JP7389547B2 - Monoacylglycerol lipase variant and method for producing the same - Google Patents
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Description
本発明は、モノアシルグリセロールリパーゼ変異体、及びその製造方法に関する。 The present invention relates to monoacylglycerol lipase variants and methods for producing the same.
モノアシルグリセロール（ＭＡＧ）は、乳化剤や抗菌剤等として食品、医薬品、化粧品等の分野に広く利用されている物質である。さらに近年、ＭＡＧが、食後の血中トリグリセリドの上昇抑制、食後血中インスリン上昇抑制、食後ＧＩＰ分泌抑制等の優れた生理活性を有することが見出されている。ＭＡＧは、生化学的な方法では、脂肪酸とグリセリンとをリパーゼの存在下で反応させることで製造される。この方法で用いるリパーゼとしては、モノグリセリドリパーゼ（ＭＧＬＰ）などの脂肪酸モノグリセリド又は脂肪酸ジグリセリドを基質として認識するリパーゼが好ましい。ＭＧＬＰについては、特許文献１に、バチルス・エスピー（Bacillus sp.）Ｈ－２５７由来ＭＧＬＰであるＨ－２５７の固定化物が開示されている。非特許文献１には、Ｈ－２５７リパーゼと近縁のＭＧＬＰである、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２が開示されている。 Monoacylglycerol (MAG) is a substance widely used as an emulsifier, antibacterial agent, etc. in the fields of food, medicine, cosmetics, etc. Furthermore, in recent years, it has been discovered that MAG has excellent physiological activities such as suppressing the rise in postprandial blood triglycerides, suppressing the rise in postprandial blood insulin, and suppressing postprandial GIP secretion. MAG is produced biochemically by reacting fatty acids and glycerin in the presence of lipase. The lipase used in this method is preferably a lipase that recognizes fatty acid monoglyceride or fatty acid diglyceride as a substrate, such as monoglyceride lipase (MGLP). Regarding MGLP, Patent Document 1 discloses an immobilized product of H-257, which is MGLP derived from Bacillus sp. H-257. Non-Patent Document 1 discloses EstGtA2, an MGLP derived from Geobacillus thermodenitrificans, which is a MGLP closely related to H-257 lipase.
ＭＡＧの生化学的合成においては、リパーゼによるエステル化反応の反応効率の点で、基質を溶液状態で用いることが重要である。そのため、融点が高い高級脂肪酸のエステル化反応は高温下で行うことが望まれる。したがって、より高温で酵素活性を保持することができるＭＧＬＰは有用である。 In the biochemical synthesis of MAG, it is important to use the substrate in a solution state from the viewpoint of reaction efficiency of the esterification reaction using lipase. Therefore, it is desirable that the esterification reaction of higher fatty acids with high melting points be carried out at high temperatures. Therefore, MGLP that can retain enzymatic activity at higher temperatures is useful.
本発明は、耐熱性の向上したモノアシルグリセロールリパーゼ変異体、及びその製造方法を提供する。 The present invention provides a monoacylglycerol lipase variant with improved heat resistance and a method for producing the same.
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ以下：
配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置における、セリン以外のアミノ酸残基；
配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置における、アルギニン以外のアミノ酸残基；及び
配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置における、アルギニン以外のアミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドを提供する。
また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリン、６７位に相当する位置のアルギニン、及び１８３位に相当する位置のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法を提供する。
さらに本発明は、前記モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
さらに本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含有する形質転換体を提供する。
さらに本発明は、前記形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法を提供する。
The present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and:
Amino acid residue other than serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
An amino acid residue other than arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and an amino acid residue other than arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
Provided is a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, having at least one amino acid residue selected from the group consisting of:
The present invention also provides a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 92% identity thereto and having monoacylglycerol lipase activity, which corresponds to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. a monomer comprising substituting at least one amino acid residue selected from the group consisting of serine at the position corresponding to position 67, arginine at the position corresponding to position 67, and arginine at the position corresponding to position 183 with another amino acid residue. A method for producing a mutant polypeptide having acylglycerol lipase activity is provided.
Furthermore, the present invention provides a polynucleotide encoding the polypeptide having the monoacylglycerol lipase activity.
Furthermore, the present invention provides a vector containing the polynucleotide.
Furthermore, the present invention provides a transformant containing the polynucleotide or the vector.
Furthermore, the present invention provides a method for producing a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, which comprises culturing the transformant.
本発明のモノアシルグリセロールリパーゼ変異体は、親酵素と比べて耐熱性が向上しており、より高温でのモノアシルグリセロール合成反応を可能にする。本発明は、酵素反応によるモノアシルグリセロール合成の効率を向上させる。 The monoacylglycerol lipase mutant of the present invention has improved thermostability compared to the parent enzyme, and enables monoacylglycerol synthesis reactions at higher temperatures. The present invention improves the efficiency of monoacylglycerol synthesis by enzymatic reaction.
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。 All patents, non-patent documents, and other publications cited herein are incorporated by reference in their entirety.
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９２％の同一性」とは、９２％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。 As used herein, "at least 92% identity" with respect to amino acid sequences or nucleotide sequences refers to 92% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more. % or more, more preferably 99% or more.
本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。 As used herein, nucleotide sequence and amino acid sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis using a search homology program of genetic information processing software Genetyx-Win with Unit size to compare (ktup) set to 2.
本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」又は「相当する領域」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。また、相当する位置により挟まれた領域、または相当するモチーフからなる領域は、相当する領域とみなされる。 As used herein, a "corresponding position" or "corresponding region" on an amino acid sequence or nucleotide sequence refers to a sequence of interest and a reference sequence (e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) that provides maximum homology. This can be determined by alignment. Alignment of amino acid or nucleotide sequences can be performed using known algorithms and procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J.D. et al, 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which are revised versions of Clustal W, can also be used. Clustal W, Clustal W2, and Clustal omega are, for example, the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]) and the Japanese DN operated by the National Institute of Genetics. A data It can be used on the website of DDBJ Bank (DDBJ [www.ddbj.nig.ac.jp/searches-j.html]). A position of the target sequence aligned to an arbitrary position of the reference sequence by the above-mentioned alignment is considered to be a "corresponding position" to the arbitrary position. Furthermore, a region sandwiched by corresponding positions or a region consisting of a corresponding motif is considered to be a corresponding region.
当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。 Those skilled in the art can further fine-tune the amino acid sequence alignment obtained above to optimize it. Such optimal alignment is preferably determined by taking into consideration the similarity of amino acid sequences, the frequency of inserted gaps, and the like. Amino acid sequence similarity here refers to the ratio (%) of the number of positions where identical or similar amino acid residues exist in both sequences to the total number of amino acid residues when two amino acid sequences are aligned. . Similar amino acid residues refer to amino acid residues among the 20 types of amino acids constituting proteins that have similar properties to each other in terms of polarity and charge and that cause so-called conservative substitutions. Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art and are, for example, arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; leucine. and isoleucine, but are not limited to these.
本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。 As used herein, "amino acid residue" refers to the 20 types of amino acid residues that make up proteins, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L ), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W) , tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V).
本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。 As used herein, "operable linkage" between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. means. Procedures for "operably linking" genes and control regions are well known to those skilled in the art.
