JP7336461B2 - 肝癌によく見られた複数の変異を同時に検出するｃｔＤＮＡライブラリーの構築及びシークエンシングデータの分析の方法 - Google Patents

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Description

本発明は、肝癌によく見られた複数の変異を同時に検出するｃｔＤＮＡライブラリーの構築及びシークエンシングデータの分析の方法に関する。
ｃｔＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ）である循環腫瘍ＤＮＡは、血液、脳脊髄液などの体液中に存在し、細胞外に遊離する腫瘍ＤＮＡを指す。ｃｔＤＮＡは通常、血液中の正常細胞由来の遊離ＤＮＡと混ざっており、ｃｆＤＮＡ（ｃｅｌｌｆｒｅｅ ＤＮＡ、セルフリーDNA）と呼ばれている。ｃｔＤＮＡの変異を検出することにより、標的投薬、治療のモニタリングや癌の早期スクリーニングなどを導くことができる。ｃｔＤＮＡに基づく検出方法は、以下を含む。１）ＰＣＲに基づくホットスポット突然変異検出法：通常、１つ又は複数のホットスポット突然変異又は既知の突然変異を検出するが、遺伝子融合などの複雑な突然変異を検出できず、未知の突然変異は検出できない。２）捕捉／次世代シークエンシング：複雑な突然変異を含む多数の遺伝子の位置突然変異を検出することが可能であるが、捕捉キットは一般的に高価であり、操作が煩雑であり、時間がかかる。以上の２つの方法では、現在、ｃｔＤＮＡの検出には以下の難問が存在する。１）１回の採血で得られるｃｔＤＮＡサンプルの量は限られており、通常は１回の検出をサポートするしかできないため、ｃｔＤＮＡの臨床検出では通常は単一プラットフォームで使い捨て型であり、低コストのホットスポット突然変異法を使用して１つの突然変異を検出すると、他の突然変異を検出することができない。しかし、臨床検査では、初回検査の結果に基づいて後続検査の目標やスキームを判定する必要があり、このため、後続の検査で再採血する必要がある。また、ｃｔＤＮＡに関連する臨床検査や研究ではしばしば多くの技術の優劣を比較する必要があり、これには正常採血量の数倍の標本が必要となり、通常患者により受け入れられない。２）ＰＣＲ法と捕捉法にかかわらず、増幅過程で発生するノイズ突然変異はｃｔＤＮＡの低頻度突然変異の検出をひどく妨害し、偽陽性結果をもたらし、患者の診断や治療を誤解させる。３）ｃｔＤＮＡ突然変異の含有量が低く、操作過程で汚染が発生しやすく、偽陽性結果をもたらしやすい。
肝癌は、世界で発病率が第５位、死亡率が第２位の、よく見られる腫瘍であり、世界の半分以上の肝癌は中国で発生し、しかもＢ型肝炎関連性肝癌が主である。Ｂ型肝炎関連性肝癌にはＫＲＡＳ、ＢＲＡＦなどのホットスポット突然変異がほとんどなく、その変異は主にＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１などのいくつかの遺伝子のコード領域突然変異、ＴＥＲＴのＧＣリッチプロモーター領域突然変異であり、またＨＢＶ組み込み、ＴＥＲＴコピー数変異などの複雑な変異を含む。このため、現在、簡便で低コストで信頼性の高い肝癌のｃｔＤＮＡ突然変異の検出手段やシステムが存在しない。ｃｔＤＮＡ検出は、肝癌の早期スクリーニング、病状追跡、治療効果評価、予後予測などに対して臨床的に重要である。
本発明の目的は、肝癌によく見られた複数の変異を同時に検出するｃｔＤＮＡライブラリーの構築及びシークエンシングデータの分析の方法を提供することである。
本発明は、
ＤＮＡサンプルに対して末端修復及び３’末端のＡテーリングを順次行うステップ（１）と、
ステップ（１）で処理したＤＮＡサンプルをリンカー混合物と連結し、ＰＣＲにより増幅してライブラリーを得るステップ（２）と、を含み、
前記リンカー混合物は、ｎ個のリンカーからなっていてもよく、
各リンカーは、１本の上流プライマー甲と１本の下流プライマー甲とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、上流プライマー甲にはシークエンシングリンカー甲、ランダムタグ、アンカー配列甲及び３’末端に位置する塩基Ｔがあり、下流プライマー甲にはアンカー配列乙及びシークエンシングリンカー乙があり、前記部分的な二本鎖構造は上流プライマーのアンカー配列甲と下流プライマーのアンカー配列乙とが逆相補することにより形成され、
前記シークエンシングリンカー甲及びシークエンシングリンカー乙は、異なるシークエンシングプラットフォームに応じて、選択された対応するシークエンシングリンカーであり、
前記ランダムタグは８～１４ｂｐのランダム塩基であってもよく、
前記アンカー配列甲は、長さが１４～２０ｂｐであり、連続する繰り返し塩基が３個以下であり、
ｎ個のリンカーはｎ個の異なるアンカー配列甲を採用し、かつ同じ位置の塩基が平衡し（塩基多様性を有し）ておりミスマッチ塩基数が３より大きく、
ｎは８以上の任意の自然数である、シーケンシングライブラリーの構築方法を提供する。
前記アンカー配列は、プライマーの他の部分と相互作用しない（例えば、ヘアカード構造、ダイマーなどを形成しない）。
前記上流プライマー甲は、５’末端から順にシークエンシングリンカー甲、ランダムタグ、アンカー配列甲、及び塩基Ｔであってもよい。
前記下流プライマー甲は、５’末端から順にアンカー配列乙、及びシークエンシングリンカー乙であってもよい。
上記では、通常、ライブラリーを構築するためのリンカーは２本の配列をアニーリングしてなり、「Ｙ」型構造を呈しており、２本の配列間の相補する部分（即ち、アンカー配列甲とアンカー配列乙）はアンカー配列と呼ばれる。前記アンカー配列は、元のテンプレート分子を標識するための、配列が固定した組込みタグとして使用することができる。
前記「同じ位置の塩基が平衡している」は、前記リンカー混合物中のｎ個のアンカー配列甲間の開始塩基から末端塩基までの各位置に塩基が平衡しており、すなわちＡ、Ｔ、Ｃ及びＧが均等に分布していてもよい。
前記「ミスマッチ塩基数が３より大きく」は、前記リンカー混合物にｎ個のアンカー配列甲を含み、各アンカー配列甲の間に少なくとも３つの異なる塩基を有していてもよい。この違いは、位置が異なる場合も、順序が異なる場合もある。
前記ＤＮＡサンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ又はｃｆＤＮＡサンプルであってもよい。
前記ｎは、具体的には１２であってもよい。
前記ランダムタグは、具体的には８ｂｐのランダム塩基であってもよい。
前記アンカー配列甲の長さは、具体的には１２ｂｐであってもよい。
ｎ＝１２の場合、前記アンカー配列甲のヌクレオチド配列は、具体的には、それぞれ配列表の配列１の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列３の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列５の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列７の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列９の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１１の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１３の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１５の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１７の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１９の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列２１の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列２３の５’末端からの３０～４１位に示されてもよい。
