JP7321445B2 - 微生物培養方法、微生物培養装置、及び、二酸化炭素還元装置 - Google Patents

Description

本発明は、微生物培養方法、微生物培養装置、及び、二酸化炭素還元装置に関する。

非特許文献１には、細胞外固体から電子を取り込む機能を有する微生物に、電極から電子を与えて上記微生物のエネルギー代謝を活性化させる方法が記載されている。具体的には、１００％窒素ガスで置換された嫌気性チャンバ内に保持されたシングルセル３電極の反応器を用いてＤ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５株を培養したところ、エネルギー代謝が活性化されたことが記載されている。

Ｘｉａｏ Ｄｅｎｇら、Ｆｒｏｎｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９、Ａｒｔｉｃｌｅ２７４４（２０１８）

本発明者らは、非特許文献１に記載された方法は、細胞外固体から電子を取り込む機能を有する微生物（以下、「特定微生物」ともいう。）のエネルギー代謝を活性化するものの、特定微生物を増殖せしめるには至らず、その活性化の程度に改善の余地があることを知見している。

そこで、本発明は、細胞外固体から電子を取り込む機能を有する微生物に、細胞外固体から電子を与えて、上記微生物を増殖させることができる微生物培養方法を提供することを課題とする。
また、本発明は微生物培養装置、及び、二酸化炭素還元装置を提供することも課題とする。

本発明者らは、上記課題を達成すべく鋭意検討した結果、以下の構成により上記課題を達成することができることを見出した。

［１］ 水と微生物とを含有する培養液と、上記培養液に接するように配置された一対の電極と、を有する電気化学セルを用いて、上記一対の電極間に電位差を発生させ、上記培養液中の上記微生物を増殖させる、微生物培養方法であって、上記電気化学セルは、上記一対の電極を互いに隔離するように配置された陽イオン交換膜を有し、上記微生物は細胞外固体から電子を取り込む機能を有する特定微生物である、微生物培養方法。
［２］ 上記電気化学セルが更に参照電極を有する、［１］に記載の微生物培養方法。
［３］ 上記培養液が実質的に水素を含有しない、［１］又は［２］に記載の微生物培養方法。
［４］ 上記一対の電極の少なくとも一方が導電性ダイヤモンド電極である、［１］～［３］のいずれかに記載の微生物培養方法。
［５］ 実質的に酸素ガスを含有しない雰囲気で行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の微生物培養方法。
［６］ 水を含有する培養液を収容するためのセルと、上記培養液に接するように上記セル内に配置された一対の電極と、上記一対の電極を互いに隔離するよう配置された陽イオン交換膜と、を有する電気化学セルを有し、上記一対の電極の少なくとも一方が、導電性ダイヤモンド電極である、微生物培養装置。
［７］ ［６］に記載の微生物培養装置を有する二酸化炭素還元装置。

本発明によれば細胞外固体から電子を取り込む機能を有する微生物に、細胞外固体から電子を与えて、上記微生物を増殖させることができる微生物培養方法が提供できる。また、本発明によれば、微生物培養装置、及び、二酸化炭素還元装置も提供できる。

本微生物培養方法に適用可能な微生物培養装置の模式図である。 Ｄ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５を電極上で５日間培養した場合に生成する電流密度の電位依存性を示した試験結果である。 電極上で５日間培養した菌体についてｎａｎｏＳＩＭＳで測定した結果をプロットした活性解析結果（電極電位－０．４Ｖ）である。 電極上で５日間培養した菌体についてｎａｎｏＳＩＭＳで測定した結果をプロットした活性解析結果（電極電位－０．５Ｖ）である。 電極電位を－０．４Ｖとして１３日間培養したＤ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５の活性解析結果である。

以下、本発明について詳細に説明する。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。

［微生物培養方法］
本発明の実施形態に係る微生物培養方法（以下、「本培養方法」ともいう。）は、水と微生物とを含有する培養液と、上記培養液に接するように配置された一対の電極と、を有する電気化学セルを用いて、上記一対の電極間に電位差を発生させ、上記培養液中の微生物を増殖させる、微生物培養方法であって、上記電気化学セルは上記一対の電極を互いに隔離するように配置された陽イオン交換膜を有し、上記微生物は細胞外固体から電子を取り込む機能を有する特定微生物である、微生物培養方法である。

