JP4915728B2 - Recombinant microorganism - Google Patents
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Description
本発明は、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に用いる組換え微生物、及びタンパク質又はポリペプチドの生産方法に関する。 The present invention relates to a recombinant microorganism used for producing a useful protein or polypeptide, and a method for producing a protein or polypeptide.
微生物による有用物質の工業的生産は、アルコール飲料や味噌、醤油等の食品類をはじめとし、アミノ酸、有機酸、核酸関連物質、抗生物質、糖質、脂質、タンパク質等、その種類は多岐に渡っており、またその用途についても食品、医薬や、洗剤、化粧品等の日用品、或いは各種化成品原料に至るまで幅広い分野に広がっている。 The industrial production of useful substances by microorganisms includes a wide variety of types including foods such as alcoholic beverages, miso and soy sauce, as well as amino acids, organic acids, nucleic acid-related substances, antibiotics, carbohydrates, lipids, proteins, etc. In addition, its application has been extended to a wide range of fields from foods, medicines, daily necessaries such as detergents and cosmetics to various chemical raw materials.
こうした微生物による有用物質の工業生産においては、その生産性の向上が重要な課題の一つであり、その手法として、突然変異等の遺伝学的手法による生産菌の育種が行われてきた。特に最近では、微生物遺伝学、バイオテクノロジーの発展により、遺伝子組換え技術等を用いたより効率的な生産菌の育種が行われるようになっており、遺伝子組換えのための宿主微生物の開発が進められている。例えば、枯草菌（Bacillus subtilis） Marburg No.168系統株の様に宿主微生物として安全かつ優良と認められた微生物菌株に更に改良を加えた菌株が開発されている。また、本出願人においても、枯草菌の遺伝子comA、yopO、treR、yvbA、cspB、yvaN、yttP、yurK、yozA、licR、sigL、mntR、glcT、yvdE、ykvE、slr、rocR、ccpA、yaaT、yyaA、yycH、yacP、hprK、rsiX、yhdK、ylbO等を削除又は不活性化された微生物変異株において、タンパク質等の生産性が向上することを見出している（特許文献１）。
本発明は、タンパク質又はポリペプチドの生産性がより向上された微生物、及び当該微生物を利用して、目的のタンパク質又はポリペプチドを製造する方法を提供することに関する。 The present invention relates to a microorganism in which productivity of a protein or polypeptide is further improved, and a method for producing a target protein or polypeptide using the microorganism.
本発明者らは、微生物ゲノム上にコードされる各種遺伝子において、有用なタンパク質又はポリペプチドの生産に影響を及ぼす遺伝子を探索したところ、枯草菌シグマ因子の一つであるSigXをコードするsigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した後、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した場合に、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性が、当該遺伝子の欠失又は不活性化前と比較して向上することを見出した。 The present inventors searched for genes that affect the production of useful proteins or polypeptides in various genes encoded on the microbial genome. As a result, the sigX gene encoding SigX, which is one of the Bacillus subtilis sigma factors. Alternatively, after a gene corresponding to the gene is deleted or inactivated from the genome and then a gene encoding the protein or polypeptide of interest is introduced, the productivity of the protein or polypeptide of interest It was found to be improved compared to before deletion or inactivation.
バチルス属細菌は、ＲＮＡポリメラーゼのサブユニットとしてプロモーター配列の認識に関与するシグマ因子を複数有している。異なるプロモーターを認識するシグマ因子が、シグマ因子以外の複数サブユニットから成るＲＮＡポリメラーゼコア複合体に結合することによって異なる遺伝子が転写され、これによって、ゲノム上に数千個存在する遺伝子について、状況に応じた遺伝子の発現制御を行っていると考えられている。例えば、バチルス属細菌のうち、枯草菌については１７個のシグマ因子が同定されており、栄養増殖期において生育に必須な遺伝子の転写に関与する主要シグマ因子（ハウスキーピングシグマ因子）であるSigAをはじめ、胞子形成過程を制御するシグマ因子SigH、SigF、SigE、SigG、SigK、べん毛形成や細胞壁溶解を制御するシグマ因子SigD、ある種のアミノ酸や糖の代謝を制御するシグマ因子SigL、環境変化への対応を制御するシグマ因子SigBやECFシグマと呼ばれるシグマ因子等の存在が知られている。 Bacillus bacteria have a plurality of sigma factors involved in recognition of promoter sequences as subunits of RNA polymerase. Different genes are transcribed by binding sigma factors recognizing different promoters to the RNA polymerase core complex consisting of multiple subunits other than sigma factors. It is considered that gene expression is controlled accordingly. For example, among Bacillus bacteria, 17 sigma factors have been identified for Bacillus subtilis, and SigA, which is a major sigma factor (housekeeping sigma factor) involved in transcription of genes essential for growth during the vegetative growth phase, is identified. First, sigma factors SigH, SigF, SigE, SigG, SigK that control the sporulation process, sigma factor SigD that controls flagellar formation and cell wall lysis, sigma factor SigL that controls the metabolism of certain amino acids and sugars, the environment The existence of sigma factors SigB and ECF sigma, which control the response to changes, is known.
栄養増殖期には主としてSigAがＲＮＡポリメラーゼコア複合体と会合してSigAが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導しているが、細胞周囲の環境が変化するとECFシグマ因子のひとつであるSigXが活性化することで、SigXが認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導し、環境変化に対応するといわれている（Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by A. L. Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)）。 During the vegetative growth phase, SigA mainly associates with the RNA polymerase core complex and induces transcription of a gene or operon that has a promoter that SigA recognizes. However, if the environment surrounding the cell changes, it is one of the ECF sigma factors. Activation of a certain SigX induces transcription of a gene or operon having a promoter recognized by SigX, and is said to respond to environmental changes ( Bacillus subtilis and Its Closest Relatives: From Genes to Cells, Edited by AL Sonenshein, American Society for Microbiology, pp289, (2002)).
SigXタンパク質は、RsiXタンパク質によりその活性が抑制されることから、sigX遺伝子をゲノム上から欠失又は不活性化した場合に上記の効果が得られたことは、特許文献１の結果からすると全く予想外のことである。 Since the activity of the SigX protein is suppressed by the RsiX protein, the above effect was obtained when the sigX gene was deleted or inactivated from the genome. It is outside.
すなわち本発明は、枯草菌のsigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子が欠失又は不活性化された微生物株に、目的のタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子を導入した組換え微生物に関する。 That is, the present invention relates to a recombinant microorganism in which a gene encoding a target protein or polypeptide is introduced into a microbial strain in which the Bacillus subtilis sigX gene or a gene corresponding to the gene is deleted or inactivated.
また本発明は、当該組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの製造方法に関する。 The present invention also relates to a method for producing a target protein or polypeptide using the recombinant microorganism.
本発明の組換え微生物を用いることにより、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性向上を図ることができる。 By using the recombinant microorganism of the present invention, the productivity of the target protein or polypeptide can be improved.
本発明においてアミノ酸配列および塩基配列の同一性はLipman-Pearson法 (Science, 227, 1435, (1985))によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win（ソフトウェア開発）のホモロジー解析（Search homology）プログラムを用いて、Unit size to compare（ktup）を２として解析を行うことにより算出される。 In the present invention, the identity of the amino acid sequence and the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, (1985)). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to compare (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development).
本明細書において、転写開始制御領域は、プロモーター及び転写開始点を含む領域であり、リボソーム結合部位は、開始コドンと共に翻訳開始制御領域を形成するShine-Dalgarno（SD）配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463 (1974)）に相当する部位である。 In the present specification, the transcription initiation control region is a region including a promoter and a transcription initiation point, and the ribosome binding site is a Shine-Dalgarno (SD) sequence (Proc. Natl. Acad) that forms a translation initiation control region together with the initiation codon. Sci. USA 74, 5463 (1974)).
本発明の微生物を構築するための親微生物としては、枯草菌のsigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を有するものであればよく、これらは野生型のものでも変異を施したものでもよい。具体的には、バチルス（Bacillus）属細菌や、クロストリジウム(Clostridium)属細菌、或いは酵母等が挙げられ、中でもバチルス（Bacillus）属細菌が好ましい。更に、全ゲノム情報が明らかにされ、遺伝子工学、ゲノム工学技術が確立されている点、またタンパク質を菌体外に分泌生産させる能力を有する点から特に枯草菌（Bacillus subtilis）が好ましい。 The parent microorganism for constructing the microorganism of the present invention may be any microorganism having the sigX gene of Bacillus subtilis or a gene corresponding to the gene, and these may be wild-type or mutated. Specific examples include bacteria belonging to the genus Bacillus, bacteria belonging to the genus Clostridium , yeast, etc. Among them, bacteria belonging to the genus Bacillus are preferable. Furthermore, Bacillus subtilis is particularly preferred from the viewpoint that whole genome information has been clarified, genetic engineering and genome engineering techniques have been established, and that it has the ability to secrete and produce proteins outside the cells.
本発明において欠失又は不活性化の対象となる枯草菌のsigX遺伝子は、枯草菌のECF（extracytoplasmic function）ファミリーに属するシグマ因子の一つであるSigXをコードする遺伝子である。
斯かる遺伝子の産物SigXは、細胞周囲の環境が変化すると活性化され、その認識するプロモーターを有する遺伝子、またはオペロンの転写を誘導することによって環境変化に対応する機能を有する。
The sigX gene of Bacillus subtilis to be deleted or inactivated in the present invention is a gene encoding SigX, which is one of the sigma factors belonging to the ECF (extracytoplasmic function) family of Bacillus subtilis.
The product SigX of such a gene is activated when the environment surrounding the cell is changed, and has a function corresponding to the environmental change by inducing transcription of a gene having a recognized promoter or an operon.