前記シーケンシングリンカーＡは、具体的には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕｓｅｑシーケンシングキットに由来するシーケンシングリンカーであってもよい。前記シーケンシングリンカーＡは、具体的には、配列表の配列１の５’末端からの１位～２９位に示されてもよい。
前記シーケンシングリンカーＢは、具体的には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のｎｅｘｔｅｒａキットに由来するシーケンシングリンカーであってもよい。前記シーケンシングリンカーＢは、具体的には、配列表の配列２の５’末端からの１３位～４１位に示されてもよい。
ｎ＝１２の場合、前記１２個のリンカーは次のとおりである。
リンカー１は、配列表の配列１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー２は、配列表の配列３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列４で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー３は、配列表の配列５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列６で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー４は、配列表の配列７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列８で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー５は、配列表の配列９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１０で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー６は、配列表の配列１１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１２で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー７は、配列表の配列１３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１４で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー８は、配列表の配列１５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１６で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー９は、配列表の配列１７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１８で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー１０は、配列表の配列１９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２０で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー１１は、配列表の配列２１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２２で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー１２は、配列表の配列２３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２４で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分二本鎖構造を形成することにより得られてもよい。
前記リンカーは、上流プライマー甲と下流プライマー甲とをアニーリングすることにより得ることができる。
前記リンカー混合物には、各リンカーが等モルで混合されていてもよい。
前記方法はまた、ステップ（２）で得られたライブラリーを増幅するステップをさらに含んでもよい。前記増幅のプライマーはリンカー配列に従って設計される。具体的には、前記増幅のプライマーは、少なくとも１つの部分の配列がリンカーのある部分の配列とマッチしていなければならない。前記増幅に使用されるプライマー対は、具体的には、配列表の配列２５及び配列２６で示される２本の一本鎖ＤＮＡ分子からなってもよい。
本発明はまた、上記方法によって構築されたＤＮＡライブラリーを保護する。
本発明はまた、上記のいずれかに記載のリンカー混合物を含む、シーケンシングライブラリーを構築するためのキットを保護する。
前記キットはまた、ＤＮＡ抽出用試薬、ＤＮＡライブラリー構築用試薬、ライブラリー精製用試薬、ライブラリー捕捉用試薬などのライブラリー構築用材料をさらに含んでもよい。
本発明はまた、上記のいずれかに記載のリンカー混合物とプライマー組み合わせを含む、ＤＮＡサンプル中の肝癌変異を検出するためのキットを保護し、前記プライマー組み合わせは、プライマーセットＩ、プライマーセットＩＩ、プライマーセットＩＩＩ、及びプライマーセットＩＶを含み、
前記プライマーセットＩ及びプライマーセットＩＩの各プライマーは、肝癌に関連する領域に基づいて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定の位置に局在し、ターゲット領域のＰＣＲによる濃縮を実現する役割を果たす。
前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶ中の各プライマーのヌクレオチド配列は、「リンカー配列＋特異配列」からなり、特異配列は、ターゲット領域の更なる濃縮に使用され、リンカー配列は、ＰＣＲにより完全なシーケンシング可能なライブラリー分子を形成することに使用される。
前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩは、「ネスト」の関係であってもよく、前記プライマーセットＩＶ及び前記プライマーセットＩＩは、「ネスト」の関係であってもよい。
前記肝癌に関連する領域は、具体的には、肝癌の高頻度変異遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１、ＴＥＲＴ）の関連領域とＨＢＶ組み込みに対するホットスポット領域であり得る。
前記プライマーセットＩは、具体的には、配列表の配列２８～配列１０５で示される一本鎖ＤＮＡからなってもよい。
前記プライマーセットＩＩは、具体的には、配列表の配列１０６～配列１８７で示される一本鎖ＤＮＡからなってもよい。
前記プライマーセットＩＩＩは、具体的には、配列表の配列１９１～配列２６５で示される一本鎖ＤＮＡからなってもよい。
前記プライマーセットＩＶは、具体的には、配列表の配列２６６～３４４で示される一本鎖ＤＮＡからなってもよい。
前記プライマー組み合わせは、具体的には、前記プライマーセットＩ、前記プライマーセットＩＩ、前記プライマーセットＩＩＩ、及び前記プライマーセットＩＶからなってもよい。
