JP7336461B2 - 肝癌によく見られた複数の変異を同時に検出するctDNAライブラリーの構築及びシークエンシングデータの分析の方法 - Google Patents
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Description
DNAサンプルに対して末端修復及び3’末端のAテーリングを順次行うステップ(1)と、
ステップ(1)で処理したDNAサンプルをリンカー混合物と連結し、PCRにより増幅してライブラリーを得るステップ(2)と、を含み、
前記リンカー混合物は、n個のリンカーからなっていてもよく、
各リンカーは、1本の上流プライマー甲と1本の下流プライマー甲とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、上流プライマー甲にはシークエンシングリンカー甲、ランダムタグ、アンカー配列甲及び3’末端に位置する塩基Tがあり、下流プライマー甲にはアンカー配列乙及びシークエンシングリンカー乙があり、前記部分的な二本鎖構造は上流プライマーのアンカー配列甲と下流プライマーのアンカー配列乙とが逆相補することにより形成され、
前記シークエンシングリンカー甲及びシークエンシングリンカー乙は、異なるシークエンシングプラットフォームに応じて、選択された対応するシークエンシングリンカーであり、
前記ランダムタグは8~14bpのランダム塩基であってもよく、
前記アンカー配列甲は、長さが14~20bpであり、連続する繰り返し塩基が3個以下であり、
n個のリンカーはn個の異なるアンカー配列甲を採用し、かつ同じ位置の塩基が平衡し(塩基多様性を有し)ておりミスマッチ塩基数が3より大きく、
nは8以上の任意の自然数である、シーケンシングライブラリーの構築方法を提供する。
リンカー1は、配列表の配列1で示される一本鎖DNA分子と配列2で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー2は、配列表の配列3で示される一本鎖DNA分子と配列4で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー3は、配列表の配列5で示される一本鎖DNA分子と配列6で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー4は、配列表の配列7で示される一本鎖DNA分子と配列8で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー5は、配列表の配列9で示される一本鎖DNA分子と配列10で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー6は、配列表の配列11で示される一本鎖DNA分子と配列12で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー7は、配列表の配列13で示される一本鎖DNA分子と配列14で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー8は、配列表の配列15で示される一本鎖DNA分子と配列16で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー9は、配列表の配列17で示される一本鎖DNA分子と配列18で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー10は、配列表の配列19で示される一本鎖DNA分子と配列20で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー11は、配列表の配列21で示される一本鎖DNA分子と配列22で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー12は、配列表の配列23で示される一本鎖DNA分子と配列24で示される一本鎖DNA分子とが部分二本鎖構造を形成することにより得られてもよい。
前記プライマーセットI及びプライマーセットIIの各プライマーは、肝癌に関連する領域に基づいて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定の位置に局在し、ターゲット領域のPCRによる濃縮を実現する役割を果たす。
前記のいずれかに記載する方法によってライブラリーを構築するステップ(1)と、
ステップ(1)で得られたライブラリーに対して2ラウンドのネストPCR増幅を行い、産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシングの結果に基づいてDNAサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ(2)と、を含み、
前記ステップ(2)では、プライマー組み合わせ甲を用いて1ラウンド目のPCR増幅を行い、
プライマー組み合わせ甲は、上流プライマー甲と下流プライマー甲とからなり、
前記上流プライマー甲は、ステップ(1)のライブラリー増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
前記下流プライマー組み合わせ甲は、n個の目標ターゲットに基づいて設計されたn本のプライマーの組み合わせであり、
1ラウンド目のPCR産物をテンプレートとして、プライマー組み合わせ乙を用いて2ラウンド目のPCR増幅を行い、
