JP4736085B2 - Host microorganism - Google Patents
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Description
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる宿主微生物、組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。 The present invention relates to a host microorganism, a recombinant microorganism, and a method for producing a protein or polypeptide used for producing a useful protein or polypeptide.
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬品、洗浄剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, pharmaceuticals, detergents, daily necessaries such as cosmetics to various chemical raw materials.
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっている。さらに、近年のゲノム解析技術の急速な発展を受けて、対象とする微生物のゲノム情報を解読し、これらを積極的に産業に応用しようとする試みもなされている。ゲノム情報の公開されている産業的に有用な宿主微生物としては、枯草菌Bacillus subtilis Marburg No.168（非特許文献１）、大腸菌Escherichia coli K-12 MG1655（非特許文献２）、コリネバクテリウムCorynebacterium glutamicum ATCC132032などが挙げられ、これらのゲノム情報を利用し、改良を加えた菌株が開発されている。しかしながら、上記のような取り組みにも関わらず、生産効率は必ずしも満足できるものではなかった。
本発明は、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性が向上する微生物を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a microorganism capable of improving the productivity of a target protein or polypeptide.
本発明者らは、バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）由来の配列番号１記載の塩基配列からなる遺伝子を導入することにより、その宿主微生物の目的タンパク質又は目的ポリペプチドの生産性を向上させることができることを見出した。 The present inventors have introduced a target protein or target polypeptide of a host microorganism by introducing a gene consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 1 derived from Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376). It has been found that productivity can be improved.
すなわち、本発明は、以下の（a）若しくは（b）のDNAからなる遺伝子又はこれらに相当する遺伝子が染色体中に導入されてなるか、又はプラスミド上に含んでなることを特徴とする宿主微生物を提供するものである。
（a）配列番号１で示される塩基配列からなるDNA、
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
That is, the present invention provides a host microorganism characterized in that a gene comprising the following DNA (a) or (b) or a gene corresponding thereto is introduced into a chromosome or contained on a plasmid: Is to provide.
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
また、本発明は、上記宿主微生物に、異種のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物を提供するものである。 The present invention also provides a recombinant microorganism in which a gene encoding a heterologous protein or polypeptide is introduced into the host microorganism.
さらに、本発明は、上記組換え微生物を用いるタンパク質又はポリペプチドの製造方法を提供するものである。 Furthermore, the present invention provides a method for producing a protein or polypeptide using the above recombinant microorganism.
本発明の宿主微生物は、目的タンパク質又はポリペプチド生産性が向上されており、これを用いて目的タンパク質又はポリペプチドの生産を行えば、当該物質の生産に必要な時間やコストを削減することができ有用である。 The host microorganism of the present invention has improved productivity of the target protein or polypeptide, and production of the target protein or polypeptide using this can reduce the time and cost required for the production of the substance. Can be useful.
この明細書においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。またこの明細書において該方法により配列同一性を算出するにあたり、文献（生物化学実験法４６ ホールゲノムショットガン法によるゲノム解析とアノテーション, 2001年6月8日初版, 著者 小笠原直毅 他, pp232, ISBN 4-7622-2974-1）に示される一般的な基準を採用し、それぞれの配列は６０％以上の領域にわたって比較した。 In this specification, the identity of amino acid sequences and nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985). Specifically, it is calculated by performing an analysis with a unit size to compare (ktup) of 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development). In this specification, in order to calculate sequence identity by this method, the literature (Biochemical Experiments 46 Genome Analysis and Annotation by Whole Genome Shotgun Method, June 8, 2001, first edition, author Naoki Ogasawara et al., Pp232, ISBN The general criterion shown in 4-7622-2974-1) was adopted, and each sequence was compared over 60% of the region.
本発明の宿主微生物は、以下の（a）若しくは（b）のDNAからなる遺伝子又はこれらに相当する遺伝子が染色体中に導入されてなるか、又はプラスミド上に含んでなるものである。
（a）配列番号１で示される塩基配列からなるDNA、
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
The host microorganism of the present invention is one in which a gene consisting of the following DNA (a) or (b) or a gene corresponding thereto is introduced into a chromosome or is contained on a plasmid.
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子（以下orf1遺伝子ともいう）は、本発明者らが、それまで未知であったバチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）のゲノムの塩基配列を解析した際に、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードすることが推定されるDNAとして見出されたものであり、また、後記実施例３に示すとおり、一定のプロモーター制御下におくことで、タンパク質の分泌生産が向上したという実験結果から、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質を実際にコードすることが確かめられたものである。そして、かかるタンパク質と、既知のタンパク質との同一性は、そのアミノ酸配列と最も高い配列同一性を示すものでも、36.2％であった（実施例４）。 The gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 (hereinafter also referred to as orf1 gene) is the genome of Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376), which was previously unknown by the present inventors. Was found as DNA presumed to encode a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and, as shown in Example 3 below, From the experimental result that protein secretion production was improved under the control of a promoter, it was confirmed that the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 was actually encoded. And the identity of this protein and a known protein was 36.2% even if it showed the highest sequence identity with its amino acid sequence (Example 4).
これらの遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の（１）〜（４）に示す遺伝子が含まれる。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価な活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件下」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
The genes corresponding to these genes include the genes shown in the following (1) to (4).
(1) A protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA encoding a protein having a functionally equivalent activity.
(2) consisting of DNA that hybridizes with a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and encodes a protein functionally equivalent to a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 gene. Here, examples of “stringent conditions” include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press]. For example, probe into a solution containing 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA In addition, there is a condition in which the temperature is kept constant at 65 ° C. for 8 to 16 hours for hybridization.
(3) A protein comprising an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A gene consisting of DNA that encodes a functionally equivalent protein.
(4) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, it consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and is functionally equivalent to a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2. A gene consisting of DNA that codes for various proteins. Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several, preferably 1 to 10 amino acids are missing in the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. A deleted, substituted or added amino acid sequence is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
そして、このような遺伝子としては、自然に生じる変換体の他、変異剤またはPCRを利用したランダム変異、特定部位変異誘発、エンドヌクレアーゼ若しくは制限酵素などによるDNA断片の変異、欠失、連結等の人為的手段によって構築されるものであってもよい。 Such genes include naturally occurring converters, mutations or random mutation using PCR, site-directed mutagenesis, DNA fragment mutation, deletion, ligation, etc. by endonuclease or restriction enzyme, etc. It may be constructed by artificial means.