また、上記のようなsigX遺伝子と同じ機能を有する、及び／又は当該sigX遺伝子と塩基配列において70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する、他の微生物由来、好ましくはBacillus属細菌由来の遺伝子は、sigX遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、本発明において欠失、不活性化すべき遺伝子に含まれる。 Further, it has the same function as the sigX gene as described above, and / or 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, particularly preferably in the sigX gene and the nucleotide sequence. having 98% or more identity, derived from other microorganisms, preferably gene from Bacillus bacteria, believed gene corresponding to sigX genes include the deletion, gene to be inactivated in the present invention.
本発明のsigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の不活性化は、当該遺伝子中に他のDNA断片を挿入する、或いは当該遺伝子の転写・翻訳開始領域に変異を与える等の方法によって行うことができるが、好適には、標的遺伝子を物理的に欠失させる方がより望ましい。 The inactivation of the sigX gene of the present invention or a gene corresponding to the gene can be performed by a method such as inserting another DNA fragment into the gene or giving a mutation to the transcription / translation initiation region of the gene. Although it is possible, preferably it is more desirable to physically delete the target gene.
本発明遺伝子の欠失又は不活性化の手順としては、sigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子（標的遺伝子）を計画的に欠失又は不活性化する方法のほか、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化変異を与えた後、適当な方法によりタンパク質生産性の評価及び遺伝子解析を行う方法が挙げられる。 As a procedure for deletion or inactivation of the gene of the present invention, in addition to a method of systematically deleting or inactivating the sigX gene or a gene corresponding to the gene (target gene), An example is a method of evaluating protein productivity and performing gene analysis by an appropriate method after giving an inactivating mutation.
標的遺伝子を欠失又は不活性化するには、例えば相同組換えによる方法を用いればよい。すなわち、標的遺伝子の一部を含むDNA断片を適当なプラスミドベクターにクローニングして得られる環状の組換えプラスミドを親微生物細胞内に取り込ませ、標的遺伝子の一部領域に於ける相同組換えによって親微生物ゲノム上の標的遺伝子を分断して不活性化することが可能である。或いは、塩基置換や塩基挿入等の変異によって不活性化した標的遺伝子、又は図１のように標的遺伝子の上流、下流領域を含むが標的遺伝子を含まない直鎖状のDNA断片等をPCR等の方法によって構築し、これを親微生物細胞内に取り込ませて親微生物ゲノムの標的遺伝子内の変異箇所の外側の２ヶ所、又は標的遺伝子上流側、下流側で２回交差の相同組換えを起こさせることにより、ゲノム上の標的遺伝子を欠失或いは不活性化した遺伝子断片と置換することが可能である。 In order to delete or inactivate the target gene, for example, a method by homologous recombination may be used. That is, a circular recombinant plasmid obtained by cloning a DNA fragment containing a part of the target gene into an appropriate plasmid vector is introduced into the parent microbial cell, and the parent gene is homologously recombined in a part of the target gene. It is possible to disrupt and inactivate target genes on the microbial genome. Alternatively, a target gene inactivated by mutation such as base substitution or base insertion, or a linear DNA fragment containing the upstream and downstream regions of the target gene but not the target gene as shown in FIG. Constructed by the method, this is incorporated into the parent microbial cells to cause two crossover homologous recombination at two locations outside the mutation site in the target gene of the parent microbial genome, or upstream and downstream of the target gene Thus, it is possible to replace the target gene on the genome with a deleted or inactivated gene fragment.
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えにより標的遺伝子を欠失又は不活性化する方法については、既にいくつかの報告例があり（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990等)、こうした方法を繰り返すことによって、本発明の宿主微生物を得ることができる。 In particular, when Bacillus subtilis is used as a parental microorganism for constructing the microorganism of the present invention, there have already been several reports on methods for deleting or inactivating a target gene by homologous recombination (Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990, etc.), the host microorganism of the present invention can be obtained by repeating these methods.
また、ランダムな遺伝子の欠失又は不活性化についてもランダムにクローニングしたDNA断片を用いて上述の方法と同様な相同組換えを起こさせる方法や、親微生物にγ線等を照射すること等によっても実施可能である。 In addition, random gene deletion or inactivation can be achieved by a method of causing homologous recombination similar to the above method using a randomly cloned DNA fragment, or by irradiating a parental microorganism with γ rays, etc. Can also be implemented.
以下に、具体例を挙げて、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989)によって調製される欠失用DNA断片を用いた二重交差法による欠失方法について説明する。 The deletion method by the double crossing method using the DNA fragment for deletion prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989) will be described below with specific examples. To do.
ここで用いる欠失用DNA断片は、欠失対象遺伝子の上流に隣接する約1.0kb断片と、同じく下流に隣接する約1.0kb断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子断片を挿入した断片である。まず、1回目のPCRによって、欠失対象遺伝子の上流断片及び下流断片、並びに薬剤耐性マーカー遺伝子断片の3断片を調製するが、この際、例えば、上流断片の下流末端に薬剤耐性マーカー遺伝子の上流側10〜30塩基対配列、逆に下流断片の上流末端には薬剤耐性マーカー遺伝子の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図１）。 The deletion DNA fragment used here is a fragment in which a drug resistance marker gene fragment is inserted between the approximately 1.0 kb fragment adjacent to the upstream of the gene to be deleted and the approximately 1.0 kb fragment adjacent to the downstream. First, an upstream fragment and a downstream fragment of a deletion target gene and three fragments of a drug resistance marker gene fragment are prepared by the first PCR. In this case, for example, upstream of the drug resistance marker gene is formed at the downstream end of the upstream fragment. A primer designed so that a 10-30 base pair sequence on the side and, on the contrary, a 10-30 base pair sequence downstream of the drug resistance marker gene is added to the upstream end of the downstream fragment is used (FIG. 1).
次いで、1回目に調製した3種類のPCR断片を鋳型とし、上流断片の上流側プライマーと下流断片の下流側プライマーを用いて2回目のPCRを行うことによって、上流断片の下流末端及び下流断片の上流末端に付加した薬剤耐性マーカー遺伝子配列に於いて、薬剤耐性マーカー遺伝子断片とのアニールが生じ、PCR増幅の結果、上流側断片と下流側断片の間に、薬剤耐性マーカー遺伝子を挿入したDNA断片を得ることができる（図１）。 Next, using the 3 types of PCR fragments prepared in the first round as a template, and performing the second round of PCR using the upstream primer of the upstream fragment and the downstream primer of the downstream fragment, the downstream end of the upstream fragment and the downstream fragment In the drug resistance marker gene sequence added to the upstream end, annealing occurs with the drug resistance marker gene fragment, and as a result of PCR amplification, a DNA fragment in which the drug resistance marker gene is inserted between the upstream fragment and the downstream fragment Can be obtained (FIG. 1).
薬剤耐性マーカー遺伝子として、クロラムフェニコール耐性遺伝子を用いる場合、例えば表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989)等に示される通常の条件によりSOE−PCRを行うことによって、各遺伝子の欠失用DNA断片が得られる。 When using a chloramphenicol resistance gene as a drug resistance marker gene, for example, using the primer set shown in Table 1, using a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA polymerase (Takara Shuzo), etc. Protocols. Current Methods and Applications, Edited by BAWhite, Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) etc., by performing SOE-PCR under the usual conditions, etc., DNA fragments for deletion of each gene Is obtained.
かくして得られた遺伝子欠失用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のある欠失対象遺伝子の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、標的遺伝子が薬剤耐性遺伝子と置換した細胞、或いは標的遺伝子内に薬剤耐性遺伝子が挿入された細胞が薬剤耐性マーカーによる選択によって分離できる（図１）。即ち、後記表１に示したプライマーセットを用いて調製した欠失用DNA断片を導入した場合、クロラムフェニコールを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上の目的遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子と置換されていることを確認すれば良い。 When the DNA fragment for gene deletion thus obtained is introduced into the cell by a competent method or the like, gene recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the identical deletion target gene. A cell in which a target gene is replaced with a drug resistance gene, or a cell in which a drug resistance gene is inserted into the target gene can be separated by selection with a drug resistance marker (FIG. 1). That is, when a deletion DNA fragment prepared using the primer set shown in Table 1 below is introduced, colonies that grow on an agar medium containing chloramphenicol are isolated, and a PCR method using the genome as a template, etc. To confirm that the target gene on the genome is replaced with the chloramphenicol resistance gene.
また、本発明においては、sigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の欠失の他に、それ以外の遺伝子の発現強化及び機能強化を組み合わせることも可能であり、生産性向上に対してより大きな効果が期待される。例えば、prsA遺伝子の発現を強化すること、具体的には、微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位（例えば、枯草菌spoVG遺伝子、aprE遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子等の転写開始制御領域や、転写開始制御領域及びリボソーム結合部位）を、枯草菌prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流に導入するか、或いは微生物において機能を有する転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を枯草菌prsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片を微生物に導入すること等が挙げられる。 In the present invention, in addition to the deletion of the sigX gene or a gene corresponding to the gene, it is also possible to combine expression enhancement and functional enhancement of other genes, which is more effective for improving productivity. There is expected. For example, to enhance the expression of the prsA gene, specifically, a transcription initiation control region or transcription initiation control region having a function in a microorganism and a ribosome binding site (for example, Bacillus subtilis spoVG gene, aprE gene or the corresponding gene) A transcription initiation control region such as a gene, a transcription initiation control region, and a ribosome binding site) are introduced upstream in the genome of the Bacillus subtilis prsA gene or a gene corresponding to the gene, or a transcription initiation control having a function in a microorganism For example, a gene fragment in which a region or a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the Bacillus subtilis prsA gene is introduced into a microorganism.