本培養方法によれば細胞外固体（例えば、電極）から電子を取り込む機能を有する微生物に、細胞外固体から電子を（好ましくは唯一のエネルギー源として）与えても、上記微生物を増殖させることができる。上記の機序は必ずしも明らかではないが、本発明者らは以下のとおり推測している。なお、以下に説明する機序は推測であり、以下の機序によらず本発明の課題が解決できる場合も、本発明の範囲に含まれる。

非特許文献１の図１Ａには、陽イオン交換膜を有しない電気化学セルを用いてＤ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５株を作用電極上で培養したとき、インキュベーション時間を長くしても、生成される負の電流の絶対値が一律に増大していくわけでなく、かつ、^１５Ｎ／Ｎ_totalも平均０．６％程度にとどまることが示されている。

上記実験系では、当初Ｎ同位体比（^１５Ｎ／Ｎ_total）が０％の微生物細胞を培養しているため、同位体窒素（^１５Ｎ）を取り込んで成長し、分裂して元と同じ大きさの２つの細胞になった場合（増殖した場合）、^１５Ｎ／Ｎ_{ｔｏｔａｌ}は５０％になると考えられる。
すなわち、非特許文献１に記載された方法によれば、Ｄ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５株のエネルギー代謝（典型的には^１５Ｎ／Ｎ_totalによって示される）が活性化されるものの、電子（印加された電位）を唯一のエネルギー源とした場合には、特定微生物を増殖させることまでは困難であることを示していると考えられた。

一方、電子以外の他のエネルギー源を加えることにより、特定微生物を増殖させることは可能であったとしても、それは特定微生物について選択的な培養を行うという観点では不利であり、電子を唯一のエネルギー源とした場合にも特定微生物を「増殖」せしめることができる培養方法が求められていた。

本発明者らは、非特許文献１に記載された方法によっては、特定微生物を増殖させることが困難だった原因について鋭意検討を続けてきた。
その結果、一対の電極を互いに隔離するように配置された陽イオン交換膜を有する電気化学セルを用いることで、驚くべきことに、特定微生物のエネルギー代謝が著しく活性化されることを本発明者らは初めて知見し本発明を完成させた。

電気化学セルにおいて特定微生物に細胞外固体から電子を与えると、特定微生物が電子を細胞内に取り込むことにより負の電流が発生する。その際、対電極における電極反応で活性酸素種（例えば、スーパーオキシド等）が発生するものと推測される。この活性酸素種が作用電極側に移動し、特定微生物の生長を阻害するものと推測される。

一般的に、対電極における酸化還元反応で生じる物質が作用電極において微生物の生長に影響を与える場合があることは知られているが、培養液に電子メディエータ（酸化還元物質）を含有しない系において、同様の現象が起こりうることは知られていなかった。
そもそも、従来の電気培養においては、電極電位をより負にすることは、微生物の生長にとっては不利であり、自然界における特定微生物の生育環境にあわせ、電極電位を負にしすぎることなく、比較的マイルドな条件にて培養することが好ましいと考えられてきた。
そのため、対電極で発生する上記活性酸素種の影響は無視できるほどに小さく、従来知覚されなかったものと推測される。

すなわち、電子を唯一のエネルギー源として、電子メディエータを含まない培養液で特定微生物を電気培養するに際し、電極電位をより負にするという、これまでの技術常識では試みられたことがない条件で特定微生物の電気培養を試みた結果、陽イオン交換膜を有さない電気化学セルを用いた場合には、特定微生物のエネルギー代謝が活性化はされるものの、特定微生物を増殖せしめるには至らず、その活性化の程度に改善の余地があること本発明者らは初めて知見したものである。すなわち、本発明の解決しようとする課題自体が本発明者らの新たな発見に基づくものである。

本培養方法で使用される電気化学セルは一対の電極を隔離するイオン交換膜を有しているため、対電極で活性酸素種等が発生しても、これらが作用電極側に輸送されにくく、結果として特定微生物の生長が阻害されにくく、微生物が増殖したものと推測される。
以下では、本培養方法についての詳細を説明する。