前記キットは、ＤＮＡ抽出用試薬、ＤＮＡライブラリー構築用試薬、ライブラリー精製用試薬、ライブラリー捕捉用試薬などのライブラリー構築用材料をさらに含んでもよい。
本発明はまた、上記プライマー組み合わせのいずれかを保護する。前記プライマー組み合わせの用途は、ＤＮＡサンプル中の肝癌変異を検出するためのキットを製造することであってもよい。
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の肝癌変異を検出するためのキットを製造するための上記プライマー組み合わせのいずれかの使用を保護する。
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の目標変異を検出するための方法であって、
前記のいずれかに記載する方法によってライブラリーを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）で得られたライブラリーに対して２ラウンドのネストＰＣＲ増幅を行い、産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシングの結果に基づいてＤＮＡサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ（２）と、を含み、
前記ステップ（２）では、プライマー組み合わせ甲を用いて１ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマー組み合わせ甲は、上流プライマー甲と下流プライマー甲とからなり、
前記上流プライマー甲は、ステップ（１）のライブラリー増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
前記下流プライマー組み合わせ甲は、ｎ個の目標ターゲットに基づいて設計されたｎ本のプライマーの組み合わせであり、
１ラウンド目のＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマー組み合わせ乙を用いて２ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、
プライマー組み合わせ乙は上流プライマー乙、下流プライマー組み合わせ乙、及びｉｎｄｅｘプライマーからなり、
前記上流プライマー乙の配列の一部は、１ラウンド目のＰＣＲ産物の増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
前記下流プライマー組み合わせ乙中のプライマーは、下流プライマー組み合わせ甲中の同一の目標ターゲットを検出するプライマーとネスト関係を形成し、各プライマーにはｉｎｄｅｘプライマーに結合するセグメントを有し、
前記ｉｎｄｅｘプライマーには、下流プライマー組み合わせ乙の各プライマーに結合するセグメント及びｉｎｄｅｘ配列を含む方法を保護する。
前記上流プライマー甲の配列の一部は、「各リンカーの上流プライマー甲のシーケンシングリンカーＡ」の配列と完全に同じである。
前記上流プライマー乙は、増幅産物を直接シーケンシングできるように、ライブラリー分子のリンカー配列を補完することに使用される。前記上流プライマー乙と前記上流プライマー甲（１ラウンド目のＰＣＲ増幅に使用されるプライマー）のヌクレオチド配列の一部は完全に同じである。
前記上流プライマー甲のヌクレオチド配列は、具体的には、配列表の配列２７に示すようにしてもよい。
前記上流プライマー乙のヌクレオチド配列は、具体的には、配列表の配列１８８に示すようにしてもよい。
前記ｉｎｄｅｘプライマーは、５’末端から、セグメントＡ、ｉｎｄｅｘ配列、及びセグメントＢを含むことができる。前記ｉｎｄｅｘプライマーは、具体的には、前記セグメントＡ、前記ｉｎｄｅｘ配列、及び前記セグメントＢからなってもよい。前記セグメントＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列１８９に示すようにしてもよい。前記セグメントＢのヌクレオチド配列は、配列表の配列１９０に示すようにしてもよい。
前記プライマー組み合わせ甲は、前記目標変異が肝癌変異である場合、以上のいずれのプライマーセットＩとプライマーセットＩＩとからなり、前記プライマー組み合わせ乙は、以上のいずれのプライマーセットＩＩＩとプライマーセットＩＶとからなる。プライマーセットＩとプライマーセットＩＩを用いて、それぞれテンプレートに対して１ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、プライマーセットＩを用いて増幅を行った産物を２ラウンド目の増幅のテンプレートとして、プライマーセットＩＩＩを用いて増幅を行い、プライマーセットＩＩを用いて増幅を行った産物を２ラウンド目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットＩＶを用いて増幅を行い、次に、増幅産物を等体積で混合する。
前記シークエンシング結果の分析方法は、次のようにしてもよい。ランダムタグ配列が同じであり、ＤＮＡ挿入断片の長さが同じであり、ＤＮＡ挿入断片の両端の切断点（ブレイクポイント）（即ちＤＮＡ断片の配列が一致（含まれる変異を除く））がすべて同じであるＤＮＡ分子シーケンシングデータを１つの分子クラスターに遡り、クラスター内の分子数が５よりも大きく、クラスター内の分子変異の一致率が８０％よりも大きく、クラスター数が５以上であれば、該変異は元のＤＮＡサンプルからの真の変異である。
本発明はまた、ＤＮＡサンプル中の複数の目標変異を検出する方法であって、
前記のいずれかに記載する方法によってライブラリーを構築するステップ（１）と、
ステップ（１）のライブラリーに対してターゲット領域濃縮を行ってシークエンシングし、シークエンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ（２）とを含む方法を保護する。
前記ターゲット領域の濃縮は、既存の市販の標的捕捉キット（例えば、Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的捕捉キット、Ａｇｉｌｅｎｔ５１９０－８６４６）を用いて行うことができ、その最終段階のＰＣＲ増幅のプライマー対をプライマー甲とプライマー乙からなるプライマー対に置き換える。前記プライマー甲のヌクレオチド配列は配列表の配列３４５に示すことができる。前記プライマー乙は、セグメントＡ、ｉｎｄｅｘ配列、及びセグメントＢを含むことができる。前記プライマー乙は、具体的には、前記セグメントＡ、前記ｉｎｄｅｘ配列、及び前記セグメントＢからなることができる。前記セグメントＡのヌクレオチド配列は、配列表の配列３４６に示すことができる。前記セグメントＢのヌクレオチド配列は、配列表の配列３４７に示すことができる。
前記シークエンシング結果の分析方法は、次のようにしてもよい。ＤＮＡ挿入断片の長さが同じであり、ＤＮＡ挿入断片の両端の切断点、両端のアンカー配列がすべて同じである初期ＤＮＡ一本鎖シークエンシングデータを１つの分子クラスターに遡り、挿入断片の長さが一致し、かつ変異点以外の配列が一致し、分子クラスターの両端のアンカー配列が同じであるが、その位置が反対である同一の開始ＤＮＡ二本鎖の分子クラスターを１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターと標識し、ある変異については，少なくとも１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターにより支持される場合、真と判断し、支持するｄｕｐｌｅｘ分子クラスターがなければ、少なくとも４つの分子クラスターにより支持される場合、真と判断する。