本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。 As used herein, "upstream" and "downstream" with respect to a gene refer to upstream and downstream of the gene in the direction of transcription. For example, "a gene located downstream of a promoter" means that the gene is located on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand, and "upstream of the gene" means that the gene is located on the 5' side of the promoter in the DNA sense strand. means the area on the side.
本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。 In this specification, the term "inherent" used with respect to the function, property, or trait of a cell is used to indicate that the function, property, or trait is originally present in the cell. In contrast, the term "foreign" is used to describe a function, property, or trait that is not native to the cell but is introduced from outside. For example, a "foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that is introduced into a cell from outside. The foreign gene or polynucleotide may be derived from the same type of organism as the cell into which it is introduced, or may be derived from a different type of organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
本明細書に記載の枯草菌の遺伝子の名称は、ＪＡＦＡＮ：Ｊａｐａｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ ｆｏｒ Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ（ＢＳＯＲＦ ＤＢ）でインターネット公開（[bacillus.genome.ad.jp/]、２００６年１月１８日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載されている。本明細書に記載される枯草菌の遺伝子番号は、ＢＳＯＲＦ ＤＢに登録されている遺伝子番号を表す。 The names of the Bacillus subtilis genes described herein are published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) ([bacillus.genome.ad.jp/], updated on January 18, 2006) The description is based on the Bacillus subtilis genome data. The Bacillus subtilis gene numbers described herein represent gene numbers registered in the BSORF DB.
本明細書において、「モノアシルグリセロールリパーゼ」（ＭＧＬＰともいう）とは、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドをいう。本明細書において、「モノアシルグリセロールリパーゼ活性」とは、トリアシルグリセロールをジアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性及びジアシルグリセロールをモノアシルグリセロールと脂肪酸に分解する活性に比較して、より選択的にモノアシルグリセロールをグリセリンと脂肪酸に分解する活性をいうか、又はグリセリンと脂肪酸との合成反応において、トリアシルグリセロール及びジアシルグリセロールに比較して、より選択的にモノアシルグリセロールを合成する活性をいう。 As used herein, "monoacylglycerol lipase" (also referred to as MGLP) refers to a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity. As used herein, "monoacylglycerol lipase activity" refers to monoacylglycerol lipase activity that is more selective than the activity that decomposes triacylglycerol into diacylglycerol and fatty acids and the activity that decomposes diacylglycerol into monoacylglycerol and fatty acids. It refers to the activity of decomposing acylglycerol into glycerin and fatty acids, or the activity of synthesizing monoacylglycerol more selectively than triacylglycerol and diacylglycerol in the synthetic reaction of glycerin and fatty acids.
本明細書において、ポリペプチド変異体の「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該ポリペプチド変異体となるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、ポリペプチド変異体が変異される前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドが変異される前のポリヌクレオチドである。 As used herein, the "parent" polypeptide of a polypeptide variant refers to a polypeptide that becomes the polypeptide variant by making a predetermined mutation in its amino acid residue. In other words, a "parent" polypeptide is the polypeptide before the polypeptide variant is mutated. Similarly, the "parent" polynucleotide of a mutant polynucleotide refers to a polynucleotide that becomes the mutant polynucleotide when a predetermined mutation is made to its nucleotides. In other words, a "parent" polynucleotide is the polynucleotide before the mutant polynucleotide is mutated.
本発明は、耐熱性が向上したＭＧＬＰ変異体、及びその製造方法を提供する。 The present invention provides an MGLP variant with improved heat resistance and a method for producing the same.
一実施形態において、本発明は、ＭＧＬＰ変異体の製造方法を提供する。当該本発明の方法は、親ＭＧＬＰにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位、６７位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む。 In one embodiment, the invention provides a method for producing an MGLP variant. The method of the present invention involves replacing at least one amino acid residue selected from the group consisting of amino acid residues at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the parent MGLP with other amino acid residues. This includes substitution of amino acid residues.
本発明のＭＧＬＰ変異体の親ＭＧＬＰの一例としては、配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドが挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドの例としては、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス由来ＭＧＬＰであるＥｓｔＧｔＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ： ＡＥＮ９２２６８．１）が挙げられる。ＥｓｔＧｔＡ２は、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｌｙｐｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅ Ｆａｍｉｌｙ ＸＶ（非特許文献１）に属するＭＧＬＰである。該親ＭＧＬＰの別の一例としては、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドが挙げられる。 An example of the parent MGLP of the MGLP mutant of the present invention is a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. An example of a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 includes EstGtA2 (GenBank: AEN92268.1), which is MGLP derived from Geobacillus thermodenitrificans. EstGtA2 is an MGLP belonging to Bacterial Lypolytic Enzyme Family XV (Non-Patent Document 1). Another example of the parent MGLP includes a polypeptide consisting of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and having monoacylglycerol lipase activity.
該親ＭＧＬＰは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリンを有するか、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にアルギニンを有するか、又は配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にアルギニンを有する。より好ましくは、該親ＭＧＬＰは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位及び６７位に相当する位置に、それぞれセリン及びアルギニンを有するか、配列番号１のアミノ酸配列の２６位及び１８３位に相当する位置に、それぞれセリン及びアルギニンを有するか、又は配列番号１のアミノ酸配列の６７位及び１８３位に相当する位置の両方にアルギニンを有する。このとき、好ましくは該２６位に相当する位置の残基はイソロイシン又はバリンではなく、該６７位に相当する位置の残基はグルタミン酸又はアラニンではなく、該１８３位に相当する位置の残基はリシン、セリン又はアルパラギン酸ではない。さらに好ましくは、該親ＭＧＬＰは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位、６７位及び１８３位に相当する位置に、それぞれセリン、アルギニン及びアルギニンを有する。 The parent MGLP has serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, has arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It has arginine at the position corresponding to position 183. More preferably, the parent MGLP has serine and arginine at positions corresponding to positions 26 and 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, respectively, or corresponds to positions 26 and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It has serine and arginine at each position, or it has arginine at both positions corresponding to positions 67 and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:1. In this case, preferably the residue at the position corresponding to the 26th position is not isoleucine or valine, the residue at the position corresponding to the 67th position is preferably not glutamic acid or alanine, and the residue at the position corresponding to the 183rd position is preferably not Not lysine, serine or aspartic acid. More preferably, the parent MGLP has serine, arginine, and arginine at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, respectively.
該親ＭＧＬＰから本発明の変異体を製造する場合、好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンが、イソロイシン又はバリンに置換される。また好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアルギニンが、グルタミン酸又はアラニンに置換される。また好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアルギニンが、リシン、セリン又はアルパラギン酸に置換され、より好ましくはリシンに置換される。本発明によるＭＧＬＰ変異体の製造においては、上述した２６位、６７位及び１８３位に相当する位置における置換のうち、いずれか１種類の置換のみが行われてもよく、又はいずれか２種もしくは３種類の置換が組み合わせて行われてもよい。置換を組み合わせる場合、好ましくは２６位に相当する位置と、６７位又は１８３位に相当する位置のアミノ酸残基が置換され、より好ましくは、２６位、６７位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基が置換される。 When producing the mutant of the present invention from the parent MGLP, preferably serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine or valine. Also preferably, arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with glutamic acid or alanine. Also preferably, arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with lysine, serine, or aspartic acid, more preferably with lysine. In the production of MGLP mutants according to the present invention, only one type of substitution among the above-mentioned substitutions at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 may be performed, or any two or The three types of substitutions may be performed in combination. When a combination of substitutions is made, preferably the amino acid residue at the position corresponding to position 26 and the position corresponding to position 67 or 183 are substituted, and more preferably the amino acid residue at the position corresponding to position 26, 67 and 183 is substituted. Residues are replaced.