〔微生物培養装置〕
図１は本微生物培養方法に適用可能な微生物培養装置１０の模式図である。
微生物培養装置１０は、電気化学セルＥＣＣと、上記電気化学セルＥＣＣに接続された制御装置１７とを有している。電気化学セルＥＣＣは、作用電極１１と、対電極１２からなる一対の電極と、参照電極１３と、チャンバ１４と、作用電極１１、及び、対電極１２を隔離する陽イオン交換膜１６とを有している。
電気化学セルＥＣＣにおいて、作用電極１１、対電極１２、及び、参照電極１３は、チャンバ１４に収容された水と特定微生物とを含有する培養液１５と接するように配置されている。

微生物培養装置１０において、作用電極１１、対電極１２、及び、参照電極１３はそれぞれ制御装置１７と電気的に接続されている。
制御装置１７は、電極間の電位、及び、電流を制御することができ、かつ、電極間の電位、及び、電流を計測できるよう構成されており、典型的にはポテンシオ／ガルバノスタット（Ｐ／Ｇスタット）である。

上記電気化学セルＥＣＣでは、制御装置１７は、作用電極１１と参照電極１３との間の電位差を測定し、測定した電位差が設定電位に達するように作用電極１１と対電極１２との間の電位差を調整する。また、基準となる参照電極１３には一切電流が流れないように制御する。

微生物培養装置１０において、電気化学セルＥＣＣは参照電極を有しているが、本培養方法に用いる電気化学セルは上記に制限されず、参照電極１３を有していなくてもよい。電気化学セルが参照電極を有していると、電極電位をより正確に測定、及び／又は、制御可能な点で好ましい。
なお、培養液の電位を設定するために必要な作用電極１１と対電極１２との間の電流量が予め分かっている場合には、電気化学セルが参照電極を有さなくても、電位の制御が可能である。

培養液１５は水と特定微生物とを含有している。そのため、特定微生物は細胞外固体である作用電極１１から外膜シトクロムを介して電子を取り込みエネルギー代謝に用いる。このとき、電流が生成され、制御装置１７で感知することができる。
本培養方法は、特定細菌を増殖せしめる程度にエネルギー代謝を活性化させるために、作用電極１１の電極電位をより負に調整する。すなわち、作用電極１１と対電極１２との間に電位差を生じさせる。
このとき、対極では、電極反応によってスーパーオキシド等の活性酸素種が生成すると推測されるが、本培養方法で用いる電気化学セルは両電極を隔離する陽イオン交換膜を有しているため、両電極間のイオン伝導は維持しつつ、活性酸素種が作用電極側に輸送されるのを抑制することができる。そのため、本発明の効果が得られるものと推測される。

このとき、作用電極の電位としては特に制限されないが、特定微生物の活性をより高められる観点で、標準水素電位に対して－０．３Ｖ以下（－０．３Ｖを含み、－０．３Ｖより負）が好ましく、－０．３Ｖ未満（－０．３Ｖを含まず、－０．３Ｖより負）がより好ましい。下限は電極の電位窓との関係で、電極反応で水素が発生しない最低電位以上（より正）が好ましい。培養液中で電子メディエータとして機能する可能性のある水素の発生を抑制することで、特定微生物をより選択的に培養できる点で好ましい。

電気化学セルＥＣＣにおいて、チャンバ１４内の培養液１５の液面より上の部分（ヘッドスペース、図１中のＨＳの部分）には、酸素（酸素ガス）を実質的に含有しない気体が充填されている。具体的には、Ｎ_２（窒素）ガスが充填されている。
本培養方法は、実質的に酸素を含有しない雰囲気で行われることが好ましい。この場合、図１のＨＳに実質的に酸素を含有しないガスが充填されていればよいが、より好ましくは、微生物培養装置が配置される雰囲気自体が酸素を実質的に含有しないことが好ましい。
なお、本明細書において、雰囲気が酸素を含有しないとは、雰囲気ガス中における酸素（ガス）の含有量が体積基準で１００ｐｐｍ以下であることを意味し、５０ｐｐｍ以下であることが好ましく、５ｐｐｍ以下であることがより好ましい。

なお、チャンバ１４はヘッドスペースを有していなくてもよいが、ヘッドスペースを有する場合、ヘッドスペースに充填される気体としては特に制限されず、空気等の酸素を含有する気体が充填されていてもよいが、より選択的に特定微生物を培養できる観点から、ヘッドスペースには、実質的に酸素を含有しない気体が充填されることが好ましく、窒素等の不活性ガスが充填されることが好ましい。