ここで、枯草菌prsA遺伝子とは、配列番号１で示される塩基配列からなる遺伝子をいう。枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子としては、以下の（１）〜（４）のいずれかの遺伝子が挙げられ、枯草菌prsA遺伝子と実質的に同じ機能を有する、例えばバチルス リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス アントラシス（Bacillus anthracis）、バチルス セレウス（Bacillus cereus）、バチルス チューリンジェンシス（Bacillus thuringiensis）、或いはオーシャノバチルス イヘエンシス（Oceanobacillus iheyensis）等において、主にゲノム解析により同定された各prsA遺伝子が含まれる。
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning −A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION［Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press］記載の方法が挙げられ、例えば、６×SSC（１×SSCの組成：０.１５M 塩化ナトリウム、０．０１５M クエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ SDS、５ｘデンハート及び１００mg／mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに６５℃で８〜１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするDNAからなる遺伝子。なお、ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは２以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列には、１若しくは数個、好ましくは１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれ、付加には、両末端への１〜数個のアミノ酸の付加が含まれる。
また、枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質とは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなる枯草菌PrsAタンパク質と同等の機能又は活性を有するタンパク質をいう。
Here, the Bacillus subtilis prsA gene refers to a gene consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1. The gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene, include any of the genes of the following (1) to (4), having a Bacillus subtilis prsA gene substantially the same function, for example, Bacillus licheniformis (Bacillus licheniformis), Bacillus anthracis (Bacillus anthracis), Bacillus cereus (Bacillus cereus), Bacillus thuringiensis Jen cis (Bacillus thuringiensis), or in O-Sha Roh Bacillus Iheenshisu (Oceanobacillus iheyensis), etc., are included each prsA gene identified mainly by genomic analysis.
(1) A protein comprising a nucleotide sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, and functionally equivalent to Bacillus subtilis PrsA protein A gene consisting of DNA encoding.
(2) A gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein. . Here, examples of the “stringent conditions” include a method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press], for example, 6 × SSC (1 × SSC composition: 0.15 M sodium chloride, 0.015 M sodium citrate, pH 7.0), 0.5% SDS, 5 × Denhart and 100 mg / mL herring sperm DNA together with the probe at 65 ° C. Examples include conditions of constant temperature for 8 to 16 hours for hybridization.
(3) A protein consisting of an amino acid sequence having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and functionally equivalent to Bacillus subtilis PrsA protein A gene consisting of DNA encoding.
(4) From an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and encoding a protein functionally equivalent to Bacillus subtilis PrsA protein The gene that becomes. Here, in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, one or several, preferably 1 to 10 amino acids are missing in the amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added. A deleted, substituted or added amino acid sequence is included, and the addition includes the addition of one to several amino acids at both ends.
The protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein is a protein having the same function or activity as the Bacillus subtilis PrsA protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域としては、JAFAN：Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）により、遺伝子番号BG101126として開示された遺伝子spoVGを制御する領域が挙げられる。また、枯草菌spoVG遺伝子と同じ機能を有する他の微生物由来の遺伝子は枯草菌spoVG遺伝子に相当する遺伝子と考えられ、当該遺伝子の転写開始制御領域等を用いて枯草菌prsA遺伝子の発現を強化することも本発明に包含される。 As a transcription initiation regulatory region of Bacillus subtilis spoVG gene, JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) published on the Internet (http://bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004) Thus , a region that controls the gene spoVG disclosed as gene number BG101126 can be mentioned. Further, genes derived from other microorganisms having the same function as the Bacillus subtilis spoVG gene is considered gene corresponding to Bacillus subtilis spoVG gene, to enhance expression of the Bacillus subtilis prsA gene using the transcriptional initiation regulatory region or the like of the gene This is also included in the present invention.
枯草菌のspoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の転写開始制御領域の具体例としては、例えば配列番号３の塩基番号３８〜２１０からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域としての機能を有するDNAが挙げられる。また、枯草菌spoVG遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としては、例えば配列番号３の塩基番号３８〜２３０からなるDNA、又は当該配列と相同な塩基配列からなり枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位としての機能を有するDNAが挙げられる。
ここで、配列番号３の塩基番号３８〜２１０の塩基配列や塩基番号３８〜２３０の塩基配列と相同な塩基配列としては、例えば、（Ａ）配列番号３の塩基番号３８〜２１０又は塩基番号３８〜２３０の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡからなる塩基配列、（Ｂ）配列番号３の塩基番号３８〜２１０又は塩基番号３８〜２３０で示される塩基配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列等が挙げられる。
尚、ここで、「ストリンジェントな条件」としては、上記したものと同様の条件が挙げられる。
また、枯草菌spoVG遺伝子の転写開始制御領域若しくは、転写開始制御領域及びリボソーム結合領域としての機能を有するとは、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の上流に導入した際に、prsA遺伝子又は当該遺伝子と機能的に等価な遺伝子の発現が強化され、目的タンパク質又はポリペプチドの生産性が向上し、しかも、その向上の程度が、枯草菌のspoVG遺伝子の転写開始領域若しくは、転写開始制御領域及びリボソーム結合領域を枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の上流に導入した時と同等に向上することをいう。
Specific examples of the Bacillus subtilis spoVG gene or the transcription initiation control region of a gene corresponding to the gene include, for example, DNA consisting of base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 3, or a base sequence homologous to the sequence, and Bacillus subtilis spoVG Examples thereof include DNA having a function as a transcription initiation control region of a gene. In addition, as a transcription initiation control region and a ribosome binding site of the Bacillus subtilis spoVG gene or a gene corresponding to the gene, for example, DNA consisting of base numbers 38 to 230 of SEQ ID NO: 3, or a base sequence homologous to the sequence, Examples thereof include DNA having a function as a transcription initiation control region and a ribosome binding site of the fungus spoVG gene.
Here, as the base sequence of base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 3 or the base sequence homologous to the base sequence of base numbers 38 to 230, for example, (A) base numbers 38 to 210 of SEQ ID NO: 3 or base number 38 A base sequence consisting of a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the base sequence of ˜230, (B) represented by base numbers 38 to 210 of
Here, examples of the “stringent conditions” include the same conditions as described above.
In addition, it has a function as a transcription initiation control region of Bacillus subtilis spoVG gene or a transcription initiation control region and a ribosome binding region when introduced upstream of the Bacillus subtilis prsA gene or a gene functionally equivalent to the gene. In addition, the expression of the prsA gene or a gene functionally equivalent to the gene is enhanced, the productivity of the target protein or polypeptide is improved, and the degree of improvement is the transcription initiation region of the spoVG gene of Bacillus subtilis or It means that the transcription initiation control region and the ribosome binding region are improved in the same manner as when the prsA gene of Bacillus subtilis or the gene corresponding to the gene is introduced upstream.
prsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子のゲノム上における上流への転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の導入は、枯草菌のprsA遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の一部又は全部を置換するものの他に、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を残したまま挿入するものが含まれる。 Introduction of the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site upstream of the prsA gene or the gene corresponding to the gene into the genome is the start of the original transcription of the Bacillus subtilis prsA gene or the gene corresponding to the gene. In addition to those that replace part or all of the control region, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the original transcription initiation control region, or those that are inserted while leaving the transcription initiation control region and the ribosome binding site intact are included .
当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位への置換は、例えば相同組換えによる公知の方法を用いて行うことができる。すなわち、まず、かかる転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むＤＮＡ断片の上流にprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片を、一方、下流にprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片を、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）などの公知の方法により結合させる。この様にして、prsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含むDNA断片、prsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を、公知の方法により親微生物細胞内に取り込ませることにより、親微生物ゲノムのprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域の上流領域、及びprsA遺伝子の翻訳開始制御領域と構造遺伝子領域の一部又は全部、或いはprsA遺伝子の構造遺伝子領域の一部又は全部を含む領域の２箇所において、二重交差の相同組換えが起こる。その結果、本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位に置換された形質転換体を、上記薬剤耐性遺伝子を指標として分離することができる。これにより、ゲノム上の上流へ導入された転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位は、遺伝的に安定に保持されることとなる。尚、具体的に導入用DNA断片を宿主微生物に導入する公知の方法としては、コンピテントセル形質転換方法(J. Bacterial. 93, 1925 (1967))、プロトプラスト形質転換法(Mol. Gen. Genet. 168, 111 (1979))、或いはエレクトロポレーション法（FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)）等が挙げられ、特にコンピテントセル形質転換方法が好ましい。また、本明細書において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の5'側に続く領域を示し、一方、下流とは対象として捉えている遺伝子又は領域の3'側に続く領域を示す。
特に、本発明微生物を構築するための親微生物として枯草菌を用いる場合、相同組換えによりprsA遺伝子の本来の転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位へ置換する方法については、既報（Mol.Gen.Genet.,223,268,1990）等の方法を利用することが出来る。
The transcription initiation control region, or the substitution to the transcription initiation control region and the ribosome binding site can be performed using, for example, a known method by homologous recombination. That is, first, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene and a drug resistance gene fragment upstream of the transcription initiation control region or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, , Downstream of the prsA gene translation initiation control region and part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene, SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene , 77, 61, 1989). In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene, a drug resistance gene fragment, the transcription initiation control region, or a DNA fragment comprising the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the prsA gene A DNA fragment is obtained in which a translation initiation control region and a part or all of the structural gene region, or a DNA fragment containing part or all of the structural gene region of the prsA gene are joined in this order. Next, by incorporating such a DNA fragment into the parent microbial cell by a known method, the upstream region of the original transcription initiation control region of the prsA gene of the parent microbial genome, and the translation initiation control region and structural gene of the prsA gene Double crossover homologous recombination occurs in two places of the region including part or all of the region or part or all of the structural gene region of the prsA gene. As a result, the original transcription initiation control region, or a transformant in which the transcription initiation control region and the ribosome binding site are replaced with the transcription initiation control region, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, is used as an indicator of the drug resistance gene. Can be separated as Thereby, the transcription initiation control region introduced upstream in the genome, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site are genetically stably maintained. Specifically, known methods for introducing a DNA fragment for introduction into a host microorganism include competent cell transformation methods (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), protoplast transformation methods (Mol. Gen. Genet 168, 111 (1979)) or electroporation method (FEMS Microbiol. Lett. 55, 135 (1990)), etc., and competent cell transformation methods are particularly preferred. Further, in the present specification, upstream and downstream of a gene is not a position from the replication start point, and upstream indicates a region continuing on the 5 ′ side of the gene or region regarded as a target, while downstream is The region following the 3 'side of the gene or region captured as the target is shown.