上記では、通常、複数の異なるサンプルのライブラリーが混合されてシーケンシングされ、前記ｉｎｄｅｘ配列は異なるサンプルを標識するために使用される。シークエンシングが完了した後、シークエンシングデータ全体を異なるｉｎｄｅｘ配列に基づいて分割する。Ｉｎｄｅｘの設計原則は、前述のアンカー配列の設計原則と基本的に類似している。
本発明は、以上の技術案を採用することにより、以下の利点を有する。
１、捕捉を必要とせずに、肝癌ｃｔＤＮＡ中の点突然変異、挿入欠失突然変異、ＨＢＶ組み込みなどの多種の変異の形式を同時に検出する。捕捉法と比べて、この技術は数本のＤＮＡプライマーだけでよく、高価な捕捉プローブとハイブリダイゼーション試薬を必要とせず、このため、コストが大幅に低下し、操作の手順が簡単であり、捕捉法の３６時間から８時間に短縮できる。
２、超小ターゲット領域の効率的な捕捉に適しており、ターゲット領域は捕捉法の最小ターゲット領域の１０％まで小さくすることができ、このように、シークエンシング効率を大幅に向上させることができる。例えば、肝癌によく見られる突然変異ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１、ＴＥＲＴ、ＨＢＶの組み合わせは本技術に適した超小ターゲット領域であり、捕捉法を用いてこのターゲット領域を濃縮する場合、標的捕捉率は１０％未満であるが、本技術の場合、８０％以上に達し、このため、シークエンシング効率を大幅に高め、シークエンシングコストを低下させる。
３、増幅されたライブラリーは、１回の検出を行った後、１０～２０回の後続の検出をサポートすることができ、各検出の結果は、感度及び特異性の低下を引き起こすことなく、すべての元のｃｔＤＮＡ標本の突然変異の状況を表すことができる。
４、ライブラリーの構築過程においてＤＮＡバーコードｂａｒｃｏｄｅを開始ｃｔＤＮＡ分子に連結し、生体情報分析プロセスと組み合わせることで、ｃｔＤＮＡ低頻度突然変異の高特異性検出を実現する。
５、本技術で構築されたライブラリーはＰＣＲのホットスポット検出と捕捉法によるシークエンシングの両方に用いることができ、しかも、１つの標本で構築されたライブラリーは同時に複数回の検出をサポートすることができ、添加されたＤＮＡ ｂａｒｃｏｄｅは偽陽性突然変異を効果的にフィルタリングすることができ、それにより、ｄｕｐｌｅｘに基づく高特異性シークエンシングが実現される。
本発明は、肝癌の早期スクリーニング、病状追跡、治療効果評価、予後予測などに対して臨床的に重要である。
ａｄａｐｔｅｒとプライマーの構造の模式図である。 ＲａｃｅＳｅｑターゲット領域の濃縮及びライブラリーの構築の模式図である。 ＭＣライブラリーによる捕捉及びｄｕｐｌｅｘシークエンシングの模式図である。
以下の実施例は、本発明をよりよく理解しやすくするが、本発明を限定するものではない。以下の実施例における実験方法は、特に断らない限り、いずれも常法である。下記実施例に用いる試験材料は、特に断らない限り、通常の生化学試薬店から購入したものである。以下の実施例における定量試験は、いずれも３回の反復実験を設定し、結果を平均値とした。
実施例１、ＭＣライブラリーの構築
一、ｃｆＤＮＡ分子の平滑末端修復とＡテーリング処理
ｃｆＤＮＡ １０～４５ｎｇを取り、表１に示すように反応系を調製し、次に、表２の手順に従ってＰＣＲ装置で末端修復及び３’末端のＡテーリングを行い、反応産物（４℃で保存）を得た。
Figure 0007336461000001
Figure 0007336461000002
二、ｃｆＤＮＡとａｄａｐｔｅｒとの連結
表３に示すように反応系を調製し、２０℃で１５ｍｉｎ反応させて、連結産物（４℃で保存）を得た。
Figure 0007336461000003
Ａｄａｐｔｅｒ Ｍｉｘの配列情報を表４に示す。
表４の一本鎖ＤＮＡをＴＥで溶解し、最終濃度１００μＭまで希釈した。同一グループの２本の一本鎖ＤＮＡを等体積（各５０μｌ）で混合し、アニーリング（アニーリング手順：９５℃、１５ｍｉｎ；２５℃、２ｈ）して１２グループのＤＮＡ溶液を得て、１２グループのＤＮＡ溶液を等体積で混合して、Ａｄａｐｔｅｒ Ｍｉｘを得た。
Figure 0007336461000004
Figure 0007336461000005
表４において、８個のＮは８ｂｐのランダムタグを表す。実際の応用では、ランダムタグの長さは８ｂｐ～１４ｂｐにすることができる。
下線は１２ｂｐのアンカー配列を表し、各グループの上流配列と下流配列において、下線部分は逆相補的であり、アニーリングにより上流配列と下流配列を結合してリンガーを形成することができる。また、アンカー配列は、元のテンプレート分子を標識するための配列が固定した組み込みタグとして使用することができる。実際の応用において、アンカー配列の長さは１２～２０ｂｐであってもよく、連続する繰り返し塩基は３個以下であり、しかもプライマーの他の部分と相互作用することができず（例えば、ヘアピン構造、ダイマーなどを形成しない）、１２グループの各位置の塩基は平衡しており、ｍｉｓｍａｔｃｈ塩基数は３よりも大きい。
上流配列中の末端にある太字にしたＴは、元の分子の末端に付加した「Ａ」と相補し、ＴＡで連結されている。
上流配列のうち、５’末端から１～２１位は、シーケンシングプライマー結合配列（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のＴｒｕｓｅｑシーケンシングキットから）であり、ここで、５’末端から１位～１９位はライブラリー増幅プライマー部分である。
下流配列のうち、非下線部分（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社のｎｅｘｔｅｒａシーケンシングキットから）はシーケンシングプライマー結合配列であり、ここで、３’末端から１位～２２位は設計ライブラリー増幅プライマー部分である。
表４には合計１２グループのリンカーが含まれており、１２×１２＝１４４種類の標識の組み合わせを形成することができ、分子自体の配列情報と組み合わせることで、元のサンプル中のすべての分子を区別するのに十分であり、実際の応用では、グループ数を適切に増加（合成コストが高くなる）又は減少（区別効果がやや弱い）することもできる。
連結産物の構造を図１に示す。ここで、ａはリンカー部分、ｂとｆはそれぞれライブラリー増幅プライマー、ｃは８ｂｐランダムタグ（表４中の８個のＮで示す）、ｄは１２ｂｐアンカー配列（表４中の下線で示す）、ｅは挿入断片（ｃｆＤＮＡ）である。
三、連結産物の精製
ステップ２で得られた連結産物にＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ１１０μｌ（ベックマンＡ６３８８０）を加え、ボルテックスで均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着させ、溶液が澄んだ後に上清を捨て、その後８０％（体積百分率含有量）エタノール水溶液２００μｌを加えて２回洗浄し、上清を捨て、エタノールを乾燥させた後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ３０μｌを加え、ボルテックスで均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着させ、上清溶液をＰＣＲチューブに吸引し、ＰＣＲテンプレートとした。
四、ライブラリーの増幅及び精製
１、ステップ３で得られたＰＣＲテンプレートを取り、表５に示すように反応系を調製し、表６に示すようにＰＣＲ増幅を行い、ＰＣＲ増幅産物を得た（４℃で保存）。
Figure 0007336461000006
表５において、プライマー情報は以下の通りである。
ＭＣ＿Ｆ（配列２５）：ＧＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ（５’－３’）；