電気化学セルＥＣＣにおいて、チャンバ１４は密閉されているが、本培養方法に適用可能な電気化学セルとしては上記に制限されず、開放されていてもよい。また、チャンバ１４に流通口を配置し、ヘッドスペースの気体、及び／又は、培養液に外部から媒体を導入可能にしてもよい。また、ヘッドスペースの気体、及び／又は、培養液の少なくとも一部をチャンバ１４外へ排出可能にしてもよい。

＜培養液＞
微生物培養装置１０のチャンバ１４には、水と微生物とを含有する培養液が充填されている。培養液は、特定微生物を増殖させるための場としての機能と、作用電極１１と対電極１２との間のイオン伝導の媒体としての機能とを有し、水を含有していれば、固体であっても液体であってもよい。固体である場合、ヒドロゲルである形態が挙げられる。

（特定微生物）
培養液は特定微生物を含有する。培養液が特定微生物を含有する形態としては特に制限されないが、例えば、調製した培養液に特定微生物を添加する方法、及び、特定微生物を含有する液体を培養液として用いる（環境から取得したサンプルを培養液とする）方法等が挙げられる。

特定微生物としては特に制限されないが、例えば、鉄還元細菌、及び、鉄酸化細菌等が挙げられる。より具体的には、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｌｆｕｒｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ ｌｏｖｌｅｙｉ等のゲオ（ジオ）バクタ―属菌；Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ ＭＲ－１等のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ属菌；デスルフォビブリオ（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ）属菌；Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ等のＡｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ（アシドチオバシラス）属菌；Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ菌等のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属菌；等が挙げられる。なお、培養液は、特定微生物の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。

また、培養液は特定微生物以外の他の微生物を含有していてもよい。環境から取得したサンプル（例えば、河川水、排水、及び、海水等）を用いる場合、一般に特定微生物以外の微生物が含有されている。本培養方法によれば、電子を唯一のエネルギー源として培養することが可能であるため、複数の微生物を含有する培養液を用いた場合でも、特定微生物を選択的に培養することが可能である点で優れている。

なお、培養液は上記以外の他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、例えば、酸化還元物質、電解質、及び、栄養源化合物等が挙げられる。

（酸化還元物質）
培養液は酸化還元物質を含有していてもよい。酸化還元物質は、培養液と接している作用電極１１、及び／又は、対電極１２と可逆的に酸化還元反応を生じる物質であり、かつ、特定微生物の生育を阻害しない物質が好ましい。このような成分としては、例えば、鉄イオンが挙げられる。
酸化還元物質が培養液中でより安定的に存在する点で、鉄イオンをキレート剤に配位させて用いてもよい。キレート剤としては、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメル、及び、エデト酸トリエンチン等が挙げられる。

また、鉄イオン以外にも、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスル及び、ホン酸ナトリウム等のキノン化合物；メチルビオロゲン；等を用いることができる。これらの物質も酸化還元反応により、酸化体と還元体に可逆的に変化する。

培養液中にける酸化還元物質の含有量としては特に制限されないが、一般に０．１～１００ｍｍｏｌ／Ｌであることが好ましい。
なお、培養液は、酸化還元物質の１種を単独で含有してもよく、２種以上を含有していてもよい。培養液が、２種以上の酸化還元物質を含有する場合には、その合計含有量が上記数値範囲内であることが好ましい。

本発明の一実施形態に係る微生物培養方法としては、培養液中に実質的に酸化還元物質を含有しない形態が好ましい。特に、培養液中に特定微生物とその他の微生物とが混在する場合、培養液中に実質的に酸化還元物質を含有しない場合であっても、特定微生物は細胞外固体から電子を取り込む機能を有するため、より選択的に特定微生物を増殖させることができる。

特に、特定微生物が低エネルギー環境下で増殖が遅い微生物である場合、培養液は酸化還元物質を実質的に含有しないことが好ましい。
なお、培養液が酸化還元物質を実質的に含有しないとは、培養液中における酸化還元物質の含有量が０．１ｍｍｏｌ／Ｌ未満であることを意味し、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましい。
また、培養液は実質的に水素を含有しないことが好ましく、培養液が水素を含有しないとは、培養液中における水素の含有量が、１００質量ｐｐｍ以下であることが好ましく、５０質量ｐｐｍ以下であることがより好ましく、１０質量ｐｐｍ以下であることが更に好ましく、１質量ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。