ちなみに、配列番号２で示されるアミノ酸配列と最大の配列同一性を示したアミノ酸配列は、バチルス ハロデュランス（Bacillus halodurans）のprsA遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列である（実施例４）。バチルス ハロデュランス（Bacillus halodurans）のprsA遺伝子がコードするアミノ酸配列を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列の同一性から、枯草菌（Bacillus subtilis）のPrsAと同様の機能を有することが予測されている。しかしながら、実験的な機能解析はなされておらず、その機能は実証されていない。ここで、PrsAは、枯草菌においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質として発見され、これまでの研究から、PrsAは、細胞膜を通過して細胞質外に輸送された後のタンパク質の折りたたみを容易にするシャペロン様の機能を有することが推測されている。この枯草菌のPrsAと類似の機能を有することが実験により確認された枯草菌以外の微生物由来のタンパク質としては、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）由来のPrsAA（配列番号１０）、PrsAB（配列番号１１）、及びPrsAC（配列番号１２）が知られている（ウィリアムス（Williams）ら、J. Biol. Chem. 278, 18056-18062 (2003)）。そして、後記実施例で示すとおり、枯草菌のPrsAと、これらのタンパク質とのアミノ酸配列における同一性は、順に46.2％、38.3％、40.3％であった。これに対し、枯草菌PrsAと配列番号２で示されるアミノ酸配列の同一性は28.4％を示すにすぎなかった。枯草菌PrsAに対して、これよりも高い同一性を示すタンパク質として、ラクトコッカス ラクチスのPrtMタンパク質（Haandikman，A.J.et al, (1989) J.Bacteriol.,171:2789-2794; Vos,P., et al., (1989) J. Bacteriol., 171:2795-2802）が知られている（PrtMはPrsAと約３０％の同一性を示す（特表平８−５０７２０７））。そして、このPrtMタンパク質の機能は、セリンプロテアーゼの成熟を助けるタンパク質であり、機能はPrsAとは異なることが知られている（特表平８−５０７２０７）。このことから、配列番号２で示されるアミノ酸配列も、枯草菌PrsAとは異なる機能を有することが考えられる。
また、後記実施例で示すとおり、当該アミノ酸配列が枯草菌PrsAのアミノ酸配列に対して示す同一性と同程度にオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）のPrsA（当該微生物において枯草菌PrsAと同様の機能を有すると予測されているタンパク質）への同一性（20.4％）を示すタンパク質（Orf2）を発現するように改変した枯草菌では、配列番号２のアミノ酸配列が示す様な目的タンパク質生産性向上効果は見られなかった。このことから、当該アミノ酸配列により奏されるタンパク質生産性向上効果は、PrsAとしての機能に由来するものではない可能性が疑われる。
Incidentally, the amino acid sequence having the maximum sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence presumed to be encoded by the Bacillus halodurans prsA gene (Example 4). A protein having an amino acid sequence encoded by the prsA gene of Bacillus halodurans is predicted to have a function similar to that of PrsA of Bacillus subtilis because of the identity of the amino acid sequence. However, experimental functional analysis has not been made and its function has not been demonstrated. Here, PrsA was discovered as a protein involved in the protein secretion process in Bacillus subtilis, and previous studies have shown that PrsA facilitates protein folding after being transported out of the cytoplasm across the cell membrane It is presumed to have a chaperone-like function. Examples of proteins derived from microorganisms other than Bacillus subtilis that have been confirmed by experiments to have a function similar to that of PrsA of Bacillus subtilis include PrsAA (SEQ ID NO: 10) and PrsAB (SEQ ID NO: 11) derived from Bacillus anthracis. And PrsAC (SEQ ID NO: 12) are known (Williams et al., J. Biol. Chem. 278, 18056-18062 (2003)). And as shown in the Example below, the identity of Bacillus subtilis PrsA and these proteins in amino acid sequences were 46.2%, 38.3%, and 40.3% in this order. In contrast, the identity of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 with Bacillus subtilis PrsA was only 28.4%. As a protein showing higher identity to Bacillus subtilis PrsA, the PrtM protein of Lactococcus lactis (Haandikman, AJ et al, (1989) J. Bacteriol., 171: 2789-2794; Vos, P., et al., (1989) J. Bacteriol., 171: 2795-2802) (PrtM shows about 30% identity with PrsA (Japanese Patent Publication No. 8-507207)). The function of this PrtM protein is a protein that helps maturation of serine protease, and the function is known to be different from that of PrsA (Japanese Translation of PCT International Publication No. 8-507207). From this, it is considered that the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 also has a function different from that of Bacillus subtilis PrsA.
In addition, as shown in Examples below, the same amino acid sequence as that of the amino acid sequence of Bacillus subtilis PrsA has the same function as that of Oceanobacillus iheyensis PrsA (the same function as Bacillus subtilis PrsA in the microorganism). B. subtilis modified to express a protein (Orf2) exhibiting identity (20.4%) to the protein predicted to have a target protein productivity improving effect of the target protein as shown by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 Was not seen. From this, it is suspected that the protein productivity improving effect exhibited by the amino acid sequence is not derived from the function as PrsA.
かような遺伝子の取得は、例えばバチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）の染色体DNAから以下のようにして行うことができる。すなわち、上記の菌体から、例えばマーマーの方法[Marmur, J., J. Mol. Biol., 3, 208(1961)] や斉藤と三浦の方法[Saito, H. and Miura, K., Biochim. Biophys. Acta, 72, 619(1963)]により染色体DNAを得られるが、他の類似の方法を用いることもできる。得られた染色体DNAと適当なプライマーとを用いてPCR法［Mullis, K. B. and Faloona, F. A., Methods Enzymol., 155, 335(1987)；Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487(1988)］によるDNA増幅法により上記遺伝子を取得できる。斯かるPCR法の採用に際して使用されるプライマーは、本発明によって明らかにされた遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、常法に従って合成することができる。尚、増幅させたDNA断片の単離精製は、例えばゲル電気泳動法等により行うことができる。 Such a gene can be obtained, for example, from the chromosomal DNA of Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) as follows. That is, from the cells described above, for example, the method of Marmer [Marmur, J., J. Mol. Biol., 3, 208 (1961)] and the method of Saito and Miura [Saito, H. and Miura, K., Biochim Biophys. Acta, 72, 619 (1963)] provides chromosomal DNA, but other similar methods can be used. PCR using the obtained chromosomal DNA and appropriate primers [Mullis, KB and Faloona, FA, Methods Enzymol., 155, 335 (1987); Saiki, RK et al., Science, 239, 487 (1988) The above gene can be obtained by a DNA amplification method. Primers used for adopting such a PCR method can be appropriately set based on the gene sequence information revealed by the present invention, and can be synthesized according to a conventional method. The amplified DNA fragment can be isolated and purified by, for example, gel electrophoresis.