本発明はまた、ＭＧＬＰ変異体を提供する。本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列に対して、配列番号１のアミノ酸配列の２６位、６７位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列からなる、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該置換前の配列番号１のアミノ酸配列の２６位、６７位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれセリン、アルギニン、及びアルギニンである。 The invention also provides MGLP variants. The MGLP variant of the present invention is located at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 92% identity thereto. A polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, consisting of an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from the group consisting of amino acid residues is substituted with another amino acid residue. Preferably, the amino acid residues at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 before the substitution are serine, arginine, and arginine, respectively.
また本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ以下：
配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置における、セリン以外のアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン又はバリン；
配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置における、アルギニン以外のアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアラニン；及び
配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置における、アルギニン以外のアミノ酸残基、好ましくはリシン、セリン又はアルパラギン酸、より好ましくはリシン、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。
Moreover, the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the following:
An amino acid residue other than serine, preferably isoleucine or valine, at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
An amino acid residue other than arginine, preferably glutamic acid or alanine, at a position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and an amino acid residue other than arginine at a position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. , preferably lysine, serine or aspartic acid, more preferably lysine,
A polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, having at least one amino acid residue selected from the group consisting of:
一実施形態において、本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体において、該２６位に相当する位置のアミノ酸残基はイソロイシン又はバリンである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体における配列番号１のアミノ酸配列の６７位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基はいずれもアルギニンである。 In one embodiment, the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has a position other than serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, having the following amino acid residues. Preferably, in the MGLP variant, the amino acid residue at the position corresponding to position 26 is isoleucine or valine. Preferably, the amino acid residues at positions corresponding to positions 67 and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the MGLP variant are both arginine.
一実施形態において、本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体において、該６７位に相当する位置のアミノ酸残基はグルタミン酸又はアラニンである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体における配列番号１のアミノ酸配列の２６位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれセリン及びアルギニンである。 In one embodiment, the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and other than arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, having the following amino acid residues. Preferably, in the MGLP variant, the amino acid residue at the position corresponding to position 67 is glutamic acid or alanine. Preferably, the amino acid residues at positions corresponding to positions 26 and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the MGLP variant are serine and arginine, respectively.
一実施形態において、本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体において、該１８３位に相当する位置のアミノ酸残基はリシン、セリン又はアルパラギン酸であり、より好ましくはリシンである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体における配列番号１のアミノ酸配列の２６位及び６７位に相当する位置のアミノ酸残基は、それぞれセリン及びアルギニンである。 In one embodiment, the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has no arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, having the following amino acid residues. Preferably, in the MGLP variant, the amino acid residue at the position corresponding to position 183 is lysine, serine, or aspartic acid, more preferably lysine. Preferably, the amino acid residues at positions corresponding to positions 26 and 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the MGLP variant are serine and arginine, respectively.
あるいは、本発明のＭＧＬＰ変異体は、上述した２６位、６７位及び１８３位に相当する位置における変異を、いずれか２つ又は３つ組み合わせて有していてもよい。好ましい例として、上記２６位に相当する位置における変異と、上記６７位に相当する位置における変異との組み合わせ、上記２６位に相当する位置における変異と、上記１８３位に相当する位置における変異との組み合わせ、及び、上記２６位に相当する位置における変異と、上記６７位に相当する位置における変異と、上記１８３位に相当する位置における変異との組み合わせ、が挙げられる。 Alternatively, the MGLP mutant of the present invention may have any two or three mutations at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 described above in combination. Preferred examples include a combination of a mutation at the position corresponding to the 26th position and a mutation at the 67th position, a combination of a mutation at the 26th position, and a mutation at the 183rd position. and a combination of a mutation at the position corresponding to the 26th position, a mutation at the 67th position, and a mutation at the 183rd position.
従って、好ましい実施形態において、本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン又はバリンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアラニンを有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体における配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアミノ酸残基はアルギニンである。 Therefore, in a preferred embodiment, the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, with a serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. Monoacylglycerol lipase activity, which has an amino acid residue other than arginine, preferably isoleucine or valine, and has an amino acid residue other than arginine, preferably glutamic acid or alanine, at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is a polypeptide having the following. Preferably, the amino acid residue at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the MGLP variant is arginine.
別の好ましい実施形態において、本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン又はバリンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸残基、好ましくはリシン、セリン又はアルパラギン酸、好ましくはリシンを有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該ＭＧＬＰ変異体における配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアミノ酸残基はアルギニンである。 In another preferred embodiment, the MGLP variant of the invention consists of an amino acid sequence that has at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has a serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. an amino acid residue other than arginine, preferably isoleucine or valine, and an amino acid residue other than arginine, preferably lysine, serine or aspartic acid, preferably lysine, at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity. Preferably, the amino acid residue at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the MGLP variant is arginine.
さらに好ましい実施形態において、本発明のＭＧＬＰ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリン以外のアミノ酸残基、好ましくはイソロイシン又はバリンを有し、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸残基、好ましくはグルタミン酸又はアラニンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にアルギニン以外のアミノ酸残基、好ましくはリシン、セリン又はアルパラギン酸、より好ましくはリシンを有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである。 In a further preferred embodiment, the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the MGLP variant of the present invention consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: an amino acid residue, preferably isoleucine or valine, and an amino acid residue other than arginine, preferably glutamic acid or alanine, at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the amino acid of SEQ ID NO: 1 A polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, which has an amino acid residue other than arginine, preferably lysine, serine or aspartic acid, more preferably lysine, at a position corresponding to position 183 of the sequence.
本発明において、親ＭＧＬＰのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親ＭＧＬＰのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異遺伝子からタンパク質を発現させることにより、目的のＭＧＬＰ変異体を得ることができる。 In the present invention, various mutagenesis techniques known in the art can be used as means for mutating the amino acid residues of parent MGLP. For example, in a polynucleotide encoding the amino acid sequence of a parent MGLP (hereinafter also referred to as a parent gene), a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be mutated is mutated into a nucleotide sequence encoding an amino acid residue after the mutation, Furthermore, the desired MGLP mutant can be obtained by expressing a protein from the mutant gene.
親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。 Introduction of a desired mutation into a parent gene can basically be performed using various site-directed mutagenesis methods well known to those skilled in the art. The site-directed mutagenesis method can be performed by any method such as inverse PCR method or annealing method. Use a commercially available kit for site-directed mutagenesis (e.g., Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit, QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit, etc.) You can also.
親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。 Site-specific mutation introduction into a parent gene can most commonly be performed using a mutation primer containing the nucleotide mutation to be introduced. The mutation primer anneals to a region containing a nucleotide sequence encoding the amino acid residue to be mutated in the parent gene, and replaces the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated with the mutated amino acid. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding a residue. Those skilled in the art can appropriately recognize and select the nucleotide sequences (codons) encoding the amino acid residues before and after mutation based on standard textbooks. Alternatively, site-directed mutagenesis is performed by splicing by overlap extension (SOE), which amplifies DNA fragments on the upstream and downstream sides of the mutation site using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced, respectively. - A method of linking them together by PCR (Gene, 1989, 77(1): p61-68) can also be used.