（電解質）
電解質としては特に制限されず、公知の電解質が使用可能である。電解質としては、例えば、塩化ナトリウム、及び、塩化カリウム等が挙げられる。

（栄養源）
培養液は、微生物の生育に必要な栄養源を含有することが好ましい、このような成分としては例えば、乳酸ナトリウム、ＫＨ_２ＰＯ_４、ＮＨ_４Ｃｌ、ＭｇＣｌ_２、及び、カザミノ酸等が挙げられる。

＜電極＞
本培養方法に用いられる電気化学セルは一対の電極を有する。また、更に参照電極を有していることが好ましい。
これらの電極としては特に制限されないが、例えば、金属を用いて形成することができる。金属としては、例えば、金、白金、銀、銅、パラジウム、イリジウム、ルテニウム、アルミニウム、ニッケル、チタン、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、酸化亜鉛、及び、これらの混合物を用いることができる。また、上記以外にも例えば、炭素（黒鉛）等も使用可能である。また、参照電極及び対電極としては、銀／塩化銀等も使用可能である。

また、電極は絶縁基板と、上記絶縁基板上に形成された導電層から形成されていてもよい。絶縁基板としては特に制限されないが、樹脂、ガラス、セラミック、及び、紙等を用いて形成できる。
樹脂としては、例えば、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリイミド樹脂、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、及び、ガラスエポキシ等が挙げられる。

導電層は、上記金属を用いて形成可能である。その場合の導電層の厚みとしては特に制限されないが、例えば、１～１０μｍが好ましい。上記導電層は、物理蒸着法、及び、化学蒸着法により形成可能である。

なかでも、電位窓がより広い点で、一対の電極の少なくとも一方（作用電極、及び、対電極からなる群より選択される少なくとも一方）の電極は、導電性ダイヤモンド電極であることが好ましい。導電性ダイヤモンド電極とは、ダイヤモンドに不純物をドープした材料を用いた電極を意味する。不純物としては特に制限されないが、ホウ素（Ｂ）、硫黄（Ｓ）、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、及び、ケイ素（Ｓｉ）等が挙げられる。
なかでも、ホウ素をドープしたホウ素ドープダイヤモンドは、電位窓が広く、他の電極材料と比較してバックグランド電流が小さいといった有利な性質を有することから好ましい。

導電性ダイヤモンド電極を用いると、培養液中の水が電気分解するのに必要な電圧がより高まり、作用電極の電位をより負に制御した場合にも水素が発生しにくい。水素は培養液中で電子メディエータとして機能する可能性がある。特定微生物は、細胞外固体から電子を取り込む機能を有しているため、電子メディエータとして機能する物質を含有しない方が、特定微生物をより選択的に培養することができる。
すなわち、培養液が水素を実質的に含有しない方が、特定微生物をより選択的に培養できる点で好ましい。

導電性ダイヤモンド電極の製造方法としては特に制限されず、公知の方法が使用可能である。具体的には、炭素源を含有する原料ガスに、ジボラン、トリメトキシボラン、及び、酸化ホウ素等のホウ素源；酸化硫黄、及び、硫化水素等の硫黄源；酸素、及び、二酸化炭素等の酸素源；アンモニア、及び、窒素等の窒素源；シラン等のケイ素源を加えればよい。

上記の電極は、特開２００６－９８２８１号公報、特開２００７－１３９７２５号公報、特開２０１１－１５２３２４号公報、又は特開２０１５－１７２４０１号公報等に開示されており、これらの公報の記載に従って作製することができる。

＜陽イオン交換膜＞
陽イオン交換膜は、作用電極１１と対電極１２とを隔離し、対電極１２において生じる活性酸素種等が作用電極１１側へと移動するのを抑制する機能を有する。
陽イオン交換膜としては、特に制限されず、電気化学セル用として公知の陽イオン（カチオン）交換膜を使用することができる。電気化学セルが陽イオン交換膜を有していると、対電極における反応で生じた活性酸素種が作用電極側へと移動を抑制し、結果として、特定微生物のエネルギー代謝が増殖可能な程度に向上するものと推測される。

