ES2807597T3 - Métodos de tratamiento y pronóstico de tumores malignos no hematopoyéticos - Google Patents

Métodos de tratamiento y pronóstico de tumores malignos no hematopoyéticos Download PDF

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Abstract

Un método in vitro para determinar si un paciente que tiene un tumor de mama es susceptible a la terapia con un agente conocido o indicado para tratar la leucemia, el método que comprende determinar si el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor del tumor de mama, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en KDM5C, CDK8, MPL, ARID1A, FLT3, FGFR1, JAK1, GLI1, EZH2, EP300, BCOR, NF1, SMARCB1, EPHA10, IRF4, INSR, EPHA2, SMO, DUSP27, NOTCH2, HNF1A, MYO18A, MET, RPTOR, ATP10A, PTCH1, BRCA1, NCOR2, PASD1, NEB, MUC4, POU2F2, HLA-A, ALK, TET2, HLA- B, FGFR4, GATA2, FLT1, ATM, ITK, FREM2, INPP4B, CSF1R, PIGN, SOX17, MLL4, TTC28, TNFSF9, TRRAP, DNMT3A, TP53, IDH2, EPHA7, WT1, PNRC1, EGFR, ETV6, SMARCA4, MLL2, MAP3K1, ALOX12B, ARID2, EPHA8, ERBB2, EPHA4, PBRM1, BCL6, HDAC2, MLL, CYLD, CEBPA, JAK3, ASXL1, KIT, MEF2B y ERG y en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están en una región de codificación, y resultan en una sustitución de aminoácido o un codón de parada prematuro.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de tratamiento y pronóstico de tumores malignos no hematopoyéticos
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los Estados Unidos núm. 62/089,148, presentada el 8 de diciembre de 2014.
Declaración de derechos del gobierno
Esta invención se realizó con apoyo gubernamental con la Subvención núm. P30CA008748 otorgada por el Instituto Nacional de Salud. El Gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.
Referencia al listado de secuencias presentada electrónicamente
Esta solicitud incorpora por referencia un Listado de secuencias presentado con esta solicitud como un archivo de texto titulado "13542-005-228_Sequence_Listing_ST25.txt" creado el 1 de diciembre de 2015 y que tiene un tamaño de 199 kilobytes.
1. Campo
En la presente descripción se proporcionan métodos in vitro para determinar si un paciente que tiene un tumor de mama es susceptible a la terapia con un agente conocido o indicado para tratar la leucemia, el método comprende determinar si el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor del tumor mama.
2. Antecedentes
En la última década, los estudios de secuenciación de genes, exomas y genomas candidatos han delineado un espectro de mutaciones somáticas en tumores malignos humanos (Cancer Genome Atlas Network, 2012, Nature, 490: 61-70; Ellis, MJ, y otros, 2012, Nature, 486: 353-360). Estos incluyen estudios de secuenciación a gran escala en cáncer de mama, que han identificado mutaciones recurrentes en genes y vías que contribuyen a la transformación maligna y a la respuesta terapéutica. Las células cancerosas interactúan con su microambiente, incluidos los constituyentes de las células del estroma, los leucocitos infiltrantes y las citocinas inflamatorias circulantes que se originan en sitios locales y distantes (Acharyya, S., y otros, 2012, Cell, 150: 165-178; Karnoub, A.E., y otros, 2007, Nature, 449: 557-563). Estudios anteriores han demostrado que las células del estroma que se encuentran en los cánceres de mama se caracterizan por mutaciones específicas y alteraciones epigenéticas específicas del sitio (Kurose, K., y otros, 2002, Nat Genet, 32: 355-357; Hu, M., y otros, 2005, Nat Genet, 37: 899-905). Además de las células estromales específicas del tejido, los leucocitos circulantes y los que infiltran el tumor pueden mediar el crecimiento primario del tumor y las metástasis (Granot, Z., y otros, 2011, Cancer Cell, 20: 300-314; Grivennikov, S.I., y otros, 2010, Cell, 140: 883-899). La evidencia reciente sugiere que las células estromales asociadas al tumor y los leucocitos infiltrantes funcionan de manera diferente que las células hematopoyéticas circulantes o residentes en la médula ósea (Acharyya, S., y otros, 2012, Cell, 150: 165-178; Orimo, A. y Weinberg, R.A., 2006, Cell Cycle, 5: 1597­ 1601; Li, HJ, y otros, 2012, Cancer Discov, 2: 840-855). En particular, varios estudios han indicado que el contenido de células linfoides y mieloides que se infiltran en los cánceres de mama se correlaciona con el resultado clínico (Mahmoud, S.M., y otros, 2011, J Clin Oncol, 29: 1949-1955; Mohammed, Z.M., y otros, 2013, Br J Cancer, 109: 1676­ 1684; Loi, S., y otros, 2013, J Clin Oncol, 31: 860-867).
Recientemente se demostró que algunas personas mayores tienen hematopoyesis clonal clínicamente inaparente, caracterizada por mutaciones somáticas recurrentes TET2 (Busque, L., y otros, 2012, Nat Genet, 44: 1179-1181). La pérdida de Tet2 en el compartimento hematopoyético conduce a un aumento de la autorrenovación y al sesgo mieloide de las células hematopoyéticas (Moran-Crusio, K., y otros, 2011, Cancer Cell, 20: 11-24; Quivoron, C., y otros, 2011, Cancer Cell, 20: 25-38; Ko, M., y otros, 2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108: 14566-14571). S. Mirza y otros, "Demethylating agent 5-aza-2 deoxycytidine enhances susceptibility of breast cancer cells to anticancer agents", MOL CELL BIOCHEM, vol. 342, no. 1-2, 2010; L. Wang y otros. "5-aza-2'-Deoxycytidine Enhances the Radiosensitivity of Breast Cancer Cells", CANCER BIOTHERAPY & RADIOPHARMACEUTICALS, vol. 28, no. 1, 2013; y V. Bovenzi y otros, "DNA methylation of retinoic acid receptor beta in breast cancer and possible therapeutic role of 5-aza-2'-deoxycytidine.",ANTI-CANCER DRUGS, vol. 10, no. 5 de 1999 describe la 5-aza-2'-desoxicitidina como Primer Agente que mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de leucocitos con relación a las células no hematopoyéticas para su uso en el tratamiento del cáncer de mama. S. Nzula y otros, "Antigen-driven clonal proliferation, somatic hypermutation, and selection of B lymphocytes infiltrating human ductal breast carcinomas", CANCER RES, vol. 63, no. 12, 2003 investigó el repertorio de células B que se infiltran en cuatro carcinomas ductales invasivos; Shanu M. y otros, "A phase II trial of imatinib mesylate monotherapy in patients with metastatic breast cancer", BREAST CANCER RESEARCH AND TREATMENT, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS, BO, (20050301), vol. 90, no. 2; y S. Loi y otros, "Prognostic and Predictive Value of Tumor-Infiltrating Lymphocytes in a Phase III Randomized Adjuvant Breast Cáncer Trial in Node-Positive Breast Cáncer Comparing the Addition of Docetaxel to Doxorubicin With Doxorubicin-Based Chemotherapy: BIG 02-98", JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, US, (20130122), vol. 31, no. 7 investigó las terapias combinadas útiles en el tratamiento del cáncer de mama.
