JP7317923B2 - 非造血器悪性腫瘍の治療及び予後判定の方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互引用）本出願は、仮出願62/089,148（2014年12月8日出願）（前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の利益を主張する。
（政府の権利に関する記述）本発明は、国立衛生研究所によるグラント番号P30CA008748の下で政府の補助を受けて達成された。当該政府は本発明に一定の権利を有する。
（電子提出配列表の引用）本出願は、テキストファイルとして本出願とともに提出された配列表を参照によって含む。前記ファイルは、“13542-005-228_Sequence_Listing_ST25.txt”と題され、2015年12月1日作成、199キロバイトのサイズを有する。
（1．技術分野）患者で非造血器悪性腫瘍を治療する方法及び患者で非造血器悪性腫瘍の予後を判定する方法が本明細書で提供される。

2．背景
過去10年間で、候補遺伝子、エクソーム、及びゲノムの配列決定研究によって、ヒト悪性疾患における一連の体細胞変異の輪郭が明らかにされた（Cancer Genome Atlas Network, 2012, Nature, 490:61-70；Ellis, M.J. et al., 2012, Nature, 486:353-360）。これらの研究には、乳癌の大規模配列決定研究が含まれ、前記は、悪性形質転換及び治療応答に寄与する遺伝子及び経路において頻発する変異を同定した。癌細胞はそれらの微小環境と相互作用する。これら微小環境には、間質細胞組成、浸潤白血球、並びに局所及び遠位部位を起源とする循環性炎症サイトカインが含まれる（Acharyya, S., et al., 2012, Cell, 150, 165-178；Karnoub, A.E. et al., 2007, Nature, 449:557-563）。以前の研究で、乳癌で見出される間質細胞は、特異的変異及び部位特異的な後成的変化を特徴とすることが示された（Kurose, K., et al., 2002, Nat Genet, 32:355-357；Hu, M., et al., 2005, Nat Genet, 37:899-905）。組織特異的間質細胞に加えて、循環白血球及び腫瘍浸潤白血球が原発腫瘍の増殖及び転移を媒介できる（Granot, Z., et al., 2011, Cance Cell, 20:300-314；Grivennikov, S.I., et al., 2010, Cell, 140:883-899）。最近の証拠は、腫瘍随伴間質細胞及び浸潤白血球は、循環性又は骨髄定住性造血細胞とは異なる働きをすると示唆している（Acharyya, S., et al., 2012, Cell, 150, 165-178；Orimo, A., and Weinberg, R.A., 2006, Cell Cycle, 5:1597-1601；Li, H.J., et al., 2012, Cancer Discov, 2:840-855）。特に、いくつかの研究は、乳癌に浸潤するリンパ系及び骨髄系細胞の内容は臨床的結末と相関性を有することを示した（Mahmoud, S.M., et al., 2011, J Clin Oncol, 29:1949-1955；Mohammed, Z.M., et al., 2013, Br J Cancer, 109:1676-1684；Loi, S., et al., 2013, J Clin Oncol, 31:860-867）。
幾人かの年齢の進んだ個体は、TET2で頻発する体細胞変異を特徴とする臨床的には明らかではないクローン性造血を有することが最近示された（Busque, L., et al., 2012, Nat Genet, 44:1179-1181）。造血区画内のTet2低下は造血細胞の自己再生及び骨髄系偏向の増加をもたらす（Moran-Crusio, K., et al., 2011, Cancer Cell, 20:11-24；Quivoron, C., et al,2011, Cancer Cell, 20:25-38；Ko, M., et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:14566-14571）。
本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本開示に対する先行技術であることを容認するものであると解されてはならない。

3．発明の要旨
本発明は非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法を提供し、前記方法は、非造血細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する薬剤（以下では“第一の薬剤”）の治療的に有効な量を当該患者に投与する工程を含む。
具体的な実施態様では、第一の薬剤はイマチニブ、ダウノルビシン、シタラビン、デシタビン、アザシチジン、エトポシド、メルカプトプリン、プレドニゾン、イデラリシブ、イブルチニブ、又はABT-199である。
1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のTET2に存在するある具体的な実施態様では、第一の薬剤はデシタビンである。1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のTET2に存在する別の具体的な実施態様では、第一の薬剤はアザシチジンである。1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のIDH2に存在する別の具体的な実施態様では、第一の薬剤はデシタビンである。1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のIDH2に存在する別の具体的な実施態様では、第一の薬剤はアザシチジンである。
多様な実施態様では、第一の薬剤は白血球特異的ｇを含む。ある具体的な実施態様では、白血球特異的抗体は抗CD45抗体である。ある具体的な実施態様では、白血球特異的抗体は抗CD33抗体である。ある具体的な実施態様では、白血球特異的抗体は抗CD20抗体である。そのような実施態様のある具体的な特徴では、抗CD20抗体はリツキシマブである。
ある種の実施態様では、白血球特異的抗体は細胞傷害性薬剤と複合物化される。ある具体的な実施態様では、第一の薬剤は、カリケアミシンと複合物化された抗CD33抗体である。そのような実施態様のある具体的な特徴では、カリケアミシンと複合物化される抗CD33抗体はゲムツズマブオゾガマイシンである。

多様な実施態様では、上記に記載の非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法はさらに、第一の薬剤とは異なる別の薬剤（以下では“第二の薬剤”）を当該患者に投与して当該非造血器悪性腫瘍を治療する工程を含む。具体的な特徴では、第二の薬剤はトラスツズマブ、ラパチニブ、フルオトウラシル、パクリタキセル、又は白金アナローグである。いくつかの実施態様では、第二の薬剤はHER2の阻害剤である。そのような実施態様のある具体的な特徴では、HER2の阻害剤は抗HER2抗体（例えばトラスツズマブ）である。そのような実施態様の別の具体的な特徴では、HER2の阻害剤はラパチニブである。
具体的な実施態様では、第二の薬剤は広域癌治療である。具体的な特徴では、広域癌治療は化学療法剤である。化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、抗体-薬剤複合化物、又は前記の組み合わせであり得るが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、化学療法剤はアルキル化剤である。いくつかの実施態様では、化学療法剤は抗微小管剤（例えばタキサン）である。いくつかの実施態様では、化学療法剤は細胞傷害性抗生物質（例えばアントラサイクリン）である。