陽イオン交換膜としては、プロトンを透過可能なカチオン交換膜を含むことが好ましい。陽イオン交換膜としては特に制限されないが、例えば、「ナフィオン（登録商標）」等を用いることができる。

なお、陽イオン交換膜は単独で用いてもよく、陰イオン交換膜、及び／又は、支持体と併せて用いてもよい。そのような場合、支持体を陽イオン交換膜と陰イオン交換膜とで挟んだ積層構造を有するイオン交換膜積層体を用いる形態が挙げられる。

［微生物培養装置］
本発明の実施形態に係る微生物培養装置は、水を含有する電解液を収容するためのセルと、上記電解液に接するように上記セル内に配置された一対の電極と、上記一対の電極を互いに隔離するよう配置されたイオン交換膜と、を有する電気化学セルを有し、上記一対の電極の少なくとも一方が、導電性ダイヤモンド電極である、微生物培養装置である。

上記微生物培養装置は、電位窓の広い導電性ダイヤモンド電極を有するため、作用電極の電位をより負にした場合にも水素が発生しにくい。そのため、作用電極の電位をより負にできる点で、特定微生物の活性をより向上しやすく、結果としてより優れた本発明の効果が得られやすい。
また、電位窓が広いため、作用電極をより負にしても、作用電極における反応で水素がより発生しにくい。水素は電子メディエータとしての機能を有するため、上記微生物培養装置によれば、電子メディエータである水素の発生をより抑制しつつ、更に、作用電極の電位をより負に制御できるため、より選択的、かつ、効率的に特定微生物を培養できる。

なお、上記微生物培養装置は一対の電極の一方が導電性ダイヤモンド電極である点を除いては、図１に示した微生物培養装置と同様であり、その好適形態も同様であり、すでに説明したとおりである。

［二酸化炭素還元装置］
本発明の実施形態に係る二酸化炭素還元装置は、上記微生物培養装置を有する二酸化炭素還元装置である。
特定微生物は細胞外固体から電子を取り込み、複数のタンパク質を介してプロトン駆動力とＮＡＤＨとを生成し、上記によってケルビン回路を駆動し、二酸化炭素を固定する機能を有する。上記微生物培養装置を用いて特定微生物のエネルギー代謝を向上させ、炭素源として二酸化炭素を加えることで、効率的に二酸化炭素を固定することが可能である。

以下に実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す実施例により限定的に解釈されるべきものではない。

［特定微生物の準備］
Ｄ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５（ＤＳＭ番号１５５７９）は，ＣＯ_２／Ｎ_２（２０：８０，ｖ／ｖ）の無酸素条件下，２８℃で１００ｍｌのＤＳＭＺ１９５ｃ培地を含むブチルゴム栓付きバイアル中で前培養した。５日後，培養物には少量の黒色硫化鉄沈殿剤が含まれていた。
なお、ＤＳＭは、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ」の略、ＤＳＭＺは、「Ｄｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ」の略である。

［特定微生物の培養］
特定微生物の培養は、１００％Ｎ_２を充填したＣＯＹ嫌気性チャンバー内に保持された３電極反応器を用いて行った。上記３電極反応器は、イオン交換膜を有し、作用電極と対電極とが上記イオン交換膜で隔離され、参照電極を有するＨ型セルの３電極反応器である。

作用電極には、スプレー熱分解によりガラス基板上に成長させた酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）（ＳＰＤ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、抵抗８Ω／ｓｑｕａｒｅ、厚さ１．１ｍｍ、表面積３．１ｃｍ^２）を用い、反応器の底に配置した。
白金線、及び、Ａｇ／ＡｇＣｌ（ｓａｔ．ＫＣｌ）をそれぞれ対電極、及び、参照電極として使用した。