親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したＥｓｔＧｔＡ２を産生するゲオバチルス・サーモデニトリフィカンスなどから、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親ＭＧＬＰのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。必要に応じて、親遺伝子は、後述するＭＧＬＰ変異体産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。コドン至適化された親遺伝子の例としては、バチルス属菌用にコドン至適された、配列番号２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチドが挙げられる。 Template DNA containing the parent gene is prepared by extracting genomic DNA from the above-mentioned EstGtA2-producing Geobacillus thermodenitrificans or the like by a conventional method, or by extracting RNA and synthesizing cDNA by reverse transcription. can do. Alternatively, a corresponding nucleotide sequence may be chemically synthesized based on the amino acid sequence of parent MGLP and used as a template DNA. If necessary, the parent gene may be codon-optimized according to the species of the transformant for producing the MGLP mutant described below. Information on codons used by various organisms is available from Codon Usage Database ([www.kazusa.or.jp/codon/]). An example of a codon-optimized parent gene includes a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, codon-optimized for Bacillus.
変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有するＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。 The mutation primer can be produced by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids R4esearch, 1989, 17:7059-7071). Such primer synthesis can also be carried out using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (manufactured by ABI, etc.). By performing site-directed mutagenesis as described above using a primer set containing the mutation primer and using the parent gene as a template DNA, a polynucleotide encoding an MGLP mutant having the desired mutation can be obtained. .
したがって、本発明はまた、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、ＭＧＬＰ変異体産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。 Accordingly, the invention also provides polynucleotides encoding the MGLP variants of the invention. The polynucleotide of the invention may include single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA or other artificial nucleic acids. The DNA, cDNA and RNA may be chemically synthesized. Furthermore, the polynucleotide of the present invention may include an untranslated region (UTR) nucleotide sequence in addition to the open reading frame (ORF). Furthermore, the polynucleotide of the present invention may be codon-optimized depending on the species of the transformant for producing the MGLP mutant.
本発明はまた、当該本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のＭＧＬＰ変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。 The invention also provides vectors containing polynucleotides encoding the MGLP variants of the invention. The vector can be constructed by inserting the polynucleotide of the present invention into any vector by a conventional method. The type of the vector is not particularly limited, and it may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, or shuttle vector. Further, the vector is preferably, but not limited to, a vector that can be amplified in bacteria, particularly bacteria of the genus Bacillus, and more preferably an expression vector that can induce expression of a transgene in bacteria of the genus Bacillus. . Among these, shuttle vectors, which are vectors that can be replicated in both Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the MGLP mutant of the present invention. Examples of preferred vectors include, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No. 3492935), pHY300PLK (an expression vector capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: Shuttle vectors such as pAC3 (Nucleic Acids Res, 1988, 16:8732); Examples include plasmid vectors that can be used to transform bacteria belonging to the genus Bacillus. Furthermore, plasmid vectors derived from E. coli (eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.) can also be used.
本発明のＭＧＬＰ変異体を組換え生産する場合、当該ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主生物における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。あるいは、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチドが、上記の有用な配列を含んでいてもよい。 When producing the MGLP mutant of the present invention recombinantly, the vector is preferably an expression vector. Expression vectors contain various elements essential for expression in host organisms such as transcription promoters, terminators, and ribosome binding sites; cis elements such as polylinkers and enhancers; polyA addition signals; ribosome binding sequences (SD sequences); and drugs (e.g. ampicillin). , neomycin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, etc.), a selection marker gene, such as a resistance gene, and the like, may optionally be included. Alternatively, polynucleotides encoding MGLP variants of the invention may include the useful sequences described above.
本発明はまた、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチド、又はそれを含有するベクターを宿主に導入することにより製造することができる。 The present invention also provides a transformant comprising a polynucleotide encoding the MGLP variant of the present invention or a vector containing the same. The transformant can be produced by introducing a polynucleotide encoding the MGLP variant of the present invention or a vector containing the same into a host.
当該形質転換体の宿主としては、枯草菌等のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）菌や、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）菌、酵母などが挙げられ、このうちバチルス属菌が好ましく、枯草菌又はその変異株がより好ましい。したがって、本発明の形質転換体は、好ましくは組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。枯草菌変異株としては、ａｐｒＸと、ａｐｒＥ、ｎｐｒＢ、ｎｐｒＥ、ｂｐｒ、ｖｐｒ、ｍｐｒ、ｅｐｒ及びｗｐｒＡから選択される遺伝子とを欠失した株（特開２００６－１７４７０７）などが挙げられる。 Examples of the host for the transformant include bacteria of the genus Bacillus such as Bacillus subtilis, bacteria of the genus Clostridium, and yeast. Among these, bacteria of the genus Bacillus are preferred, and Bacillus subtilis or its mutant strains are more preferred. preferable. Therefore, the transformant of the present invention is preferably a recombinant Bacillus bacterium, more preferably a recombinant Bacillus subtilis or a mutant strain thereof. Examples of Bacillus subtilis mutants include strains that have deleted aprX and a gene selected from aprE, nprB, nprE, bpr, vpr, mpr, epr, and wprA (Japanese Patent Laid-Open No. 2006-174707).
ポリヌクレオチドやベクターの宿主細胞への導入には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な方法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５－１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５－１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）などが挙げられる。 For introducing polynucleotides or vectors into host cells, well-known transformation techniques such as the calcium phosphate method, electroporation method, lipofection method, particle gun method, and PEG method can be applied. For example, methods applicable to Bacillus bacteria include competent cell transformation method (J Bacteriol, 1967, 93: 1925-1937), electroporation method (FEMS Microbiol Lett, 1990, 55: 135-138), protoplast Examples include the transformation method (Mol Gen Genet, 1979, 168: 111-115), the Tris-PEG method (J Bacteriol, 1983, 156: 1130-1134), and the like.
当該本発明の形質転換体を培養することにより、本発明のＭＧＬＰ変異体を製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いるＭＧＬＰ変異体の製造方法を提供する。ＭＧＬＰ変異体製造のための当該形質転換体の培養は、当該分野の一般的な方法に従って行うことができる。例えば、該形質転換体がバチルス属菌である場合、その培養のための培地は、バチルス属菌の生育に必要な炭素源、及び無機窒素源もしくは有機窒素源を含む。炭素源としては、例えばグルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖、メタノールなどが挙げられる。無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えばアンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが挙げられる。必要に応じて、該培地は、他の栄養素、例えば無機塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン等）などを含んでいてもよい。培養条件、例えば温度、通気撹拌条件、培地のｐＨ及び培養時間等は、微生物の種や形質、培養スケール等に応じて適宜選択され得る。 The MGLP mutant of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention. Therefore, the present invention also provides methods for producing MGLP mutants using the transformants of the present invention. Cultivation of the transformant for producing MGLP mutants can be carried out according to common methods in the art. For example, when the transformant is a bacterium of the genus Bacillus, the medium for culturing it contains a carbon source and an inorganic or organic nitrogen source necessary for the growth of the bacterium of the genus Bacillus. Examples of carbon sources include glucose, dextran, soluble starch, sucrose, and methanol. Examples of inorganic nitrogen sources or organic nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, amino acids, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, and potato extract. Optionally, the medium is supplemented with other nutrients such as inorganic salts (e.g., sodium chloride, calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, magnesium chloride), vitamins, antibiotics (e.g., tetracycline, neomycin, kanamycin, spectinomycin, etc.). Mycin, erythromycin, etc.) may also be included. Culture conditions, such as temperature, aeration and agitation conditions, pH of the medium, culture time, etc., can be appropriately selected depending on the species and characteristics of the microorganism, culture scale, etc.