3. Resumen de la invención
La presente invención proporciona las siguientes modalidades definidas bajo los items 1-15:
1. Un método in vitro para determinar si un paciente que tiene un tumor de mama es susceptible a la terapia con un agente conocido o indicado para tratar la leucemia, el método comprende determinar si el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor del tumor de mama, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en KDM5C, CDK8, MPL, ARID 1A, FLT3, FGFR1, JAK1, GLI1, EZH2, EP300, BCOR, NF1, SMARCB1, EPHA10, IRF4, INSR, EPHA2, SMO, DUSP27, NOTCH2, HNF1A, MYO18A, MET, RPTOR, ATP10A, PTCH1, BRCA1, NCOR2, PASD1, NEB, MUC4, POU2F2, HLA-A, ALK, TET2, HLA-B, FGFR4, GATA2, FLT1, ATM, ITK, FREM2, INPP4B, CSF1R, PIGN, SOX17, MLL4, TTC28, TNFSF9, TRRAP, DNMT3A, TP53, IDH2, EPHA7, WT1, PNRC1, EGFR, ETV6, SMARCA4, MLL2, MAP3K1, ALOX12B, ARID2, EPHA8, ERBB2, EPHA4, PBRM1, BCL6, HDAC2, MLL, CYLD, CEBPA, JAK3, ASXL1, KIT, MEF2B, y ERG, y en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están en una región de codificación, y da como resultado una sustitución de aminoácidos o un codón de parada prematuro.
2. El método de acuerdo con el ítem 1, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en BCOR, NOTCH2, TET2, NF1, EZH2, JAK1, DNMT3A, y TP53.
3. El método de acuerdo con el ítem 1, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en TET2, DNMT3A o ASXL1.
4. El método de acuerdo con el ítem 1, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas se seleccionan del grupo que consiste en ALK p.A892T, ALK p.H1030P, ALK p.L1145V, ALK p.R1209Q, ALOX12B p.D492N, ARID1A p.Q1365K, ASXL1 p.G792D, ATM p.A1211T, ATM p.P1564S, ATM p.R2105S, ATP10A p.P35A, BCL6 p.K558M, BCOR p.P1156L, BCOR p.P1613L, BCOR p.P1648L, BCOR p.V293I, BRCA1 p.S1613G, CDK8 p.V169I, CEBPA p.A79T, CSF1R p.R216Q, CYLDp.G173C, DNMT3A p.T260N, DNMT3A p.Y533C, DUSP27 p.Q737L, DUSP27 p.T1124N, EGFR p.A871E, EP300 p.G1777C, EP300 p.M1972T, EP300 p.Q2355L, EP300 p.R1737H, EPHA2 p.E302G, EPHA7 p.G592S, EPHA10 p.L80Q, ERG p.P299L, ETV6 p.P25S, EZH2 p.A478S, EZH2 p.A483S, FGFR1 p.G205D, FGFR1 p.M731V, FGFR4 p.S776F, FLT1 p.V1331I, FLT3 p.P439S, FLT3 p.Q394*, FREM2 p.G1608D, GATA2 p.A286P, GLI1 p.G162C, HLA-A p.A270S, HLA-A p.E176V, HLA-B p.R155S, HNF1A p.A562V, IDH2 p.K205R, IDH2 p.W164L, INPP4B p.K816E, INSR p.R162S, IRF4 p.A370V, IRF4 p.M146I, ITK p.D510N, JAK1 p.S260G, JAK3 p.Q1094*, KDM5C p.A612T, KIT p.G126E, KIT p.G93S, MAP3K1 p.S1002F, MEF2B p.P197R, MEF2B p.P279S, MET p.Q165K, MLL p.A2061T, MLL p.K3846M, MLL2 p.E4152K, MLL2 p.H4930L, MLL4 p.S214P, MPL p.E54V, MUC4 p.A2025V, MYO18A p.A958V, NCOR2 p.A1706T, NEB p.Y1092C, NF1 p.A1670V, NF1 p.K1517M, NF1 p.N2775S, NF1 p.Q2434H, NOTCH2 p.A21T, NOTCH2 p.P1101T, NOTCH2 p.S1708P, PASD1 p.Q213E, PIGN p.T569N, PNRC1 p.R97Q, POU2F2 p.L459F, PTCH1 p.1685M, RPTOR p.V476M, SMARCA4 p.D694E, SMARCP1 p.N154K, SMO p.A379V, SOX17 p.G178R, TET2 p.E1874K, TET2 p.Q1702*, TNFSF9 p.A58S, TP53 p.M1691, TP53 p.R248L, TP53 p.R283P, TRRAP p.S1073G, TTC28 p.K2346Q, y WT1 p.T278I.
5. El método de acuerdo con uno cualquiera de los items 1-4, en donde los leucocitos infiltrantes de tumor son células CD45 positivas.
6. El método de acuerdo con uno cualquiera de los items 1-5, en donde el agente es imatinib, daunorubicina, citarabina, decitabina, azacitidina, etopósido, mercaptopurina, prednisona, idelalisib, ibrutinib o ABT-199.
7. El método de acuerdo con el ítem 6, en donde el agente es decitabina.
8. El método de acuerdo con el ítem 6, en donde el agente es azacitidina.
9. El método de acuerdo con uno cualquiera de los items 1-5, en donde el agente comprende un anticuerpo específico de leucocitos.
10. El método de acuerdo con el ítem 9, en donde el agente comprende un anticuerpo anti-CD45, un anticuerpo anti-CD33 o un anticuerpo anti-CD20.
11. El método de acuerdo con el ítem 10, en donde el anticuerpo anti-CD20 es rituximab.
12. El método de acuerdo con el ítem 9, en donde el anticuerpo específico de leucocitos se conjuga con un fármaco citotóxico.
13. El método de acuerdo con el ítem 12, en donde el agente es un anticuerpo anti-CD33 conjugado con caliqueamicina.
14. El método de acuerdo con el ítem 13, en donde el agente es gemtuzumab ozogamicina.
15. El método de acuerdo con uno cualquiera de los items 1-14, en donde el paciente no ha recibido quimioterapia neoadyuvante.
En la presente descripción se describen métodos para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente (en adelante "Primer Agente") que mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de leucocitos con relación a células no hematopoyéticas.
En modalidades específicas, el Primer Agente es imatinib, daunorubicina, citarabina, decitabina, azacitidina, etopósido, mercaptopurina, prednisona, idelalisib, ibrutinib o ABT-199.
En una modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en TET2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la decitabina. En otra modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en TET2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la azacitidina. En otra modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en IDH2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la decitabina. En otra modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en IDH2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la azacitidina.