In particular, when Bacillus subtilis is used as a parental microorganism for constructing the microorganism of the present invention, the original transcription initiation control region of the prsA gene by homologous recombination, or the transcription initiation control region and the ribosome binding site, the transcription initiation control region, Alternatively, as a method of substituting the transcription initiation control region and the ribosome binding site, a method described in the previous report (Mol. Gen. Genet., 223, 268, 1990) or the like can be used.
また、当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の挿入は、挿入したい転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位の両末端に付加するDNA断片の配列を適切に選択すれば、上述の置換の方法と同様の方法により行うことができる。例えば、かかる転写開始制御領域の上流に、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片と薬剤耐性遺伝子断片とを結合させ、下流に本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片を結合させる。この様にして、本来の転写開始制御領域の上流領域を含むDNA断片、薬剤耐性遺伝子断片、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、本来の転写開始制御領域の一部又は全部を含むDNA断片、の順に結合したDNA断片を得る。次に、かかるDNA断片を宿主微生物に挿入したのち、薬剤耐性遺伝子を指標として形質転換体を分離することができる。このようにして分離した形質転換体のゲノム上では、本来の転写開始制御領域と当該他の転写開始制御領域とがそれぞれ間をあけずに隣接した状態で安定に保持されることとなる。 In addition, for the insertion of the transcription initiation control region or transcription initiation control region and the ribosome binding site, appropriately select the transcription initiation control region to be inserted or the sequence of the DNA fragment added to both ends of the transcription initiation control region and the ribosome binding site. For example, it can be carried out by the same method as the above-described substitution method. For example, a DNA fragment containing an upstream region of the original transcription initiation control region and a drug resistance gene fragment are linked upstream of the transcription initiation control region, and a DNA containing a part or all of the original transcription initiation control region downstream. Combine the fragments. In this way, a DNA fragment containing the upstream region of the original transcription initiation control region, a drug resistance gene fragment, a transcription start control region of the spoVG gene, and a DNA fragment containing part or all of the original transcription start control region. A bound DNA fragment is obtained. Next, after inserting such a DNA fragment into a host microorganism, a transformant can be isolated using a drug resistance gene as an index. On the genome of the transformant thus separated, the original transcription initiation control region and the other transcription initiation control region are stably held in a state where they are adjacent to each other without any gap.
本発明において当該転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位が導入されるゲノム上における上流とは、prsA遺伝子の開始コドンの上流側であれば特に限定されないが、隣接する２０００塩基対以内の領域が好ましく、５００塩基対以内の領域がより好ましく、１００塩基対以内の領域が更に好ましく、５０塩基対以内の領域が特に好ましい。 In the present invention, the transcription initiation control region or the upstream in the genome where the transcription initiation control region and the ribosome binding site are introduced is not particularly limited as long as it is upstream of the start codon of the prsA gene, but within 2000 base pairs adjacent to each other. This region is preferable, a region within 500 base pairs is more preferable, a region within 100 base pairs is more preferable, and a region within 50 base pairs is particularly preferable.
また、転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片は、枯草菌その他の微生物のゲノムをテンプレートとして、PCR法等の公知のクローニング方法により得た転写開始制御領域若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位断片、及びprsA遺伝子断片をもとに、制限酵素法やSOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）））など公知の方法により連結することにより得ることができる。かかる断片は、プラスミド等のベクターによって細胞質中に導入することができ、また、公知の形質転換法によって細胞内に導入した核酸断片と染色体との間で相同組換えをさせることにより、染色体上に導入することができる。 In addition, a transcription initiation control region or a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene is a transcription obtained by a known cloning method such as PCR using the genome of Bacillus subtilis or other microorganisms as a template. Based on the initiation control region or transcription initiation control region, ribosome binding site fragment, and prsA gene fragment, restriction enzyme method and SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989))) are known. It can obtain by connecting by the method of. Such a fragment can be introduced into the cytoplasm by a vector such as a plasmid, and homologous recombination is performed between the nucleic acid fragment introduced into the cell and the chromosome by a known transformation method. Can be introduced.
なお、宿主において導入を起こさせる染色体の領域としては、必須でない遺伝子の内部、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましく、例えば、aprE遺伝子、sacB遺伝子、nprE遺伝子、amyE遺伝子、ybxG遺伝子の内部、若しくは当該遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が挙げられるが、amyE遺伝子の内部、若しくはybxG遺伝子上流の非遺伝子領域の内部が好ましい。ここで必須でない遺伝子とは、破壊されたとしても、少なくともある条件においては、宿主は生存することができる遺伝子の意である。また、導入に際して、必須でない遺伝子、若しくは必須でない遺伝子上流の非遺伝子領域の一部又は全部の欠失を伴ってもなんら問題は生じない。 The chromosomal region to be introduced in the host is preferably a non-essential gene or a non-essential gene non-gene region upstream, for example, aprE gene, sacB gene, nprE gene, amyE gene, ybxG gene internal, or while the interior of the non-gene region of the gene upstream and the like, inside the amyE gene, or the interior of the non-gene region of ybxG gene upstream preferred. Here, a non-essential gene means a gene that allows a host to survive at least under certain conditions even if it is destroyed. In addition, no problem arises even when a part or all of a non-essential gene upstream or a non-gene region upstream of a non-essential gene is involved in introduction.
以下、具体例を挙げて、SOE（splicing by overlap extension）−PCR法（Gene,77,61,1989）によって調製されるDNA断片を用いた当該転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片の二重交差による親微生物ゲノム上への導入方法について説明する。
ここで用いる導入用DNA断片は、親微生物ゲノム上の導入部位の上流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（１））と、下流に隣接する約0.1〜3、好ましくは0.4〜3kb断片（以下、断片（２））の間に、当該転写開始制御領域、若しくは転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む断片（以下、断片（３））、prsA遺伝子断片（以下、断片（４））、及び薬剤耐性マーカー遺伝子断片（以下、断片（５））を挿入したDNA断片である。まず、1回目のPCRによって、断片（１）〜断片（５）の5断片を調製する。この際、例えば、断片（１）の下流末端に断片（３）の上流側10〜30塩基対配列、断片（４）の上流末端に断片（３）の下流側10〜30塩基対配列、断片（４）の下流末端に断片（５）の上流側10〜30塩基対配列、更に断片（２）の上流側に断片（５）の下流側10〜30塩基対配列が付加される様にデザインしたプライマーを用いる（図３）。
Hereinafter, with specific examples, the transcription initiation control region using a DNA fragment prepared by SOE (splicing by overlap extension) -PCR method (Gene, 77, 61, 1989), or transcription initiation control region and ribosome binding A method of introducing a gene fragment having a site linked upstream of the prsA gene into the parent microorganism genome by double crossing will be described.
The DNA fragment for introduction used here is about 0.1 to 3, preferably 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (1)) adjacent to the upstream of the introduction site on the parent microorganism genome, and about 0.1 to 3 adjacent to the downstream. Preferably, the transcription initiation control region or a fragment comprising the transcription initiation control region and a ribosome binding site (hereinafter referred to as fragment (3)), between the 0.4 to 3 kb fragment (hereinafter referred to as fragment (2)), prsA gene fragment ( Hereinafter, it is a DNA fragment into which a fragment (4)) and a drug resistance marker gene fragment (hereinafter referred to as fragment (5)) are inserted. First, five fragments of fragment (1) to fragment (5) are prepared by the first PCR. At this time, for example, the upstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the downstream end of fragment (1), and the downstream 10-30 base pair sequence of fragment (3) at the upstream end of fragment (4) Designed to add the 10-30 base pair sequence upstream of fragment (5) at the downstream end of (4), and the 10-30 base pair sequence downstream of fragment (5) upstream of fragment (2). Were used (FIG. 3).
次いで、1回目に調製した5種類のPCR断片を鋳型とし、断片（１）の上流側プライマーと断片（２）の下流側プライマーを用いて２回目のPCRを行う。これにより、断片（１）の下流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、同様に、断片（４）の上流末端に付加した断片（３）の配列に於いて断片（３）とのアニールが生じ、断片（４）の下流末端に付加した断片（５）の配列に於いて断片（５）とのアニールが生じ、断片（２）の上流側に付加した断片（５）の配列において断片（５）とのアニールが生じる。PCR増幅の結果、断片（１）〜断片（５）の5断片が、（１）（３）（４）（５）（２）の順に結合したDNA断片を得ることが出来る（図３）。 Next, the second PCR is carried out using the five types of PCR fragments prepared in the first round as templates and using the upstream primer of fragment (1) and the downstream primer of fragment (2). This causes annealing with the fragment (3) in the sequence of the fragment (3) added to the downstream end of the fragment (1). Similarly, the sequence of the fragment (3) added to the upstream end of the fragment (4) Annealing with fragment (3) occurs in the sequence, annealing with fragment (5) occurs in the sequence of fragment (5) added to the downstream end of fragment (4), and upstream of fragment (2) Annealing with the fragment (5) occurs in the sequence of the fragment (5) added to. As a result of PCR amplification, it is possible to obtain a DNA fragment in which five fragments (1) to (5) are bound in the order of (1), (3), (4), (5), and (2) (FIG. 3).