^１５Ｎでラベル化された塩化アンモニウムは以下に示す培養液の一部として用いられた。培養液の組成を以下に示した。

（培養液の組成）
・ＮａＣｌ ：４５７ｍＭ
・ＭｇＣｌ_２ ：４７ｍＭ
・ＫＣｌ ：７．０ｍＭ
・ＮａＨＣＯ_３ ：５．０ｍＭ
・ＣａＣｌ_２ ：１．０ｍＭ
・Ｋ_２ＨＰＯ_４ ：１．０ｍＭ
・Ｎａ^＋－Ｈｅｐｅｓ液（ｐＨ７．５） ：２５ｍＭ
・亜セレン酸タングステン酸塩溶液 ：１ｍＬ
（１２．５ｍＭのＮａＯＨ、１１．４ｍＭのＮａ_２ＳｅＯ_３・５Ｈ_２Ｏ、及び、１２．１ｍＭのＮａ_２ＷＯ_４２Ｈ_２Ｏ）
・微量元素溶液ＳＬ－１０（ＤＳＭＺ３２０培地に記載されている）：１ｍＬ
・Ｎａ_２ＳＯ_４（電子受容体） ：２１ｍＭ
・［１５Ｎ］ＮＨ_４Ｃｌ ：１ｍＭ
・［１３Ｃ－１］Ｎａ ａｃｅｔａｔｅ（炭素源） ：１ｍＭ

５日間の培養中に、ＩＴＯ電極に対して、唯一のエネルギー源として－０．２～－０．５Ｖの電圧を印加した。電圧印加後、ＩＴＯ電極の色の変化、及び、抵抗の変化は確認されなかった。なお、Ｄ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５（特定微生物に該当する）細胞は、前培養した５日間の液体細胞培養のボトルから蓄積し、^１５Ｎで標識した無酸素培養液に再懸濁し、６００ｎｍでの最終ＯＤ（光学濃度）が電流測定開始後３０分で０．３となるよう、上述の電気化学反応器に添加した。

また、ネガティブコントロールとして、特定微生物をガラスバイアルに同じ密度で添加した。ガラスバイアルは電極を欠いており、電気化学反応器中の電解質と同じ培養液を含んでいた。このネガティブコントロールを、「開回路（ｏｃ）状態」とした。

図２には、Ｄ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５を電極上で５日間培養した場合に生成する電流密度の電位依存性を示した。図２において、横軸は培養日数（日）、縦軸は電流密度（μＡｃｍ^－２）を示している。図２中、実線は印加した電位が－０．４Ｖ（ｖｓ．標準水素電位）であり、一点鎖線は、－０．５Ｖを示している。上記の結果から、電位の印加によって電流が生成され、生成する電流量は、培養期間中、増加する傾向だった。なお、上記実験系では－０．９Ｖより正の電位ではＨ_２はほとんど発生しないため、上記電流生成はＤ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５によって電極から取り込まれた電子によるものと推測される。

（ナノスケール二次イオン質量分析（ｎａｎｏＳＩＭＳ））
ＩＴＯ電極は文献（Ｓａｉｔｏら、Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ８５（８）， ４４４-４４６ （２０１７））に記載された方法でｎａｎｏＳＩＭＳ分析用サンプルに調製された。
具体的には、セルアタッチメントを有するＩＴＯ電極を、７ｍｍ×７ｍｍの小片に切断して、ＮａｎｏＳＩＭＳサンプルホルダーに適合させた。電位差なしでガラスバイアル中で培養した細胞（ｏｃ条件）を、０．０１％（ｗ／ｖ）ポリ－Ｌ－リジン溶液で前処理した７ｍｍｘ７ｍｍＩＴＯ電極片の表面に移した。

次に、２．５％グルタルアルデヒドで固定し、電極を５０ｍＭのＮａ^＋ヘペス（ｐＨ７．４）に３回浸すことによって洗浄した。洗浄した試料を同じ緩衝液中の２５、５０、７５、９０、及び、１００％エタノール勾配で脱水し、ｔ－ブタノールで３回交換し、そして真空下で凍結乾燥した。乾燥サンプルを蒸発した白金で被覆した。ＩＴＯ電極に付着した乾燥細胞をＣＡＭＥＣＡ ＮａｎｏＳＩＭＳ ５０Ｌシステムを用いて分析した。試料表面にＣｓ^＋ビームを照射し、二次イオンの量（^１２Ｃ^１４Ｎ^－、及び、^１２Ｃ^１５Ｎ^－）を定量した。個々の細胞における同位体比の分析のために、データは「Ｆｉｊｉ」によって処理した（ＳｃｈｉｎｄｅｌｉｎらＮａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｖｏｌｕｍｅ ９， ｐａｇｅｓ ６７６-６８２ （２０１２））。