En diversas modalidades, el Primer Agente comprende un anticuerpo específico de leucocitos. En una modalidad específica, el anticuerpo específico de leucocitos es un anticuerpo anti-CD45. En una modalidad específica, el anticuerpo específico de leucocitos es un anticuerpo anti-CD33. En una modalidad específica, el anticuerpo específico de leucocitos es un anticuerpo anti-CD20. En un aspecto específico de tal modalidad, el anticuerpo anti-CD20 es rituximab.
En ciertas modalidades, el anticuerpo específico de leucocitos se conjuga con un fármaco citotóxico. En una modalidad específica, el Primer Agente es un anticuerpo anti-CD33 conjugado con caliqueamicina. En un aspecto específico de tal modalidad, el anticuerpo anti-CD33 conjugado con caliqueamicina es gemtuzumab ozogamicina.
En diversas modalidades, el método de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, administrar al paciente otro agente (en adelante "Segundo Agente"), diferente del Primer Agente, para tratar el tumor maligno no hematopoyético. En modalidades específicas, el Segundo Agente es trastuzumab, lapatinib, fluorouracilo, paclitaxel o un análogo de platino. En algunas modalidades, el Segundo Agente es un inhibidor de HER2. En un aspecto específico de tales modalidades, el inhibidor de HER2 es un anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzumab). En otro aspecto específico de tales modalidades, el inhibidor de HER2 es lapatinib.
En modalidades específicas, el Segundo Agente es un tratamiento de cáncer de amplio espectro. En aspectos específicos, el tratamiento de cáncer de amplio espectro es un agente quimioterapéutico. El agente quimioterapéutico puede ser, entre otros, un agente alquilante, un antimetabolito, un agente antimicrotúbulo, un inhibidor de topoisomerasa, un antibiótico citotóxico, un conjugado anticuerpo-fármaco o sus combinaciones. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente alquilante. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente antimicrotúbulos (por ejemplo, un taxano). En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un antibiótico citotóxico (por ejemplo, una antraciclina).
En diversas modalidades, el método para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, tratar al paciente con radioterapia. En una modalidad específica, la radioterapia es radioterapia local. En una modalidad específica, la radioterapia implica radioterapia de campo.
En diversas modalidades, el método para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, tratar al paciente mediante resección quirúrgica del tumor maligno no hematopoyético.
En diversas modalidades en donde el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el método de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético en el paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, antes de la etapa de administración, una etapa para determinar que la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor.
En ciertas modalidades, la etapa de determinar comprende comparar la secuencia de ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor con la secuencia de ADN de células no cancerosas. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, generar un informe que indica la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En un aspecto específico de tales modalidades, el informe indica, además, el pronóstico del paciente basado en la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, comunicar la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, comunicar (i) la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor, y (ii) que el Primer Agente es una terapia seleccionada o indicada para el paciente. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, obtener los leucocitos infiltrantes de tumor a partir del tejido del tumor maligno no hematopoyético. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, extraer ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, secuenciar el ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor.
En la presente descripción se describen, además, métodos para pronosticar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, que comprende determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas, en donde si los leucocitos infiltrantes de tumor tienen una o más mutaciones genéticas somáticas, entonces el paciente está indicado para tener un peor pronóstico que si los leucocitos infiltrantes de tumor no tienen una o más mutaciones genéticas somáticas.
En algunas modalidades, el método de pronóstico del tumor maligno no hematopoyético comprende, además, tratar al paciente con una terapia, en donde la terapia es una terapia más agresiva si se determina que los leucocitos infiltrantes de tumor tienen una o más mutaciones genéticas somáticas, que si los leucocitos infiltrantes de tumor no tienen la una o más mutaciones genéticas somáticas.
En ciertas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende comparar la secuencia de ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor con la secuencia de ADN de células no cancerosas. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, generar un informe que indica la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En un aspecto específico de tales modalidades, el informe indica, además, el pronóstico del paciente basado en la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, comunicar la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, comunicar (i) la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor, y (ii) el pronóstico del paciente basado en la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, obtener los leucocitos infiltrantes de tumor a partir del tejido del tumor maligno no hematopoyético. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, extraer ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, secuenciar el ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor.
Los leucocitos infiltrantes de tumor en cualquiera de los métodos descritos en la presente descripción pueden ser, entre otros, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos y/o linfocitos.
En diversas modalidades de los métodos descritos en la presente descripción, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en KDM5C, CDK8, MPL, ARID1A, FLT3, FGFR1, JAK1, GLI1, EZH2, EP300, BCOR, NF1, SMARCB1, EPHA10, IRF4, INSR, EPHA2, SMO, DUSP27, NOTCH2, HNF1A, MYO18A, MET, RPTOR, ATP10A, PTCH1, BRCA1, NCOR2, PASD1, NEB, MUC4, POU2F2, HLA-A, ALK, TET2, HLA-B, FGFR4, GATA2, FLT1, ATM, ITK, FREM2, INPP4B, CSF1R, PIGN, SOX17, MLL4, TTC28, TNFSF9, TRRAP, DNMT3A, TP53, IDH2, EPHA7, WT1, PNRC1, EGFR, ETV6, SMARCA4, MLL2, MAP3K1, ALOX12B, ARID2, EPHA8, ERBB2, EPHA4, PBPM1. BCL6, HDAC2, EPHA7, MLL, CYLD, CEBPA, JAK3, ASXL1, KIT, MEF2B, y ERG. En modalidades específicas, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en BCOR, NOTCH2, TET2, NF1, EZH2, JAK1, DNMT3A, y TP53. En una modalidad específica, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en TET2. En una modalidad específica, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en IDH2.
En modalidades específicas, la una o más mutaciones genéticas somáticas están en una región de codificación. En un aspecto de tales modalidades, la una o más mutaciones somáticas dan como resultado una sustitución de aminoácido. En otro aspecto de tales modalidades, la una o más mutaciones genéticas somáticas dan como resultado un codón de parada prematuro.
En modalidades específicas de los métodos descritos en la presente descripción, el tumor maligno no hematopoyético es un tumor epitelial. El tumor epitelial puede ser, entre otros, un tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de ovario, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de laringe, tumor de esófago, tumor de testículos, tumor de hígado, tumor de parótida, tumor de vías biliares, tumor de colon, tumor de recto, tumor de cuello uterino, tumor de útero, tumor de endometrio, tumor de riñón, tumor de vejiga, tumor de próstata o tumor de tiroides. En una modalidad específica, el tumor epitelial es un tumor de mama. En modalidades específicas de los métodos de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético descrito en la presente descripción, el tumor maligno no hematopoyético es un tumor epitelial, y el Primer Agente mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de leucocitos con relación a las células epiteliales.
En una modalidad preferida de los métodos descritos en la presente descripción, el paciente es un paciente humano.