なお、増幅されたDNA断片は、例えばDNAリガーゼによってベクターへ結合させる方法等により必要に応じてクローニングすることができ、TOPO PCR Cloning Kit（Invirogen）等の市販のクローニングキットを用いてクローニングしてもよい。クローニングされたDNA断片の塩基配列の確認は、蛍光プライマーを用いるジデオキシ法により行うことができ、簡便には、市販のシークエンスキット等を用いてその塩基配列を決定すればよい。 The amplified DNA fragment can be cloned as necessary by, for example, a method of binding to a vector with DNA ligase or the like, and can be cloned using a commercially available cloning kit such as TOPO PCR Cloning Kit (Invirogen). Good. Confirmation of the base sequence of the cloned DNA fragment can be performed by the dideoxy method using a fluorescent primer. For convenience, the base sequence may be determined using a commercially available sequence kit or the like.
以上に述べた遺伝子に宿主微生物において機能するプロモーター、及び宿主微生物が有する適切な塩基配列を適切に付加してなるＤＮＡ断片を構築し、この断片で微生物を形質転換し、微生物中において相同組換えをおこすことにより、当該遺伝子が染色体上に導入された宿主微生物を製造することができる。ここで、上記ＤＮＡ断片は、公知のＳＯＥ−ＰＣＲ法などを応用することにより作製することができる。以下、より具体的にSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される導入用DNA断片を用いた二重交差法によって前述の遺伝子の一例であるorf1遺伝子を導入する方法について説明するが、本発明に於ける遺伝子導入方法は下記に限定されるものではない。 A DNA fragment is constructed by appropriately adding a promoter that functions in the host microorganism to the gene described above and an appropriate base sequence possessed by the host microorganism, transforming the microorganism with this fragment, and homologous recombination in the microorganism. By performing the above, a host microorganism into which the gene is introduced onto the chromosome can be produced. Here, the DNA fragment can be prepared by applying a known SOE-PCR method or the like. More specifically, the orf1 gene, which is an example of the aforementioned gene, by the double crossover method using the DNA fragment for introduction prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989) However, the gene introduction method in the present invention is not limited to the following.
本方法で用いる導入用DNA断片は、amyE遺伝子などの宿主微生物が有する遺伝子の上流側約0.5〜3、好ましくは0.5〜1kb断片と、同じく下流側約0.5〜3、好ましくは0.5〜1kb断片の間に、宿主微生物において機能するプロモーター断片、orf1遺伝子断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片を順に挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、プロモーター断片、orf1遺伝子断片及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、プロモーター断片の下流末端にorf1遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端にはorf1遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。 The introduction DNA fragment used in this method is about 0.5-3 kb, preferably 0.5-1 kb upstream of the gene of the host microorganism such as amyE gene, and about 0.5-3 kb, preferably 0.5-1 kb frag- ment on the downstream side. A fragment in which a promoter fragment that functions in a host microorganism, an orf1 gene fragment, and a drug resistance marker gene fragment are inserted in this order. First, three fragments of a promoter fragment, an orf1 gene fragment and a drug resistance marker gene fragment are prepared by the first PCR. In this case, for example, at the downstream end of the promoter fragment, an upstream 10-30 base pair sequence of the orf1 gene A primer designed to add a 10-30 base pair sequence downstream of the orf1 gene to the upstream end of the drug resistance marker gene fragment is used (FIG. 1).
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、プロモーター断片の上流側プライマーと薬剤耐性マーカー遺伝子断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行う。これにより、プロモーター断片の下流末端に付加したorf1遺伝子配列に於いて、orf1遺伝子断片とのアニールが生じ、また、薬剤耐性マーカー遺伝子断片の上流末端に付加したorf1遺伝子配列に於いて、orf1遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、プロモーター断片と薬剤耐性マーカー遺伝子断片との間にorf1遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。 Next, the second PCR is performed using the three types of PCR fragments prepared in the first round as templates and using the upstream primer of the promoter fragment and the downstream primer of the drug resistance marker gene fragment. As a result, the orf1 gene sequence added to the downstream end of the promoter fragment annealed with the orf1 gene fragment, and the orf1 gene fragment added to the upstream end of the drug resistance marker gene fragment. As a result of PCR amplification, a DNA fragment in which the orf1 gene is inserted between the promoter fragment and the drug resistance marker gene fragment can be obtained (FIG. 1).
一方、3回目のPCRによって、宿主微生物遺伝子の上流側断片及び下流側断片の2断片を調製するが、この際、例えば、上流側断片の下流末端にプロモーター断片の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流側断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。 On the other hand, by the third PCR, two fragments of the upstream fragment and the downstream fragment of the host microbial gene are prepared. At this time, for example, at the downstream end of the upstream fragment, the upstream 10-30 base pair sequence of the promoter fragment On the contrary, a primer designed so that a 10-30 base pair sequence downstream of the drug resistance marker gene is added to the upstream end of the downstream fragment is used (FIG. 1).
次いで、2回目によって調製されたPCR断片と、3回目に調製された2種類のPCR断片とを鋳型とし、宿主微生物遺伝子上流側断片の上流側プライマーと下流側断片の下流側プライマーを用いて４回目のPCRを行う。これにより、宿主微生物遺伝子上流側断片の下流末端に付加したプロモーター断片の配列において、プロモーター断片とのアニールが生じ、また下流側断片の上流末端に付加したマーカー遺伝子配列に於いて、マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、宿主微生物遺伝子の上流側断片と下流側断片との間に、2回目のPCRによって調製したPCR断片を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。 Next, using the PCR fragment prepared in the second round and the two kinds of PCR fragments prepared in the third round as templates, using the upstream primer of the host microorganism gene upstream fragment and the downstream primer of the downstream fragment, 4 Perform the second PCR. As a result, in the sequence of the promoter fragment added to the downstream end of the host microorganism gene upstream fragment, annealing with the promoter fragment occurs, and in the marker gene sequence added to the upstream end of the downstream fragment, the marker gene fragment and As a result of PCR amplification, a DNA fragment in which the PCR fragment prepared by the second PCR is inserted between the upstream fragment and the downstream fragment of the host microorganism gene can be obtained (FIG. 1).