あるいは、本発明のＭＧＬＰ変異体は、無細胞翻訳系を使用して、本発明のＭＧＬＰ変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。 Alternatively, the MGLP variants of the invention may be expressed from polynucleotides encoding the MGLP variants of the invention or transcripts thereof using cell-free translation systems. A "cell-free translation system" is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically disrupting host cells. It is composed of
当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明のＭＧＬＰ変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、細胞の破砕、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから取得することができる。 The MGLP mutant of the present invention produced by the transformant or cell-free translation system can be purified by conventional methods used for protein purification, such as cell disruption, centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, and ion exchange chromatography. By using chromatography, affinity chromatography, etc. alone or in appropriate combinations, it can be obtained from culture fluids, cell disruption fluids, reaction fluids of cell-free translation systems, and the like.
本発明のＭＧＬＰ変異体は、上述したアミノ酸残基の置換前のＭＧＬＰ（親ＭＧＬＰ）に対して、耐熱性が向上している。例えば、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の本発明のＭＧＬＰ変異体の残存活性は、好ましくは４０％以上であり、より好ましくは、親ＭＧＬＰの残存活性に比べて１１０％以上、より好ましくは１１５％以上である。本発明のＭＧＬＰ変異体は、より高温下でそのモノアシルグリセロールリパーゼ活性を維持することができるので、より高温条件下での酵素反応の効率を向上させる。特に、本発明のＭＧＬＰ変異体は、より高温下でのエステル化反応が望まれる高級脂肪酸エステル合成の効率を向上させる。 The MGLP mutant of the present invention has improved heat resistance compared to MGLP before the amino acid residue substitution described above (parent MGLP). For example, the residual activity of the MGLP mutant of the present invention after being heated at pH 6.0 and 70°C for 30 minutes is preferably 40% or more, more preferably 110% or more compared to the residual activity of the parent MGLP. , more preferably 115% or more. The MGLP variant of the present invention can maintain its monoacylglycerol lipase activity under higher temperature conditions, thus improving the efficiency of the enzymatic reaction under higher temperature conditions. In particular, the MGLP variant of the present invention improves the efficiency of higher fatty acid ester synthesis in which esterification reaction at higher temperatures is desired.
したがって、本発明の別の実施形態は、ＭＧＬＰの耐熱性向上方法である。例えば、当該方法は、上述した親ＭＧＬＰにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位、６７位及び１８３位に相当する位置のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む方法である。当該方法の詳細は、上述した本発明のＭＧＬＰ変異体の製造方法と同様である。 Therefore, another embodiment of the present invention is a method for improving heat resistance of MGLP. For example, in the parent MGLP described above, at least one amino acid residue selected from the group consisting of amino acid residues at positions corresponding to positions 26, 67, and 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is removed. This method involves substituting the amino acid residue of The details of the method are the same as the method for producing the MGLP mutant of the present invention described above.
本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。 The present invention also includes the following materials, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments. However, the present invention is not limited to these embodiments.
〔１〕配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ以下：
配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置における、セリン以外のアミノ酸残基；
配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置における、アルギニン以外のアミノ酸残基；及び
配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置における、アルギニン以外のアミノ酸残基、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。
〔２〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシン又はバリンを有する、〔１〕記載のポリペプチド。
〔３〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にグルタミン酸又はアラニンを有する、〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド。
〔４〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にリシン、セリン又はアルパラギン酸、より好ましくはリシンを有する、〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載のポリペプチド。
〔５〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシン又はバリンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にグルタミン酸又はアラニンを有し、
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にグルタミン酸を有する、
〔１〕記載のポリペプチド。
〔６〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシン又はバリンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にリシン、セリン又はアルパラギン酸を有し、
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にリシンを有する、
〔１〕記載のポリペプチド。
〔７〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシン又はバリンを有し、配列番号１の６７位に相当する位置にグルタミン酸又はアラニンを有し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置にリシン、セリン又はアルパラギン酸を有し、
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にイソロイシンを有し、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置にグルタミン酸を有し、かつ配列番号１の１８３位に相当する位置にリシンを有する、
〔１〕記載のポリペプチド。
〔８〕好ましくは、親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上しており、
より好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が４０％以上であり、
さらに好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が、親ポリペプチドに比べて１１０％以上である、
〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載のポリペプチド。
[1] Consists of an amino acid sequence having at least 92% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and the following:
Amino acid residue other than serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
An amino acid residue other than arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and an amino acid residue other than arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
A polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, having at least one amino acid residue selected from the group consisting of:
[2] The polypeptide according to [1], preferably having isoleucine or valine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[3] The polypeptide according to [1] or [2], which preferably has glutamic acid or alanine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[4] The polypeptide according to any one of [1] to [3], preferably having lysine, serine or aspartic acid, more preferably lysine, at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. .
[5] Preferably, it has isoleucine or valine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has glutamic acid or alanine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
More preferably, it has isoleucine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has glutamic acid at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[1] The polypeptide described in [1].
[6] Preferably, it has isoleucine or valine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and lysine, serine, or aspartic acid at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. death,
More preferably, it has isoleucine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has lysine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
[1] The polypeptide described in [1].
[7] Preferably has isoleucine or valine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, has glutamic acid or alanine at the position corresponding to position 67 of SEQ ID NO: 1, and has Having lysine, serine or aspartic acid at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence,
More preferably, it has isoleucine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, has glutamic acid at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has at position 183 of SEQ ID NO: 1. having lysine in the corresponding position,
[1] The polypeptide described in [1].
[8] Preferably, the polypeptide has improved heat resistance compared to the parent polypeptide,
More preferably, the residual activity after heating at pH 6.0 and 70°C for 30 minutes is 40% or more,
More preferably, the residual activity after heating at pH 6.0 and 70°C for 30 minutes is 110% or more compared to the parent polypeptide.
The polypeptide according to any one of [1] to [7].
〔９〕〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
〔１０〕〔９〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔１１〕〔９〕記載のポリヌクレオチド又は〔１０〕記載のベクターを含有する形質転換体。
〔１２〕好ましくはバチルス属菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である、〔１１〕記載の形質転換体。
〔１３〕〔１１〕又は〔１２〕記載の形質転換体を培養することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドの製造方法。
[9] A polynucleotide encoding the polypeptide according to any one of [1] to [8].
[10] A vector containing the polynucleotide described in [9].
[11] A transformant containing the polynucleotide according to [9] or the vector according to [10].
[12] The transformant according to [11], which is preferably a Bacillus bacterium, more preferably Bacillus subtilis or a mutant strain thereof.