多様な実施態様では、上記に記載の非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法は、さらに放射線療法で患者を治療する工程を含む。ある具体的な実施態様では、放射線療法は局所放射線療法である。ある具体的な実施態様では、放射線療法は関与領域放射線療法である。
上記に記載の非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法はさらに、非造血器悪性腫瘍を外科的に切除することによって患者を治療する工程を含む。
患者が、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球に存在する1つ以上の体細胞遺伝子変異を有する多様な実施態様では、上記に記載の非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法はさらに、1つ以上の体細胞遺伝子変異が当該腫瘍浸潤白血球に存在することを当該投与工程の前に決定する工程を含む。
ある種の実施態様では、決定工程は、腫瘍浸潤白血球のDNA配列を非癌性細胞のDNA配列と比較する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在を指摘する報告を作成する工程を含む。そのような実施態様のある具体的な特徴では、当該報告はさらに腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在に基づいて患者の予後を指摘する。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在を伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、（i）腫瘍浸潤白血球の1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在、及び（ii）第一の薬剤が当該患者のために選択された又は指示された治療法であることを伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、非造血器悪性腫瘍の組織から腫瘍浸潤白血球を入手する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球からDNAを抽出する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球のDNAを配列決定する工程を含む。

本発明はまた、患者で非造血器悪性腫瘍の予後を判定する方法を提供し、前記方法は、当該非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程を含み、ここで、腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有する場合、当該患者は腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異をもたない場合よりも予後が悪いと指摘される。
いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の予後判定の方法はさらに患者をある治療法で治療する工程を含み、ここで、当該腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有すると決定された場合、当該治療法は腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異をもたない場合よりも攻撃的な治療法である。

ある種の実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程は、腫瘍浸潤白血球のDNA配列を非癌性細胞のDNA配列と比較する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無を指摘する報告を作成する工程を含む。そのような実施態様のある具体的な特徴では、当該報告はさらに腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無に基づいて患者の予後を指摘する。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球の1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無を伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、（i）腫瘍浸潤白血球の1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無、及び（ii）腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無に基づく患者の予後を伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、非造血器悪性腫瘍の組織から腫瘍浸潤白血球を入手する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球からDNAを抽出する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球のDNAを配列決定する工程を含む。

本明細書に記載の方法のいずれかの腫瘍浸潤白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、及び/又はリンパ球であり得るが、ただしこれらに限定されない。
本明細書に記載の方法の多様な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は以下から成る群から選択される1つ以上の遺伝子に存在する：KDM5C、CDK8、MPL、ARID1A、FLT3、FGFR1、JAK1、GLI1、EZH2、EP300、BCOR、NF1、SMARCB1、EPHA10、IRF4、INSR、EPHA2、SMO、DUSP27、NOTCH2、HNF1A、MYO18A、MET、RPTOR、ATP10A、PTCH1、BRCA1、NCOR2、PASD1、NEB、MUC4、POU2F2、HLA-A、ALK、TET2、HLA-B、FGFR4、GATA2、FLT1、ATM、ITK、FREM2、INPP4B、CSF1R、PIGN、SOX17、MLL4、TTC28、TNFSF9、TRRAP、DNMT3A、TP53、IDH2、EPHA7、WT1、PNRC1、EGFR、ETV6、SMARCA4、MLL2、MAP3K1、ALOX12B、ARID2、EPHA8、ERBB2、EPHA4、PBRM1、BCL6、HDAC2、EPHA7、MLL、CYLD、CEBPA、JAK3、ASXL1、KIT、MEF2B及びERG。具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は、BCOR、NOTCH2、TET2、NF1、EZH2、JAK1、DNMT3A、及びTP53から成る群から選択される1つ以上の遺伝子に存在する。ある具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はTET2に存在する。ある具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はIDH2に存在する。
具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はコード領域に存在する。そのような実施態様のある具体的な特徴では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はアミノ酸置換を生じる。そのような実施態様の別の特徴では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は未成熟終止コドンを生じる。
本明細書に記載の方法の具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は上皮腫瘍である。上皮腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、胃の腫瘍、膵腫瘍、喉頭腫瘍、食道腫瘍、精巣腫瘍、肝腫瘍、耳下腺腫瘍、胆管腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、子宮頸腫瘍、子宮腫瘍、子宮内膜腫瘍、腎腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、又は甲状腺腫瘍であり得るが、ただしこれらに限定されない。ある具体的な実施態様では、上皮腫瘍は乳房腫瘍である。本明細書に記載の非造血器悪性腫瘍の治療方法の具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は上皮腫瘍であり、第一の薬剤は、上皮細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する。
本明細書に記載の方法の好ましい実施態様では、患者は人間の患者である。
4．図面の簡単な説明

遺伝子分析の要旨。図表は、全エクソームシーケンシング（a）及び捕捉に基づくシーケンシング（b）によって同定された変種をフィルター分離するために用いた工程を概略する。*は、癌の体細胞遺伝子変異カタログ（Catalogue of Somatic Gene Mutations in Cancer（COSMIC））で以前に報告された、同じアミノ酸の異なる置換を含むコドン変異変種を示す。 21の原発性乳癌のシーケンシング分析は、腫瘍浸潤白血球で体細胞の後天的変異を同定した。（a）CD45陽性造血細胞（患者#20）の蛍光活性化細胞仕分けのためのゲーティングの模式図。生死細胞染色としてDAPIが加えられた。2細胞凝集物はPE-Cy7でのゲーティング前に除外された（示されていない）。CD45陽性分画から抽出したDNAは、3つの独立したシーケンシングプラットフォームを用いて分析した。 （b）後天的変異の存在を示す代表的IGV画像。参照ヌクレオチドと一致しない読みが置換核酸塩基で示されている。上部の灰色の棒線図は読み深度を示す。参照ヌクレオチド及びタンパク質配列が各変異について示されている。変種対立遺伝子頻度（VAF）並びに変異数及び総数の読みが示されている（変異数｜総数、VAF）。

5．詳細な説明
本発明は、患者で非造血器悪性腫瘍を治療する方法及び患者で非造血器悪性腫瘍の予後を判定する方法を提供する。本発明者らは、いくつかの非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球は体細胞の後天的変異を有することを見出した。本発明にしたがえば、腫瘍浸潤白血球は非造血器悪性腫瘍の治療標的であり、腫瘍浸潤白血球における体細胞変異の存在は、非造血器悪性腫瘍の予後の判定因子である。
5.1．非造血器悪性腫瘍を治療する方法
本明細書では患者で非造血器悪性腫瘍を治療する方法が提供され、前記方法は、非造血細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する薬剤（以下では“第一の薬剤”）の治療的に有効な量を当該患者に投与する工程を含む。
具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は、癌腫、肉腫、生殖細胞腫瘍、芽細胞腫、又は脳腫瘍である。具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は上皮腫瘍であり、第一の薬剤は、上皮細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する。上皮腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、胃の腫瘍、膵腫瘍、喉頭腫瘍、食道腫瘍、精巣腫瘍、肝腫瘍、耳下腺腫瘍、胆管腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、子宮頸腫瘍、子宮腫瘍、子宮内膜腫瘍、腎腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、又は甲状腺腫瘍であり得るが、ただしこれらに限定されない。具体的な実施態様では、上皮腫瘍は乳房腫瘍である。具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は特定の組織又は器官タイプの悪性腫瘍であり、第一の薬剤は、そのような組織又は器官の細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する。

