JP7336154B2 - 血液組織関門インビトロモデル、及び薬物の血液組織関門移行性評価方法 - Google Patents
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Description
本願は、2019年10月18日に、日本に出願された特願2019-190832号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
特に、血液脳関門については、多孔質膜上で血管内皮細胞を培養することで、様々な培養モデルが開発されてきた(例えば、特許文献1~4及び非特許文献1参照。)。
特許文献2では、トランスジェニックラット由来の不死化脳毛細血管内皮細胞株と同ラット由来の不死化アストロサイト細胞株との共培養による血液脳関門再構築モデルが提案されている。
特許文献3では、脳毛細血管内皮細胞、アストロサイト、及びペリサイトの共培養系で構築した血液脳関門インビトロモデル、及び所定の病態条件に対応する培養液を利用して構築した病態血液脳関門インビトロモデルが提案されている。
特許文献4では、血管内皮細胞、ペリサイト、及びアストロサイトの3種類の細胞層が、直接的な相互作用が可能な状態で層構造を形成することで、解剖学的構造をより正確に再現した血液脳関門インビトロモデルが提案されている。
非特許文献1では、世界で初めて血液脳関門のin vitro再構築系モデルが開発されている。
[1]コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデル。
[2]前記培養液は、無血清培養液である、[1]に記載の血液組織関門インビトロモデル。
[3]コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、臓器由来細胞の馴化培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデル。
[4]前記馴化培養液は、無血清培養液である、[3]に記載の血液組織関門インビトロモデル。
[5][1]~[4]のいずれか一つに記載の血液組織関門インビトロモデルを用いて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
[6][1]~[4]のいずれか一つに記載の血液組織関門インビトロモデルにおいて、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量をそれぞれ測定し、比較することにより、薬物の病態組織選択的移行性を評価する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
1実施形態において、本発明は、コラーゲンビトリゲル膜と、前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞である、血液組織関門インビトロモデルを提供する。
コラーゲンビトリゲル膜3の上面には、ヒト血管内皮細胞5が配置されており、コラーゲンビトリゲル膜3の下面には、臓器由来細胞6が配置されており、コラーゲンビトリゲル膜3の多孔性により両細胞間のクロストークが可能となっている。
ヒト血管内皮細胞5としては、ヒト新生児包皮由来微小血管内皮細胞、各種ヒト幹細胞(iPS細胞、ES細胞、等)、hCMEC/D3細胞(SV-40 large T抗原が導入されたヒト脳微小血管内皮細胞株)等が挙げられる。
また、ヒト型の血液脳関門モデルを生産する方法としては、温度感受性SV-40 large T抗原を含有するベクターを、ヒトの血液脳関門から単離培養した脳微小血管内皮細胞、アストロサイト、及びペリサイトに導入して作製する方法が報告されているが、培養の温度管理が容易ではなかった。
本実施形態においては、上述したヒト血管内皮細胞を用いることで容易に血液組織関門インビトロモデルを構築することができる。
本明細書において、用語「ビトリゲル」を用いる際には、用語「(登録商標)」を省略して用いる場合がある。
また、コラーゲンの中でもより好ましい原料としては、ネイティブコラーゲン又はアテロコラーゲンを例示でき、ネイティブコラーゲンがさらに好ましい。
馴化培養液20を用いることで、コラーゲンビトリゲル膜3の下面に、臓器由来細胞6を配置する手間が省ける。また、後述するように、本実施形態の血液組織関門インビトロモデル101を、薬物の血液組織関門移行性評価方法に用いる場合には、評価対象の化合物の臓器由来細胞6への非特異的吸着を回避することができる。更に、評価対象の化合物のタンパク質への非特異的吸着回避の観点から、馴化培養液20として、無血清培養液を用いることが好ましい。
1実施形態において、本発明は、上記血液組織関門インビトロモデルを用いて、コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法を提供する。