4. Breve descripción de las figuras
Figura 1. Resumen del análisis genético. El diagrama describe las etapas usadas para filtrar las variantes identificadas por secuenciación de exoma completo (a) y secuenciación basada en captura (b). * Indica variantes que alteran un codón previamente reportado en el Catálogo de mutaciones genéticas somáticas en cáncer (COSMIC) que incluye una sustitución diferente del mismo aminoácido.
Figura 2. El análisis de secuenciación de 21 cánceres de mama primarios identificó mutaciones adquiridas somáticamente en leucocitos infiltrantes de tumor. (a) Esquema de activación para la clasificación de células hematopoyéticas CD45 positivas activadas por fluorescencia (Paciente # 20). Se incluyó DAPI como tinción vital, vivamuerta. Se excluyeron los dobletes celulares antes de la activación en PE-Cy7 (no mostrado). El ADN extraído de la fracción CD45 positiva se analizó mediante el uso de tres plataformas de secuenciación independientes. (b) Imagen representativa de IGV que muestra la presencia de mutaciones adquiridas. Las lecturas que no coinciden con el nucleótido de referencia están marcadas con la nucleobase sustituyente. El gráfico de barras gris en la parte superior muestra la profundidad de lectura. La secuencia de nucleótidos y proteínas de referencia se representa para cada mutación. Se muestran la frecuencia de alelos variantes (VAF) y el número de lecturas alteradas y totales (alt | total, VAF).
5. Descripción detallada
En la presente descripción se describen métodos para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente y métodos para pronosticar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente. Los inventores han descubierto que los leucocitos infiltrantes de tumor en algunos tumores malignos no hematopoyéticos tienen mutaciones adquiridas somáticamente. De acuerdo con la descripción, los leucocitos infiltrantes de tumor son dianas en el tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético y la presencia de mutaciones somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor es un factor pronóstico para pronosticar un tumor maligno no hematopoyético.
5.1. Métodos de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético
En la presente descripción se proporcionan métodos para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, que comprenden administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente (en adelante "Primer Agente") que mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de leucocitos con relación a células no hematopoyéticas.
En modalidades específicas, el tumor maligno no hematopoyético es un carcinoma, sarcoma, tumor de células germinales, blastoma o tumor cerebral. En modalidades específicas, el tumor maligno no hematopoyético es un tumor epitelial, y el Primer Agente mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de leucocitos con relación a las células epiteliales. El tumor epitelial puede ser, entre otros, un tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de ovario, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de laringe, tumor de esófago, tumor de testículos, tumor de hígado, tumor de parótida, tumor de vías biliares, tumor de colon, tumor de recto, tumor de cuello uterino, tumor de útero, tumor de endometrio, tumor de riñón, tumor de vejiga, tumor de próstata o tumor de tiroides. En una modalidad específica, el tumor epitelial es un tumor de mama. En una modalidad específica, el tumor maligno no hematopoyético es un tumor maligno de un tipo particular de tejido u órgano, y el Primer Agente mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de leucocitos con relación a las células de dicho tejido u órgano.
5.1.1. Tratamiento con el Primer Agente
El Primer Agente es cualquier agente farmacéuticamente aceptable que mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de los leucocitos con relación a las células no hematopoyéticas. En diversas modalidades, el Primer Agente es un agente conocido o indicado para tratar la leucemia. En modalidades específicas, el Primer Agente es imatinib, daunorubicina, citarabina, decitabina, azacitidina, etopósido, mercaptopurina, prednisona, idelalisib, ibrutinib o ABT-199.
Los Primeros Agentes son conocidos en la técnica, o pueden identificarse por métodos conocidos. En particular, la destrucción preferencial o la inhibición de la proliferación o actividad de los leucocitos con relación a las células no hematopoyéticas puede determinarse mediante métodos conocidos en la técnica. Como un ejemplo, la incubación de leucocitos y células no hematopoyéticas, respectivamente, con la misma cantidad de Primer Agente candidato en las mismas condiciones o en condiciones similares, y la detección del porcentaje de muerte celular (o alternativamente la supervivencia celular) puede llevarse a cabo para determinar si un agente es un Primer Agente. El porcentaje de muerte celular puede determinarse, por ejemplo, mediante el uso de colorantes comúnmente usados para determinar la viabilidad celular.
En una modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en TET2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la decitabina. En otra modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en TET2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la azacitidina. En otra modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en IDH2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la decitabina. En otra modalidad específica en donde una o más mutaciones somáticas están presentes en IDH2 en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el Primer Agente es la azacitidina.
En diversas modalidades, el Primer Agente comprende un anticuerpo específico de leucocitos. En una modalidad específica, el anticuerpo específico de leucocitos es un anticuerpo anti-CD45. En una modalidad específica, el anticuerpo específico de leucocitos es un anticuerpo anti-CD33. En una modalidad específica, el anticuerpo específico de leucocitos es un anticuerpo anti-CD20. En un aspecto específico de tal modalidad, el anticuerpo anti-CD20 es rituximab.
En ciertas modalidades, el anticuerpo específico de leucocitos se conjuga con un fármaco citotóxico. En una modalidad específica, el Primer Agente es un anticuerpo anti-CD33 conjugado con caliqueamicina. En un aspecto específico de tal modalidad, el anticuerpo anti-CD33 conjugado con caliqueamicina es gemtuzumab ozogamicina.
5.1.2. Tumores malignos no hematopoyéticos que portan mutaciones somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor
En diversas modalidades, el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético. En una modalidad específica, los leucocitos infiltrantes de tumor son células CD45+ aisladas de una(s) muestra(s) (por ejemplo, obtenidas por biopsia o resección quirúrgica) del tumor maligno no hematopoyético. Los leucocitos infiltrantes de tumor pueden ser, entre otros, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos y/o linfocitos.
En modalidades específicas, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en KDM5C, CDK8, MPL, ARID1A, FLT3, FGFR1, JAK1, GLI1, EZH2, EP300, BCOR, NF1, SMARCB1, EPHA10, IRF4, INSR, EPHA2, SMO, DUSP27, NOTCH2, HNF1A, MYO18A, MET, RPTOR, ATP10A, PTCH1, BRCA1, NCOR2, PASD1, NEB, MUC4, POU2F2, HLA-A, ALK, TET2, HLA-B, FGFR4, GATA2, FLT1, ATM, ITK, FREM2, INPP4B, CSF1R. PIGN. SOX17, MLL4, TTC28, TNFSF9, TRRAP, DNMT3A, TP53, IDH2, EPHA7, WT1, PNRC1, EGFR, ETV6, SMARCA4, MLL2, MAP3K1, ALOX12B, ARID2, EPHA8, ERBB2, EPHA4, PBRM1, BCL6, HDAC2, EPHA7, MLL, CYLD, CEBPA, JAK3, ASXL1, KIT, MEF2B, y ERG. En modalidades específicas, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en BCOR, NOTCH2, TET2, NF1, EZH2, JAK1, DNMT3A, y TP53. En una modalidad específica, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en TET2. En una modalidad particular, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en TET2 humano, en donde el paciente es un paciente humano. En una modalidad específica, el TET2 humano tiene una secuencia de tipo silvestre que es SEQ ID NO: 1. En una modalidad específica, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en IDH2. En una modalidad particular, la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en IDH2 humano, en donde el paciente es un paciente humano. En una modalidad específica, el IDH2 humano tiene una secuencia de tipo silvestre que es SEQ ID NO: 2.