5.1.1．第一の薬剤による治療
第一の薬剤は、非造血細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する任意の医薬的に許容できる薬剤である。多様な実施態様では、第一の薬剤は、白血病を治療すると知られているか又は示されている薬剤である。具体的な実施態様では、第一の薬剤はイマチニブ、ダウノルビシン、シタラビン、デシタビン、アザシチジン、エトポシド、メルカプトプリン、プレドニゾン、イデラリシブ、イブルチニブ、又はABT-199である。
第一の薬剤は当業界で公知の任意のものであるか、又は公知の方法によって同定することができる。特に、非造血細胞と比較して白血球の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害するか否かは、当業界で公知の方法によって決定できる。ほんの一例として、白血球及び非造血細胞をそれぞれ同じ量の第一の薬剤候補とともに同じ又は同様な条件下でインキュベートし、細胞死のパーセンテージを検出することによって、ある薬剤が第一の薬剤であるか否かの決定を実施できる。細胞死のパーセンテージは、例えば、細胞の生存率を決定するために通例的に用いられる染料の使用によって決定できる。
非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球で1つ以上の体細胞遺伝子変異がTET2に存在するある具体的な実施態様では、第一の薬剤はデシタビンである。1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のTET2に存在する別の具体的な実施態様では、第一の薬剤はアザシチジンである。1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のIDH2に存在する別の具体的な実施態様では、第一の薬剤はデシタビンである。1つ以上の体細胞変異が非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球のIDH2に存在する別の具体的な実施態様では、第一の薬剤はアザシチジンである。
多様な実施態様では、第一の薬剤は白血球特異的抗体を含む。ある具体的な実施態様では、白血球特異的抗体は抗CD45抗体である。ある具体的な実施態様では、白血球特異的抗体は抗CD33抗体である。ある具体的な実施態様では、白血球特異的抗体は抗CD20抗体である。そのような実施態様のある具体的な特徴では、抗CD20抗体はリツキシマブである。
ある種の実施態様では、白血球特異的抗体は細胞傷害性薬剤と複合物化される。ある具体的な実施態様では、第一の薬剤は、カリケアミシンと複合物化された抗CD33抗体である。そのような実施態様のある具体的な特徴では、カリケアミシンと複合物化される抗CD33抗体はゲムツズマブオゾガマイシンである。

5.1.2．腫瘍浸潤白血球で体細胞変異を保有する非造血器悪性腫瘍
多様な実施態様では、患者は、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球に存在する1つ以上の体細胞遺伝子変異を有する。ある具体的な実施態様では、腫瘍浸潤白血球は、非造血器悪性腫瘍のサンプル（例えば生検又は外科的切除によって得られる）から単離されるCD45+細胞である。腫瘍浸潤白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、及び/又はリンパ球であり得るが、ただしこれらに限定されない。
具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は以下から成る群から選択される1つ以上の遺伝子に存在する：KDM5C、CDK8、MPL、ARID1A、FLT3、FGFR1、JAK1、GLI1、EZH2、EP300、BCOR、NF1、SMARCB1、EPHA10、IRF4、INSR、EPHA2、SMO、DUSP27、NOTCH2、HNF1A、MYO18A、MET、RPTOR、ATP10A、PTCH1、BRCA1、NCOR2、PASD1、NEB、MUC4、POU2F2、HLA-A、ALK、TET2、HLA-B、FGFR4、GATA2、FLT1、ATM、ITK、FREM2、INPP4B、CSF1R、PIGN、SOX17、MLL4、TTC28、TNFSF9、TRRAP、DNMT3A、TP53、IDH2、EPHA7、WT1、PNRC1、EGFR、ETV6、SMARCA4、MLL2、MAP3K1、ALOX12B、ARID2、EPHA8、ERBB2、EPHA4、PBRM1、BCL6、HDAC2、EPHA7、MLL、CYLD、CEBPA、JAK3、ASXL1、KIT、MEF2B及びERG。具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は、BCOR、NOTCH2、TET2、NF1、EZH2、JAK1、DNMT3A、及びTP53から成る群から選択される1つ以上の遺伝子に存在する。ある具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はTET2に存在する。ある具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はヒトTET2に存在し、ここで患者は人間の患者である。ある具体的な実施態様では、ヒトTET2は配列番号:1の野生型配列を有する。ある具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はIDH2に存在する。ある特定の実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はヒトIDH2に存在し、ここで患者は人間の患者である。ある具体的な実施態様では、ヒトIDH2は配列番号:2の野生型配列を有する。
具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はコード領域に存在する。そのような実施態様のある具体的な特徴では、1つ以上の体細胞遺伝子変異はアミノ酸置換を生じる。そのような実施態様の別の特徴では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は未成熟終止コドンを生じる。例示として、具体的な実施態様では、1つ以上の体細胞遺伝子変異は、表4、表5又は表6のいずれかに示すアミノ酸置換又は未成熟終止コドンを生じる。

5.1.3．併用療法
多様な実施態様では、上記に記載する非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法はさらに、第一の薬剤とは異なる別の薬剤（以下では“第二の薬剤”）を当該患者に投与して当該非造血器悪性腫瘍を治療する工程を含む。ある種の実施態様では、第二の薬剤は、当該非造血器悪性腫瘍を治療することが公知であるか、又は当該非造血器悪性腫瘍を治療するために指示される。ある具体的な実施態様では、第二の薬剤は、白血球と比較して、非造血細胞（例えば当該非造血器悪性腫瘍と同じ組織の非造血細胞）の増殖又は活性を優先的に抑え又は阻害する。別の具体的な実施態様では、第二の薬剤は、前記が当該非造血器悪性腫瘍と同じ組織の細胞の増殖又は活性を抑え又は阻害する効力とほぼ同じ効力で白血球の増殖又は活性を抑え又は阻害する。具体的な実施態様では、第二の薬剤はトラスツズマブ、ラパチニブ、フルオトウラシル、パクリタキセル、又は白金アナローグである。いくつかの実施態様では、第二の薬剤はHER2の阻害剤である。そのような実施態様のある具体的な特徴では、HER2の阻害剤は抗HER2抗体（例えばトラスツズマブ）である。そのような実施態様の別の具体的な特徴では、HER2の阻害剤はラパチニブである。
具体的な実施態様では、第二の薬剤は広域癌治療である。具体的な特徴では、広域癌治療は化学療法剤である。化学療法剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞傷害性抗生物質、抗体-薬剤複合化物、又は前記の組み合わせであり得るが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、化学療法剤はアルキル化剤である。いくつかの実施態様では、化学療法剤は抗微小管剤（例えばタキサン）である。いくつかの実施態様では、化学療法剤は細胞傷害性抗生物質（例えばアントラサイクリン）である。
多様な実施態様では、上記に記載の非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法は、さらに放射線療法で患者を治療する工程を含む。ある具体的な実施態様では、放射線療法は局所放射線療法である。ある具体的な実施態様では、放射線療法は関与領域放射線療法である。
多様な実施態様では、上記に記載の非造血器悪性腫瘍を患者で治療する方法はさらに、非造血器悪性腫瘍を外科的に切除することによって患者を治療する工程を含む。