薬剤マーカー遺伝子としては、エリスロマイシン耐性遺伝子等を用いることが出来る。また、ここで行うPCR反応は、表１に示したプライマーセットを用い、Pyrobest DNAポリメーラーゼ（宝酒造）などの一般のPCR用酵素キット等を用いて、成書（PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited by B.A.White, Humana Press pp251 ,1993、Gene,77,61,1989）等に示される通常の条件に準じて行えばよい。 As a drug marker gene, an erythromycin resistance gene or the like can be used. The PCR reaction performed here uses the primer set shown in Table 1 and a general PCR enzyme kit such as Pyrobest DNA Polymerase (Takara Shuzo), etc. (PCR Protocols. Current Methods and Applications, Edited). by BAWhite, Humana Press pp251, 1993, Gene, 77, 61, 1989) and the like.
かくして得られた導入用DNA断片を、コンピテント法等によって細胞内に導入すると、同一性のあるゲノム上導入部位の上流及び下流の相同領域おいて、細胞内での遺伝子組換えが生じ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入された細胞を薬剤耐性マーカーによる選択によって分離することができる。すなわち、表１に示したプライマーセットを用いて調製した導入用DNA断片を導入した場合、エリスロマイシンを含む寒天培地上に生育するコロニーを分離し、ゲノムを鋳型としたPCR法などによってゲノム上導入部位に、spoVG遺伝子の転写開始制御領域、又は転写開始制御領域とリボソーム結合部位をprsA遺伝子の上流に連結した遺伝子断片が導入していることを確認すれば良い。 When the DNA fragment for introduction thus obtained is introduced into a cell by a competent method or the like, gene recombination occurs in the cell in the homologous region upstream and downstream of the introduction site on the same genome, spoV A cell into which a transcription initiation control region of the G gene or a gene fragment in which a transcription initiation control region and a ribosome binding site are linked upstream of the prsA gene can be isolated by selection with a drug resistance marker. That is, when the DNA fragment for introduction prepared using the primer set shown in Table 1 is introduced, colonies that grow on the agar medium containing erythromycin are isolated, and then introduced into the genome by PCR or the like using the genome as a template. to, may be sure that the transcriptional initiation regulatory region of spoV G gene or gene fragment was ligated to the upstream of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site prsA gene is introduced.
本発明の組換え微生物を用いて生産される目的タンパク質又は目的ポリペプチドは、特に限定されず、例えば洗剤、食品、繊維、飼料、化学品、医療、診断など各種産業用酵素や、生理活性ペプチドなどが挙げられるが、産業用酵素が好ましい。また、産業用酵素の機能別には、酸化還元酵素(Oxidoreductase)、転移酵素(Transferase)、加水分解酵素(Hydrolase)、脱離酵素 (Lyase)、異性化酵素(Isomerase)、合成酵素(Ligase/Synthetase)等が含まれるが、好適にはセルラーゼ、α-アミラーゼ、プロテアーゼ等の加水分解酵素が挙げられる。α-アミラーゼとしては、微生物由来、好ましくはバチルス（Bacillus）属細菌由来、より好ましくはバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼが挙げられる。バチルス エスピー（Bacillus sp.） KSM-K38株（FERM BP-6946）由来のα-アミラーゼのより具体的な例としては、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス(Bacillus)属細菌由来のアルカリアミラーゼや、当該アミノ酸配列と70％、好ましくは80％、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるアミラーゼが挙げられる。尚、アミノ酸配列の同一性はLipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)によって計算される。また、セルラーゼとしては、多糖加水分解酵素の分類（Biochem. J., 280, 309 (1991)）中でファミリー５に属するセルラーゼが挙げられ、中でも微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセルラーゼが挙げられる。プロテアーゼとしては、微生物由来、特にバチルス(Bacillus)属細菌由来のセリンプロテアーゼや金属プロテアーゼ等が挙げられる。
The target protein or target polypeptide produced using the recombinant microorganism of the present invention is not particularly limited, and examples thereof include various industrial enzymes such as detergents, foods, fibers, feeds, chemicals, medicines, and diagnostics, and bioactive peptides. Industrial enzymes are preferred. In addition, the functions of industrial enzymes are classified into oxidoreductase (Oxidoreductase), transferase (Transferase), hydrolase (Hydrolase), elimination enzyme (Lyase), isomerase (Isomerase), and synthetic enzyme (Ligase / Synthetase). ) And the like, preferably hydrolyzing enzymes such as cellulase, α-amylase and protease. Examples of α-amylase include α-amylase derived from microorganisms, preferably derived from bacteria belonging to the genus Bacillus , more preferably derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946). As a more specific example of α-amylase derived from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946), an alkali derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5 Examples include amylase and amylase having an amino acid sequence having 70%, preferably 80%, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and particularly preferably 98% or more with the amino acid sequence. The amino acid sequence identity is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985). Cellulases include cellulases belonging to
本発明の微生物に導入される目的タンパク質又はポリペプチドの遺伝子は、その上流に当該遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる制御領域、即ち、プロモーター及び転写開始点を含む転写開始制御領域、リボソーム結合部位及び開始コドンを含む翻訳開始領域並びに分泌シグナルペプチド領域から選ばれる１以上の領域が適正な形で結合されていることが望ましい。特に、転写開始制御領域、翻訳開始制御領域及び分泌シグナル領域からなる3領域が結合されていることが好ましく、更に分泌シグナルペプチド領域がバチルス（Bacillus）属細菌のセルラーゼ遺伝子由来のものであり、転写開始領域及び翻訳開始領域が当該セルラーゼ遺伝子の上流0.6〜1 kb領域であるものが、目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子と適正な形で結合されていることが望ましい。例えば、特開2000-210081号公報や特開平4-190793号公報等に記載されているバチルス（Bacillus）属細菌、すなわちKSM-S237株（FERM BP-7875）、KSM-64株（FERM BP-2886）由来のセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始領域及び分泌シグナルペプチド領域が目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。より具体的には配列番号６で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜659の塩基配列、配列番号８で示される塩基配列からなるセルラーゼ遺伝子の塩基番号1〜696の塩基配列、また当該塩基配列に対して70％以上、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上、特に好ましくは98％以上の同一性を有する塩基配列からなるDNA断片、或いは上記いずれかの塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片が、目的のタンパク質又はポリペプチドの構造遺伝子と適正に結合されていることが望ましい。尚、ここで、上記塩基配列の一部が欠失した塩基配列からなるDNA断片とは、上記塩基配列の一部を欠失しているが、遺伝子の転写、翻訳、分泌に関わる機能を保持しているDNA断片を意味する。
The target protein or polypeptide gene introduced into the microorganism of the present invention is upstream of the control region involved in transcription, translation, and secretion of the gene, that is, the transcription initiation control region including the promoter and transcription start site, and the ribosome binding site. It is desirable that at least one region selected from a translation initiation region including a start codon and a secretory signal peptide region is bound in an appropriate form. In particular, it is preferable that three regions consisting of a transcription initiation control region, a translation initiation control region, and a secretion signal region are combined, and the secretion signal peptide region is derived from a cellulase gene of a bacterium belonging to the genus Bacillus , It is desirable that the start region and the translation start region are 0.6-1 kb region upstream of the cellulase gene and are linked to the target protein or polypeptide gene in an appropriate form. For example, Bacillus (Bacillus) bacteria as described in 2000-210081 and JP 4-190793 Patent Publication JP, i.e. KSM-S237 strain (FERM BP-7875), KSM -64 strain (FERM BP- It is desirable that the transcription initiation regulatory region, the translation initiation region, and the secretory signal peptide region of the cellulase gene derived from 2886) are appropriately combined with the structural gene of the target protein or polypeptide. More specifically, the base sequence of
上記の目的のタンパク質又はポリペプチド遺伝子を含むDNA断片と適当なプラスミドベクターを結合させた組換えプラスミドを、一般的な形質転換法を用いて宿主微生物細胞に取り込ませることによって、本発明の組換え微生物を得ることができる。また、当該DNA断片に宿主微生物ゲノムとの適当な相同領域を結合したDNA断片を用い、宿主微生物ゲノムに直接組み込むことによっても本発明の組換え微生物を得ることができる。 The recombinant plasmid of the present invention is obtained by incorporating a recombinant plasmid obtained by binding a DNA fragment containing the target protein or polypeptide gene and an appropriate plasmid vector into a host microbial cell using a general transformation method. Microorganisms can be obtained. The recombinant microorganism of the present invention can also be obtained by using a DNA fragment in which an appropriate homologous region with the host microorganism genome is bound to the DNA fragment and directly integrating it into the host microorganism genome.
本発明の組換え微生物を用いた目的のタンパク質又はポリペプチドの生産は、当該菌株を同化性の炭素源、窒素源、その他の必須成分を含む培地に接種し、通常の微生物培養法にて培養し、培養終了後、タンパク質又はポリペプチドを採取・精製することにより行えばよい。そして、後記実施例に示すように、目的のタンパク質又はポリペプチドの生産性は、sigX遺伝子又は当該遺伝子に相当する遺伝子を欠失又は不活性化していない微生物を用いた場合と比較して、その向上が達成されている。 Production of the target protein or polypeptide using the recombinant microorganism of the present invention is carried out by inoculating the strain in a medium containing an assimilable carbon source, nitrogen source and other essential components, and cultivating it by a normal microorganism culture method. Then, after completion of the culture, the protein or polypeptide may be collected and purified. And, as shown in the examples below, the productivity of the target protein or polypeptide is compared to the case of using a microorganism that has not deleted or inactivated the sigX gene or a gene corresponding to the gene. Improvements have been achieved.
以下に、本発明の組換え微生物の構築方法及び当該組換え微生物を用いたセルラーゼの生産方法について具体的に説明する。 Below, the construction method of the recombinant microorganism of this invention and the production method of cellulase using the said recombinant microorganism are demonstrated concretely.