ＭＣ＿Ｒ（配列２６）：ＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ（５’－３’）。
Figure 0007336461000007
２、ステップ１で得られたＰＣＲ増幅産物にＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ９０μｌを加え、ボルテックスで均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着させ、溶液が澄んだ後に上清を捨て、その後８０％（体積百分率含有量）エタノール水溶液２００μｌを加えて２回洗浄し、上清を捨て、エタノールを乾燥させた後、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ １００μｌを加え、ボルテックスで均一に混合し、室温で１０ｍｉｎ放置し、磁気ラックで５ｍｉｎ吸着させ、上清溶液を産物として得た（－２０℃で貯蔵）。産物は長期保存、繰り返し使用が可能なＭＣライブラリーである。
検出の結果、ＭＣライブラリーは１０～２０回の後続検出をサポートすることができ、各検出の結果は、感度及び特異性の低下を引き起こすことなく、すべての元のサンプルの突然変異の状況を表すことができる。一方、このライブラリーの構築方法は、ｃｆＤＮＡサンプルだけでなく、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡサンプルにも用いられ得る。
実施例２、ＲａｃｅＳｅｑによるターゲット領域の濃縮及びライブラリーの構築
図２に示すように、中国の肝癌高頻度突然変異遺伝子（ＴＰ５３、ＣＴＮＮＢ１、ＡＸＩＮ１、ＴＥＲＴ）の関連領域とＨＢＶ組み込みホットスポットセグメントに対して設計したプライマーを用いて、固定プライマーと組み合わせて、ＭＣライブラリーに対して２ラウンドのＰＣＲ増幅を行い、増幅産物としてシーケンシングライブラリーを得た。
図２において、ａは１ラウンド目のライブラリー増幅上流プライマー、ｂは２ラウンド目のライブラリー増幅上流プライマー、ｃは特異的目的配列濃縮用の１ラウンド目のライブラリー増幅下流プライマーライブラリー、ｄは特異的目的配列濃縮用の２ラウンド目のライブラリー増幅下流プライマーライブラリー、ｅはｉｎｄｅｘ配列付加用のｉｎｄｅｘプライマーである。
１、実施例１で製造したＭＣライブラリー３００ｎｇを２部に分け、表７の反応系（１部にＧＳＰ１Ａ ｍｉｘを加え、もう１部にＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘを加えた）を調製し、表９の反応手順に従って１ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、１ラウンド目の増幅産物を得た（合計２部の１ラウンド目の増幅産物を得て、１部はＧＳＰ１Ａ ｍｉｘの増幅産物、もう１部はＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘの増幅産物である）。
Figure 0007336461000008
表７において、プライマー情報は以下の通りである。
上流プライマー１３５５（配列２７）：ＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ（５’－３’）。
ＧＳＰ１Ａ ｍｉｘ：表８のプライマープールＧＳＰ１Ａに属する各プライマーをＴＥで濃度が１００μＭとなるように溶解した後、等体積で混合し、ＴＥで０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ１Ａ中のプライマーは、テンプレートのセンス鎖の増幅に用いられた。
ＧＳＰ１Ｂ ｍｉｘ：表８のプライマープールＧＳＰ１Ｂに属する各プライマーをＴＥで濃度が１００μＭとなるように溶解した後、等体積で混合し、ＴＥで０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ１Ｂ中のプライマーは、テンプレートのアンチセンス鎖の増幅に用いられた。
プライマープールＧＳＰ１ＡとプライマープールＧＳＰ１Ｂでは、元の分子を最大限に濃縮できる情報を使用しながら、同一番号のプライマーが正反両方向から同一突然変異部位を検出した。
Figure 0007336461000009
Figure 0007336461000010
Figure 0007336461000011
Figure 0007336461000012
Figure 0007336461000013
Figure 0007336461000014
Figure 0007336461000015
Figure 0007336461000016
Figure 0007336461000017
Figure 0007336461000018
２、ステップ１で得られた２部の１ラウンド目の増幅産物を、それぞれＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて１：１．３の割合で精製し、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ２５μｌで溶出して、２部の１ラウンド目の精製産物を得た。
３、ステップ２で得られた２部の１ラウンド目の精製産物をそれぞれテンプレートとし、表１０の反応系（ＧＳＰ１Ａ ｍｉｘ増幅産物をテンプレートとする場合は、ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘで増幅し、ＧＳＰ１Ｂｍｉｘ増幅産物をテンプレートとする場合は、ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘで増幅する）を調製し、表１２の反応手順に従って２ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、２ラウンド目の増幅産物を得た（４℃で保存）。
Figure 0007336461000019
表１０において、プライマー情報は以下の通りである。
上流プライマー３３５５（配列１８８）：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴ（５’－３’）。ここで、下線部分は１ラウンド目の上流プライマー１３５５と同じ部分であり、３３５５及び１３５５はいずれもＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームでシーケンシングされた固定配列（他のシーケンシングプラットフォームでシーケンシング可能な配列にも置換可能）である。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘ：表１１のプライマープールＧＳＰ２Ａに属する各プライマーをＴＥで濃度が１００μＭとなるように溶解した後、等体積で混合し、ＴＥで０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ａ中のプライマーは、テンプレートのセンス鎖の増幅に用いられた。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘ：表１１のプライマープールＧＳＰ２Ｂに属する各プライマーをＴＥで濃度が１００μＭとなるように溶解した後、等体積で混合し、ＴＥで０．３μＭに希釈した。プライマープールＧＳＰ２Ｂ中のプライマーは、テンプレートのアンチセンス鎖の増幅に用いられた。
表１１において、５’末端から１位～２０位はＩｎｄｅｘプライマーに結合している部分である。
ＧＳＰ２Ａ ｍｉｘとＧＳＰ１Ａ ｍｉｘにおいてプライマー番号が同じプライマーは同一突然変異部位に対して設計されており、２本のプライマーはネスト関係を形成している。