5.1.4．投与ルート及び投薬量
上記に記載の薬剤（例えば第一の薬剤及び第二の薬剤）は多様なルートで患者に投与できる。これらには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：非経口、鼻内、気管内、経口、皮内、局所、筋肉内、腹腔内、経皮、静脈内、腫瘍内、結膜及び皮下ルート。肺投与もまた、例えば吸入器又はネブライザー及びスプレーとして使用されるエアロゾル化剤による処方を用いることによって利用することができる。
さらにまた、本明細書に記載の薬剤又はその医薬組成物は、標的誘導薬剤デリバリー系で、例えば白血球に特異的な抗体で被覆されたリポソームで投与され得る。リポソームは白血球に標的誘導され、白血球によって選択的に取り込まれるであろう。
非造血器悪性腫瘍の治療に有効な、本明細書に記載の薬剤又はその医薬組成物の量は疾患の性質及び患者の状態に左右され、標準的な臨床技術及び医師の知識によって決定できる。
ある組成物で用いられる正確な用量及びレジメンもまた投与ルート及び腫瘍の重篤度に左右され、医師及び患者の周囲状況を判定して決定されるべきである。

5.1.5．腫瘍浸潤白血球の体細胞変異を検出する方法
患者が非造血器悪性腫瘍の浸潤白血球に存在する1つ以上の体細胞遺伝子変異を有する多様な実施態様では、上記に記載の非造血器悪性腫瘍を治療する方法はさらに、投与工程の前に、1つ以上の体細胞遺伝子変異が腫瘍浸潤白血球に存在することを決定する工程を含む。
具体的な実施態様では、腫瘍浸潤白血球は、非造血器悪性腫瘍のサンプル（例えば生検又は外科的切除によって得られる）から単離されるCD45+細胞である。腫瘍浸潤白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ及び/又はリンパ球である。1つ以上の体細胞遺伝子変異は上記セクション5.1.2に記載した位置に存在し得る。
ある種の実施態様では、決定工程は、腫瘍浸潤白血球のDNA配列を非癌性細胞のDNA配列と比較する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在を指摘する報告を作成する工程を含む。そのような実施態様のある具体的な特徴では、報告はさらに腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在に基づいて患者の予後を指摘する。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在を伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、（i）腫瘍浸潤白血球の1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在、及び（ii）第一の薬剤が当該患者のために選択された又は指示された治療法であることを伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、非造血器悪性腫瘍の組織から腫瘍浸潤白血球を入手する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球からDNAを抽出する工程を含む。いくつかの実施態様では、決定工程はさらに、腫瘍浸潤白血球のDNAを配列決定する工程を含む。

非造血器悪性腫瘍の組織は、当業界で公知の任意の方法（例えば生検又は外科的切除）によって入手できる。
非造血器悪性腫瘍の組織から腫瘍浸潤白血球を入手する工程は、当業界で公知の任意の方法、例えば非造血器悪性腫瘍のサンプルからCD45+細胞を単離する蛍光活性化細胞仕分け（FACS）（実施例セクション6.1.2．に記載）によって実施できる。
腫瘍浸潤白血球からDNAを抽出する工程は当業界で公知の任意の方法によって実施できる。DNA抽出の非限定的な例には以下が含まれる：塩抽出方法、有機的抽出方法、塩化セシウム密度勾配法、陰イオン交換法、及びシリカゲルによる方法（Green, M.R. and Sambrook, J., 2012, Molecular Cloning (4th ed.), Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press；Carpi, F.M. et. Al., 2011, Recent Pat DNA Gene Seq, 5:1-7；Tan, S.C. and Yiap, B.C., 2009, J Biomed Biotechnol, Article ID 574398）。
腫瘍浸潤白血球のDNAの配列決定は、当業界で公知の任意の配列決定技術によって実施できる。DNA配列決定のための非限定例示方法には以下が含まれる：SOLiDシーケンシング（Shendure, J., et al., 2005, Science, 309:1728-1732；McKernan, K.J. et al., 2009, Genome Res, 19:1527-1541；Berglund, E.C., et al., 2011, Investig Genet, 2:23（当該技術の完全な説明にはApplied Biosystemsのウェブサイトもまた参照されたい））、454シーケンシング（King, C. and Scott-Horton, T., 2008, J Vis Exp, (11):630；Wheeler, D.A., et al., 2008, Nature, 452:872-876；Berglund, E.C., et al., 2011, Investig Genet, 2:23（当該技術の完全な説明には454.comのウェブサイトもまた参照されたい））、イルミナ（Solexa）シーケンシング（Bentley, D.R., et al., 2008, Nature, 456:53-59；Balasubramanian, S., 2011, Chem Commun, 47:7281-7286；Berglund, E.C., et al., 2011, Investig Genet, 2:23（当該技術の完全な説明にはIlluminaのウェブサイトもまた参照されたい））、Ion Torrent半導体シーケンシング（Rusk, N., 2011, Nat Meth, 8:44-44）、DNAナノボールシーケンシング（Porreca, G.J., 2010, Nat Biothechnol, 28:43-44）、ヘリスコープ単一分子シーケンシング（Thompson, J.F. and Steinmann, K.E., 2010, Curr Protoc Mol Biol, Chapter7: Unit7）、及び単一分子リアルタイム（SMRT）シーケンシング（Eid, J. et al., 2009, Science, 323:133-138）。例示すれば、いくつかの実施態様では、腫瘍浸潤白血球のDNAを配列決定する工程は、実施例セクション6.1.5に示すように、全エクソームシーケンシング、標的捕捉シーケンシング、又は前記の組み合わせによって実施できる。ある具体的な実施態様では、決定工程はさらに、当該患者由来の非癌性サンプル（例えば頬スワブサンプル）（適合する生殖細胞DNA配列コントロールを提供する）のDNAを配列決定して腫瘍浸潤白血球の体細胞遺伝子変異を同定する工程を含む。
報告を作成する工程は、手動で実施するか、又はコンピュータシステム若しくはコンピュータ読み出し可能媒体を用いてコンピュータで実行できる。具体的な実施態様では、報告はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の存在に基づく当該患者の予後を指摘する。具体的な実施態様では、報告はさらに、患者の腫瘍浸潤白血球における体細胞変異遺伝子の名称を指摘する。さらに別の具体的な実施態様では、報告はさらに、患者の腫瘍浸潤白血球における体細胞変異遺伝子の変異を指摘する。

