JP7320808B2 - 皮膚外用剤 - Google Patents
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Description
AA2G
Ge-(CH2-CH2-COOH)2O3
或いは式
[(Ge-CH2-CH2-COOH)2O3]n
等で表される有機ゲルマニウム化合物となる。当該有機ゲルマニウム化合物は、重合度nを用いて表した場合は、重合度n=2~∞のオリゴマー乃至ポリマー(poly-trans-[(2-carboxyethyl)germasesquioxane])ということができるが、重合度nを用いずに表わした場合も同様である。
手法及び結果
酵素を用いたTHGP並びにVC及びVC誘導体単独でのメラニン産生抑制試験
THGPとVC及びVC誘導体が、チロシナーゼによってL-ドーパから誘導されるメラニンの産生を抑制することの確認をまず行った。5mM L-DOPA 40μlと、後述する各濃度のTHGP並びにVC及びVC誘導体(AA2G、 VC-エチル及びVC)20μlの組み合わせ、及び500 U/ml チロシナーゼ 40μl(計100μl)を96-well plateに分注してメラニン形成させ、阻害作用を評価した。37℃、20分間のインキュベート後、メラニンの吸収波長である405nmの吸光度を計測した。
THGP及びVC誘導体の添加により、チロシナーゼの酵素反応は抑制され、いずれもかなりの高濃度においてはメラニン産生が抑制されることが確認できた。特に、AA2GとTHGPは同時添加によって相乗的な抑制が認められた。
細胞におけるメラニン量の測定
B16 4A5メラノーマ細胞を24-well plateに5×104cells/wellで播種した。24時間後、50, 500, 5000μMの濃度のTHGPと、メラニン産生抑制20~30%前後の濃度のVC誘導体及びL-DOPA 100μMを添加し、細胞内におけるメラニン産生抑制効果について検討した。72時間継続培養した培養上清を100μl回収して、96-well plateに分注し、メラニンの吸収波長である405nmの吸光度を計測した。
細胞におけるTHGP併用によるメラニン産生抑制効果についての評価
AA2GとTHGPの組み合わせでのメラニン産生量を図1に、又、その組み合わせ効果の相乗性について図2に示し、VCエチルとTHGPの組み合わせでのメラニン産生量を図3に、又、その組み合わせ効果の相乗性について図4に示した。その結果、図1及び図2に示すように、AA2G 500μMもしくは1000μMとTHGP 500μMを併用したときに相乗効果を示した(図1)。その中でも、AA2G 1000μMとTHGP 500μMを併用した時に7.9倍と強い相乗効果を示した(図2)。又、VC-エチルと併用した場合では、VC-エチル 5000μMとTHGP 500μMを併用した時のみ約1.3倍の相乗的な抑制効果を示した(図3及び4)。尚、THGPを5000μM使用した実験系では、THGP単独でも抑制効果が十分にみられるので、本実験系には不適と考え、図2及び図4では表記を省略した。
細胞試験においてAA2GとVC-エチルがTHGPとの相乗効果を示した。その中でも特に、AA2G 1000μMとTHGP 500μMを併用した時においてもっとも高い相乗効果を示した(図2)。THGP 500μMは、公知の有機ゲルマニウム化合物であるGe-(CH2-CH2-COOH)2O3に換算するとおよそ0.0085%であり、AA2G 1000μMは0.034%である。ex vivoの試験においてAA2Gの浸透率は10%ほどと報告されていて、THGPの皮膚への浸透率については解析されていないが、仮に約1%浸透すると仮定したとき、浸透した部位での作用濃度を前述のとおりとなる想定で設定すると、今回の実験結果からは、THGPの濃度が約1%、AA2Gの濃度が1%という程度の組み合わせが最も効果の高い濃度と考えられる。
本試験において、実験はすべてモル濃度をベースにして実験を行った。重量%による濃度表記も必要と考えられるので、はじめに実験に用いたモル濃度の重量%での濃度換算表を以下に付記する。
細胞培養
NHEM-HP(AD) (クラボウ)は、専用培地 (DermaLife Basal Medium + DermaLife Ma Life Factors Kit) (クラボウ)を用いて培養した。細胞の継代は、Dethatch kit (クラボウ)を用いて行った。実験には、継代数3から7回のものを使用した。
メラニン量の測定
NHEMを48-well plateに1.5×104 cells/well播種した。培養24時間後、メラニン産生の基質となるL-DOPA 100μMをすべてのウェルに添加し、THGP、AA2GもしくはVCを各々単独で添加処理した。又、併用試験では、L-DOPA 100μMをすべてのウェルに添加し、THGPとAA2Gの併用もしくはTHGPとVCを併用にて添加処理した。添加培養72時間後、培養上清100μlを96-well plateに回収し、プレートリーダーを用いて、培養上清中に含まれるメラニン量を測定した。細胞内に含まれるメラニン量は、1M NaOH 200μlを細胞に加えて60℃、 20分間加熱し、メラニンを溶解後、100μlを96-well plateに移し、プレートリーダーを用いて細胞内に含まれるメラニン量を吸光度405nmで測定した。未処理群を100%としてメラニン量の割合変化を算出した。
THGP、AA2Gの単独処理時におけるメラニン産生抑制効果の検討
NHEMにTHGPもしくはAA2Gを最終濃度0-5000μMとなるように添加し、更にL-DOPA 100μMを添加処理し、72時間培養した場合の細胞外に含まれるメラニン量を測定した。THGPは200μM以上の濃度において、有意な細胞外メラニン量の抑制効果を認め、特に1000及び5000μMではほぼ完全(5%未満)にメラニン量が抑制された(図5a)。AA2Gは40μM以上の濃度で有意な細胞外メラニン量の抑制効果を認めた(図5b)。
NHEMにTHGPとAA2Gを併用した時の細胞外と細胞内に含まれるメラニン量を測定した。THGPとAA2Gを組み合わせることでTHGP 1000μMとAA2G 1000μM或いは5000μMの併用では高い相乗効果を認めた(図6a、図6b)。
THGP、AA2G共に、正常ヒトメラノサイトにおいてもB16 4A5 メラノーマ細胞と同様にメラニン産生抑制効果を示した。THGPは濃度依存的に200μM以上で培地中に含まれる場合に(すなわち細胞外の)メラニン量を抑制し、特に1000μM、5000μMで高い抑制効果を示した。尚、細胞内のメラニン量では、細胞外の量程ではないが、高濃度の領域では同様のメラニン量の抑制が認められた(図5)。
Claims (3)
- ビタミンC誘導体であるAA2Gと、3-トリヒドロキシゲルミルプロパン酸とを、AA2Gが500μMから30mM、3-トリヒドロキシゲルミルプロパン酸が500μMから5mMの任意の混合比で有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
- AA2G:3-トリヒドロキシゲルミルプロパン酸のモル比が1:1~6:1である請求項1に記載の皮膚外用剤。
- ビタミンC誘導体であるAA2Gと、3-トリヒドロキシゲルミルプロパン酸とを、AA2G:3-トリヒドロキシゲルミルプロパン酸のモル比で1:1~6:1の割合で有効成分として含有することを特徴とする皮膚外用剤。
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