[13] A method for producing a polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, which comprises culturing the transformant according to [11] or [12].
〔１４〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９２％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリン、６７位に相当する位置のアルギニン、及び１８３位に相当する位置のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を他のアミノ酸残基に置換することを含む、モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有する変異ポリペプチドの製造方法。
〔１５〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシン又はバリンに置換することを含む、〔１４〕に記載の方法。
〔１６〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアルギニンをグルタミン酸又はアラニンに置換することを含む、〔１４〕又は〔１５〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアルギニンをリシン、セリン又はアルパラギン酸に置換することを含む、〔１４〕～〔１６〕のいずれか１項記載の方法。
〔１８〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシン又はバリンに置換し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアルギニンをグルタミン酸又はアラニンに置換することを含み、
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシンに置換し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアルギニンをグルタミン酸に置換することを含む、
〔１４〕記載の方法。
〔１９〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシン又はバリンに置換し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアルギニンをリシン、セリン又はアルパラギン酸に置換することを含み、
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシンに置換し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアルギニンをリシンに置換することを含む、
〔１４〕記載の方法。
〔２０〕好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシン又はバリンに置換し、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアルギニンをグルタミン酸又はアラニンに置換し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアルギニンをリシン、セリン又はアルパラギン酸に置換することを含み、
より好ましくは、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリンをイソロイシンに置換し、配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置のアルギニンをグルタミン酸に置換し、かつ配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置のアルギニンをリシンに置換することを含む、
〔１４〕記載の方法。
〔２１〕前記変異ポリペプチドが、
好ましくは、親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上しており、
より好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が４０％以上であり、
さらに好ましくは、ｐＨ６．０、７０℃で３０分間加熱された後の残存活性が、親ポリペプチドに比べて１１０％以上である、
〔１４〕～〔２０〕のいずれか１項記載の方法。
[14] In a polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 92% identity thereto and having monoacylglycerol lipase activity, a position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 A monoacylglycerol comprising substituting at least one amino acid residue selected from the group consisting of serine, arginine at the position corresponding to position 67, and arginine at the position corresponding to position 183 with another amino acid residue. A method for producing a mutant polypeptide having lipase activity.
[15] The method according to [14], which preferably includes substituting serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with isoleucine or valine.
[16] The method according to [14] or [15], which preferably comprises substituting arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with glutamic acid or alanine.
[17] The method according to any one of [14] to [16], which preferably comprises substituting arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with lysine, serine, or aspartic acid. .
[18] Preferably, serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine or valine, and arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid or alanine. including replacing;
More preferably, the method includes substituting serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with isoleucine, and substituting arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with glutamic acid.
[14] The method described.
[19] Preferably, serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine or valine, and arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with lysine, serine, or including substitution with aspartic acid,
More preferably, the method includes substituting serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with isoleucine, and substituting arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with lysine.
[14] The method described.
[20] Preferably, serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine or valine, and arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid or alanine. and substituting arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with lysine, serine or aspartic acid,
More preferably, serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with isoleucine, arginine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is replaced with glutamic acid, and SEQ ID NO: 1 including substituting arginine at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of
[14] The method described.
[21] The mutant polypeptide is
Preferably, the polypeptide has improved heat resistance compared to the parent polypeptide,
More preferably, the residual activity after heating at pH 6.0 and 70°C for 30 minutes is 40% or more,
More preferably, the residual activity after heating at pH 6.0 and 70°C for 30 minutes is 110% or more compared to the parent polypeptide.
The method according to any one of [14] to [20].
以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, the present invention will be explained in more detail using Examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these Examples.
以下の実施例において、ＰＣＲはＰｒｉｍｅＳＴＡＲ Ｍａｘ Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用して行った。Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（タカラバイオ）を使用して行った。宿主微生物へのプラスミドの導入は、プロトプラスト法（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）にて行った。タンパク質生産のための組換え微生物の培養には、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）、又は２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン４－５水和物）を用いた。表１に、以下の実施例で使用したプライマーの名称とヌクレオチド配列を示す。 In the following examples, PCR was performed using PrimeSTAR Max Premix (Takara Bio). The In-fusion method was performed using the In-Fusion HD Cloning Kit (Takara Bio). The plasmid was introduced into the host microorganism by the protoplast method (Mol. Gen. Genet, 1979, 168:111-115). For culturing recombinant microorganisms for protein production, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) or 2x L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% % NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm manganese sulfate tetra-pentahydrate). Table 1 shows the names and nucleotide sequences of the primers used in the following examples.
実施例１ ＭＧＬＰ変異体発現組換え枯草菌株の作製
（１）プラスミドｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２の構築
モノアシルグリセロールリパーゼＥｓｔＧｔＡ２（配列番号１）をコードする、枯草菌用にコドン至適化した遺伝子（配列番号２）をプラスミドｐＵＣ５７に挿入したプラスミド（ＥｓｔＧｔＡ２－ｐＵＣ５７）を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社の人工遺伝子合成サービスを利用して作製した。作製したプラスミドを鋳型とし、プライマーＥｓｔＧｔＡ２－Ｆ及びプライマーＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ（配列番号３及び４）を用いてＰＣＲを行った。同様に、ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーｐＨＹ－Ｓ２３７－Ｆ及びｐＨＹ－Ｓ２３７－Ｒ（配列番号５及び６）を使用してＰＣＲ反応を行った。それぞれのＰＣＲ産物をＤｐｎＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）にてＤｐｎＩ処理を行った。得られた両断片を適量混合し、Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法を用いてプラスミド（ｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２）を合成した。
Example 1 Preparation of recombinant Bacillus subtilis strain expressing MGLP mutant (1) Construction of plasmid pHY-EstGtA2 Codon-optimized gene for Bacillus subtilis (SEQ ID NO: 2) encoding monoacylglycerol lipase EstGtA2 (SEQ ID NO: 1) ) was inserted into plasmid pUC57 to create a plasmid (EstGtA2-pUC57) using GenScript's artificial gene synthesis service. PCR was performed using the prepared plasmid as a template and primer EstGtA2-F and primer EstGtA2-R (SEQ ID NOs: 3 and 4). Similarly, a PCR reaction was performed using plasmid pHY-S237 described in Example 7 of WO2006/068148A1 as a template and primers pHY-S237-F and pHY-S237-R (SEQ ID NOs: 5 and 6). Each PCR product was treated with DpnI (New England Biolabs). Appropriate amounts of both obtained fragments were mixed and a plasmid (pHY-EstGtA2) was synthesized using the in-fusion method.
（２）プラスミドｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２の抽出
（１）で得られたＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を用いて、ＥＣＯＳTM Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（ニッポンジーン、３１０－０６２３６）を形質転換した。形質転換処理した細胞をアンピシリンを含有するＬＢプレートに塗抹し、３７℃で一晩培養した。プレート上に形成したコロニーをアンピシリンを含むＬＢ培地に植菌して、一晩培養した後、菌体を回収し、Ｈｉｇｈ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用してプラスミドｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２を抽出した。
(2) Extraction of plasmid pHY-EstGtA2 Using the In-Fusion reaction solution obtained in (1), ECOS ™ Competent E. E. coli DH5α (Nippon Gene, 310-06236) was transformed. The transformed cells were spread on an LB plate containing ampicillin and cultured at 37°C overnight. Colonies formed on the plates were inoculated into LB medium containing ampicillin and cultured overnight, then the bacterial cells were collected and plasmid pHY-EstGtA2 was extracted using High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche).