プライマー組み合わせ乙は上流プライマー乙、下流プライマー組み合わせ乙、及びindexプライマーからなり、
前記上流プライマー乙の配列の一部は、1ラウンド目のPCR産物の増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
前記下流プライマー組み合わせ乙中のプライマーは、下流プライマー組み合わせ甲中の同一の目標ターゲットを検出するプライマーとネスト関係を形成し、各プライマーにはindexプライマーに結合するセグメントを有し、
前記indexプライマーには、下流プライマー組み合わせ乙の各プライマーに結合するセグメント及びindex配列を含む方法を保護する。
前記のいずれかに記載する方法によってライブラリーを構築するステップ(1)と、
ステップ(1)のライブラリーに対してターゲット領域濃縮を行ってシークエンシングし、シークエンシング結果に基づいてDNAサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ(2)とを含む方法を保護する。
1、捕捉を必要とせずに、肝癌ctDNA中の点突然変異、挿入欠失突然変異、HBV組み込みなどの多種の変異の形式を同時に検出する。捕捉法と比べて、この技術は数本のDNAプライマーだけでよく、高価な捕捉プローブとハイブリダイゼーション試薬を必要とせず、このため、コストが大幅に低下し、操作の手順が簡単であり、捕捉法の36時間から8時間に短縮できる。
2、超小ターゲット領域の効率的な捕捉に適しており、ターゲット領域は捕捉法の最小ターゲット領域の10%まで小さくすることができ、このように、シークエンシング効率を大幅に向上させることができる。例えば、肝癌によく見られる突然変異TP53、CTNNB1、AXIN1、TERT、HBVの組み合わせは本技術に適した超小ターゲット領域であり、捕捉法を用いてこのターゲット領域を濃縮する場合、標的捕捉率は10%未満であるが、本技術の場合、80%以上に達し、このため、シークエンシング効率を大幅に高め、シークエンシングコストを低下させる。
3、増幅されたライブラリーは、1回の検出を行った後、10~20回の後続の検出をサポートすることができ、各検出の結果は、感度及び特異性の低下を引き起こすことなく、すべての元のctDNA標本の突然変異の状況を表すことができる。
4、ライブラリーの構築過程においてDNAバーコードbarcodeを開始ctDNA分子に連結し、生体情報分析プロセスと組み合わせることで、ctDNA低頻度突然変異の高特異性検出を実現する。
5、本技術で構築されたライブラリーはPCRのホットスポット検出と捕捉法によるシークエンシングの両方に用いることができ、しかも、1つの標本で構築されたライブラリーは同時に複数回の検出をサポートすることができ、添加されたDNA barcodeは偽陽性突然変異を効果的にフィルタリングすることができ、それにより、duplexに基づく高特異性シークエンシングが実現される。
本発明は、肝癌の早期スクリーニング、病状追跡、治療効果評価、予後予測などに対して臨床的に重要である。
一、cfDNA分子の平滑末端修復とAテーリング処理
cfDNA 10~45ngを取り、表1に示すように反応系を調製し、次に、表2の手順に従ってPCR装置で末端修復及び3’末端のAテーリングを行い、反応産物(4℃で保存)を得た。
表3に示すように反応系を調製し、20℃で15min反応させて、連結産物(4℃で保存)を得た。
表4の一本鎖DNAをTEで溶解し、最終濃度100μMまで希釈した。同一グループの2本の一本鎖DNAを等体積(各50μl)で混合し、アニーリング(アニーリング手順:95℃、15min;25℃、2h)して12グループのDNA溶液を得て、12グループのDNA溶液を等体積で混合して、Adapter Mixを得た。
ステップ2で得られた連結産物にAMPure XPビーズ110μl(ベックマンA63880)を加え、ボルテックスで均一に混合し、室温で10min放置し、磁気ラックで5min吸着させ、溶液が澄んだ後に上清を捨て、その後80%(体積百分率含有量)エタノール水溶液200μlを加えて2回洗浄し、上清を捨て、エタノールを乾燥させた後、DNase/RNase-Free Water 30μlを加え、ボルテックスで均一に混合し、室温で10min放置し、磁気ラックで5min吸着させ、上清溶液をPCRチューブに吸引し、PCRテンプレートとした。
1、ステップ3で得られたPCRテンプレートを取り、表5に示すように反応系を調製し、表6に示すようにPCR増幅を行い、PCR増幅産物を得た(4℃で保存)。
MC_F(配列25):GACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’);
MC_R(配列26):GTGGGCTCGGAGATGTGTATAA(5’-3’)。
図2に示すように、中国の肝癌高頻度突然変異遺伝子(TP53、CTNNB1、AXIN1、TERT)の関連領域とHBV組み込みホットスポットセグメントに対して設計したプライマーを用いて、固定プライマーと組み合わせて、MCライブラリーに対して2ラウンドのPCR増幅を行い、増幅産物としてシーケンシングライブラリーを得た。
図2において、aは1ラウンド目のライブラリー増幅上流プライマー、bは2ラウンド目のライブラリー増幅上流プライマー、cは特異的目的配列濃縮用の1ラウンド目のライブラリー増幅下流プライマーライブラリー、dは特異的目的配列濃縮用の2ラウンド目のライブラリー増幅下流プライマーライブラリー、eはindex配列付加用のindexプライマーである。