ＧＳＰ２Ｂ ｍｉｘとＧＳＰ２Ａ ｍｉｘにおいてプライマー番号が同じプライマーは同一突然変異部位に対して設計されており、２本のプライマーはネスト関係を形成している。
Ｉｎｄｅｘプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列１８９）＊＊＊＊＊＊＊＊ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＣＴＴＧＧＣＡＣＣＣＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡ（配列１９０）。ここで、下線部分はＧＳＰ２ ｍｉｘと結合した部分である。＊＊＊＊＊＊＊＊＊はｉｎｄｅｘ配列位置であり、ｉｎｄｅｘの長さは６～８ｂｐであり、サンプル間の配列を区別し、複数のサンプルの混合シーケンシングを容易にする役割を果たす。ｉｎｄｅｘ配列以外は、すべてＩｌｌｕｍｉｎａのｓｍａｌｌ ＲＮＡシーケンシングキットからの固定配列である。
Figure 0007336461000020
Figure 0007336461000021
Figure 0007336461000022
Figure 0007336461000023
Figure 0007336461000024
Figure 0007336461000025
Figure 0007336461000026
Figure 0007336461000027
Figure 0007336461000028
Figure 0007336461000029
ここでＮＡはプライマーがないことを示す。
Figure 0007336461000030
４、ステップ３で得られたＧＳＰ２Ａ ｍｉｘを用いて２ラウンド目の増幅を行った産物とＧＳＰ１Ｂｍｉｘを用いて２ラウンド目の増幅を行った産物とを等体積で混合し、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを用いて１：１．３の割合で精製し、ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ－Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ５０μｌで溶出して２ラウンド目の精製産物として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｈｉｓｅｑ Ｘプラットフォームでシークエンシング可能なシーケンシングライブラリーを得て１ライブラリーあたりのシークエンシングデータ量は２Ｇであり、平均シークエンシング深さは６００００×より大きい。
ＭＣライブラリー上のＤＮＡランダムタグはｃｆＤＮＡ配列とともにシーケンシングライブラリーのＲｅａｄ１配列の下流に付加された。シーケンシングにおいて、ＤＮＡランダムタグ配列、アンカー配列、ｃｆＤＮＡ配列（図１中のｃ、ｄ、ｅ配列）を順次取得した。データ分析には、ランダムタグ配列が同じであり、ＤＮＡ挿入断片の長さが同じであり、ＤＮＡ挿入断片の両端の切断点がすべて同じであるＤＮＡ分子シークエンシングデータを１つの分子クラスターに遡り、クラスター内の分子数が５よりも大きく、クラスター内の分子突然変異の一致率が８０％よりも大きく、クラスターの個数が５以上であれば、この突然変異は元のＤＮＡサンプルからの真の突然変異である。
肝癌患者のｃｆＤＮＡ ３０ｎｇのシークエンシング実験から明らかなように、この方法の合計時間は約６時間（手動操作は約１．５ｈ）であり、生成したＲａｃｅＳｅｑライブラリーの標的捕捉率は８０％に達し、２Ｇｂデータ量の場合、シークエンシング深さは６００００×に達し、分子クラスターは５０００個に達し、１クラスターあたりの平均シークエンシング分子数は１２個に達し、具体的には、表１３に示す。
Figure 0007336461000031
実施例３、ＭＣライブラリーの捕捉及びシーケンシング
図３に示すように、実施例１のＭＣライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴ標的捕捉キット（Ａｇｉｌｅｎｔ ５１９０－８６４６）を用いて捕捉することができ（キットの取り扱い書を参照して行い、他のブラウンドの捕捉試薬とも互換性がある）、最終段階のＰＣＲ増幅におけるプライマーを以下のプライマーに交換することができる。
上流プライマー（５’－３’）：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列３４５）（図３の「ａ」）。ここで、下線部分はプライマーＭＣ＿Ｆと同じであり、ライブラリー増幅として機能し、残りの部分はＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームのシーケンシングに必要な固定配列である。
下流プライマー（５’－３’）：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列３４６）＊＊＊＊＊＊＊＊ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡ（配列３４７）（図３の「ｂ」）。ここで、下線部分はプライマーＭＣ＿Ｒと同じであり、ライブラリー増幅として機能する。＊＊＊＊＊＊＊＊はｉｎｄｅｘ配列位置、ｉｎｄｅｘ長さは６－８ｂｐであり、サンプル間の配列を区別し、複数のサンプルの混合シーケンシングを容易にする。残りの部分は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングプラットフォームのシーケンシングに必要な固定配列である。
捕捉されたライブラリーは、ＭＣライブラリーと同じＤＮＡランダムタグ配列、アンカー配列及びｃｆＤＮＡ配列を有し、順次にＲｅａｄ１の下流に位置する。ＤＮＡ挿入断片の長さが同じであり、ＤＮＡ挿入断片の両端の切断点、両端のアンカー配列がすべて同じである初期ＤＮＡ一本鎖シークエンシングデータを１つの分子クラスターに遡った。また、挿入断片の長さが一致し、かつ突然変異点以外の配列が一致し、分子クラスター両端のアンカー配列が同じであるが、その位置が反対である同一の開始ＤＮＡ二本鎖の分子クラスターを１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターと標識した。ある突然変異については、少なくとも１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターにより支持されば、真と判断し、支持するｄｕｐｌｅｘ分子クラスターがないが、少なくとも４つの分子クラスターにより支持されれば、真と判断する。１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターで共通に支持された突然変異は、信頼性がより高く、偽陽性突然変異を９０％減少させることができる。
実施例４、方法の比較
５例の肝癌患者ｃｆ ＤＮＡ標本を収集し、まず、実施例１の方法に従ってＭＣライブラリーを構築し、次に、実施例２の方法に従ってＲａｃｅＳｅｑターゲット領域の濃縮と実施例３の常規のＡｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴターゲット領域の濃縮、シークエンシングを行い、変異検出結果を表１３と表１４に示す。
Figure 0007336461000032
Figure 0007336461000033
Ａｇｉｌｅｎｔ ｓｕｒｅｓｅｌｅｃｔ ＸＴターゲット領域濃縮法とＲａｃｅＳｅｑ法は、一塩基突然変異とＨＢＶ挿入に対する検出結果がほぼ一致していることが分かった。