（３）ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ発現組換え枯草菌株の作製
（２）で得られたｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２を鋳型として、変異用プライマーＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｆ及びＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ（配列番号７及び８）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩにて処理した。得られた断片をプロトプラスト形質転換法にてプロテアーゼ遺伝子９重欠失枯草菌株（Ｋａｏ９株；プロテアーゼ遺伝子aprE、nprB、nprE、bpr、vpr、mpr、epr、wprA及びaprXが欠失した株、特開２００６－１７４７０７）に導入し、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉを発現する組換え枯草菌株を得た。
(3) Preparation of EstGtA2-S26I-expressing recombinant Bacillus subtilis strain Using pHY-EstGtA2 obtained in (2) as a template, mutation primers EstGtA2-S26I-F and EstGtA2-S26I-R (SEQ ID NO: 7 and 8) were used. PCR was performed. The PCR product was treated with DpnI. The obtained fragment was transformed into a Bacillus subtilis strain with nine protease genes deleted (Kao9 strain; a strain with deleted protease genes aprE, nprB, nprE, bpr, vpr, mpr, epr, wprA and aprX, JP 2006-174707) to obtain a recombinant Bacillus subtilis strain expressing EstGtA2-S26I.
（４）他のＭＧＬＰ変異体発現組換え枯草菌株の作製
（３）と同様の手順で、変異用プライマーとして表１記載の変異用プライマーを用いて、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｖ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ６７Ｅ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ６７Ａ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ１８３Ｋ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ１８３Ｓ、及びＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ１８３Ｄを発現する組換え枯草菌株を取得した。
(4) Preparation of recombinant Bacillus subtilis strains expressing other MGLP mutants In the same manner as in (3), EstGtA2-S26V, EstGtA2-R67E, EstGtA2-R67A were used as mutation primers listed in Table 1. , EstGtA2-R183K, EstGtA2-R183S, and EstGtA2-R183D were obtained.
（５）ＭＧＬＰ多重変異体発現組換え枯草菌株の作製
（３）で得られたＤｐｎＩ処理断片を用いて、（２）と同様の手順で、プラスミドｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉを抽出した。該ｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉを鋳型として、（４）と同様の手順で、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ６７Ｅ、及びＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ１８３Ｋを発現する組換え枯草菌株を取得した。その際に作製したＤｐｎＩ処理断片を用いて、（２）と同様の手順で、プラスミドｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ６７Ｅを抽出した。該ｐＨＹ－ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ６７Ｅを鋳型として、（４）と同様の手順で、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ６７Ｅ－Ｒ１８３Ｋを発現する組換え枯草菌株を取得した。
(5) Preparation of recombinant Bacillus subtilis strain expressing MGLP multiple mutants Using the DpnI-treated fragment obtained in (3), plasmid pHY-EstGtA2-S26I was extracted in the same manner as in (2). Using the pHY-EstGtA2-S26I as a template, recombinant Bacillus subtilis strains expressing EstGtA2-S26I-R67E and EstGtA2-S26I-R183K were obtained in the same manner as in (4). Using the DpnI-treated fragment prepared at that time, plasmid pHY-EstGtA2-S26I-R67E was extracted in the same manner as in (2). Using the pHY-EstGtA2-S26I-R67E as a template, a recombinant Bacillus subtilis strain expressing EstGtA2-S26I-R67E-R183K was obtained in the same manner as in (4).
実施例２ ＭＧＬＰ変異体の製造
実施例１で得られた菌株を３ｍＬ／大試験管（１８×１８０ｍｍ）のＬＢ培地で１５時間、３０℃、２５０ｒｐｍで振盪培養した。得られた培養液０．０２ｍＬを２０ｍＬ／５００ｍＬ容ヒダ付三角フラスコ（バイオット）の２×Ｌ－マルトース培地に接種し、３７℃で３日間、２１０ｒｐｍで振盪培養した。培養後、遠心分離（８０００ｒｐｍ×３０分間）後の上清をフィルター（０．４５μｍ、ＰＶＤＦ、メルクミリポア製）でろ過して菌体を除いた。培養液上清をビバスピン２０（分画分子量５Ｋ、ザルトリウス）にて濃縮後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）を加え、再びビバスピン２０を用いて濃縮した。上記の作業を３～５回繰り返すことにより培養上清を緩衝液へと置換し、これを酵素溶液として用いた。
Example 2 Production of MGLP mutants The strain obtained in Example 1 was cultured in 3 mL/large test tube (18 x 180 mm) of LB medium for 15 hours at 30°C with shaking at 250 rpm. 0.02 mL of the obtained culture solution was inoculated into 2×L-maltose medium in a 20 mL/500 mL pleated Erlenmeyer flask (Biot), and cultured with shaking at 210 rpm at 37° C. for 3 days. After culturing, the supernatant after centrifugation (8000 rpm x 30 minutes) was filtered with a filter (0.45 μm, PVDF, manufactured by Merck Millipore) to remove bacterial cells. The culture supernatant was concentrated using Vivaspin 20 (molecular weight cutoff 5K, Sartorius), 50 mM phosphate buffer (pH 6.0) was added, and the mixture was concentrated again using Vivaspin 20. The above procedure was repeated 3 to 5 times to replace the culture supernatant with a buffer solution, which was used as an enzyme solution.
実施例３ ＭＧＬＰ変異体の耐熱性
実施例２で得られた酵素溶液を用いて、ＭＧＬＰ変異体の耐熱性を調べた。実施例２で得た酵素溶液には、ＭＧＬＰ変異体と、枯草菌宿主（Ｋａｏ９株）が本来生産するリパーゼとが混在するため、先ず、枯草菌宿主由来のリパーゼを加熱により前処理することにより不活化した。具体的には、酵素溶液１００μＬをＰＣＲチューブに分注後、ＰｒｏＦｌｅｘTM ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて６０℃で１０分間前処理して、枯草菌宿主由来のリパーゼを不活化し、前処理サンプルを得た。該前処理サンプル５０μＬをＰＣＲチューブに分注し、ＰｒｏＦｌｅｘTM ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いて７０℃、７５℃又は８０℃、ｐＨ６．０で３０分間熱処理し、熱処理サンプルを得た。得られた前処理サンプルと熱処理サンプルそれぞれのリパーゼ活性測定を行い、前処理サンプルの活性を１００％とした場合の熱処理サンプルの活性（残存活性）を算出した。同様の手順で、ＭＧＬＰ変異体の親ＭＧＬＰ（配列番号１のＥｓｔＧｔＡ２）の残存活性を算出した。各リパーゼ活性測定は、以下の手順で行った。
Example 3 Heat resistance of MGLP mutants Using the enzyme solution obtained in Example 2, the heat resistance of MGLP mutants was investigated. Since the enzyme solution obtained in Example 2 contains a mixture of the MGLP mutant and the lipase originally produced by the Bacillus subtilis host (Kao 9 strain), first, the lipase derived from the Bacillus subtilis host was pretreated by heating. Inactivated. Specifically, after dispensing 100 μL of the enzyme solution into a PCR tube, it was pretreated at 60°C for 10 minutes using the ProFlex ™ PCR System (Thermo) to inactivate the lipase derived from the Bacillus subtilis host, and the pretreated sample I got it. 50 μL of the pretreated sample was dispensed into a PCR tube and heat-treated at 70° C., 75° C., or 80° C. and pH 6.0 for 30 minutes using ProFlex ™ PCR System (Thermo) to obtain a heat-treated sample. The lipase activity of each of the obtained pretreated sample and heat-treated sample was measured, and the activity (residual activity) of the heat-treated sample was calculated when the activity of the pretreated sample was taken as 100%. Using the same procedure, the residual activity of the parent MGLP (EstGtA2 of SEQ ID NO: 1) of the MGLP mutant was calculated. Each lipase activity measurement was performed according to the following procedure.