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、上記遺伝子の導入用DNA断片が得られる。 When using a chloramphenicol resistance gene as a drug resistance marker gene, for example, using the primer set shown in Table 1, using a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), etc. Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) etc. can get.
かくして得られた導入用DNA断片を、公知の方法によって細胞内に導入すると、同一性のある宿主微生物遺伝子の相同領域において、細胞内での遺伝子組換えが生じ、orf1遺伝子が宿主微生物遺伝子中に挿入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる（図１）。即ち、表１に示したプライマーセットを用いて調製したDNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによって前記amyE遺伝子部位等のゲノム上の目的部位に上記導入用DNA断片が導入されていることを確認すれば良い。具体的に導入用DNA断片を細胞内に導入する方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。 When the DNA fragment for introduction thus obtained is introduced into a cell by a known method, genetic recombination occurs in the cell in the homologous region of the identical host microbial gene, and the orf1 gene is incorporated into the host microbial gene. Inserted cells can be separated by selection with drug resistance markers (FIG. 1). That is, when a DNA fragment prepared using the primer set shown in Table 1 is introduced, colonies that grow on an agar medium containing chloramphenicol are isolated, and the amyE gene is obtained by PCR or the like using the genome as a template. What is necessary is just to confirm that the said DNA fragment for introduction | transduction is introduce | transduced into the target site | parts on the genome, such as a site | part. Specifically, as a method for introducing a DNA fragment for introduction into a cell, a competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979)) or electroporation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)), etc., and competent cell transformation method is particularly preferred.
ここで、宿主微生物として利用される微生物としては、特に限定されず、野生型のものでも変異を施したものでものよいが、遺伝子を挿入する為の適当な遺伝子、例えば前述のamyE遺伝子等を有する微生物が好ましい。具体的には、枯草菌（Bacillus subtilis）などのバチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム（Clostridium）属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましく、バチルス（Bacillus）属細菌としては、公知の枯草菌（Bacillus subtilis）168株なる株が好ましい。 Here, the microorganism used as the host microorganism is not particularly limited and may be a wild type or a mutant. However, an appropriate gene for inserting a gene, such as the amyE gene described above, may be used. The microorganism which has is preferable. Specifically, Bacillus (Bacillus) bacteria or Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Clostridium (Clostridium) bacteria, or yeast, and among them B. (Bacillus) bacteria are preferred, Bacillus (Bacillus) genus As the bacterium, a known strain of Bacillus subtilis 168 is preferable.
また、前述の（a）若しくは（b）のDNAからなる遺伝子又はこれらに相当する遺伝子を、pUB110（Plasmid, 15, 93, 1986）やpTP5（Gene, 24, 255, 1983）の様な適当なベクターに導入して発現用の組換えベクターを構築し、このベクターで前述のような微生物を形質転換することにより、プラスミド上に当該遺伝子を含んでなる宿主微生物を作ることができる。ここで用いられる適当なベクターとしては、宿主菌中で複製可能であり、組み込んだ当該遺伝子を安定に保持できるものであれば、いかなるものも使用することができる。また、ベクターに導入する遺伝子としては、宿主微生物において機能するプロモーター遺伝子断片をその上流に結合してなる遺伝子が好ましい。 In addition, a gene consisting of the DNA of (a) or (b) described above or a gene corresponding thereto is used as appropriate, such as pUB110 (Plasmid, 15, 93, 1986) or pTP5 (Gene, 24, 255, 1983). A host microorganism comprising the gene on a plasmid can be produced by introducing the vector into a vector and constructing a recombinant vector for expression, and transforming the microorganism as described above with this vector. Any suitable vector can be used as long as it can be replicated in a host bacterium and can stably retain the incorporated gene. Further, as a gene to be introduced into the vector, a gene obtained by binding a promoter gene fragment that functions in the host microorganism upstream thereof is preferable.
かようにして作製された宿主微生物に、目的とするタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子をコンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の公知の方法により導入することによって本発明の組換え微生物を得ることができる。 By introducing a gene encoding the target protein or polypeptide into the host microorganism thus prepared by a known method such as a competent cell transformation method, a protoplast transformation method, or an electroporation method. The recombinant microorganism of the present invention can be obtained.
目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子は特に限定されず、食品用、医薬品用、化粧品用、洗浄剤用、繊維処理用、医療検査薬用等として有用な酵素や生理活性因子等のタンパク質やポリペプチドが挙げられ、洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが含まれるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素 (Oxidoreductase) 、転移酵素 (Transferase) 、加水分解酵素 (Hydrolase) 、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素 (Isomerase) 、合成酵素 (Ligase/Synthetase) 等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素の遺伝子が挙げられる。具体的には、α-アミラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼが挙げられる。バチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス(Bacillus)属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science,227,1435,1985)によって計算される。また、セルラーゼの具体例としては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。プロテアーゼの具体例としては、微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。 The target protein or target polypeptide gene is not particularly limited, and examples thereof include proteins and polypeptides such as enzymes and physiologically active factors that are useful for foods, pharmaceuticals, cosmetics, detergents, fiber treatments, medical tests, etc. And various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, and diagnostics, and bioactive peptides. Industrial enzymes are preferred. In addition, industrial enzymes are classified according to their functions: oxidoreductase, transferase, hydrolase, lyase, isomerase, and synthase (Ligase / Synthetase). ) And the like, and preferred examples include genes for hydrolases such as cellulase, α-amylase, and protease. Specific examples include α-amylase. Among them, α-amylase derived from microorganisms, preferably derived from bacteria belonging to the genus Bacillus , more preferably derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946). Amylase is mentioned. As a more specific example of α-amylase derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946), an alkali derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 Examples include amylase and amylase having an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more with the amino acid sequence. The amino acid sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985). Specific examples of cellulases include cellulases belonging to family 5 in the classification of polysaccharide hydrolases (Biochem. J., 280, 309 (1991)). Among them, microorganisms, especially bacteria belonging to the genus Bacillus. Derived cellulase. Specific examples of proteases include serine proteases, metal proteases, and the like derived from microorganisms, particularly from bacteria belonging to the genus Bacillus .