本発明の発明者は大量の実験を行ったところ、ＤＮＡサンプル中の肝癌突然変異を検出するためのプライマー組み合わせを取得し、このプライマー組み合わせはプライマーセットＩ、プライマーセットＩＩ、プライマーセットＩＩＩ、及びプライマーセットＩＶからなり、プライマーセットＩは、配列表の配列２８～配列１０５で示される一本鎖ＤＮＡからなり、プライマーセットＩＩは、配列表の配列１０６～配列１８７で示される一本鎖ＤＮＡからなり、プライマーセットＩＩＩは、配列表の配列１９１～配列２６５で示される一本鎖ＤＮＡからなり、プライマーセットＩＶは、配列表の配列２６６～３４４で示される一本鎖ＤＮＡからなる。実験により、捕捉を必要としない場合、上記ライマー組み合わせは同時に肝癌ｃｔＤＮＡ中の点突然変異、挿入欠失突然変異、ＨＢＶ組み込みなどの多種の突然変異形式を検出できることを証明した。高価な捕捉プローブやハイブリダイゼーション試薬が不要であるため、コストが大幅に削減され、操作手順が簡単であり、検出時間がわずか８ｈである。本発明は、肝癌の早期スクリーニング、病状追跡、治療効果評価、予後予測などに対して臨床的に重要である。

Claims (16)

  1. ＤＮＡサンプルに対して末端修復及び３’末端のＡテーリングを順次行うステップ（１）と、
    ステップ（１）で処理したＤＮＡサンプルをリンカー混合物と連結し、ＰＣＲで増幅してライブラリーを得るステップ（２）と、を含み、
    前記リンカー混合物は、ｎ個のリンカーからなり、
    各リンカーは、１本の上流プライマー甲と１本の下流プライマー甲とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、上流プライマー甲にはシークエンシングリンカー甲、ランダムタグ、アンカー配列甲及び３’末端に位置する塩基Ｔがあり、下流プライマー甲にはアンカー配列乙及びシークエンシングリンカー乙があり、前記部分的な二本鎖構造は上流プライマーのアンカー配列甲と下流プライマーのアンカー配列乙とが逆相補することにより形成され、
    前記シークエンシングリンカー甲及びシークエンシングリンカー乙は、異なるシークエンシングプラットフォームに応じて選択された対応するシークエンシングリンカーであり、
    前記ランダムタグは８～１４ｂｐのランダム塩基であり、
    前記アンカー配列甲は、長さが１４～２０ｂｐであり、連続する繰り返し塩基が３個以下であり、
    ｎ個のリンカーはｎ個の異なるアンカー配列甲を採用し、かつ同じ位置の塩基が平衡しており、ミスマッチ塩基数が３より大きく、
    ｎは８以上の任意の自然数である、シークエンシングライブラリーの構築方法。
  2. ｎが１２である場合、前記アンカー配列甲のヌクレオチド配列は、それぞれ配列表の配列１の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列３の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列５の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列７の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列９の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１１の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１３の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１５の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１７の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列１９の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列２１の５’末端からの３０～４１位、配列表の配列２３の５’末端からの３０～４１位であり、
    リンカー１は、配列表の配列１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー２は、配列表の配列３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列４で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー３は、配列表の配列５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列６で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー４は、配列表の配列７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列８で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー５は、配列表の配列９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１０で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー６は、配列表の配列１１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１２で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー７は、配列表の配列１３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１４で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー８は、配列表の配列１５で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１６で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー９は、配列表の配列１７で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列１８で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー１０は、配列表の配列１９で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２０で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー１１は、配列表の配列２１で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２２で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー１２は、配列表の配列２３で示される一本鎖ＤＮＡ分子と配列２４で示される一本鎖ＤＮＡ分子とが部分二本鎖構造を形成することにより得られる、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（２）で得られたライブラリーを増幅するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記増幅に用いるプライマー対は、配列表の配列２５と配列２６で示される２本の一本鎖ＤＮＡ分子からなる、ことを特徴とする請求項３に記載の方法。
  5. 請求項１～４のいずれか一項に記載の方法により構築されたＤＮＡライブラリー。
  6. シーケンシングライブラリーを構築するためのキットであって、請求項１又は２に記載のリンカー混合物を含むキット。