以下の実施例におけるDNA断片増幅のためのポリメラーゼ連鎖反応（PCR）には、GeneAmp PCR System（アプライドバイオシステムズ）を使用し、Pyrobest DNA Polymerase（タカラバイオ）と付属の試薬類を用いてDNA増幅を行った。PCRの反応液組成は、適宜希釈した鋳型DNAを1μL、センス及びアンチセンスプライマーを各々20pmol及びPyrobest DNA Polymeraseを2.5U添加して、反応液総量を50μLとした。PCRの反応条件は、98℃で10秒間、55℃で30秒間及び72℃で1〜5分間（目的増幅産物に応じて調整。目安は1kbあたり1分間）の3段階の温度変化を30回繰り返した後、72℃で5分間反応させることにより行った。 For the polymerase chain reaction (PCR) for DNA fragment amplification in the following examples, GeneAmp PCR System (Applied Biosystems) is used, and DNA amplification is performed using Pyrobest DNA Polymerase (Takara Bio) and attached reagents. went. The PCR reaction solution composition was 1 μL of appropriately diluted template DNA, 20 pmol of sense and antisense primers and 2.5 U of Pyrobest DNA Polymerase, respectively, and the total amount of the reaction solution was 50 μL. PCR reaction conditions were 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 to 5 minutes (adjusted according to the target amplification product, 1 minute per 1 kb). After repeating, the reaction was carried out at 72 ° C. for 5 minutes.
以下の実施例における各遺伝子及び遺伝子領域の名称は、Nature, 390, 249-256,(1997)で報告され、JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB)でインターネット公開（http://bacillus.genome.ad.jp/、2004年3月10日更新）された枯草菌ゲノムデータに基づいて記載している。 The names of each gene and gene region in the following examples are reported in Nature, 390, 249-256, (1997) and published on the Internet at JAFAN: Japan Functional Analysis Network for Bacillus subtilis (BSORF DB) (http: // Bacillus.genome.ad.jp/, updated March 10, 2004), based on genome data of Bacillus subtilis.
また、以下の実施例において、遺伝子の上流・下流とは、複製開始点からの位置ではなく、上流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の開始コドンの5’側に続く領域を示し、一方、下流とは各操作・工程において対象として捉えている遺伝子の終始コドンの3’側に続く領域を示す。 Further, in the following examples, upstream and downstream of a gene are not positions from the replication start point, but upstream is a region continuing on the 5 ′ side of the start codon of the gene that is regarded as a target in each operation / step. On the other hand, “downstream” indicates a region continuing 3 ′ of the stop codon of the gene taken as a target in each operation / step.
枯草菌の形質転換は以下の様に行った。
すなわち、枯草菌株をSPI培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.02% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.25μM 塩化マンガン、50μg/ml トリプトファン）において37℃で、生育度(OD600)の値が1程度になるまで振盪培養した。振盪培養後、培養液の一部を9倍量のSPII培地（0.20% 硫酸アンモニウム、1.40% リン酸水素二カリウム、0.60% リン酸二水素カリウム、0.10% クエン酸三ナトリウム二水和物、0.50% グルコース、0.01% カザミノ酸 (Difco)、5mM 硫酸マグネシウム、0.40μM 塩化マンガン、5μg/ml トリプトファン）に接種し、更に生育度(OD600)の値が0.4程度になるまで振盪培養することで、枯草菌株のコンピテントセルを調製した。次いで調製したコンピテントセル懸濁液（SPII培地における培養液）100μＬに各種ＤＮＡ断片を含む溶液（ＳＯＥ−ＰＣＲの反応液等）５μＬを添加し、37℃で１時間振盪培養後、適切な薬剤を含むＬＢ寒天培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、１．５％寒天）に全量を塗沫した。37℃における静置培養の後、生育したコロニーを形質転換体として分離した。得られた形質転換体のゲノムを抽出し、これを鋳型とするＰＣＲによって目的とするゲノム構造の改変が為されたことを確認した。
Transformation of Bacillus subtilis was performed as follows.
That is, the Bacillus subtilis strain is SPI medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% glucose, 0.02% casamino acid (Difco) , 5 mM magnesium sulfate, 0.25 μM manganese chloride, 50 μg / ml tryptophan) at 37 ° C. with shaking until the degree of growth (OD600) is about 1. After shaking culture, a portion of the culture broth was added to 9 times the amount of SPII medium (0.20% ammonium sulfate, 1.40% dipotassium hydrogen phosphate, 0.60% potassium dihydrogen phosphate, 0.10% trisodium citrate dihydrate, 0.50% Inoculate glucose, 0.01% casamino acid (Difco), 5 mM magnesium sulfate, 0.40 μM manganese chloride, 5 μg / ml tryptophan), and further shake culture until the growth degree (OD600) is about 0.4. A competent cell was prepared. Next, 5 μL of a solution containing various DNA fragments (SOE-PCR reaction solution, etc.) is added to 100 μL of the prepared competent cell suspension (culture medium in SPII medium), shaken at 37 ° C. for 1 hour, LB agar medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar) containing the whole amount was smeared. After static culture at 37 ° C., the grown colonies were isolated as transformants. The genome of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed that the intended genomic structure was altered by PCR using this as a template.
培養上清中のアミラーゼの活性測定には、リキテックAmy EPS(ロシュ・ダイアグノスティック社)を使用した。すなわち1% NaCl-1/7.5M リン酸緩衝液 (pH7.4 和光純薬工業)で適宜希釈したサンプル溶液50μLに、100μLのR1・R2混合液(R1(カップリング酵素)：R2(アミラーゼ基質)=5：1(Vol.))を加えて混和し、30℃にて反応を行った際に遊離するp-ニトロフェノール量を405nmにおける吸光度(OD405nm)変化により定量した。1分間に1μmolのp-ニトロフェノールを遊離させる酵素量を1Uとした。 Liquitech Amy EPS (Roche Diagnostics) was used for measuring the amylase activity in the culture supernatant. In other words, 50 μL of a sample solution appropriately diluted with 1% NaCl-1 / 7.5 M phosphate buffer (pH 7.4 Wako Pure Chemical Industries) was added to 100 μL of R1 and R2 mixture (R1 (coupling enzyme): R2 (amylase substrate) ) = 5: 1 (Vol.)) Was added and mixed, and the amount of p-nitrophenol released when the reaction was performed at 30 ° C. was quantified by the change in absorbance (OD405 nm) at 405 nm. The amount of enzyme that liberates 1 μmol of p-nitrophenol per minute was defined as 1 U.
実施例１ ゲノム中sigX遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換
図１に基づいて、ゲノム中sigX遺伝子の薬剤耐性遺伝子による置換方法を説明する。尚、sigX遺伝子は枯草菌のECF（extracytoplasmic function）ファミリーに属するシグマ因子の一つであるSigXをコードする遺伝子である。
枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型とし、表に示したsigX/Cm-F及びsigX-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigX遺伝子の上流に隣接する0.6kb断片（A）をPCRにより増幅した。また、上記ゲノムDNAを鋳型とし、sigX-F及びsigX/Cm-Rのプライマーセットを用いて、ゲノム中のsigX遺伝子の下流に隣接する0.6kb断片（B）をPCRにより増幅した。
Example 1 Replacement of a sigX gene in a genome with a drug resistance gene A method of replacing a sigX gene in a genome with a drug resistance gene will be described with reference to FIG. The sigX gene encodes SigX, which is one of the sigma factors belonging to the ECF (extracytoplasmic function) family of Bacillus subtilis.
Using a genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain as a template, using the primer set of sigX / Cm-F and sigX-R shown in the table, a 0.6 kb fragment (A) adjacent to the upstream of the sigX gene in the genome Amplified by PCR. In addition, a 0.6 kb fragment (B) adjacent to the downstream of the sigX gene in the genome was amplified by PCR using the genomic DNA as a template and a primer set of sigX-F and sigX / Cm-R.
さらに、プラスミドpC194（J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)）のクロラムフェニコール耐性遺伝子をプラスミドｐＵＣ１８のＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ切断点に挿入した組換えプラスミドpCBB31を鋳型とし、表１に示したCmF及びCmRのプライマーセットを用いて、1kbのクロラムフェニコール（Cm）耐性遺伝子領域（C）をPCRにより調製した。
次に、図１に示すように、得られた0.6kb断片（A）、0.6kb断片（B）及びCm耐性遺伝子領域（C）の3断片を混合して鋳型として、sigX-R及びsigX-Fのプライマーセットを用いたSOE-PCR法によって、3断片が0.6kb断片（A）、Cm耐性遺伝子領域（C）、0.6kb断片（B）の順に含まれる2.2kbのDNA断片（D）を得た。
Furthermore, the recombinant plasmid pCBB31 in which the chloramphenicol resistance gene of the plasmid pC194 (J. Bacteriol. 150 (2), 815 (1982)) was inserted at the XbaI-BamHI breakpoint of the plasmid pUC18 was used as a template and shown in Table 1. A 1 kb chloramphenicol (Cm) resistance gene region (C) was prepared by PCR using the CmF and CmR primer sets.
Next, as shown in FIG. 1, three fragments of the obtained 0.6 kb fragment (A), 0.6 kb fragment (B), and Cm resistant gene region (C) were mixed and used as templates to prepare sigX-R and sigX- By SOE-PCR using the F primer set, a 2.2 kb DNA fragment (D) containing 3 fragments in the order of 0.6 kb fragment (A), Cm resistance gene region (C), and 0.6 kb fragment (B). Obtained.
さらに、コンピテントセル形質転換法によって、得られたDNA断片（D）を用いて、168株の形質転換を行った。形質転換後、クロラムフェニコール（10μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
得られた形質転換体のゲノムDNAを抽出し、PCRによってsigX遺伝子がCm耐性遺伝子に置換していることを確認した。以上のようにして、sigX遺伝子欠失株（ΔsigX株）を構築した。
Furthermore, 168 strains were transformed using the obtained DNA fragment (D) by the competent cell transformation method. After transformation, colonies that grew on the LB agar medium containing chloramphenicol (10 μg / mL) were isolated as transformants.
Genomic DNA of the obtained transformant was extracted, and it was confirmed by PCR that the sigX gene was replaced with a Cm resistant gene. As described above, a sigX gene deletion strain (ΔsigX strain) was constructed.