5.2．非造血器悪性腫瘍の予後判定方法
患者で非造血器悪性腫瘍の予後を判定する方法もまた本明細書で提供される。前記方法は、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程を含み、ここで、腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有する場合、当該患者は、腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異をもたない場合よりも予後が悪いと指摘される。
具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は、癌腫、肉腫、生殖細胞腫瘍、芽細胞腫、又は脳腫瘍である。具体的な実施態様では、非造血器悪性腫瘍は上皮腫瘍である。上皮腫瘍は、乳房腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、胃の腫瘍、膵腫瘍、喉頭腫瘍、食道腫瘍、精巣腫瘍、肝腫瘍、耳下腺腫瘍、胆管腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、子宮頸腫瘍、子宮腫瘍、子宮内膜腫瘍、腎腫瘍、膀胱腫瘍、前立腺腫瘍、又は甲状腺腫瘍であり得るが、ただしこれらに限定されない。具体的な実施態様では、上皮腫瘍は乳房腫瘍である。
具体的な実施態様では、腫瘍浸潤白血球は、非造血器悪性腫瘍のサンプル（例えば生検又は外科的切除によって得られる）から単離されるCD45+細胞である。腫瘍浸潤白血球は、好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、及び/又はリンパ球であり得るが、ただしこれらに限定されない。1つ以上の体細胞遺伝子変異は、上記のセクション5.1.1に記載した位置に存在し得る。
いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の予後を判定する方法はさらに患者をある治療法で治療する工程を含み、ここで、腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有すると決定された場合、当該治療法は、腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異をもたない場合よりも攻撃的な治療法（例えばより顕著な薬剤有効性又はより顕著な投与頻度）である。治療法は、本明細書に記載の非造血器悪性腫瘍を治療する任意の方法であり得る。

ある種の実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程は、腫瘍浸潤白血球のDNA配列を非癌性細胞のDNA配列と比較する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無を指摘する報告を作成する工程を含む。そのような実施態様のある具体的な特徴では、当該報告はさらに腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無に基づいて患者の予後を指摘する。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球の1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無を伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、（i）腫瘍浸潤白血球の1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無、及び（ii）腫瘍浸潤白血球における1つ以上の体細胞遺伝子変異の有無に基づく患者の予後を伝達する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、非造血器悪性腫瘍の組織から腫瘍浸潤白血球を入手する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球からDNAを抽出する工程を含む。いくつかの実施態様では、非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球が1つ以上の体細胞遺伝子変異を有するか否かを決定する工程はさらに、腫瘍浸潤白血球のDNAを配列決定する工程を含む。
非造血器悪性腫瘍の組織はセクション5.1.5に記載の方法を用いて入手できる。
非造血器悪性腫瘍の組織の腫瘍浸潤白血球の入手、腫瘍浸潤白血球のDNA抽出、腫瘍浸潤白血球のDNAの配列決定、及び報告の作成はセクション5.1.5に記載の方法を用いて実施できる。

5.3．患者
本開示で言う患者は、人間の患者又は人間以外の脊椎動物（例えば野生動物、家畜動物又は農場飼育動物）であり得るが、ただしこれらに限定されない。ある種の実施態様では、患者は哺乳動物（例えば人間、乳牛、イヌ、ネコ、ヤギ、ウマ、ヒツジ又はブタ）である。好ましい実施態様では、患者は人間の患者である。
多様な実施態様では、患者は、上記セクション5.1.2に記載の非造血器悪性腫瘍の腫瘍浸潤白血球に存在する1つ以上の体細胞遺伝子変異を有する。
具体的な実施態様では、患者は70歳以下である。具体的な実施態様では、患者は60歳以下である。具体的な実施態様では、患者は55歳以下である。具体的な実施態様では、患者は50歳以下である。

6．実施例
以下の非限定的な例は、体細胞遺伝子変異（公知の癌遺伝子を含む）が白血球浸潤乳癌に存在することを示す。
6.1．方法：
6.1.1．患者材料
乳癌サンプルを原発性トリプルネガティブ乳癌（TNBC）の継続患者から収集した。前記患者はスローンケタリング記念癌センター（MSKCC）で2012年から2013年に手術を受けた（表1）。ネオアジュバント化学療法で処置された患者はこの試験から除外した。コア生検で顕著なリンパ球浸潤を示す非トリプルネガティブ乳癌もまた加えた。全ての標本で切片を作成し、日常的な病理学試験のために処理した。ヘマトキシリンエオシン（H&E）染色スライドを乳房病理医が審査して診断を確立させた。エストロゲン受容体（ER）、プロゲステロン受容体（PR）及びヒト上皮成長因子受容体2（HER2）の状態は免疫組織化学（IHC）によって判定した。HER2の蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）は、IHCの結果が不明瞭な1症例で実施した。腫瘍浸潤白血球の判定を以前に記載されたように実施した（Loi, S., et al., 2013, J Clin Oncol, 31:860-867）。腫瘍浸潤白血球を以下のように採点した：重度＝間質又は腫瘍内の50%以上のリンパ球浸潤；中度＝5－10%；最少＝5%以下。頬スワブサンプルを各患者から収集した。単核球及び顆粒球を標準的フィコールプロトコルにしたがって末梢血から単離した。各患者の臨床病理学的特色は表1に列挙されている。
表1：臨床病理学的特色の要旨

⁺星状細胞腫併発患者（WHO III）；⁺⁺同側性乳癌再発；^*全エクソームシーケンシングデータのみ利用可能；^#リンパ球浸潤レベルの採点基準は上記セクション6.1.1で規定；IDC、侵襲性乳管癌；NOS、別段の特徴なし；ILC、侵襲性小葉癌；HG、組織学的グレード；NG、核グレード；LVI、リンパ管侵襲；LN、リンパ節転移；ER、エストロゲン受容体；PR、プロゲステロン受容体；HER2、ヒト上皮増殖因子受容体2；FISH、蛍光in situハイブリダイゼーション；N/A、サンプル非採取；TIL、腫瘍浸潤リンパ球；y、年齢