上流プライマー1355(配列27):TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT(5’-3’)。
GSP1A mix:表8のプライマープールGSP1Aに属する各プライマーをTEで濃度が100μMとなるように溶解した後、等体積で混合し、TEで0.3μMに希釈した。プライマープールGSP1A中のプライマーは、テンプレートのセンス鎖の増幅に用いられた。
GSP1B mix:表8のプライマープールGSP1Bに属する各プライマーをTEで濃度が100μMとなるように溶解した後、等体積で混合し、TEで0.3μMに希釈した。プライマープールGSP1B中のプライマーは、テンプレートのアンチセンス鎖の増幅に用いられた。
プライマープールGSP1AとプライマープールGSP1Bでは、元の分子を最大限に濃縮できる情報を使用しながら、同一番号のプライマーが正反両方向から同一突然変異部位を検出した。
上流プライマー3355(配列188):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCT(5’-3’)。ここで、下線部分は1ラウンド目の上流プライマー1355と同じ部分であり、3355及び1355はいずれもIlluminaシーケンシングプラットフォームでシーケンシングされた固定配列(他のシーケンシングプラットフォームでシーケンシング可能な配列にも置換可能)である。
GSP2A mix:表11のプライマープールGSP2Aに属する各プライマーをTEで濃度が100μMとなるように溶解した後、等体積で混合し、TEで0.3μMに希釈した。プライマープールGSP2A中のプライマーは、テンプレートのセンス鎖の増幅に用いられた。
GSP2B mix:表11のプライマープールGSP2Bに属する各プライマーをTEで濃度が100μMとなるように溶解した後、等体積で混合し、TEで0.3μMに希釈した。プライマープールGSP2B中のプライマーは、テンプレートのアンチセンス鎖の増幅に用いられた。
GSP2A mixとGSP1A mixにおいてプライマー番号が同じプライマーは同一突然変異部位に対して設計されており、2本のプライマーはネスト関係を形成している。
GSP2B mixとGSP2A mixにおいてプライマー番号が同じプライマーは同一突然変異部位に対して設計されており、2本のプライマーはネスト関係を形成している。
Indexプライマー:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(配列189)********GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA(配列190)。ここで、下線部分はGSP2 mixと結合した部分である。*********はindex配列位置であり、indexの長さは6~8bpであり、サンプル間の配列を区別し、複数のサンプルの混合シーケンシングを容易にする役割を果たす。index配列以外は、すべてIlluminaのsmall RNAシーケンシングキットからの固定配列である。
図3に示すように、実施例1のMCライブラリーは、Agilent sureselect XT標的捕捉キット(Agilent 5190-8646)を用いて捕捉することができ(キットの取り扱い書を参照して行い、他のブラウンドの捕捉試薬とも互換性がある)、最終段階のPCR増幅におけるプライマーを以下のプライマーに交換することができる。
上流プライマー(5’-3’):AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTTCCGATCT(配列345)(図3の「a」)。ここで、下線部分はプライマーMC_Fと同じであり、ライブラリー増幅として機能し、残りの部分はIlluminaシーケンシングプラットフォームのシーケンシングに必要な固定配列である。
下流プライマー(5’-3’):CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT(配列346)********GTCTCGTGGCTCGGAGATGTGTATAA(配列347)(図3の「b」)。ここで、下線部分はプライマーMC_Rと同じであり、ライブラリー増幅として機能する。********はindex配列位置、index長さは6-8bpであり、サンプル間の配列を区別し、複数のサンプルの混合シーケンシングを容易にする。残りの部分は、Illuminaシーケンシングプラットフォームのシーケンシングに必要な固定配列である。
5例の肝癌患者cf DNA標本を収集し、まず、実施例1の方法に従ってMCライブラリーを構築し、次に、実施例2の方法に従ってRaceSeqターゲット領域の濃縮と実施例3の常規のAgilent sureselect XTターゲット領域の濃縮、シークエンシングを行い、変異検出結果を表13と表14に示す。
Claims (16)
- DNAサンプルに対して末端修復及び3’末端のAテーリングを順次行うステップ(1)と、
ステップ(1)で処理したDNAサンプルをリンカー混合物と連結し、PCRで増幅してライブラリーを得るステップ(2)と、を含み、
前記リンカー混合物は、n個のリンカーからなり、