上述した血液組織関門インビトロモデルにおいて、病態条件に対応する培養液を用いる、又は、疾患を患っている患者由来の細胞を用いる等により、病態のインビトロモデルを作製することができる。
そして、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデル、それぞれにおける薬物の組織移行性を検討することにより、病態組織選択的に移行する薬物をスクリーニングすることができる。
(1)予め培養したHDF(クラボウより購入、KF-4009)を回収し、1.3×105細胞/mLとなるように培養液と混合し、HDFの懸濁液を調製した。培養液は、10%ウシ胎児血清(Fetal bovine serum;FBS)、20mM HEPES、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン含有DMEM(ThermoFisher Scientificより購入、11885-084)を用いた。
(2)次いで、オプションリング(関東化学株式会社より購入、08369-96)を装着したad-MEDビトリゲル(登録商標)2(12ウエル)、08363-96)のチャンバー裏面に、(1)で調製したHDFの懸濁液を4.0×104細胞/cm2となるように0.3mL加え、培養した(図3のday-1参照。)。
(3)次いで、(2)の翌日(図3のday0参照。)に予め培養したHMVEC(クラボウより購入、KE-4209)を回収し、1.4×105細胞/mLとなるように培養液と混合し、HMVECの懸濁液を調製した。培養液は、5%FBS、5ng/mL組み換えヒトFGF-b、50μg/mLアスコルビン酸、1μg/mLヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、10mM L-グルタミン、15ng/mL組み換えヒトIGF-1、5ng/mL組み換えヒトEGF、5ng/mL組み換えヒトVEGF、0.75units/mLヘパリン硫酸、30mg/mLゲンタマイシン、15μg/mLアムホテリシンB含有VascuLife(登録商標)Basal Medium(Lifeline Cell Technologyより購入、LM-0002)を用いた。
(4)次いで、(2)で用意したチャンバーを12ウェルプレートにセットし、チャンバーの内側に(3)で調製したHMVECの懸濁液を7.0×104細胞/cm2となるように0.5mL加えた。次いで、チャンバーの外側にHMVECの培養液を1.5mL加えた。
なお、図3に示すように、HMVECとHDFをインサート両面に培養したモデルを皮膚血管の「器官様プレート型」モデル、HMVEC又はHDFの1種類の細胞のみを培養したモデルを「組織シート型」モデルと定義する。
(5)次いで、位相差顕微鏡を用いて、day0、day2、day6に「器官様プレート型」モデル(図4の(A)~(C)参照。)、HMVECの「組織シート型」モデル(図4の(D)~(F)参照。)。HDFの「組織シート型」モデル(図4の(G)~(I)参照。)を観察した。
(1)実施例1で作製した3種類のモデルのTEER値をday0、day1、day2、day3、及びday6に測定した。測定前に、各モデルのチャンバー内及びチャンバー外に入っている培養液を除去し、予め室温に戻しておいたHMVECの培養液をチャンバー内に0.5mL、チャンバー外に1.5mL加えた。
(2)次いで、TEER測定装置(関東化学株式会社より購入、40225-97)につないだ専用電極(関東化学株式会社より購入、14136-97)を各モデルのチャンバーにセットし、TEER値を記録した。ネガティブコントロールであるHDFの「組織シート型」モデルのTEER値は、day3が最大値(11.69±0.27Ω・cm2)であった(図5参照。)。これに対し、HMVECの「組織シート型」モデルのday3のTEER値は、23.53±0.45Ω・cm2であった。一方、「器官様プレート型」モデルは、day1より高いTEER値を示し、day1、day2、day3、及びday6のTEER値は、それぞれ、22.62±3.06Ω・cm2、31.50±2.46Ω・cm2、42.63±3.94Ω・cm2、及び57.24±7.29Ω・cm2であった。以上より、「器官様プレート型」モデルは、高い内皮バリア機能を有することが確認された。
(1)実施例2で用いたday6のHMVECの「組織シート型」モデルのチャンバー内、及び外の培養液を除去し、同じく実施例2で用いたday6の「器官様プレート型」モデルのチャンバー内及び外のCMを加えて24時間培養した(図6(A)参照)。