また、目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる３領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス(Bacillus)属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的タンパク質又は目的ポリペプチド遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス(Bacillus)属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子と当該セルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌用シグナルペプチド領域が目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号５で示される塩基配列の塩基番号1〜659の塩基配列、または、配列番号７で示される塩基配列の塩基番号1〜696の塩基配列、或いは当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、あるいは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失、置換、もしくは付加した塩基配列からなるDNA断片が、目的タンパク質又は目的ポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは付加した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部が欠失、置換、若しくは複数個の塩基配列が付加されているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。 In addition, the target protein or polypeptide gene includes a control region related to transcription, translation, and secretion of the gene upstream, that is, a transcription initiation control region including a promoter and a transcription initiation site, a translation including a ribosome binding site and an initiation codon. It is desirable that one or more regions selected from the initiation region and the secretory signal peptide region are bound in a proper form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are linked, and the secretion signal peptide region is derived from a cellulase gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus , It is desirable that the start region and the translation start region are 0.6-1 kb region upstream of the cellulase gene and appropriately bound to the target protein or polypeptide gene. For example, Bacillus (Bacillus) bacteria as described in 2000-210081 and JP 4-190793 Patent Publication JP, i.e. KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM -64 strain (FERM BP- It is desirable that the cellulase gene derived from 2886) and the transcription initiation regulatory region, translation initiation region, and secretory signal peptide region of the cellulase gene are appropriately combined with the structural gene of the target protein or polypeptide. More specifically, the base sequence of base numbers 1 to 659 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 5, the base sequence of base numbers 1 to 696 of the base sequence shown by SEQ ID NO: 7, or the base sequence 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, particularly preferably 98% or more of a DNA fragment comprising a nucleotide sequence having identity or any of the above nucleotide sequences It is desirable that a DNA fragment consisting of a base sequence partially deleted, substituted, or added is appropriately linked to the structural gene of the target protein or polypeptide. Here, a DNA fragment consisting of a base sequence in which a part of the base sequence is deleted, substituted, or added is a part of the base sequence deleted, substituted, or added with a plurality of base sequences. However, it means a DNA fragment that retains functions related to gene transcription, translation, and secretion.
上記の目的タンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、コンピテントセル形質転換方法、プロトプラスト形質転換法、或いはエレクトロポレーション法等の一般的な形質転換法によって宿主微生物細胞に取り込ませることによって、導入することができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても導入することができる。 General transformation such as competent cell transformation method, protoplast transformation method, or electroporation method using a recombinant plasmid in which a DNA fragment containing the target protein or polypeptide gene is combined with an appropriate plasmid vector. It can be introduced by incorporating it into a host microbial cell by the method. Alternatively, the DNA fragment can be introduced by directly integrating it into the host microorganism genome using a DNA fragment obtained by binding an appropriate homologous region with the host microorganism genome.
本発明の組換え微生物を用いれば有用なタンパク質又はポリペプチドを効率的に生産することができる。本発明の組換え微生物を用いた目的タンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。 If the recombinant microorganism of the present invention is used, a useful protein or polypeptide can be efficiently produced. In producing the target protein or polypeptide using the recombinant microorganism of the present invention, the strain is inoculated into a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source, and other essential components, and cultured by a normal microorganism culture method. After completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified.
実施例１ バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）のゲノムの塩基配列決定
好アルカリ性バチルス属細菌バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16（FERM BP-3376）株を染色体DNA調製に使用した。染色体DNAのライブラリー構築に使用する宿主菌には、大腸菌（Escherichia coli）DH5α（タカラバイオ）を使用した。
The sequencing alkalophilic Bacillus genomic bacteria Bacillus clausii (Bacillus clausii) KSM-K16 ( FERM BP-3376) strain of Example 1 Bacillus clausii (Bacillus clausii) were used in the chromosomal DNA preparation. Escherichia coli DH5α (Takara Bio) was used as the host bacterium used for constructing the chromosomal DNA library.
（ホールゲノムショットガンライブラリーの作製）
バチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）を、10%炭酸ナトリウムでpH8.5に調整したTSB培地（BD BBL Trypticase Soy BrothTM ;BD Diagnostic Systems）100mL中で30℃において培養した。対数増殖期の菌体から、斉藤と三浦（Saito & Miura）の方法（フェノール法；サイトウ（Saito）ら、 Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)）により染色体DNAを得た。
20μgの染色体DNA（100ng/μL）を超音波破砕により断片化した。断片化DNAは、30℃、5分間のBAL31ヌクレアーゼ（タカラバイオ）処理により、突出末端を平滑化した後、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製した。次にDNA Blunting Kit（タカラバイオ）でT4 DNAポリメラーゼ処理後、フェノール・クロロホルム処理とエタノール沈殿により精製した。続いて、精製DNA断片のアガロース電気泳動を行い、1-2kbの画分をQiaquick Gel Extraction Kit（QIAGEN）を用いて回収した。
(Preparation of whole genome shotgun library)
Cultured at 30 ° C. in; (BD Diagnostic Systems BD BBL Trypticase Soy Broth TM) in 100mL Bacillus clausii (Bacillus clausii) KSM-K16 strain (FERM BP-3376), 10 % TSB medium was adjusted to pH8.5 with sodium carbonate did. Chromosomal DNA was obtained from the cells in the logarithmic growth phase by the method of Saito & Miura (phenol method; Saito et al., Biochem. Biophys. Acta. 72, 619-629 (1963)).