実施例２ prsA遺伝子発現強化株の構築
以下の様に、prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った（図２参照）。枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示したPVG-FWとPVG-R、及びprsA/PVG-FとprsA/Em2-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ａ）、及びprsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ｂ）をPCRにより増幅した。またプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表１に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表１に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がprsA遺伝子の上流に連結し（spoVG遺伝子の開始コドンの位置にprsA遺伝子の開始コドンが位置する様に連結）、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示したybdOfwとybdO/PVGr、及びybxG/EmfとybxGrvのプライマーセットを用いてybxG遺伝子の上流に位置するybdO遺伝子領域を含む1.1kb断片（Ｅ）、及びybxG遺伝子領域を含む1.1kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表に示したybdOfw2とybxGrv2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にエリスロマイシン耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がybdO遺伝子領域とybxG遺伝子領域の間の非遺伝子領域に挿入された総塩基長4.4kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.4kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
Example 2 Construction of prsA gene-enhanced strain A mutant strain with enhanced prsA gene expression was constructed as follows (see FIG. 2). Using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, transcription start control of the spoVG gene using the primer sets of PVG-FW and PVG-R and prsA / PVG-F and prsA / Em2-R shown in Table 2 A 0.2 kb fragment (A) containing the region and the ribosome binding site and a 0.9 kb fragment (B) containing the prsA gene were amplified by PCR. A 1.3 kb fragment (C) containing the erythromycin (Em) resistance gene was amplified by PCR using plasmid pMUTIN4 (Microbiology. 144, 3097 (1998)) as a template and using the primer set of emf2 and emr2 shown in Table 1. . Next, the obtained (A), (B), and (C) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the PVG-FW2 and emr2 primer sets shown in Table 1 was performed to obtain 3 fragments. (a) (B) bonded to as made in the order of (C), the start codon of prsA gene at the position of initiation codon of the transcription initiation regulatory region and the ribosome binding site of spoVG gene is linked upstream of prsA gene (spoVG gene And a 2.4 kb DNA fragment (D) with an Em resistance gene bound downstream thereof was obtained. Subsequently, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, the ybdO gene region located upstream of the ybxG gene using the ybdOfw and ybdO / PVGr and ybxG / Emf and ybxGrv primer sets shown in Table 2 is included. A 1.1 kb fragment (E) and a 1.1 kb fragment (F) containing the ybxG gene region were amplified by PCR. Next, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to form a template, and SOE-PCR using the ybdOfw2 and ybxGrv2 primer sets shown in the table was performed to obtain the 3 fragments (E) (D) A 2.4 kb DNA fragment in which the prsA gene is ligated downstream of the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site, and the erythromycin resistance gene is further ligated downstream thereof. A DNA fragment (G) having a total base length of 4.4 kb inserted in the non-gene region between the ybdO gene region and the ybxG gene region was obtained. The obtained 4.4 kb DNA fragment (G) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain by competent cell method and grown on LB agar medium containing erythromycin (1 μg / mL) and lincomycin (25 μg / mL). Colonies were isolated as transformants.
得られた形質転換体から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示すybdOfとprsA/Em2-R、及びprsA/PVG-FとybxGrvのプライマーセットを用いたPCRを行うことによって2.2kb及び3.2kbのDNA断片の増幅を確認し、枯草菌168株ゲノム上のybxG遺伝子上流非遺伝子領域の内部にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入されたことを確認した。この様にして得られた菌株をprsA-Ka株と命名した。また上記形質転換における168株に替えて実施例１にて構築したΔsigX株を用いることにより、ΔsigX株ゲノム中のybxG遺伝子上流非遺伝子領域の内部にspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結したDNA断片が挿入された菌株（prsAKΔsigX株）を構築した。 Using genomic DNA extracted from the obtained transformant as a template, PCR was performed using the primer sets of ybdOf and prsA / Em2-R and prsA / PVG-F and ybxGrv shown in Table 2 to obtain 2.2 kb and 3.2 kb. After confirming the amplification of the kb DNA fragment, a DNA fragment linked to the transcription initiation control region of the spoVG gene and the prsA gene downstream of the ribosome binding site was inserted inside the ybxG gene upstream non-gene region on the genome of Bacillus subtilis 168. I confirmed that. The strain obtained in this way was named prsA-Ka strain. In addition, by using the ΔsigX strain constructed in Example 1 instead of the 168 strain in the above transformation, the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site are located inside the non-gene region upstream of the ybxG gene in the genome of ΔsigX strain. A strain (prsAKΔsigX strain) in which a DNA fragment linked with the prsA gene was inserted downstream was constructed.
実施例３ アルカリアミラーゼ分泌生産評価
実施例１及び２にて得られたΔsigX株、prsA-Ka株及びprsAKΔsigX株の異種タンパク質生産性評価は、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるバチルス属細菌由来のアルカリアミラーゼの生産性を指標として以下の様に行った。
バチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-K38株（FERM BP-6946）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示されるK38matu-F2(ALAA)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリアミラーゼ（特開2000-184882号公報、Eur.J.Biochem.,268,2974,2001）をコードする配列番号４で示される塩基配列の1.5kbのDNA断片（Ｈ）を増幅した。またバチルス エスピー（Bacillus sp.）KSM-S237株（FERM BP-7875）より抽出したゲノムDNAを鋳型として、表３に示されるS237ppp-F2(BamHI)とS237ppp-R2(ALAA)のプライマーセットを用いてPCRを行い、アルカリセルラーゼ遺伝子（特開2000-210081号公報）の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域と、及び分泌シグナル配列をコードする領域を含む0.6kbのDNA断片（I）を増幅した。次いで、得られた（Ｈ）（Ｉ）の2断片を混合して鋳型とし、表３に示されるS237ppp-F2(BamHI)とSP64K38-R(XbaI)のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、アルカリセルラーゼ遺伝子の転写開始制御領域、翻訳開始制御プロモーター領域と、及び分泌シグナル配列をコードする領域の下流にアルカリアミラーゼ遺伝子が連結した2.1kbのDNA断片（Ｊ）を得た。得られた2.2kbのDNA断片（Ｊ）をシャトルベクターpHY300PLK（ヤクルト）のBamHI-XbaI制限酵素切断点に挿入し、アルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を構築した。
Example 3 Evaluation of Alkaline Amylase Secretion Production The heterologous protein productivity evaluation of the ΔsigX strain, prsA-Ka strain and prsAKΔsigX strain obtained in Examples 1 and 2 was derived from a Bacillus bacterium comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5. The production was carried out as follows using the productivity of alkaline amylase as an index.
Using genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-K38 strain (FERM BP-6946) as a template, using the primer set of K38matu-F2 (ALAA) and SP64K38-R (XbaI) shown in Table 3 PCR is performed to amplify a 1.5 kb DNA fragment (H) of the base sequence represented by SEQ ID NO: 4 encoding alkaline amylase (JP 2000-184882, Eur. J. Biochem., 268, 2974, 2001) did. In addition, using the genomic DNA extracted from Bacillus sp. KSM-S237 strain (FERM BP-7875) as a template, S237ppp-F2 (BamHI) and S237ppp-R2 (ALAA) primer sets shown in Table 3 were used. PCR is performed to amplify a 0.6 kb DNA fragment (I) containing the transcription initiation control region of the alkaline cellulase gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210081), the translation initiation control promoter region, and the region encoding the secretory signal sequence. did. Subsequently, the obtained 2 fragments of (H) (I) are mixed to form a template, and SOE-PCR using the S237ppp-F2 (BamHI) and SP64K38-R (XbaI) primer sets shown in Table 3 is performed. Thus, a 2.1 kb DNA fragment (J) was obtained in which the alkaline amylase gene was linked downstream of the transcription initiation control region, translation initiation control promoter region of the alkaline cellulase gene, and the region encoding the secretory signal sequence. The obtained 2.2 kb DNA fragment (J) was inserted into the BamHI-XbaI restriction enzyme cleavage point of shuttle vector pHY300PLK (Yakult) to construct alkaline amylase productivity evaluation plasmid pHYK38 (S237ps).