En modalidades específicas, la una o más mutaciones genéticas somáticas están en una región de codificación. En un aspecto de tales modalidades, la una o más mutaciones somáticas dan como resultado una sustitución de aminoácido. En otro aspecto de tales modalidades, la una o más mutaciones genéticas somáticas dan como resultado un codón de parada prematuro. A manera de ejemplo, en modalidades específicas, la una o más mutaciones somáticas dan como resultado una sustitución de aminoácido o un codón de parada prematuro como se muestra en la Tabla 4, Tabla 5 o Tabla 6.
5.1.3. Terapia Combinada
En diversas modalidades, el método de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, administrar al paciente otro agente (en adelante "Segundo Agente"), diferente del Primer Agente, para tratar el tumor maligno no hematopoyético. En ciertas modalidades, el Segundo Agente es conocido o está indicado para tratar el tumor maligno no hematopoyético. En una modalidad específica, el Segundo Agente mata o inhibe preferentemente la proliferación o actividad de células no hematopoyéticas, por ejemplo, del mismo tejido que el tumor maligno no hematopoyético, con relación a los leucocitos. En otra modalidad específica, el Segundo Agente mata o inhibe la proliferación o actividad de leucocitos aproximadamente a la misma potencia que mata o inhibe la proliferación o actividad de células del mismo tejido que el tumor maligno no hematopoyético. En modalidades específicas, el Segundo Agente es trastuzumab, lapatinib, fluorouracilo, paclitaxel o un análogo de platino. En algunas modalidades, el Segundo Agente es un inhibidor de HER2. En un aspecto específico de tales modalidades, el inhibidor de HER2 es un anticuerpo anti-HER2 (por ejemplo, trastuzumab). En otro aspecto específico de tales modalidades, el inhibidor de HER2 es lapatinib.
En modalidades específicas, el Segundo Agente es un tratamiento de cáncer de amplio espectro. En aspectos específicos, el tratamiento de cáncer de amplio espectro es un agente quimioterapéutico. El agente quimioterapéutico puede ser, entre otros, un agente alquilante, un antimetabolito, un agente antimicrotúbulo, un inhibidor de topoisomerasa, un antibiótico citotóxico, un conjugado anticuerpo-fármaco o sus combinaciones. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente alquilante. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente antimicrotúbulos (por ejemplo, un taxano). En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un antibiótico citotóxico (por ejemplo, una antraciclina).
En diversas modalidades, el método para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, tratar al paciente con radioterapia. En una modalidad específica, la radioterapia es radioterapia local. En una modalidad específica, la radioterapia implica radioterapia de campo.
En diversas modalidades, el método para tratar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, tratar al paciente mediante resección quirúrgica del tumor maligno no hematopoyético.
5.1.4. Vías de administración y dosificación
Los agentes, como se describió anteriormente, (por ejemplo, Primer Agente y Segundo Agente) pueden administrarse a los pacientes por una variedad de rutas. Estas rutas incluyen, entre otras, la vía parenteral, intranasal, intratraqueal, oral, intradérmica, tópica, intramuscular, intraperitoneal, transdérmica, intravenosa, intratumoral, conjuntival y subcutánea. Además, puede emplearse la administración pulmonar, por ejemplo mediante el uso de un inhalador o nebulizador, y la formulación con un agente de atomización para usar como aerosol.
Además, pueden administrarse el(los) agente(s) descrito(s) en la presente descripción o una composición farmacéutica del mismo en un sistema de suministro de fármacos dirigido, por ejemplo, en un liposoma recubierto con un anticuerpo específico para leucocitos. Los liposomas serán dirigidos y captados selectivamente por los leucocitos.
La cantidad de agente descrita en la presente descripción o una composición farmacéutica del mismo que será eficaz en el tratamiento del tumor no hematopoyético dependerá de la naturaleza de la enfermedad y del estado del paciente, y puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar y el conocimiento del médico.
La dosis precisa y el régimen a emplear en una composición dependerán, además, de la vía de administración, y la gravedad de la enfermedad, y debe decidirse de acuerdo con el criterio del médico y las circunstancias de cada paciente.
5.1.5. Métodos de detección de mutaciones somáticas en leucocitos infiltrantes de tumor.
En diversas modalidades en donde el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, el método de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético en el paciente, como se describió anteriormente, comprende, además, antes de la etapa de administración, una etapa para determinar que la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor.
En una modalidad específica, los leucocitos infiltrantes de tumor son células CD45+ aisladas de una(s) muestra(s) (por ejemplo, obtenidas por biopsia o resección quirúrgica) del tumor maligno no hematopoyético. Los leucocitos infiltrantes de tumor pueden ser neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos y/o linfocitos. La una o más mutaciones genéticas somáticas pueden estar presentes en ubicaciones como se describió anteriormente en las Secciones 5.1.2.
En ciertas modalidades, la etapa de determinar comprende comparar la secuencia de ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor con la secuencia de ADN de células no cancerosas. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, generar un informe que indica la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En un aspecto específico de tales modalidades, el informe indica, además, el pronóstico del paciente basado en la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, comunicar la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, comunicar (i) la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor, y (ii) que el Primer Agente es una terapia seleccionada o indicada para el paciente. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, obtener los leucocitos infiltrantes de tumor a partir del tejido del tumor maligno no hematopoyético. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, extraer ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar comprende, además, secuenciar el ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor.
El tejido del tumor maligno no hematopoyético puede obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, biopsia o resección quirúrgica.
La obtención de leucocitos infiltrantes de tumor a partir del tejido del tumor maligno no hematopoyético puede realizarse mediante cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, Clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para aislar células CD45+ a partir de una muestra(s) del tumor maligno no hematopoyético, como se describió en la Sección de Ejemplo 6.1.2.
La extracción de ADN de leucocitos infiltrantes de tumor puede realizarse por cualquier método conocido en la técnica. Entre los métodos ilustrativos no limitantes para extraer ADN se incluyen los métodos de salazón, los métodos de extracción orgánica, los métodos de gradiente de densidad de cloruro de cesio, los métodos de intercambio aniónico y los métodos basados en sílice (Green, M.R. y Sambrook J., 2012, Molecular Cloning (4th ed.), Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Carpi F.M., y otros, 2011, Recent Pat DNA Gene Seq, 5:1-7; Tan, S.C. y Yiap, B.C., 2009, J Biomed Biotechnol, ID del artículo 574398).