各リンカーは、1本の上流プライマー甲と1本の下流プライマー甲とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、上流プライマー甲にはシークエンシングリンカー甲、ランダムタグ、アンカー配列甲及び3’末端に位置する塩基Tがあり、下流プライマー甲にはアンカー配列乙及びシークエンシングリンカー乙があり、前記部分的な二本鎖構造は上流プライマーのアンカー配列甲と下流プライマーのアンカー配列乙とが逆相補することにより形成され、
前記シークエンシングリンカー甲及びシークエンシングリンカー乙は、異なるシークエンシングプラットフォームに応じて選択された対応するシークエンシングリンカーであり、
前記ランダムタグは8~14bpのランダム塩基であり、
前記アンカー配列甲は、長さが14~20bpであり、連続する繰り返し塩基が3個以下であり、
n個のリンカーはn個の異なるアンカー配列甲を採用し、かつ同じ位置の塩基が平衡しており、ミスマッチ塩基数が3より大きく、
nは8以上の任意の自然数である、シークエンシングライブラリーの構築方法。 - nが12である場合、前記アンカー配列甲のヌクレオチド配列は、それぞれ配列表の配列1の5’末端からの30~41位、配列表の配列3の5’末端からの30~41位、配列表の配列5の5’末端からの30~41位、配列表の配列7の5’末端からの30~41位、配列表の配列9の5’末端からの30~41位、配列表の配列11の5’末端からの30~41位、配列表の配列13の5’末端からの30~41位、配列表の配列15の5’末端からの30~41位、配列表の配列17の5’末端からの30~41位、配列表の配列19の5’末端からの30~41位、配列表の配列21の5’末端からの30~41位、配列表の配列23の5’末端からの30~41位であり、
リンカー1は、配列表の配列1で示される一本鎖DNA分子と配列2で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー2は、配列表の配列3で示される一本鎖DNA分子と配列4で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー3は、配列表の配列5で示される一本鎖DNA分子と配列6で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー4は、配列表の配列7で示される一本鎖DNA分子と配列8で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー5は、配列表の配列9で示される一本鎖DNA分子と配列10で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー6は、配列表の配列11で示される一本鎖DNA分子と配列12で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー7は、配列表の配列13で示される一本鎖DNA分子と配列14で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー8は、配列表の配列15で示される一本鎖DNA分子と配列16で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー9は、配列表の配列17で示される一本鎖DNA分子と配列18で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー10は、配列表の配列19で示される一本鎖DNA分子と配列20で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー11は、配列表の配列21で示される一本鎖DNA分子と配列22で示される一本鎖DNA分子とが部分的な二本鎖構造を形成することにより得られ、リンカー12は、配列表の配列23で示される一本鎖DNA分子と配列24で示される一本鎖DNA分子とが部分二本鎖構造を形成することにより得られる、ことを特徴とする請求項1に記載の方法。 - ステップ(2)で得られたライブラリーを増幅するステップをさらに含む、ことを特徴とする請求項1又は2に記載の方法。
- 前記増幅に用いるプライマー対は、配列表の配列25と配列26で示される2本の一本鎖DNA分子からなる、ことを特徴とする請求項3に記載の方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載の方法により構築されたDNAライブラリー。
- シーケンシングライブラリーを構築するためのキットであって、請求項1又は2に記載のリンカー混合物を含むキット。
- DNAサンプル中の肝癌変異を検出するためのキットであって、
請求項1又は2に記載のリンカー混合物及びプライマー組み合わせを含み、
前記プライマー組み合わせは、プライマーセットI、プライマーセットII、プライマーセットIII及びプライマーセットIVを含み、
前記プライマーセットI及び前記プライマーセットIIの各プライマーは、肝癌に関連する領域に基づいて設計された特異的プライマーであり、ゲノムの特定の位置に局在し、ターゲット領域のPCRによる濃縮を実現する役割を果たし、
前記プライマーセットIII及び前記プライマーセットIVの各プライマーのヌクレオチド配列は、すべて「リンカー配列+特異配列」からなり、特異配列は、ターゲット領域の更なる濃縮に使用され、リンカー配列は、PCRにより完全なシーケンシング可能なライブラリー分子を形成することに使用され、