20 μg of chromosomal DNA (100 ng / μL) was fragmented by sonication. The fragmented DNA was purified by treatment with BAL31 nuclease (Takara Bio) for 5 minutes at 30 ° C., and then purified by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation. Next, after treatment with T4 DNA polymerase with DNA Blunting Kit (Takara Bio), purification was performed by phenol / chloroform treatment and ethanol precipitation. Subsequently, the purified DNA fragment was subjected to agarose electrophoresis, and a 1-2 kb fraction was collected using a Qiaquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
このDNA画分と等量のベクターpUC18/SmaI/BAP（Amersham Pharmacia Biotech）を１：１の比率で混合し、DNA Ligation Kit Ver.1（タカラバイオ）を用いて、16℃で一晩、ライゲーションを行った。その後、このDNAにてコンピテントセル大腸菌E.coli DH5αを形質転換した。形質転換体は、100μg/mLのアンピシリン含むＬＢ寒天培地に塗布し、30℃で一晩培養した。この方法により、約1x106クローン／μgベクターの形質転換効率のホールゲノムショットガンライブラリーを作製した。 This DNA fraction and an equal amount of vector pUC18 / Sma I / BAP (Amersham Pharmacia Biotech) were mixed at a ratio of 1: 1, and DNA Ligation Kit Ver.1 (Takara Bio) was used overnight at 16 ° C. Ligation was performed. Thereafter, competent cell E. coli E. coli DH5α was transformed with this DNA. The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / mL ampicillin and cultured at 30 ° C. overnight. By this method, a whole genome shotgun library having a transformation efficiency of about 1 × 10 6 clones / μg vector was prepared.
（ショットガンシーケンシング用鋳型DNAの増幅）
ショットガンクローンは、100μg/mLのアンピシリン含むLB液体培地を用いて、37℃で18時間培養した。この培養液を鋳型として、インサートDNAをTaKaRa Ex TaqTM（タカラバイオ）を用いたPCRにより増幅した。このPCRには、ベクターの塩基配列より設計したプライマーLF（5'-CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG-3'）（配列番号３７）とLR（5'-CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3'）（配列番号３８）を使用した。
(Amplification of template DNA for shotgun sequencing)
The shotgun clone was cultured at 37 ° C. for 18 hours using an LB liquid medium containing 100 μg / mL ampicillin. Using this culture solution as a template, insert DNA was amplified by PCR using TaKaRa Ex Taq ™ (Takara Bio). For this PCR, primers LF (5'-CAAGGCGATTAAGTTGGGTAACG-3 ') (SEQ ID NO: 37) and LR (5'-CTTCCGGCTCGTATGTTGTGTG-3') (SEQ ID NO: 38) designed from the base sequence of the vector were used.
（鋳型DNAの精製）
PCR産物に残存する未反応のプライマーを、exonuclease I（Amersham Pharmacia Biotech）により分解し、その分解物をshrimp alkaline phosphatase（Amersham Pharmacia Biotech）により脱リン酸化することでPCR産物の精製を行った。
(Purification of template DNA)
Unreacted primers remaining in the PCR product were digested with exonuclease I (Amersham Pharmacia Biotech), and the degradation product was dephosphorylated with shrimp alkaline phosphatase (Amersham Pharmacia Biotech) to purify the PCR product.
（ショットガンクローンのシーケンシング）
ショットガンクローンのシーケンシングは、インサートDNAの精製PCR産物を鋳型とし、LFまたはLRをプライマーとして、DYEnamic ET terminator（Amersham Pharmacia Biotech）を使用して行った。反応産物は、エタノール沈殿により精製後、キャピラリー型DNAシーケンサーを用いてシーケンシングを行った。
(Sequencing of shotgun clones)
Shotgun clones were sequenced using the DYEnamic ET terminator (Amersham Pharmacia Biotech) using the purified PCR product of the insert DNA as a template and LF or LR as a primer. The reaction product was purified by ethanol precipitation and then sequenced using a capillary DNA sequencer.
（アセンブル（配列結合編集））
32,214個のショットガンクローンより得た配列データは、大型アセンブルソフトPhred/Phrap（エウィング（Ewing）ら、Genome Res. 8, 186-194 (1998)）を使用してアセンブルした。その結果、コンティグの総塩基長は約4.19Mbpとなり、コンティグ数は472個であった。これら塩基長の総和は推定されるゲノムサイズの99％に達した。
(Assemble (array join editing))
Sequence data obtained from 32,214 shotgun clones were assembled using the large assembly software Phred / Phrap (Ewing et al., Genome Res. 8, 186-194 (1998)). As a result, the total base length of the contig was about 4.19 Mbp, and the number of contigs was 472. The sum of these base lengths reached 99% of the estimated genome size.
実施例２ orf1遺伝子発現枯草菌の構築
実施例１にて得られたバチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）のゲノム塩基配列情報より、配列番号１に示す塩基配列はタンパク質をコードする遺伝子領域であると考えられた。該遺伝子領域orf1について、以下の様にorf1にコードされるタンパク質を発現する様に改変した枯草菌（Bacillus subtilis）の構築を行った（図１参照）。枯草菌（Bacillus subtilis）168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したPVG-FWとPVG-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子のプロモーター領域とShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）を含む0.2kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。またバチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したorf1/PVG-Fとorf1/Cm-Rのプライマーセットを用いてorf1を含む1.0kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。更にプラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）を鋳型として、表１に示したcatfとcatrのプライマーセットを用いてクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む0.85kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とcatr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVGプロモーター及びSD配列がorf1の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にorf1の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した2.1kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌（Bacillus subtilis）168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Cm2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5’側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3’側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVGプロモーター及びSD配列の下流にorf1遺伝子が連結し、更にその下流にクロラムフェニコール耐性遺伝子が結合した2.1kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.0kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.0kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌（Bacillus subtilis）168株を形質転換し、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示すamyEfw2とorf1/Cm-R、及びorf1/PVG-FとamyErv2のプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.2kb及び2.9kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌（Bacillus subtilis）168株ゲノム上のamyE遺伝子部位にspoVGプロモーター及びSD配列の下流にorf1が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株を168PVGorf1株と命名した。
