１４６）とは、ビームスプリッター（１３５）によって分離され、
    前記干渉装置は、前記サンプルが前記干渉装置の前記物体アームに配置されているときに、イメージングフィールドの各点において、前記イメージングフィールドの前記点に対応する前記第１の反射面の素子面上での入射光波の反射によって得られる参照波と、所与の深さにある前記サンプルのスライスのボクセルであって、前記イメージングフィールドの前記点に対応する前記ボクセルによる入射光波の後方散乱によって得られる物体波と、の間の干渉を生じさせるように適合され、
    前記取得装置（１３８）は、前記イメージングフィールドの各点で生じた前記干渉に起因する時間的に連続した複数の２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）を取得するように構成され、
    前記ＯＣＴイメージングシステム（１１０）は、前記２次元干渉信号の取得と同時に、前記サンプルと前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記第１の反射面（１３３）の両方の断面画像を提供するためのものであり、
    前記処理装置（１６０）は、
    前記サンプルの複数のスライスの複数のen face画像（Ｘ－Ｙ）を、各々、所与の位相シフトを有する少なくとも２つの２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）から決定し、
    前記２つの２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）のそれぞれの取得時に前記ＯＣＴイメージングシステム（１１０）によって提供される前記断面画像から、前記複数のスライスの各en face画像（Ｘ－Ｙ）の深さ（ｚ）を決定し、
    前記サンプルの前記複数のスライスの前記複数のen face画像と深さから、前記サンプルの３Ｄ画像を決定するように構成されている、システム（１０１、１０２）。
11. 前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記参照アームの前記第１の反射面（１３３）は、前記少なくとも２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）間の前記光路差を提供するように位置シフトされる、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記処理装置（１６０）はさらに、前記取得装置によって取得された前記時間的に連続した複数の２次元干渉信号において、前記所与の光路差を有する前記少なくとも２次元干渉信号（Ｉ₁、Ｉ₂）を選択するように構成され、前記光路差は、前記サンプルのin vivoでの動きに起因する、請求項１０または１１に記載のシステム。
13. 前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記物体アーム（１４７）は、光学レンズ（１４２）をさらに備える、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のシステム。
14. 前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記参照アーム（１４６）および／または前記物体アームは、前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）の前記干渉装置の前記ビームスプリッター（１３５）に対して移動可能である、請求項１０～１３のいずれか１項に記載のシステム。
15. 可動式プラットフォーム（１０１）をさらに備え、前記全視野ＯＣＴイメージングシステム（１３０）および前記ＯＣＴイメージングシステム（１１０）が前記可動式プラットフォーム（１０１）に搭載されている、請求項１０～１４のいずれか１項に記載のシステム。
16. 前記ＯＣＴイメージングシステムは、スペクトル領域ＯＣＴイメージングシステム、時間領域ＯＣＴイメージングシステム、または波長掃引型ＯＣＴイメージングシステムである、請求項１０～１５のいずれか１項に記載のシステム。

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