前記プライマーセットIII及び前記プライマーセットIは、「ネスト」の関係であり、前記プライマーセットIV及び前記プライマーセットIIは、「ネスト」の関係であり得るキット。 - 前記プライマーセットIは、配列表の配列28~配列105で示される一本鎖DNAからなり、
前記プライマーセットIIは、配列表の配列106~配列187で示される一本鎖DNAからなり、
前記プライマーセットIIIは、配列表の配列191~配列265で示される一本鎖DNAからなり、
前記プライマーセットIVは、配列表の配列266~配列344で示される一本鎖DNAからなる、ことを特徴とする請求項7に記載のキット。 - 請求項7又は8に記載のプライマー組み合わせ。
- 請求項7又は8に記載のプライマー組み合わせを含むDNAサンプル中の肝癌変異を検出するためのキット。
- DNAサンプル中の目標変異を検出する方法であって、
請求項1~4のいずれか一項に記載の方法によってライブラリーを構築するステップ(1)と、
ステップ(1)で得られたライブラリーに対して2ラウンドのネストPCR増幅を行い、産物に対してシークエンシングを行い、シークエンシングの結果に基づいてDNAサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ(2)と、を含み、
前記ステップ(2)では、プライマー組み合わせ甲を用いて1ラウンド目のPCR増幅を行い、
プライマー組み合わせ甲は、上流プライマー甲と下流プライマー甲とからなり、
前記上流プライマー甲は、ステップ(1)のライブラリー増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
前記下流プライマー組み合わせ甲は、n個の目標ターゲットに基づいて設計されたn本のプライマーの組み合わせであり、
1ラウンド目のPCR産物をテンプレートとして、プライマー組み合わせ乙を用いて2ラウンド目のPCR増幅を行い、
前記プライマー組み合わせ乙は上流プライマー乙、下流プライマー組み合わせ乙、及びindexプライマーからなり、
前記上流プライマー乙は、1ラウンド目のPCR産物の増幅に用いられるライブラリー増幅プライマーであり、
前記下流プライマー組み合わせ乙中のプライマーは、下流プライマー組み合わせ甲中の同一の目標ターゲットを検出するプライマーとネスト関係を形成し、各プライマーにはindexプライマーに結合するセグメントを有し、
前記indexプライマーには、下流プライマー組み合わせ乙の各プライマーに結合するセグメント及びindex配列を含む、方法。 - 前記プライマー甲のヌクレオチド配列は、配列表の配列27に示され、
前記プライマー乙のヌクレオチド配列は、配列表の配列188に示され、
前記indexプライマーは、5’末端から、セグメントA、index配列、及びセグメントBを含み、前記セグメントAのヌクレオチド配列は配列表の配列189に示され、前記セグメントBのヌクレオチド配列は配列表の配列190に示される、ことを特徴とする請求項11に記載の方法。 - 前記プライマー組み合わせ甲は、前記目標変異が肝癌変異である場合、プライマーセットIとプライマーセットIIとからなり、前記プライマー組み合わせ乙は、プライマーセットIIIとプライマーセットIVとからなり、
プライマーセットIとプライマーセットIIを用いて、それぞれテンプレートに対して1ラウンド目のPCR増幅を行い、プライマーセットIを用いて増幅を行った産物を2ラウンド目の増幅のテンプレートとして、プライマーセットIIIを用いて増幅を行い、プライマーセットIIを用いて増幅を行った産物を2ラウンド目の増幅のテンプレートとしてプライマーセットIVを用いて増幅を行い、次に、増幅産物を等体積で混合する、ことを特徴とする請求項11又は12に記載の方法。 - 前記シーケンシング結果の分析方法は、ランダムタグ配列が同じであり、DNA挿入断片の長さが同じであり、DNA挿入断片の両端の切断点がすべて同じであるDNA分子シーケンシングデータを1つの分子クラスターに遡り、クラスター内の分子数が5よりも大きく、クラスター内の分子変異の一致率が80%よりも大きく、クラスター数が5以上であれば、該変異は元のDNAサンプルからの真の変異である、ことを特徴とする請求項11~13のいずれか一項に記載の方法。
- DNAサンプル中の複数の目標変異を検出する方法であって、
請求項1~4のいずれか一項に記載の方法によってライブラリーを構築するステップ(1)と、
ステップ(1)のライブラリーに対してターゲット領域濃縮を行ってシークエンシングし、シークエンシング結果に基づいてDNAサンプル中の目標変異の発生の状況を分析するステップ(2)と、を含む方法。 - 前記シークエンシング結果の分析方法は、DNA挿入断片の長さが同じであり、DNA挿入断片の両端の切断点、両端のアンカー配列がすべて同じである初期DNA一本鎖シークエンシングデータを1つの分子クラスターに遡り、挿入断片の長さが一致し、かつ変異点以外の配列が一致し、分子クラスターの両端のアンカー配列が同じであるが、その位置が反対である同一の開始DNA二本鎖の分子クラスターを1対のduplex分子クラスターと標識し、ある変異については、少なくとも1対のduplex分子クラスターにより支持される場合、真と判断し、支持するduplex分子クラスターがないが、少なくとも4つの分子クラスターにより支持される場合、真と判断する、ことを特徴とする請求項15に記載の方法。
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