(2)次いで、TEER値を測定したところ、培養液を加えたHMVECの「組織シート型」モデル (HMVEC+培養液) のTEER値は14.5±1.51Ω・cm2であったのに対し、CMを加えた同モデル (HMVEC+CM) のTEER値は27.04±7.77 Ω・cm2であり、統計学的に有意な差を認めた(**P<0.01、t検定により検定)(図6(B)参照) 。以上より、「器官様プレート型」モデルのCMには内皮バリア機能を強化する作用があることが確認された。
(1)実施例2で用いたday6のHMVECの「組織シート型」モデル、及び「器官様プレート型」モデルのチャンバー内及び外の培養液を除去し、予め室温に戻しておいた添加剤を含まないVascuLife(登録商標)Basal Mediumをチャンバー内に0.5mL、チャンバー外に1.5mL加えた。
(2)次いで、チャンバーに電極をセットし、TEER値を測定した。この時の測定値を、測定開始時(0秒) の値とした。
(3)次いで、チャンバー内のVascuLife(登録商標)Basal Mediumを除去し、ヒスタミン二塩酸塩(東京化成工業株式会社より購入、H0146)を含有するVascuLife(登録商標)Basal Mediumを加えた。次いで、TEER測定を開始し、10秒ごとに180秒間TEER値を連続測定した。「器官様プレート型」モデルでは測定開始時の値が約50Ω・cm2であったのに対し、1nMヒスタミンの添加により約32Ω・cm2まで減少し、この変化はヒスタミンを加えていないコントロールと比較して統計学的に有意な変化であった(***P<0.001、二元配置分散分析の後Tukey-Kramer法により検定)。さらに、1μM ヒスタミンの添加では約23Ω・cm2まで減少したが、この変化はコントロールおよび1nMヒスタミン添加の両方と比較して統計学的に有意な変化であった(***P<0.001、###P<0.001、二元配置分散分析の後Tukey-Kramer法により検定)(図7(A)参照)。一方、HMVECの「組織シート型」モデルでは測定開始時の値が約5.7Ω・cm2であったのに対し、100 μMヒスタミンの添加で約3.2Ω・cm2まで減少したが、この変化はコントロールと比較して統計学的に有意な差ではなかった(二元配置分散分析により検定)(図7(B)参照)。以上より、「器官様プレート型」モデルは「組織シート型」モデルよりも低濃度のヒスタミンに濃度依存的に応答し、TEER値の変化を統計学的な有意な差をもって検出できることが示された。
(1)実施例2で用いたday 6のHMVECの「組織シート型」モデルのチャンバー内及び外の培養液を除去し、予め室温に戻しておいたHank’s Balanced Salt Solution (HBSS、ThermoFisher Scientificより購入、14025-092) をチャンバー内に0.5mL、チャンバー外に1.5 mL加えて2回洗浄した。
(2)次いで、HBSSをチャンバー外に1.8mL、100μMヒスタミン含有HBSSをチャンバー内に0.5mL加え、室温で10分間インキュベートした。
(3)次いで、 チャンバー内の溶液を除去し、100μMヒスタミン及び10μg/mL Sodium fluorescein (Uranine)(東京化成工業株式会社より購入、F0096)又は500μg/mL Fluorescein isothiocyanate-dextran (FD)-4(Sigma-Aldrichより購入、FD4-100MG)又は500μg/mL FD-40(Sigma-Aldrichより購入、FD40S-100MG)を含有するHBSSをチャンバー内に0.5mL加え、室温で60分間インキュベートした。
(4)次いで、チャンバー外の溶液100μLを96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーSpectraMax Gemini XS Microplate Reader(Molecular Devicesより購入)を用いて蛍光強度を測定した(λexcitation/λemission=490nm/520nm) 。あわせて、各蛍光物質の希釈系列を用いて検量線を作製し、チャンバー外へ移行した蛍光物質の量を求めた。
(5)次いで、次式に基づいて各蛍光物質の見かけの透過係数Papp(cm/sec) を求めた。
Papp=dQ/dt×1/A×1/C0
dQ/dt; 単位時間あたりの移行量(μg/sec)、A; 表面積 (cm2)、C0; 各蛍光物質の初濃度
100μMヒスタミンの添加により、Sodium fluorescein(分子量376)、FD-4(分子量4,000)、及びFD-40(分子量40,000)のいずれの分子のPappも上昇した(図8(A)-(C)参照)。特に、FD-4についてはControlのPappが3.15×10-6±9.83×10-7cm/secであったのに対し、100μMヒスタミンの添加により約2倍の5.88×10-6±5.52×10-7cm/secまで上昇し、この変化は統計学的に有意な変化であった(*P<0.05、t検定により検定)。以上より、皮膚血管の「器官様プレート型」モデルではヒスタミン誘発の炎症によって分子量4,000程度の中分子の透過性が上昇することが確認された。