図３には、電極上で５日間培養した菌体についてｎａｎｏＳＩＭＳで測定した結果をプロットした活性解析結果（電極電位－０．４Ｖ）を示した。また、図４には、同じく電極電位－０．５Ｖの場合の活性解析結果を示した
図３及び図４において、横軸は、単一細胞における^１３Ｃ／Ｃ_{ｔｏｔａｌ}を表しており、縦軸は、単一細胞における^１５Ｎ／Ｎ_{ｔｏｔａｌ}を表している。

図３及び図４によれば、多くの細胞においてＮ（窒素）、Ｃ（炭素）の同位体比が高く、Ｄ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５の活性が向上していることがわかった。
また、印加電位が－０．４Ｖである図３と比較して、印加電位が－０．４Ｖより負である（－０．５Ｖ）図４は、菌体細胞内における同位体Ｎ（^１５Ｎ）に対する、同位体Ｃ（^１３Ｃ）の割合（Ｃ／Ｎ比）がより高かった。なお、Ｃ／Ｎ比は、図３及び図４に示した回帰線（破線）の傾きから判断できる。
Ｃ（炭素）の同化過程にはエネルギー（ＡＴＰ）が必要であるため、Ｃの取り込み比率がより高い図５（印加電位が－０．４Ｖより負）の菌体は電極からより多くのエネルギーを獲得したことが示唆された。

図５は、電極電位を－０．４Ｖとして１３日間培養したＤ．ｆｅｒｒｏｐｈｉｌｕｓＩＳ５の活性解析結果を示した。
細胞のＮ同位体比（^１５Ｎ／Ｎ_{ｔｏｔａｌ}）が０％の微生物細胞が同位体窒素（^１５Ｎ）のみを取り込んで生長し、分裂して元と同じ大きさの細胞２つになった場合、^１５Ｎ／Ｎ_{ｔｏｔａｌ}は５０％になると考えられる。図５によれば、電極上で培養した菌体の一部において^１５Ｎ／Ｎ_{ｔｏｔａｌ}が５０％を超えた結果（図中、網掛けの部分）から、一部の微生物細胞が電極上で分裂したことが示唆された。

１０ 微生物培養装置
１１ 作用電極
１２ 対電極
１３ 参照電極
１４ チャンバ
１５ 培養液
１６ 陽イオン交換膜
１７ 制御装置

Claims (9)

1. 微生物培養方法であって、
   水及び微生物を含有し、酸化還元物質の含有量が０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である培養液と、前記培養液に接するように配置された一対の電極と、前記一対の電極を互いに隔離するように配置された陽イオン交換膜と、を有する電気化学セルを用意することと、
   前記一対の電極間に電位差を発生させ、前記一対の電極のうち、電極電位をより負に調整した一方の電極から、前記培養液中の前記微生物が電子を取り込み代謝に用いることにより、前記微生物を増殖させることと、を含み、
   前記微生物の増殖において、前記電極からの電子が唯一のエネルギー源であり、
   前記微生物は、鉄還元細菌、及び、鉄酸化細菌からなる群から選択される少なくとも１種である、微生物培養方法。
2. 前記電気化学セルが更に参照電極を有する、請求項１に記載の微生物培養方法。
3. 前記培養液中における水素の含有量が、１００質量ｐｐｍ以下である、請求項１又は２に記載の微生物培養方法。
4. 前記一対の電極の少なくとも一方が導電性ダイヤモンド電極である、請求項１～３のいずれか１項に記載の微生物培養方法。
5. 酸素ガスの含有量が体積基準で１００ｐｐｍ以下である雰囲気で行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の微生物培養方法。
6. 前記培養液中の前記酸化還元物質の含有量が０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項１～５のいずれか１項に記載の微生物培養方法。
7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の微生物培養方法を実施するための微生物培養装置であって、
   水を含有し、酸化還元物質の含有量が、０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、微生物を培養するための培養液と、
   前記培養液を収容するためのセルと、
   前記培養液に接するように前記セル内に配置された一対の電極と、
   前記一対の電極を互いに隔離するよう配置された陽イオン交換膜と、を有する電気化学セルを有し、
   前記一対の電極の少なくとも一方が、導電性ダイヤモンド電極である、微生物培養装置。
8. 前記培養液中の前記酸化還元物質の含有量が０．００１ｍｍｏｌ／Ｌ以下である、請求項７に記載の微生物培養装置。
9. 請求項７又は８に記載の微生物培養装置を有する二酸化炭素還元装置。