Example 2 Construction of orf1 gene-expressing Bacillus subtilis Based on the genomic nucleotide sequence information of Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) obtained in Example 1, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 is a protein. It was considered to be a gene region encoding. For the gene region orf1, a Bacillus subtilis modified so as to express the protein encoded by orf1 was constructed as follows (see FIG. 1). Using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain as a template and using the PVG-FW and PVG-R primer sets shown in Table 1, the promoter region of the spoVG gene and the Shine-Dalgarno (SD) sequence (Proc A 0.2 kb fragment (A) containing Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)) was amplified by PCR. In addition, using genomic DNA extracted from Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) as a template, orf1 / PVG-F and orf1 / Cm-R primer sets shown in Table 1 were used for orf1 The containing 1.0 kb fragment (B) was amplified by PCR. Furthermore, using plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)) as a template and the catf and catr primer sets shown in Table 1, a 0.85 kb fragment containing the chloramphenicol resistance gene (C) Was amplified by PCR. Next, the 3 fragments obtained by mixing the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments as a template and performing SOE-PCR using the PVG-FW2 and catr2 primer sets shown in Table 1 were obtained. (A), (B) and (C) are combined in order, and the spoVG promoter and SD sequence are linked upstream of orf1 (linked so that the start codon of orf1 is located at the position of the start codon of the spoVG gene) Further, a 2.1 kb DNA fragment (D) having a chloramphenicol resistance gene bound thereto was obtained downstream thereof. Subsequently Bacillus subtilis (Bacillus subtilis) extracted genomic DNA from 168 strain as a template, the amyE gene using amyEfw2 and amyE / PVG2-R, and primer set of amyE / Cm2-F and amyErv2 shown in Table 1 5 A 1.0 kb fragment (E) containing the 'side region and a 1.0 kb fragment (F) containing the 3' side region of the amyE gene were amplified by PCR. Next, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 1 was performed to obtain the 3 fragments (E ) (D) (binding was as made in the order of F), spoVG promoter and orf1 gene ligated downstream of the SD sequence, further DNA fragments of 2.1kb chloramphenicol resistance gene linked to the downstream amyE gene A DNA fragment (G) having a total base length of 4.0 kb inserted in the center of was obtained. The resulting 4.0 kb DNA fragment (G) was used to transform Bacillus subtilis 168 strain by competent cell method and grown on an LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL). Colonies were isolated as transformants. Using genomic DNA extracted from the obtained transformant as a template, PCR was performed using the primer sets of amyEfw2 and orf1 / Cm-R and orf1 / PVG-F and amyErv2 shown in Table 1 to obtain 2.2 kb and 2.9 The amplification of the kb DNA fragment was confirmed, and it was confirmed that the DNA fragment with the spoVG promoter and orf1 linked downstream of the SD sequence was inserted into the amyE gene site on the Bacillus subtilis 168 genome. The strain thus obtained was named 168PVGorf1 strain.
実施例３ orf1遺伝子発現枯草菌（Bacillus subtilis）のアルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例２にて得られた168PVGorf1株の異種タンパク質生産性評価は配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるバチルス（Bacillus）属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
Example 3 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production of Bacillus subtilis Expressing Orf1 Gene The heterologous protein productivity evaluation of 168PVGorf1 strain obtained in Example 2 was performed in the genus Bacillus comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4. The production was carried out as follows using the productivity of bacterial alkaline amylase as an index.
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号３で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（I）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表１に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子のプロモーター領域と分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。 Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template, using the primer set of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 1 PCR is performed to amplify a 1.5 kb DNA fragment (H) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 encoding alkaline amylase (JP 2000-184882, Eur. J. Biochem., 268, 2974, 2001) did. Using the genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, the S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) primer sets shown in Table 1 were used. PCR was performed to amplify a 0.6 kb DNA fragment (I) containing the promoter region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081) and the region encoding the secretory signal sequence. Next, the obtained 2 fragments of (H) (I) are mixed to form a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets shown in Table 1 is performed. Thus, a 2.1 kb DNA fragment (J) in which the alkaline amylase gene was linked downstream of the promoter region of the alkaline cellulase gene and the region encoding the secretory signal sequence was obtained. The obtained 2.2 kb DNA fragment (J) was inserted into the Bam HI- Xba I restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).
実施例２にて得られた168PVGorf1株及び対照として枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で5日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表２に示した様に、宿主として168PVGorf1株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。これはorf1によりコードされるタンパク質が枯草菌内にて発現し、該タンパク質の機能がアルカリアミラーゼの生産に好ましい影響を与えた為であると推測された。 A plasmid pHYK38 (S237ps) for evaluating alkaline amylase productivity was introduced into the 168PVGorf1 strain obtained in Example 2 and the Bacillus subtilis 168 strain as a control by the protoplast transformation method. The resulting strain was shaken and cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture solution was added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% Maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline), and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 days. After culturing, the alkaline amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of alkaline amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 2, when the 168PVGorf1 strain was used as the host, a higher secretory production of alkaline amylase was observed compared to the control 168 strain (wild type). This was presumed to be because the protein encoded by orf1 was expressed in Bacillus subtilis, and the function of the protein had a favorable influence on the production of alkaline amylase.