La secuenciación del ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor puede realizarse mediante cualquier tecnología de secuenciación conocida en la técnica. Los métodos ilustrativos no limitantes para la secuenciación de ADN incluyen secuenciación SOLiD (Shendure, J., y otros, 2005, Science, 309: 1728-1732; McKernan, K.J., y otros, 2009, Genome Res, 19: 1527-1541; Berglund, EC, y otros, 2011, Investig Genet, 2: 23; ver además, el sitio web Applied Biosystems para obtener una descripción completa de la tecnología), secuenciación 454 (King, C. y Scott-Horton, T., 2008, J Vis Exp, (11): 630; Wheeler, D.A., y otros, 2008, Nature, 452: 872-876; Berglund, E.C., y otros, 2011, Investig Genet, 2: 23; ver además, el sitio web 454.com para una descripción completa de la tecnología), secuenciación Illumina (Solexa) (Bentley, D.R., y otros, 2008, Nature, 456: 53-59; Balasubramanian, S., 2011, Chem Commun, 47: 7281-7286; Berglund, E.C., y otros, 2011, Investig Genet, 2: 23; ver además, el sitio web de Illumina para una descripción completa de la tecnología), secuenciación de semiconductores Ion Torrent (Rusk, N., 2011, Nat Meth, 8: 44-44), Secuenciación de DNA Nanoball (Porreca, G.J., 2010, Nat Biotechnol, 28: 43-44), Secuenciación de moléculas individuales de Heliscope (Thompson, J.F. y Steinmann, K.E., 2010, Curr Protoc Mol Biol, Capítulo 7: Unidad7) y secuenciación de una sola molécula en tiempo real (SMRT) (Eid, J, y otros, 2009, Science, 323: 133-138). A manera de ejemplo, en algunas modalidades, la etapa de secuenciar el ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor puede realizarse mediante secuenciación completa del exoma, secuenciación de captura diana o una combinación de las mismas, como se muestra en la Sección 6.1.5 del Ejemplo. En una modalidad específica, la etapa de determinar comprende, además, secuenciar el ADN de una muestra no tumoral (por ejemplo, una muestra de hisopado bucal) del paciente para proporcionar un control de secuencia de ADN emparejado de línea germinal, para identificar mutación(es) genética(s) somática(s) en los leucocitos infiltrantes de tumor.
La generación de un informe puede realizarse manualmente o implementarse por computadora mediante el uso de un sistema informático o un medio legible por computadora. En modalidades específicas, el informe indica, además, el pronóstico del paciente basado en la presencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En modalidades específicas, el informe indica, además, los nombres de los genes que están mutados somáticamente en los leucocitos infiltrantes de tumor del paciente. En modalidades específicas adicionales, el informe indica, además, las mutaciones en el(los) gen(es) que están mutados somáticamente en los leucocitos infiltrantes de tumor del paciente.
5.2. Métodos de pronóstico de un tumor maligno no hematopoyético
En la presente descripción se proporcionan, además, métodos para pronosticar un tumor maligno no hematopoyético en un paciente, que comprenden determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas, en donde si los leucocitos infiltrantes de tumor tienen una o más mutaciones genéticas somáticas, entonces el paciente está indicado para tener un peor pronóstico que si los leucocitos infiltrantes de tumor no tienen una o más mutaciones genéticas somáticas.
En modalidades específicas, el tumor maligno no hematopoyético es un carcinoma, sarcoma, tumor de células germinales, blastoma o tumor cerebral. En modalidades específicas, el tumor maligno no hematopoyético es un tumor epitelial. El tumor epitelial puede ser, entre otros, un tumor de mama, tumor de pulmón, tumor de ovario, tumor de estómago, tumor de páncreas, tumor de laringe, tumor de esófago, tumor de testículos, tumor de hígado, tumor de parótida, tumor de vías biliares, tumor de colon, tumor de recto, tumor de cuello uterino, tumor de útero, tumor de endometrio, tumor de riñón, tumor de vejiga, tumor de próstata o tumor de tiroides. En una modalidad específica, el tumor epitelial es un tumor de mama.
En una modalidad específica, los leucocitos infiltrantes de tumor son células CD45+ aisladas de una(s) muestra(s) (por ejemplo, obtenidas por biopsia o resección quirúrgica) del tumor maligno no hematopoyético. Los leucocitos infiltrantes de tumor pueden ser, entre otros, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monocitos, macrófagos y/o linfocitos.
La una o más mutaciones genéticas somáticas pueden estar presentes en ubicaciones como se describió anteriormente en las Secciones 5.1.1.
En algunas modalidades, el método de pronóstico del tumor maligno no hematopoyético comprende, además, tratar al paciente con una terapia, en donde la terapia es una terapia más agresiva (por ejemplo, mayor potencia del fármaco o mayor frecuencia de administración) si se determina que los leucocitos infiltrantes de tumor tienen una o más mutaciones genéticas somáticas, que si los leucocitos infiltrantes de tumor no tienen una o más mutaciones genéticas somáticas. La terapia puede ser cualquier método de tratamiento de un tumor maligno no hematopoyético como se describió en la presente descripción.
En ciertas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende comparar la secuencia de ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor con la secuencia de ADN de células no cancerosas. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, generar un informe que indica la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En un aspecto específico de tales modalidades, el informe indica, además, el pronóstico del paciente basado en la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, comunicar la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, comunicar (i) la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor, y (ii) el pronóstico del paciente basado en la presencia o ausencia de una o más mutaciones genéticas somáticas en los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, obtener los leucocitos infiltrantes de tumor a partir del tejido del tumor maligno no hematopoyético. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, extraer ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor. En algunas modalidades, la etapa de determinar si los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético tienen una o más mutaciones genéticas somáticas comprende, además, secuenciar el ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor.
El tejido del tumor maligno no hematopoyético puede obtenerse mediante el uso de los métodos descritos en la Sección 5.1.5.
La obtención de leucocitos que infiltran el tejido del tumor maligno no hematopoyético, la extracción de ADN de leucocitos infiltrantes de tumor, la secuenciación del ADN de los leucocitos infiltrantes de tumor y la generación de un informe pueden realizarse mediante el uso de los métodos descritos en la Sección 5.1.5.
5.3. Pacientes
El paciente al que se hace referencia en esta descripción, puede ser, entre otros, un vertebrado humano o no humano tal como un animal salvaje, doméstico o de granja. En ciertas modalidades, el paciente es un mamífero, por ejemplo, un humano, una vaca, un perro, un gato, una cabra, un caballo, una oveja o un cerdo. En una modalidad preferida, el paciente es un paciente humano.
En diversas modalidades, el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor maligno no hematopoyético, como se describió en la Sección 5.1.2 anterior.
En modalidades específicas, el paciente tiene menos de 70 años. En modalidades específicas, el paciente tiene menos de 60 años. En modalidades específicas, el paciente tiene menos de 55 años. En modalidades específicas, el paciente tiene menos de 50 años.
6. EJEMPLO
El siguiente ejemplo no limitante demuestra que las mutaciones genéticas somáticas, incluso en genes cancerosos conocidos, están presentes en los leucocitos que infiltran los cánceres de mama.