6.1.2．腫瘍浸潤細胞の単離及び処理
この試験に含まれる全ての患者がインフォームドコンセントを提供した。新鮮な腫瘍細胞、間質細胞、及び腫瘍浸潤白血球を、原発性腫瘍の切断表面を外科用メスで5－10回削り取ることによって分離した。PBS中でメスをリンスすることによって細胞材料を収集した。細胞を遠心分離し、染色前に赤血球溶解緩衝液に再懸濁して赤血球を除去した。染色には、FACS緩衝液（2％BSA補充PBS）中の抗ヒトCD45-PE-Cy7又はCD45-APC-Cy7結合フロー抗体を用いた。細胞を室温にて暗所で20分染色し、FACS緩衝液で1回洗浄してフィルターに通した。生細胞と死細胞を区別するために仕分け前にDAPIを添加した。続いてFACSAriaIIIセルソーター（MSKCC Flow Core Facility）を用いてCD45陽性細胞を精製した。
6.1.3．腫瘍細胞のレーザーキャプチャー顕微解剖
当該腫瘍の連続する代表的な8μm厚さの核ファストレッド染色切片を、以前に記載されたようにPALMロボットMicroBeamレーザー顕微解剖システムでレーザーアシスト顕微解剖に付した（Westbury, C.B., et al., 2009, J Pathol, 219:131-140）。最初に、非新形成細胞（炎症性細胞、間質細胞及び正常乳房を含む）を切断した。続いて、組織学的に明確な新形成細胞のみを顕微鏡下で各サンプルから顕微解剖した。組織を直に抽出緩衝液に顕微解剖し、DNeasy血液組織キット（Qiagen, Valencia, CA）を用いてDNAを抽出し、Qubitフルオロメーター（Invitrogen, Life Technologies, Norwalk, CT）で定量した。
6.1.4．DNA抽出及び全ゲノム増幅
製造業者の指示にしたがいQiaAmp DNAキット（Qiagen）を用いてDNAを抽出した。製造業者の指示にしたがいQiaAmp DNAミニキット（Qiagen）を用いて頬スワブを処理した。DNAサンプルの品質はAgilentバイオアナライザー2100により分析した。DNAの量が不十分なサンプル（500ng未満）は、下流の適用でさらに使用する前にREPLI-gミニキット（Qiagen）を用いて全ゲノム増幅（WGA）を実施した。QPCRを実施して、WGA DNAの品質を査定した。
6.1.5．全エクソームシーケンシング及び標的捕捉シーケンシング
仕分けしたCD45陽性腫瘍浸潤白血球及び頬スワブから抽出したDNA（表2）を、全エクソームシーケンシングのために180bp+/-80bpの平均サイズにせん断した。DNAライブラリー調製のために、200－250bpフラグメントを選別してPCR増幅に付した。続いて、ライブラリーをAgilent SureSelectヒト全エクソンキットとハイブリダイズさせ、SOLiD 3プラス又はSOLiD4でシーケンシングを実施した。各患者の腫瘍浸潤白血球及び適合生殖細胞系列DNAの標的誘導シーケンシングを以前に記載されたように実施した（Welch, J.S., et al., 2012, Cell, 150:264-278）。
表2：平均標的カバレッジ情報

^*サンプルは表示のシーケンシングプラットフォームでシーケンシングされなかった。
⁺適合生殖細胞系列DNAサンプルのカバレッジが低かったので、#13の患者のCD45+サンプルはプールした頬スワブサンプルと比較した。

6.1.6．454ディープシーケンシング分析
単核球、顆粒球、レーザーキャプチャー顕微解剖腫瘍細胞、及び腫瘍浸潤白血球でシーケンス反応を実施した。全てのPCR反応はアンプリコン特異的融合プライマーを用いて実施された。融合プライマーは、鋳型特異的配列に並んで5’-プライム末端に方向性を有するプライマーを含み、バーコードサンプルの識別のための多重識別子がその後に続く。6－8人の異なる患者のサンプルを混合し、454ディープシーケンシングのために処理しゲノムシーケンサーFLX装置で用いた。BWA MEM（ver 0.7.4）を用い、データを完全なヒトゲノムにマッピングした。複数のマッピングの読み（MAPQ==0）を取り出し、続いてGATKツールキット（ver 3.1）を用い、塩基再調整のためにBAMファイルを処理した。2つの事象のみを見つけるハプロタイプコーラー（HaplotypeCaller）を用いて変異を呼び出した。加えて、当該読みの集積を各サンプルについて公知の変異部位の各々で計測し、参照及び変種対立遺伝子の両方の実際の深度を計算し、さらに各部位について非参照対立遺伝子頻度を計算した。
6.1.7．変種検出
BWA 0.6.2-r126（Iyer, G., et al., 2012, Science, 338:221）を用いて、ペアードエンドの読みをヒトhg19ゲノムに対してアラインメントした。GATK一式バージョン2.8-1を用いさらにその著者らの推奨にしたがい（McKenna, A., et al., 2010, Genome Res, 20:1297-1303）、インデル領域における局所再アラインメント及び塩基Q再調整を実施した。
MuTectバージョン1.1.4を用いて標的誘導腫瘍-正常サンプルペアの変種を呼び出した。MuTectフィルターを通過する変種を高信頼性（HC）と注釈した。アルゴリズムによって検出されたがMuTectフィルターを通過できなかった変種は低信頼性（LC）と注釈した。全エクソームシーケンシングサンプルのために、GATK一式バージョン2.8-1のハプロタイプコーラーを用いてSNP及びインデルを呼び出した。GATK推奨フィルターを通過しかつ同じパイプラインを介して分析した2つの頬サンプルのいずれでも報告されなかったか、或いは2つ以上の非体細胞データベース（dbSNP、NHLBIエクソームシーケンシングプロジェクト及び我々自身の正常組織の内部収集物由来の非臨床変種）で見出された変種はHCと注釈した。
他の変種はLCと報告した。
6.1.8．データ分析
遺伝子分析の要旨は図1に示されている。略記すれば、全エクソームシーケンシングサンプルのために、体細胞変種（セクション6.1.7参照）をHem-キャプチャー遺伝子パネル（表3）及びIMPACTパネル遺伝子リストに対してフィルター処理し、それぞれ血液学的悪性疾患及び上皮性悪性疾患で以前に報告された遺伝子を同定した。同定された変種で10%以上の頻度で生じるものを表4に示す。以前にCOSMIC（Catalogue of Somatic Mutations in Cancer）に記載された変種に無カットオフフィルターを適用した。3つのシーケンシングプラットフォームによって確認された変種を、対立遺伝子頻度に左右されない体細胞変異とみなした。対照的に、2つのプラットフォームによって検出された変種は、COSMICに以前に記載された変種を除き10%以上の対立遺伝子頻度で生じるときのみ体細胞変異とみなした（無カットオフ適用）（表5及び表6）。
表3：Hem-キャプチャーシーケンシングパネルの標的となった遺伝子

表4：エクソームシーケンシングによって同定された変種の発見

表5：公知癌遺伝子の体細胞変異

この表に列挙した変異は、対立遺伝子頻度が10%以上の2つ又は3つの独立したプラットフォームによって同定された。より低い頻度で生じる変異は、以前にCOSMICで報告された場合に加えられた。

表6：少なくとも2つのプラットフォームによって同定された体細胞変種

太字で強調された変種は以前にCOSMICに記載された。⁺は以前にCOSMICに報告されたが、同じアミノ酸の種々の置換を生じるコドン変異変種を示す。標的誘導なし；対応するシーケンシングプラットフォームは特定の遺伝子を標的としない。Ref：参照ヌクレオチド、alt：変異ヌクレオチド、chr：染色体。3つのシーケンシングプラットフォームのデータ（Hem-キャプチャーパネル（Hem）、IMPACT及び全エクソームシーケンシングデータ）が示されている。