実施例４ orf1がコードするタンパク質の機能予測
orf1がコードするタンパク質の機能を予測するため、配列番号１に示す塩基配列から推定されるアミノ酸配列（配列番号２）について、タンパク質データベース（nr（http://www.ncbi.nih.gov/））に対してホモロジー検索プログラムBLAST（アルチュール（Altschul）ら、J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)参照）を用いて、ホモロジー検索を行った。その結果orf1がコードすると推定されるアミノ酸配列は、バチルス ハロデュランス（Bacillus halodurans）のprsA遺伝子がコードすると推定される配列番号９で示されるアミノ酸配列と最も高い配列同一性を示した。この配列は、アミノ酸配列の同一性から、枯草菌（Bacillus subtilis）のPrsAと同様の機能を有することが予測されてはいるものの、機能解析はなされておらず、その機能は不明である。遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて上記2つのアミノ酸配列の同一性を解析したところ、同一性は36.2%と計算された。尚、PrsAは元来、枯草菌（Bacillus subtilis）においてタンパク質の分泌過程に関与するタンパク質として発見されたものである。これまでに枯草菌（Bacillus subtilis）のPrsAと類似の機能を有することが実験により確認された枯草菌（Bacillus subtilis）以外の微生物由来のタンパク質としては、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）由来のPrsAA（配列番号１０）、PrsAB（配列番号１１）、及びPrsAC（配列番号１２）が報告されている（ウィリアムス（Williams）ら、 J. Biol. Chem. 278, 18056-18062 (2003)）。しかしながら、上記バチルス ハロデュランス（Bacillus halodurans）を含め、他の微生物にてPrsAをコードするとされている遺伝子は、いずれも塩基配列より推定されるアミノ酸配列から機能予測されたものである。配列番号１３で示される枯草菌のPrsAに対するバチルス アントラシス（Bacillus anthracis）のPrsAA、PrsAB、及びPrsACのアミノ酸配列同一性はそれぞれ46.2％、38.3％、及び40.3％であった。一方、枯草菌（Bacillus subtilis）のPrsAに対するorf1がコードすると考えられるアミノ酸配列の同一性は28.4％と低く、また推定されるアミノ酸配列の等電点において、枯草菌のPrsAは9.18、orf1遺伝子がコードすると推定されるアミノ酸配列は3.48と大きく異なることから、当該アミノ酸配列を有するタンパク質の機能が枯草菌のPrsAと類似であるとは断定できず、orf1遺伝子は新規の遺伝子であると考えられた。尚、上記等電点は、文献（Trends in analytical chemistry, vol.5, No.4, 1986）記載の方法によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）の等電点解析（Isoelectric Point）プログラムを用いて、pKa valueをpKaとして解析を行うことにより算出される。
Example 4 Function prediction of protein encoded by orf1
In order to predict the function of the protein encoded by orf1, the protein database (nr (http://www.ncbi.nih.gov/)) is used for the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) deduced from the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1. ) Using a homology search program BLAST (see Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). As a result, the amino acid sequence presumed to be encoded by orf1 showed the highest sequence identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 presumed to be encoded by the prsA gene of Bacillus halodurans . Although this sequence is predicted to have a function similar to that of PrsA of Bacillus subtilis from the identity of the amino acid sequence, the function analysis has not been performed and the function is unknown. The identity of the two amino acid sequences was analyzed using the homology analysis (Search homology) program of genetic information software Genetyx-Win (software development), and the identity was calculated to be 36.2%. PrsA was originally discovered as a protein involved in the protein secretion process in Bacillus subtilis . Proteins derived from microorganisms other than Bacillus subtilis that have been confirmed by experiments to have similar functions to Bacillus subtilis PrsA so far include PrsAA derived from Bacillus anthracis (sequence) No. 10), PrsAB (SEQ ID NO: 11), and PrsAC (SEQ ID NO: 12) have been reported (Williams et al., J. Biol. Chem. 278, 18056-18062 (2003)). However, all of the genes that are supposed to encode PrsA in other microorganisms, including the Bacillus halodurans described above, have been predicted to function from the amino acid sequence deduced from the base sequence. The amino acid sequence identities of PrsAA, PrsAB, and PrsAC of Bacillus anthracis against PrsA of Bacillus subtilis represented by SEQ ID NO: 13 were 46.2%, 38.3%, and 40.3%, respectively. On the other hand, the identity of the amino acid sequence considered to be encoded by orf1 to PrsA of Bacillus subtilis is as low as 28.4%, and at the isoelectric point of the deduced amino acid sequence, PrsA of Bacillus subtilis is 9.18, Since the amino acid sequence estimated to be encoded differs greatly from 3.48, it was not possible to conclude that the function of the protein having the amino acid sequence is similar to PrsA of Bacillus subtilis, and the orf1 gene was thought to be a novel gene . The isoelectric point is calculated by the method described in the literature (Trends in analytical chemistry, vol. 5, No. 4, 1986). Specifically, it is calculated by performing an analysis using pKa value as pKa using an isoelectric point analysis program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
参考例 orf2遺伝子発現枯草菌のアルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例１にて得られたバチルス クラウジイ（Bacillus clausii）KSM-K16株（FERM BP-3376）のゲノム塩基配列情報より、配列番号１６で示されるアミノ酸配列をコードすると推定される遺伝子orf2を見出した。遺伝子orf2がコードすると推定されるアミノ酸配列は、オーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）にてPrsAをコードするとされている遺伝子より推定されるアミノ酸配列（配列番号１４）と20.4％の配列同一性を示した。orf2の塩基配列は配列番号１５で示される。該orf2について、実施例２に示したorf1と同様に、orf2にコードされるタンパク質を発現するように改変した枯草菌168VGorf2株の構築を行った。該菌株の構築には表１に示すプライマーを使用し、orf1にコードされるタンパク質を発現するように改変した枯草菌（Bacillus subtilis）の構築に用いたプライマーとの対応を表３に示した。また菌株の構築を確認する為に行ったPCRに用いたプライマーと増幅DNA断片長を表４に示した。実施例３と同様に構築した菌株のアルカリアミラーゼ生産性評価を行ったところ、表５に示した様に168VGorf2株の生産性は対照として用いた168株（野生株）と同等であった。即ち、オーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）のPrsAと推定されるアミノ酸配列と若干の同一性を示しながらも、orf2がコードすると推定されるタンパク質はアルカリアミラーゼの生産には寄与しないことが示された。
Reference Example Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production of Bacillus subtilis orf2 Gene Expressed From the genomic base sequence information of Bacillus clausii KSM-K16 strain (FERM BP-3376) obtained in Example 1, it is represented by SEQ ID NO: 16. The gene orf2 presumed to encode the amino acid sequence was found. The amino acid sequence presumed to be encoded by the gene orf2 shows 20.4% sequence identity with the amino acid sequence (SEQ ID NO: 14) deduced from the gene that is supposed to encode PrsA in Oceanobacillus iheyensis. It was. The base sequence of orf2 is represented by SEQ ID NO: 15. As for orf2, the Bacillus subtilis 168VGorf2 strain modified so as to express the protein encoded by orf2 was constructed in the same manner as orf1 shown in Example 2. The primers shown in Table 1 were used for the construction of the strain, and the correspondence with the primers used for the construction of Bacillus subtilis modified to express the protein encoded by orf1 is shown in Table 3. Table 4 shows the primers used for PCR performed to confirm the construction of the strain and the length of the amplified DNA fragment. When the alkaline amylase productivity evaluation of the strain constructed in the same manner as in Example 3 was performed, as shown in Table 5, the productivity of the 168VGorf2 strain was equivalent to that of the 168 strain (wild strain) used as a control. In other words, it was shown that the protein predicted to be encoded by orf2 does not contribute to the production of alkaline amylase while showing a slight identity with the amino acid sequence predicted to be PrsA of Oceanobacillus iheyensis . .
Claims (9)
（a）配列番号１で示される塩基配列からなるDNA、
（b）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。 A host microorganism characterized in that a gene comprising the following DNA (a) or (b) is introduced into a chromosome or contained on a plasmid:
(A) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
(B) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
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