係る結果から、評価に用いた分子量の異なる上記3種の化合物は、病態組織選択的透過性がそれぞれ異なる化合物ということができる。即ち、本発明によれば、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、両インビトロモデルにおいて、薬物の移行性を比較評価することにより、病態組織選択的に透過性を有する薬物をスクリーニングすることができる。
(1)実施例1で作製したHMVECとHDFを用いた「器官様プレート型」モデルと同様の方法で、HMVECとラットグリオーマ細胞株C6(理化学研究所バイオリソースセンターより提供、RCB2854)又はHMVECと肝がん細胞株HepG2-NIAS(理化学研究所バイオリソースセンターより提供されたHepG2を馴化培養し再寄託した細胞株、RCB4679)を用いた「器官様プレート型」モデルを作製した。C6とHepG2-NIASの培養液は、10% FBS、20mM HEPES、100 units/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン含有DMEMを用いた。
(2)次いで、実施例2と同様の方法で経時的なTEER値の変化を測定した。結果を図9に示す。皮膚由来のHDF(図9(A)参照。)のみならず、脳由来のC6(図9(B)参照。)、肝臓由来のHepG2-NIAS(図9(C)参照。)を用いても血管内皮培養モデルが作製できることが確認された。
hCMEC/D3は、増殖能が高く汎用されているヒト血管内皮細胞株であるが、内皮バリア機能が低いため血液組織関門モデルの構築には不適である。そこで、本細胞から内皮バリア機能を有するクローン細胞株を選別し、その炎症応答性を確認した。
これらの結果、生理的な濃度のヒスタミンによる内皮バリア機能変化を定量的に評価することができたことから、本クローン細胞株は、薬物の組織移行性評価モデルの構築に適していると考えられる。
(1)予め培養したHDFを回収し、8.0×104細胞/mLとなるように培養液と混合し、HDFの懸濁液を調製した。培養液は、5% FBS、5ng/mL 組み換えヒトFGF-b、50μg/mL アスコルビン酸、1μg/mL ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、10 mM L-グルタミン、15 ng/mL 組み換えヒトIGF-1、5ng/mL組み換えヒトEGF、5ng/mL 組み換えヒトVEGF、0.75units/mL ヘパリン硫酸、30mg/mL ゲンタマイシン、15μg/mL アムホテリシンB含有VascuLife(登録商標)Basal Mediumを用いた。
(4)また、オプションリングを装着したコラーゲンビトリゲル膜チャンバーのチャンバー裏面に、(3)で調製したHDFの懸濁液を4.0×104細胞/cm2となるように0.3mL加えて培養した。細胞が接着した2時間後にオプションリングを外して12穴プレートに設置し、コラーゲンビトリゲル膜チャンバーの外側に1.5mL、内側に0.5mLの培養液を注入して6日間培養した。この間、毎日培養液を交換した。培養4日目、5日目、及び6日目のチャンバー内及び外のCMを回収して混合した(図13(B)参照。)。
Claims (4)
- コラーゲンビトリゲル膜と、
前記コラーゲンビトリゲル膜の上面に配置されたヒト血管内皮細胞と、
前記コラーゲンビトリゲル膜の下面に配置された臓器由来細胞と、培養液と、を含み、
前記ヒト血管内皮細胞は、前記臓器由来細胞に依存して、前記臓器由来細胞が由来する臓器の血管内皮細胞に分化し得る細胞であり、
前記臓器由来細胞は、脳由来細胞、又は肝臓由来細胞、或いはこれらのクローン化された細胞であり、前記臓器は、脳、又は肝臓である、血液組織関門インビトロモデル。 - 前記培養液は、無血清培養液である、請求項1に記載の血液組織関門インビトロモデル。
- 請求項1又は2に記載の血液組織関門インビトロモデルを用いて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量を測定する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
- 請求項1又は2に記載の血液組織関門インビトロモデルにおいて、正常状態のインビトロモデルと病態のインビトロモデルを用意し、
両インビトロモデルにおいて、前記コラーゲンビトリゲル膜の上方部に薬剤を添加し、一定時間後に、前記コラーゲンビトリゲル膜の下方部に漏れ出た、薬物の量をそれぞれ測定し、比較することにより、薬物の病態組織選択的移行性を評価する、薬物の血液組織関門移行性評価方法。
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