  7. ＤＮＡサンプル中の肝癌変異を検出するためのキットであって、
    請求項１又は２に記載のリンカー混合物及びプライマー組み合わせを含み、
    前記プライマー組み合わせは、プライマーセットＩ、プライマーセットＩＩ、プライマーセットＩＩＩ及びプライマーセットＩＶを含み、
    前記プライマーセットＩ及び前記プライマーセットＩＩの各プライマーは、肝癌に関連する領域に基づいて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定の位置に局在し、ターゲット領域のＰＣＲによる濃縮を実現する役割を果たし、
    前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩＶの各プライマーのヌクレオチド配列は、すべて「リンカー配列＋特異配列」からなり、特異配列は、ターゲット領域の更なる濃縮に使用され、リンカー配列は、ＰＣＲにより完全なシーケンシング可能なライブラリー分子を形成することに使用され、
    前記プライマーセットＩＩＩ及び前記プライマーセットＩは、「ネスト」の関係であり、前記プライマーセットＩＶ及び前記プライマーセットＩＩは、「ネスト」の関係であり得るキット。
  8. 前記プライマーセットＩは、配列表の配列２８～配列１０５で示される一本鎖ＤＮＡからなり、
    前記プライマーセットＩＩは、配列表の配列１０６～配列１８７で示される一本鎖ＤＮＡからなり、
    前記プライマーセットＩＩＩは、配列表の配列１９１～配列２６５で示される一本鎖ＤＮＡからなり、
    前記プライマーセットＩＶは、配列表の配列２６６～配列３４４で示される一本鎖ＤＮＡからなる、ことを特徴とする請求項７に記載のキット。
  9. 請求項７又は８に記載のプライマー組み合わせ。
  10. 請求項７又は８に記載のプライマー組み合わせを含むＤＮＡサンプル中の肝癌変異を検出するためのキット。
  11. ＤＮＡサンプル中の目標変異を検出する方法であって、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によってライブラリーを構築するステップ（１）と、
    ステップ（１）で得られたライブラリーに対して２ラウンドのネストＰＣＲ増幅を行い、産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシングの結果に基づいてＤＮＡサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ（２）と、を含み、
    前記ステップ（２）では、プライマー組み合わせ甲を用いて１ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、
    プライマー組み合わせ甲は、上流プライマー甲と下流プライマー甲とからなり、
    前記上流プライマー甲は、ステップ（１）のライブラリー増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
    前記下流プライマー組み合わせ甲は、ｎ個の目標ターゲットに基づいて設計されたｎ本のプライマーの組み合わせであり、
    １ラウンド目のＰＣＲ産物をテンプレートとして、プライマー組み合わせ乙を用いて２ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、
    前記プライマー組み合わせ乙は上流プライマー乙、下流プライマー組み合わせ乙、及びｉｎｄｅｘプライマーからなり、
    前記上流プライマー乙は、１ラウンド目のＰＣＲ産物の増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
    前記下流プライマー組み合わせ乙中のプライマーは、下流プライマー組み合わせ甲中の同一の目標ターゲットを検出するプライマーとネスト関係を形成し、各プライマーにはｉｎｄｅｘプライマーに結合するセグメントを有し、
    前記ｉｎｄｅｘプライマーには、下流プライマー組み合わせ乙の各プライマーに結合するセグメント及びｉｎｄｅｘ配列を含む、方法。
  12. 前記プライマー甲のヌクレオチド配列は、配列表の配列２７に示され、
    前記プライマー乙のヌクレオチド配列は、配列表の配列１８８に示され、
    前記ｉｎｄｅｘプライマーは、５’末端から、セグメントＡ、ｉｎｄｅｘ配列、及びセグメントＢを含み、前記セグメントＡのヌクレオチド配列は配列表の配列１８９に示され、前記セグメントＢのヌクレオチド配列は配列表の配列１９０に示される、ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. 前記プライマー組み合わせ甲は、前記目標変異が肝癌変異である場合、プライマーセットＩとプライマーセットＩＩとからなり、前記プライマー組み合わせ乙は、プライマーセットＩＩＩとプライマーセットＩＶとからなり、
    プライマーセットＩとプライマーセットＩＩを用いて、それぞれテンプレートに対して１ラウンド目のＰＣＲ増幅を行い、プライマーセットＩを用いて増幅を行った産物を２ラウンド目の増幅のテンプレートとして、プライマーセットＩＩＩを用いて増幅を行い、プライマーセットＩＩを用いて増幅を行った産物を２ラウンド目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットＩＶを用いて増幅を行い、次に、増幅産物を等体積で混合する、ことを特徴とする請求項１１又は１２に記載の方法。
  14. 前記シーケンシング結果の分析方法は、ランダムタグ配列が同じであり、ＤＮＡ挿入断片の長さが同じであり、ＤＮＡ挿入断片の両端の切断点がすべて同じであるＤＮＡ分子シーケンシングデータを１つの分子クラスターに遡り、クラスター内の分子数が５よりも大きく、クラスター内の分子変異の一致率が８０％よりも大きく、クラスター数が５以上であれば、該変異は元のＤＮＡサンプルからの真の変異である、ことを特徴とする請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. ＤＮＡサンプル中の複数の目標変異を検出する方法であって、
    請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によってライブラリーを構築するステップ（１）と、
    ステップ（１）のライブラリーに対してターゲット領域濃縮を行ってシークエンシングし、シークエンシング結果に基づいてＤＮＡサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ（２）と、を含む方法。
  16. 前記シークエンシング結果の分析方法は、ＤＮＡ挿入断片の長さが同じであり、ＤＮＡ挿入断片の両端の切断点、両端のアンカー配列がすべて同じである初期ＤＮＡ一本鎖シークエンシングデータを１つの分子クラスターに遡り、挿入断片の長さが一致し、かつ変異点以外の配列が一致し、分子クラスターの両端のアンカー配列が同じであるが、その位置が反対である同一の開始ＤＮＡ二本鎖の分子クラスターを１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターと標識し、ある変異については、少なくとも１対のｄｕｐｌｅｘ分子クラスターにより支持される場合、真と判断し、支持するｄｕｐｌｅｘ分子クラスターがないが、少なくとも４つの分子クラスターにより支持される場合、真と判断する、ことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
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