6.2．結果：
浸潤白血球のエクソームシーケンシング
17の未処置原発性乳癌の新鮮なサンプルを入手し（表1）、蛍光活性化細胞仕分けを実施して、CD45陰性上皮細胞からCD45陽性白血球を分離した（図2a）。コア生検で顕著なリンパ球浸潤を示す非トリプルネガティブ乳癌もまたこの試験に加えた。ネオアジュバント化学療法を受けた患者は、変異負荷における化学療法の影響を排除するために試験されなかった。17人の患者のうち、13人がトリプルネガティブ乳癌を有し、2人がER陽性、HER2陽性症状を有し、2人がER陽性、HER2陰性症状を有していた（表1）。これらのCD45陽性腫瘍浸潤白血球のエクソームシーケンシングを実施して、変異の存在について精査した。5人の患者（1、3、5、8及び14）の頬スワブサンプルもまた全エクソームシーケンシングによって分析した。DNAの量が不十分なサンプルは、下流でさらに利用する前に全ゲノム増幅（WGA）を実施した。ハプロタイプコーラー（GATK一式バージョン2.8-1）を用いて、生殖細胞系列サンプルでは報告されなかった腫瘍浸潤白血球に存在する変異を同定した。GATKによって呼び出され、かつ頬サンプル（同じパイプラインを介して分析された）では存在せず、かつSNPデータベースで多形性と注釈されなかった（セクション6.1参照）変種候補を高信頼性変種と注釈した。このアプローチは公知の癌遺伝子（BCR、NOTCH2、TET2、NF1、EZH2及びJAK1を含む）で変異候補を同定した（図2b、表4）。重要なことに、これら遺伝子の変異は、血液学的悪性疾患の発症で以前に示唆された。データは、公知の癌遺伝子の変異が乳癌サブセットの浸潤白血球に存在することを提唱している。

標的誘導シーケンシングプラットフォームを用いる同定遺伝子の確認
エクソームシーケンシングは乳癌サブセットで公知の癌遺伝子の仮定的体細胞変種を同定したが、その限定的なカバレッジによって浸潤白血球の変異を同定する能力は制限されることがある。したがって、悪性形質転換で公知の役割を有する遺伝子をカバーするために、さらにエクソームシーケンシングで同定された仮定的変異を検証するために、20の腫瘍浸潤白血球及び適合生殖細胞系列（頬スワブ）DNAサンプルペア（表1）の捕捉に基づくシーケンシングを実施した。造血細胞悪性疾患で（表3及びセクション6.1）及び上皮細胞悪性疾患で（Iyer, G., et al., 2012, Science, 338:221）示唆される遺伝子を審問する2つの補足系プラットフォームを用いた。全エクソームシーケンシングによって同定された体細胞変種を2つの標的誘導シーケンシングパネルに対してさらにフィルター処理し、同じ変種がより高度のカバレッジシーケンシングを用いても同定されることを確認した。
3つのシーケンシングプラットフォームによって確認され及び/又は以前にCOSMICで記載され、かつ生殖細胞系列DNAでは同定されなかった全ての変種を、対立遺伝子頻度の影響を受けない体細胞性と採点した。さらにまた、2つのシーケンシングプラットフォームによって検出され対立遺伝子頻度が10%以上で、かつペアの生殖細胞系列DNAでは同定されなかった変種を体細胞変異と採点した。これらの規準にしたがい、我々は、20人の患者のうち9人（45%；表5及び表6）で体細胞変異を同定した。レーザーキャプチャー解剖による乳癌細胞のPCR及び高カバレッジ454シーケンシングを実施し、検出された特異的変異を分析した。2つのTP53変異が精製乳癌細胞に存在し（これらの変異は上皮悪性クローンを起源とすることが示唆される）、前記変異を削除した（表7）。対照的に、全ての他の変異は、白血球成分におけるそれらの起原と一致して乳癌細胞では同定されなかった。これらの変異には公知の白血病遺伝子（DNMT3A、TET2、BCOR、及びTP53）の体細胞変異が含まれ、前記変異は腫瘍浸潤白血球に存在した。特異的な変異サブセットを元々のDNA（TET2（患者4：TET2 p.Q1702^*）及びBCOR（患者12：BCOR p.P1613L）に変異を含む）を用いて検証した。この2つのTET2変異はおそらくナンセンス対立遺伝子（TET2p.Q1702*）として病原性であり、骨髄系悪性疾患では通常的に変異するTET2の高度に保存的な残基における変異（TET2p.E1874K）が同定された。転写共同リプレッサーBCORの変異（前記は骨髄性白血病で体細胞変異の標的である）が3人の患者で同定された。これらの変異の大半が読みの少なくとも5－20%に存在したことを特記することは重要である。このことは、これらの変異が濃縮サブクローンに存在し、正常なドナーで以前に報告されたような少数の造血幹細胞に存在する稀な対立遺伝子ではなかったことを示唆している。7つの変異事例の中央値が体細胞変異を有する9人の患者で同定された（表6）。腫瘍浸潤白血球の変異が全ての乳癌サブタイプで同定され、前記変異は、組織病理学的評価によって査定された白血球浸潤の程度に関係なく存在した（表1）。
表7：乳房腫瘍細胞のディープシーケンシング

VAF、変種対立遺伝子頻度；⁺腫瘍サンプル入手不可；^*配列決定せず；N/A、利用不可

循環白血球のシーケンシング分析
次にこれら患者由来の循環白血球のシーケンシングを実施した。末梢血液サンプルは、HIPAA-コンプライアンス及びIRB-承認に対応する態様で、体細胞変異がその腫瘍浸潤白血球で同定された10人の患者のうち8人から将来を見越して入手された。2つの変異（患者2：DNMT3A p.Y533C、患者12：BCOR p.P1513L）が循環リンパ球（単核球及び顆粒球の両方）から検出できた。残りの19変異は、シーケンシングカバレッジの限界のために、循環白血球ではシーケンシングによって検出できなかった。注目すべきことに、DNMT3Aの変異は、腫瘍浸潤白血球と比較して25倍低い変種対立遺伝子頻度で存在した（表8）。これら他の変異が低い対立遺伝子負荷で循環細胞に存在する可能性、或いは変異が循環細胞とはまた別に又は循環細胞に加えてこれらの患者の骨髄の幹細胞/始原細胞に存在する可能性を排除できない。しかしながら、これらのデータは、体細胞変異が全身の造血区画と比較して腫瘍浸潤白血球で高度に濃縮されることを示している。
表8：乳癌患者の末梢血細胞のディープシーケンシング