6.1. Métodos:
6.1.1. Materiales de pacientes.
Se recogieron muestras de cáncer de mama de pacientes consecutivos con cáncer de mama triple negativo primario (TNBC) que se sometieron a cirugía en el Centro de Cáncer Memorial-Sloan Kettering (MSKCC) entre 2012 y 2013 (Tabla 1). Los pacientes tratados con quimioterapia neoadyuvante se excluyeron del estudio. Además, se incluyeron cánceres de mama no triples negativos que muestran infiltrado linfocítico prominente en biopsias centrales. Todos los especímenes se cortaron y procesaron para el examen patológico de rutina. Los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina (H&E) fueron revisados por patólogos mamarios para establecer los diagnósticos. Mediante inmunohistoquímica (IHC) se evaluó el estado del receptor de estrógeno (ER), el receptor de progesterona (PR) y el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2). La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) para HER2 se realizó en un caso con resultados equívocos por IHC. La evaluación de los leucocitos infiltrantes de tumor se realizó como se describió anteriormente (Loi, S., y otros, 2013, J Clin Oncol, 31: 860-867). Los leucocitos infiltrantes de tumor se puntuaron de la siguiente manera: infiltración extensa > 50 % de linfocitos estromales o intratumorales; moderado = 5-10 %; mínimo < 5 %. Se recogieron muestras de hisopados bucales de cada paciente. Las células mononucleares y los granulocitos se aislaron de la sangre periférica mediante un protocolo estándar de Ficoll. En la Tabla 1 se enumera una descripción detallada de las características clinicopatológicas de cada paciente.
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6.1.2. Aislamiento y procesamiento de células que infiltran tumores.
Todos los pacientes incluidos en este estudio dieron su consentimiento informado. Se disociaron células tumorales frescas, células del estroma y leucocitos infiltrantes de tumor a partir de los tumores primarios mediante raspado de la superficie de corte 5-10 veces con una cuchilla de bisturí quirúrgico. El material celular se recolectó mediante enjuague de la cuchilla en PBS. Las células se centrifugaron y se resuspendieron en tampón de lisis de glóbulos rojos para eliminar los glóbulos rojos antes de la tinción con un anticuerpo antihumano de flujo conjugado CD45-PE-Cy7 o c D45-APC-Cy7 en tampón FACS (PBS suplementado con BSA al 2 %). Las células se tiñeron durante 20 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, se lavaron una vez con tampón FACS y se pasaron a través de un filtro. Se agregó DAPI antes de clasificar para discriminar las células vivas y muertas. Las células CD45 positivas se purificaron luego mediante el uso de un clasificador de células FACSAriaIII Cell Sorter (MSKCC Flow Core Facility).
6.1.3. Microdisección de captura de células tumorales con láser.
Diez secciones consecutivas de 8 pm de espesor teñidas de rojo rápido, representativas de los tumores, se sometieron a microdisección asistida por láser en un sistema de microdisección láser PALM Robot MicroBeam, como se describió anteriormente (Westbury, C.B., y otros, 2009, J Pathol, 219: 131-140). Primero se extirparon las células no neoplásicas, incluidas las células inflamatorias, del estroma y de la mama normal. Subsecuentemente, bajo un microscopio, nosotros microdiseccionamos solo células neoplásicas histológicamente inequívocas de cada muestra. El tejido se microdiseccionó directamente en tampón de extracción, y el ADN se extrajo mediante el uso del kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Valencia, CA) y se cuantificó con el fluorómetro Qubit (Invitrogen, Life Technologies, Norwalk, CT).
6.1.4. Extracción de ADN y amplificación del genoma completo.
El ADN se extrajo mediante el uso del kit de ADN QiaAmp (Qiagen) siguiendo las instrucciones de fabricación. Los hisopados bucales se procesaron mediante el uso del Mini kit QiaAmp DNA (Qiagen) siguiendo las instrucciones de fabricación. La calidad de las muestras de ADN se analizó con el Agilent Bioanalyzer 2100. A las muestras con una cantidad insuficiente de ADN (<500 ng) se les amplificó el genoma completo (WGA) mediante el uso del mini kit REPLI-g (Qiagen) antes de su uso adicional en aplicaciones aguas abajo. Se realizó QPCR para evaluar la calidad del ADN WGA.
6.1.5. Secuenciación del exoma completo y secuenciación del objetivo de captura.
El ADN extraído de los leucocitos CD45 positivos clasificados que infiltran tumor y los hisopados bucales (Tabla 2) se cortó a un tamaño promedio de 180pb+/-80 pb para la secuenciación completa del exoma. Para la preparación de la biblioteca de ADN, se seleccionaron fragmentos de 200-250 pb y se sometieron a amplificación por PCR. La biblioteca luego se hibridó con el kit Agilent SureSelect Human All Exon y la secuenciación se realizó en SOLiD 3plus o SOLiD 4. La secuenciación dirigida a leucocitos infiltrantes de tumor y ADN de línea germinal coincidente de cada paciente se realizó como se describió previamente (Welch, J.S., y otros, 2012, Cell, 150: 264-278).
Tabla 2. Información de cobertura media del objetivo
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6.1.6. Análisis 454 de secuenciación profunda.
Las reacciones de secuencia se realizaron en ADN extraído de células mononucleares, granulocitos, células tumorales microdiseccionadas con captura láser y leucocitos infiltrantes de tumor. Todas las reacciones de PCR se realizaron mediante el uso de cebadores de fusión específicos amplicón. Los cebadores de fusión contenían, junto a la secuencia específica de la plantilla, un cebador direccional en el extremo 5' de cebado seguido de un identificador multiplex para la identificación de la muestra del código de barras. Se mezclaron muestras de 6-8 pacientes diferentes, se procesaron para una secuenciación 454 profunda y se corrieron en un instrumento Genome Sequencer FLX. Los datos se mapearon con BWA MEM (ver 0.7.4) para el genoma humano completo. Se eliminaron múltiples lecturas de mapeo (MAPQ == 0) y luego los archivos bAm se procesaron para la recalibración de bases mediante el uso del kit de herramientas GATK (ver 3.1). Las mutaciones se nombraron mediante el uso del nombrador Haplotype que encontró solo dos eventos. Además, las acumulaciones de lectura se contaron en cada uno de los sitios de mutación conocidos para cada muestra para calcular la profundidad real tanto del alelo variante como el de referencia y para calcular la frecuencia de alelos no referenciales para cada sitio.