実施例１及び２にて得られたΔsigX株、prsA-Ka株、prsAKΔsigX株及び枯草菌168株にアルカリアミラーゼ生産性評価用プラスミドpHYK38(S237ps)を、プロトプラスト形質転換法によって導入した。これによって得られた菌株を10ｍＬのLB培地で一夜37℃で振盪培養を行い、更にこの培養液0.05mLを50mLの2xL−マルトース培地（2％トリプトン、1％酵母エキス、1％NaCl、7.5％マルトース、7.5ppm硫酸マンガン4-5水和物、15ppmテトラサイクリン）に接種し、30℃で3日間、振盪培養を行った。培養後、遠心分離によって菌体を除いた培養液上清のアルカリアミラーゼ活性を測定し、培養によって菌体外に分泌生産されたアルカリアミラーゼの量を求めた。この結果、表４に示した様に、宿主としてΔsigX株およびprsA-Ka株を用いた場合、対照の168株（野生型）の場合と比較して高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められた。ΔsigX株においては、SigX制御下の遺伝子が発現しなくなるものと推測されるが、一方でSigXの働きを抑制するrsiX遺伝子の欠失によって酵素生産性が向上することが知られており、SigX制御下の遺伝子がより多く発現することが蛋白質の分泌生産には有効であると考えられている（特許文献１参照）。このことからΔsigX株におけるアルカリアミラーゼの生産性向上には、従来の知見では解釈し得ない未知の因子が介在している可能性が示唆された。prsA-Ka株についてはprsA遺伝子の発現が野生株より高まり、細胞膜上のPrsAタンパク質量が増加したことにより、タンパク質の分泌効率が向上した結果によるものと推測された。また宿主としてprsAKΔsigX株を用いた場合、ΔsigX株、prsA-Ka株を宿主として用いた場合よりも更に高いアルカリアミラーゼの分泌生産が認められ、prsA遺伝子の発現強化とsigX遺伝子欠失の組合せの優れた有効性が示された。 A plasmid pHYK38 (S237ps) for evaluating the productivity of alkaline amylase was introduced into the ΔsigX strain, prsA-Ka strain, prsAKΔsigX strain and Bacillus subtilis 168 strain obtained in Examples 1 and 2 by the protoplast transformation method. The resulting strain was shaken and cultured overnight at 37 ° C. in 10 mL of LB medium, and 0.05 mL of this culture solution was added to 50 mL of 2 × L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% Maltose, 7.5 ppm manganese sulfate 4-5 hydrate, 15 ppm tetracycline) and shaking culture at 30 ° C. for 3 days. After culturing, the alkaline amylase activity of the culture supernatant after removing the cells by centrifugation was measured, and the amount of alkaline amylase secreted and produced outside the cells by the culture was determined. As a result, as shown in Table 4, when the ΔsigX strain and the prsA-Ka strain were used as hosts, a higher secretory production of alkaline amylase was observed compared to the control 168 strain (wild type). In the ΔsigX strain, it is speculated that the gene under the control of SigX will not be expressed. On the other hand, it is known that deletion of the rsiX gene that suppresses the action of SigX improves enzyme productivity, and SigX control It is considered that more expressed genes below are effective for protein secretory production (see Patent Document 1). This suggests that an unknown factor that cannot be interpreted by conventional knowledge is mediated by the improvement in alkaline amylase productivity in the ΔsigX strain. For the prsA-Ka strain, it was speculated that the prsA gene expression was higher than that of the wild strain and the amount of PrsA protein on the cell membrane was increased, resulting in improved protein secretion efficiency. In the case of using the prsAKΔsigX strain as the host, DerutasigX strain observed secretory production of higher alkali amylase than with the prsA-Ka strain as a host, an excellent combination of enhanced expression and sigX gene deletion of prsA gene The effectiveness was shown.
実施例４ バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子発現強化とsigX遺伝子欠失との組み合わせにおけるアルカリアミラーゼ分泌生産評価
バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子（配列番号３３）は、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子である。実施例２の方法と同様の方法にて、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の発現を強化した変異株の構築を行った。すなわち、バチルス セレウス（Bacillus cereus）から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表５に示したBce/PVG-FとBce/emf2-Rのプライマーセットを用いてバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子を含む0.9kb断片（Ａ）をPCRにより増幅した。また枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表２に示したPVG-FWとPVG-Rのプライマーセットを用いてspoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位を含む0.2kb断片（Ｂ）を増幅した。更にプラスミドpMUTIN4（Microbiology. 144, 3097 (1998)）を鋳型として、表２に示したemf2とemr2のプライマーセットを用いてエリスロマイシン（Em）耐性遺伝子を含む1.3kb断片（Ｃ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）3断片を混合して鋳型とし、表２に示したPVG-FW2とemr2のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｂ）（Ａ）（Ｃ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位がバチルス セレウス（Bacillus cereus）由来prsA遺伝子の上流に連結し、更にその下流にEm耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片（Ｄ）を得た。続いて枯草菌168株から抽出したゲノムDNAを鋳型として、表５に示したamyEfw2とamyE/PVG2-R、及びamyE/Em2-FとamyErv2のプライマーセットを用いてamyE遺伝子の5'側領域を含む1.0kb断片（Ｅ）、及びamyE遺伝子の3'側領域を含む1.0kb断片（Ｆ）をPCRにより増幅した。次いで、得られた（Ｅ）（Ｆ）（Ｄ）3断片を混合して鋳型とし、表５に示したamyEfw1とamyErv1のプライマーセットを用いたSOE-PCRを行うことによって、3断片を（Ｅ）（Ｄ）（Ｆ）の順になる様に結合させ、spoVG遺伝子の転写開始制御領域とリボソーム結合部位の下流にprsA遺伝子が連結し、更にその下流にエリスロマイシン耐性遺伝子が結合した2.4kbのDNA断片がamyE遺伝子の中央に挿入された総塩基長4.4kbのDNA断片（Ｇ）を得た。得られた4.4kbのDNA断片（Ｇ）を用いてコンピテントセル法により枯草菌168株を形質転換し、エリスロマイシン（1μg/mL）とリンコマイシン（25μg/mL）を含むLB寒天培地上に生育したコロニーを形質転換体として分離した。
次いで、実施例1と同様の方法にて、prsAbc-K株のゲノム上よりsigX遺伝子をクロラムフェニコール耐性遺伝子にて置換したprsAbcKΔsigX株を構築した。
構築した上記prsAbc-K株及びprsAbcKΔsigX株について、実施例２と同様の方法によりアルカリアミラーゼ分泌生産評価を行った。対照として枯草菌168株とΔsigX株についても評価を行った。その結果、表６に示すようにprsAbc-K株にて168株を大きく上回る分泌生産が認められた。更にprsAbc-K株よりsigX遺伝子を欠失した菌株においては一層顕著な生産性向上が認められ、実施例３で見られたのと同様、バチルス セレウス（Bacillus cereus）由来のprsA遺伝子発現強化とsigX遺伝子欠失との組み合わせがアルカリアミラーゼ分泌生産量向上に対し、効果的に作用したものと考えられた。すなわち、枯草菌prsA遺伝子に相当する遺伝子を用いれば、枯草菌prsA遺伝子を用いた場合と同様の有効性が得られることが確認された。
EXAMPLE 4 Bacillus cereus (Bacillus cereus) from prsA gene expression enhancement and alkaline amylase secretory production evaluation in combination with sigX gene deletion Bacillus cereus (Bacillus cereus) derived prsA gene (SEQ ID NO: 33), the Bacillus subtilis prsA gene The corresponding gene. In the same manner as in Example 2, a mutant strain with enhanced expression of the Bacillus cereus- derived prsA gene was constructed. In other words, using the genomic DNA extracted from Bacillus cereus as a template and the Bce / PVG-F and Bce / emf2-R primer sets shown in Table 5, the Bacillus cereus- derived prsA gene is included. A 0.9 kb fragment (A) was amplified by PCR. In addition, using genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 strain as a template, and using the primer set of PVG-FW and PVG-R shown in Table 2, a 0.2 kb fragment containing the transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site (B ) Was amplified. Furthermore, a 1.3 kb fragment (C) containing the erythromycin (Em) resistance gene was amplified by PCR using plasmid pMUTIN4 (Microbiology. 144, 3097 (1998)) as a template and using the primer set of emf2 and emr2 shown in Table 2. . Next, the 3 fragments obtained by mixing the obtained (A), (B) and (C) 3 fragments into a template and performing SOE-PCR using the PVG-FW2 and emr2 primer sets shown in Table 2 were obtained. (B) The transcription initiation control region of the spoVG gene and the ribosome binding site are linked upstream of the Bacillus cereus- derived prsA gene, and further downstream of the Em resistance. A 2.4 kb DNA fragment (D) to which the gene was bound was obtained. Subsequently, using the genomic DNA extracted from Bacillus subtilis 168 as a template, the 5 'region of the amyE gene was identified using the amyEfw2 and amyE / PVG2-R and amyE / Em2-F and amyErv2 primer sets shown in Table 5. The 1.0 kb fragment containing (E) and the 1.0 kb fragment containing the 3 ′ region of the amyE gene (F) were amplified by PCR. Subsequently, the obtained (E) (F) (D) 3 fragments were mixed to serve as a template, and SOE-PCR using the amyEfw1 and amyErv1 primer sets shown in Table 5 was performed to obtain 3 fragments (E ) (D) (F), a 2.4 kb DNA fragment in which the transcription initiation control region of the spoVG gene and the prsA gene are linked downstream of the ribosome binding site and the erythromycin resistance gene is further linked downstream Obtained a DNA fragment (G) having a total base length of 4.4 kb inserted in the center of the amyE gene. The obtained 4.4 kb DNA fragment (G) was transformed into Bacillus subtilis 168 strain by competent cell method and grown on LB agar medium containing erythromycin (1 μg / mL) and lincomycin (25 μg / mL). Colonies were isolated as transformants.
Subsequently, a prsAbcKΔsigX strain was constructed by replacing the sigX gene with a chloramphenicol resistance gene from the genome of the prsAbc-K strain in the same manner as in Example 1.
About the constructed prsAbc-K strain and prsAbcKΔsigX strain, alkaline amylase secretion production was evaluated in the same manner as in Example 2. As controls, Bacillus subtilis 168 and ΔsigX were also evaluated. As a result, as shown in Table 6, the prsAbc-K strain showed secretory production far exceeding 168 strains. Furthermore, in the strain lacking the sigX gene from the prsAbc-K strain, a further remarkable improvement in productivity was observed, and as seen in Example 3, the expression enhancement of the prsA gene derived from Bacillus cereus and the sigX It was considered that the combination with the gene deletion effectively acted on the increase in production of alkaline amylase secretion. That is, the use of the gene corresponding to the Bacillus subtilis prsA gene, it was confirmed that the effectiveness of the same in the case of using the Bacillus subtilis prsA gene is obtained.
Claims (7)
（１）配列番号１で示される塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（２）配列番号１で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（３）配列番号２で示されるアミノ酸配列と９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。
（４）配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、且つ枯草菌PrsAタンパク質と機能的に等価なタンパク質をコードするＤＮＡからなる遺伝子。 The recombinant microorganism according to any one of claims 1 to 4 , wherein the gene corresponding to the prsA gene is a gene selected from the following (1) to (4).
(1) A gene comprising a DNA comprising a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encoding a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein.
(2) A gene comprising a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and encodes a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein .
(3) A gene comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 and a DNA encoding a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein.
(4) From an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been deleted, substituted or added, and encoding a protein functionally equivalent to the Bacillus subtilis PrsA protein The gene that becomes.
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