（リパーゼ活性測定方法）
適宜希釈した培養上清５μＬを９６穴アッセイプレート（ＩＷＡＫＩ）の各ウェルに分注した。各ウェルに、さらに脱イオン水１８３μＬ、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）１０μＬ、及び基質溶液２μＬを分注し、反応を開始した。基質溶液には、４－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ ｏｃｔａｎｏａｔｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）を１００ｍＭ含むジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液を用いた。４０℃にて１５分間反応させ、反応液の４０５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて測定した。１Ｕは４０℃で１分間に１μｍｏｌのｐＮＰを遊離する酵素量と定義した。
(Lipase activity measurement method)
5 μL of the appropriately diluted culture supernatant was dispensed into each well of a 96-well assay plate (IWAKI). Further, 183 μL of deionized water, 10 μL of 1M Tris-HCl (pH 8.0), and 2 μL of substrate solution were dispensed into each well to start the reaction. A dimethyl sulfoxide (DMSO) solution containing 100 mM of 4-Nitrophenyl octanoate (SIGMA-ALDRICH) was used as the substrate solution. The reaction was carried out at 40° C. for 15 minutes, and the absorbance of the reaction solution at 405 nm was measured using a microplate reader (TECAN). 1 U was defined as the amount of enzyme that releases 1 μmol of pNP per minute at 40°C.
各ＭＧＬＰ変異体の残存活性を図１～４に示す。図１は、ＥｓｔＧｔＡ２、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ、及びＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｖの７５℃（ｐＨ６．０）、３０分後の残存活性を示す。図２、３は、ＥｓｔＧｔＡ２、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ６７Ｅ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ６７Ａ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ１８３Ｋ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ１８３Ｓ、及びＥｓｔＧｔＡ２－Ｒ１８３Ｄの７０℃（ｐＨ６．０）、３０分後の残存活性を示す。いずれのＭＧＬＰ変異体も、親ＭＧＬＰ（野生型ＥｓｔＧｔＡ２）と比較して耐熱性が向上していた。図４は、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ６７Ｅ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ１８３Ｋ、ＥｓｔＧｔＡ２－Ｓ２６Ｉ－Ｒ６７Ｅ－Ｒ１８３Ｋの８０℃（ｐＨ６．０）、３０分後の残存活性を示す。ＭＧＬＰ多重変異体では、単変異体と比較してさらに耐熱性が向上した。 The residual activity of each MGLP mutant is shown in Figures 1-4. FIG. 1 shows the residual activities of EstGtA2, EstGtA2-S26I, and EstGtA2-S26V after 30 minutes at 75°C (pH 6.0). Figures 2 and 3 show the residual activity of EstGtA2, EstGtA2-R67E, EstGtA2-R67A, EstGtA2-R183K, EstGtA2-R183S, and EstGtA2-R183D after 30 minutes at 70°C (pH 6.0). All MGLP mutants had improved thermostability compared to the parent MGLP (wild type EstGtA2). FIG. 4 shows the residual activity of EstGtA2-S26I, EstGtA2-S26I-R67E, EstGtA2-S26I-R183K, and EstGtA2-S26I-R67E-R183K after 30 minutes at 80°C (pH 6.0). The thermostability of the MGLP multiple mutant was further improved compared to the single mutant.
Claims (7)
該ポリペプチドは、親ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、以下：
配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置におけるイソロイシン又はバリン；
配列番号１のアミノ酸配列の６７位に相当する位置におけるグルタミン酸又はアラニン；及び
配列番号１のアミノ酸配列の１８３位に相当する位置におけるリシン、セリン又はアスパラギン酸、
からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列からなり、
該親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上しており、
該親ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列、又は当該配列と少なくとも９２％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリン、６７位に相当する位置にアルギニン、及び１８３位に相当する位置にアルギニンを有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドである、
モノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチド。 A polypeptide having monoacylglycerol lipase activity,
The polypeptide has, relative to the amino acid sequence of the parent polypeptide, the following:
Isoleucine or valine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1;
Glutamic acid or alanine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; and lysine, serine or aspartic acid at the position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1,
consisting of an amino acid sequence having at least one amino acid residue selected from the group consisting of;
It has improved heat resistance compared to the parent polypeptide ,
The parent polypeptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or at least 92% identity with the sequence, and has serine at the position corresponding to position 26 and serine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having arginine and arginine at a position corresponding to position 183, and having monoacylglycerol lipase activity.
A polypeptide having monoacylglycerol lipase activity.
該方法は、親ポリペプチドにおいて、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置のセリン、６７位に相当する位置のアルギニン、及び１８３位に相当する位置のアルギニンからなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を、以下のアミノ酸残基：
２６位に相当する位置のセリンの場合；イソロイシン又はバリン、
６７位に相当する位置のアルギニンの場合；グルタミン酸又はアラニン、
１８３位に相当する位置のアルギニンの場合；リシン、セリン又はアスパラギン酸、
に置換することを含み、
該親ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列、又は当該配列と少なくとも９２％の同一性を有し、配列番号１のアミノ酸配列の２６位に相当する位置にセリン、６７位に相当する位置にアルギニン、及び１８３位に相当する位置にアルギニンを有するアミノ酸配列からなり、かつモノアシルグリセロールリパーゼ活性を有するポリペプチドであり、
該変異ポリペプチドは、該親ポリペプチドと比べて耐熱性が向上している、
方法。 A method for producing a mutant polypeptide having monoacylglycerol lipase activity, the method comprising:
The method includes selecting a serine at a position corresponding to position 26, an arginine at a position corresponding to position 67, and an arginine at a position corresponding to position 183 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in the parent polypeptide. At least one amino acid residue of the following amino acid residues:
In the case of serine at the position corresponding to position 26; isoleucine or valine,
In the case of arginine at the position corresponding to position 67; glutamic acid or alanine,
In the case of arginine at the position corresponding to position 183; lysine, serine or aspartic acid,
including replacing
The parent polypeptide has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or at least 92% identity with the sequence, and has serine at the position corresponding to position 26 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and serine at the position corresponding to position 67 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. A polypeptide consisting of an amino acid sequence having arginine and arginine at a position corresponding to position 183, and having monoacylglycerol lipase activity,
The mutant polypeptide has improved heat resistance compared to the parent polypeptide.
Method.
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| Mol. Biotechnol.，2016年，Vol.58，p.37-46 |
| PLOS ONE，2013年，Vol.8，e76675 |
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