PB、末梢血；MNC、単核球；深度、読みの総数；N/A、利用不可。^*配列決定せず。
この試験では、高処理次世代シーケンシングデータを用いて、公知の癌遺伝子で体細胞変異を有する白血球が多くの原発癌に浸潤することを示した。体細胞変異は20人の患者のうち10人で同定され検証された（前記は公知の白血病遺伝子（DNTM3A、TET2、及びBCOR）に含まれる）。2つの事例では、腫瘍浸潤白血球で観察された2つの変異はまた同じ患者の循環白血球で検出されたが、頻度は顕著に低かった。
データは、いくつかの非造血器癌は公知の癌遺伝子に体細胞変異を有する白血球の浸潤を特徴とすることを示す。
7．参照による取り込み
多様な刊行物が本明細書に引用され、それら刊行物の開示は参照によりその全体が本明細書に含まれる。

Claims (12)

1. 変異腫瘍浸潤白血球を治療する為の医薬組成物を投与する患者を決定するインビトロの方法であって、前記方法は、当該患者が乳房腫瘍の腫瘍浸潤白血球に存在する1つ以上の体細胞遺伝子変異を有することを決定する工程を含み、
   当該1つ以上の体細胞遺伝子変異が、KDM5C、CDK8、MPL、ARID1A、FLT3、FGFR1、JAK1、GLI1、EZH2、EP300、BCOR、NF1、SMARCB1、EPHA10、IRF4、INSR、EPHA2、SMO、DUSP27、NOTCH2、HNF1A、MYO18A、MET、RPTOR、ATP10A、PTCH1、BRCA1、NCOR2、PASD1、NEB、MUC4、POU2F2、HLA-A、ALK、TET2、HLA-B、FGFR4、GATA2、FLT1、ATM、ITK、FREM2、INPP4B、CSF1R、PIGN、SOX17、MLL4、TTC28、TNFSF9、TRRAP、DNMT3A、TP53、IDH2、EPHA7、WT1、PNRC1、EGFR、ETV6、SMARCA4、MLL2、MAP3K1、ALOX12B、ARID2、EPHA8、ERBB2、EPHA4、PBRM1、BCL6、HDAC2、MLL、CYLD、CEBPA、JAK3、ASXL1、KIT、MEF2B及びERGから成る群から選択される1つ以上の遺伝子に存在し、コード領域に存在してアミノ酸置換または未成熟終止コドンを生じ、且つ乳房腫瘍そのものの新形成細胞中には同定されず、
   前記医薬組成物が、イマチニブ、ダウノルビシン、シタラビン、デシタビン、アザシチジン、エトポシド、メルカプトプリン、プレドニゾン、イデラリシブ、イブルチニブ、ABT-199、または抗CD45抗体、抗CD33抗体及び抗CD20抗体から選ばれる白血球特異的抗体である薬剤を含む、前記方法。
2. 当該1つ以上の体細胞遺伝子変異が、BCOR、NOTCH2、TET2、NF1、EZH2、JAK1、DNMT3A、及びTP53から成る群から選択される1つ以上の遺伝子に存在する、請求項1に記載の方法。
3. 当該1つ以上の体細胞遺伝子変異がTET2、DNMT3AまたはASXL1に存在する、請求項1に記載の方法。
4. 当該1つ以上の体細胞遺伝子変異が、ALK p.A892T、ALK p.H1030P、ALK p.L1145V、ALK p.R1209Q、ALOX12B p.D492N、ARID1A p.Q1365K、ASXL1p.G792D、ATM p.A1211T、ATM p.P1564S、ATM p.R2105S、ATP10A p.P35A、BCL6 p.K558M、BCOR p.P1156L、BCORp.P1613L、BCOR p.P1648L、BCOR p.V293I、BRCA1 p.S1613G、CDK8 p.V169I、CEBPA p.A79T、CSF1R p.R216Q、CYLD p.G173C、DNMT3A p.T260N、DNMT3A p.Y533C、DUSP27 p.Q737L、DUSP27 p.T1124N、EGFR p.A871E、EP300 p.G1777C、EP300 p.M1972T、EP300 p.Q2355L、EP300 p.R1737H、EPHA2 p.E302G、EPHA7 p.G592S、EPHA10 p.L80Q、ERG p.P299L、ETV6 p.P25S、EZH2 p.A478S、EZH2 p.A483S、FGFR1 p.G205D、FGFR1 p.M731V、FGFR4 p.S776F、FLT1 p.V1331I、FLT3 p.P439S、FLT3 p.Q394^*、FREM2 p.G1608D、GATA2 p.A286P、GLI1 p.G162C、HLA-A p.A270S、HLA-A p.E176V、HLA-B p.R155S、HNF1A p.A562V、IDH2 p.K205R、IDH2 p.W164L、INPP4B p.K816E、INSR p.R162S、IRF4 p.A370V、IRF4 p.M146I、ITK p.D510N、JAK1 p.S260G、JAK3 p.Q1094^*、KDM5C p.A612T、KIT p.G126E、KIT p.G93S、MAP3K1 p.S1002F、MEF2B p.P197R、MEF2B p.P279S、MET p.Q165K、MLL p.A2061T、MLL p.K3846M、MLL2 p.E4152K、MLL2 p.H4930L、MLL4 p.S214P、MPL p.E54V、MUC4 p.A2025V、MYO18A p.A958V、NCOR2 p.A1706T、NEB p.Y1092C、NF1 p.A1670V、NF1 p.K1517M、NF1 p.N2775S、NF1 p.Q2434H、NOTCH2 p.A21T、NOTCH2 p.P1101T、NOTCH2 p.S1708P、PASD1 p.Q213E、PIGN p.T569N、PNRC1 p.R97Q、POU2F2 p.L459F、PTCH1 p.I685M、RPTOR p.V476M、SMARCA4 p.D694E、SMARCB1 p.N154K、SMO p.A379V、SOX17 p.G178R、TET2 p.E1874K、TET2 p.Q1702^*、TNFSF9 p.A58S、TP53 p.M169I、TRRAP p.S1073G、TTC28 p.K2346Q、及びWT1 p.T278Iから成る群から選択される、請求項1に記載の方法。
5. 当該腫瘍浸潤白血球が、CD45陽性細胞である、請求項1－4のいずれか1項に記載の方法。
6. 当該薬剤がデシタビンである、請求項1－5のいずれか1項に記載の方法。
7. 当該薬剤がアザシチジンである、請求項1－5のいずれか1項に記載の方法。
8. 当該薬剤が抗CD45抗体、抗CD33抗体または抗CD20抗体である、請求項1－5のいずれか1項に記載の方法。
9. 当該抗CD20抗体がリツキシマブである、請求項8に記載の方法。
10. 当該抗CD33抗体が、カリケアミシンと複合物化された、請求項8に記載の方法。
11. 当該抗CD33抗体がゲムツズマブオゾガマイシンである、請求項10に記載の方法。
12. 当該患者がネオアジュバント化学療法を受けたことがない請求項1-11いずれか1項に記載の方法。

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