6.1.7. Detección de variantes.
Las lecturas terminadas en pares se alinearon con el genoma humano hg19 con BWA 0.6.2-r126 (Iyer, G., y otros, 2012, Science, 338: 221). La realineación local en las regiones indel y la recalibración de baseQ se realizó mediante el uso del paquete GATK versión 2.8-1 y siguiendo las recomendaciones de sus autores (McKenna, A., y otros, 2010, Genome Res, 20: 1297-1303). Las variantes en los pares de muestras diana tumoral- normal se nombraron con MuTect versión 1.1.4. Las variantes que pasan los filtros MuTect se anotaron como de alta confianza (HC). Las variantes que se detectaron mediante el algoritmo, pero que no pasaron los filtros MuTect se anotaron como de baja confianza (LC). Para las muestras de secuenciación de exoma completo, los SNP y los indeles se nombraron con HaplotypeCaller del paquete GATK versión 2.8-1. Las variantes que pasaron los filtros recomendados por GATK y no se informaron en ninguna de las dos muestras bucales que se analizaron a través del mismo proceso o se encontraron en dos o más bases de datos no somáticas (variantes no clínicas de dbSNP, proyecto de secuenciación del exoma NHLBI y el nuestra propia colección interna de tejidos normales) fueron anotados como HC. Otras variantes se informaron como LC.
6.1.8. Análisis de datos.
Un resumen del análisis genético se representa en la Figura 1. Brevemente, para las muestras de secuenciación del exoma completo, las variantes somáticas (ver Sección 6.1.7) se filtraron adicionalmente contra el panel de genes Hem-Capture (Tabla 3) y la lista de genes del panel IMPACT para identificar genes previamente reportados en neoplasias hematológicas y epiteliales, respectivamente. Las variantes identificadas que ocurren con una frecuencia > 10 % se muestran en la Tabla 4. No se aplicó un filtro de corte a las variantes que se describieron previamente en COSMIC (Catálogo de mutaciones somáticas en el cáncer). Las variantes confirmadas por las tres plataformas de secuenciación se consideraron mutaciones somáticas independientes de la frecuencia del alelo. Por el contrario, las variantes detectadas por dos plataformas solo se consideraron somáticas cuando ocurrieron con una frecuencia de alelos de 10 % o más, con la excepción de las variantes descritas previamente en COSMIC (sin corte aplicado) (Tabla 5 y Tabla 6).
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CM x
oc o
w
oc
N N
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Tabla 4. Variantes del descubrimiento identificadas por secuenciación del exorna
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Tabla 4. Variantes del descubrimiento identificadas por secuenciación del exoma Continuación
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Tabla 5. Mutaciones somáticas en enes cancerí enos conocidos
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Tabla 5. Mutaciones somáticas en enes cancerí enos conocidos Continuación
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Las mutaciones enumeradas en esta tabla fueron identificadas por dos o tres plataformas independientes con una frecuencia de alelos > 10 %. Se incluyeron mutaciones que ocurrieron a una frecuencia más baja si se informaron previamente en COSMIC.
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Las variantes resaltadas en negrita se describieron previamente en COSMIC. Indica variantes que alteran un codón previamente informado en COSMIC, pero dan como resultado una sustitución diferente del mismo aminoácido. No dirigido, gen específico no dirigido por la plataforma de secuenciación respectiva. Ref, nucleótido de referencia; alt, nucleótido alterado; Chr, cromosoma. Se muestran los datos de tres plataformas de secuenciación (pane1 Hem-Capture (Hem), IMPACT y datos de secuenciación de exoma completo).
6.2. Resultados:
Secuenciación de exoma de glóbulos blancos infiltrantes
Se obtuvieron muestras frescas de diecisiete cánceres de mama primarios no tratados (Tabla 1) y se realizó una clasificación de células activadas con fluorescencia para separar los leucocitos CD45 positivos de las células epiteliales CD45 negativas (Figura 2a). Los cánceres de mama no triple negativos que muestran un infiltrado linfocítico prominente en las biopsias centrales se incluyeron, además, en este estudio. Los pacientes con quimioterapia neoadyuvante no se estudiaron para excluir los efectos de la quimioterapia sobre la carga mutacional. De los 17 pacientes, 13 tenían cáncer de mama triple negativo, 2 tenían enfermedad ER-positiva, HER2-positiva, y 2 tenían enfermedad ER-positiva, HER2-negativa (Tabla 1). La secuenciación del exoma de estos leucocitos CD45 positivos que infiltran el tumor se realizó para investigar la presencia de mutaciones. Además, se analizaron muestras de hisopado bucal de cinco pacientes (1, 3, 5, 8 y 14) mediante secuenciación completa del exoma. A las muestras con una cantidad insuficiente de ADN se les amplificó el genoma completo (WGA) antes de otras aplicaciones posteriores. Se usó HaplotypeCaller (paquete GATK versión 2.8-1) para identificar las mutaciones presentes en leucocitos infiltrantes de tumor que no se han informado en muestras de línea germinal. Las variantes candidatas nombradas por GATK y que no estaban presentes en las muestras bucales que se analizaron a través del mismo proceso y no se anotaron como polimorfismos en las bases de datos SNP (ver Sección 6.1) se anotaron como variantes de alta confianza. Este enfoque identificó mutaciones candidatas en genes de cáncer conocidos, incluso en BCOR, NOTCH2, TET2, NF1, EZH2, y JAK1 (Figura 2b, Tabla 4). De importancia, las mutaciones en estos genes estaban previamente implicadas en la patogénesis de tumores malignos hematológicos. Los datos sugieren que las mutaciones en genes del cáncer conocidos están presentes en los glóbulos blancos que infiltran un subconjunto de cánceres de mama.
Confirmación de variantes identificadas mediante el uso de plataformas de secuenciación específicas
Aunque la secuenciación del exoma identificó mutaciones somáticas putativas en genes de cáncer conocidos en un subconjunto de cánceres de mama, la cobertura limitada puede limitar la capacidad de identificar mutaciones en los leucocitos infiltrantes. Por lo tanto, con el fin de obtener cobertura para los genes con roles conocidos en la transformación maligna y validar mutaciones putativas identificadas en la secuenciación del exoma, se realizó una secuencia basada en la captura de 20 muestras pareadas de ADN de leucocitos infiltrantes tumorales y muestras de ADN emparejado de la línea germinal (hisopado bucal) (Tabla 1). Se usaron dos plataformas basadas en captura que interrogan genes implicados en neoplasias hematopoyéticas (tabla 3 y sección 6.1) y en neoplasias epiteliales (lyer, G., y otros, 2012, Science, 338: 221). Las variantes somáticas identificadas por la secuenciación del exoma completo se filtraron adicionalmente contra los dos paneles de secuenciación específicos para garantizar que se identificaran las mismas variantes mediante el uso de una secuenciación de mayor cobertura. Todas las variantes confirmadas por tres plataformas de secuenciación y/o descritas previamente en COSMIC y que no se identificaron en el ADN de la línea germinal se puntuaron como somáticas independientemente de la frecuencia de alelos. Además, las variantes detectadas por dos plataformas de secuenciación y una frecuencia alélica > 10 % y no identificadas en ADN emparejado de línea germinal se puntuaron como mutaciones somáticas. Siguiendo estos criterios, identificamos mutaciones somáticas en 9 de los 20 pacientes (45 %; Tabla 5 y Tabla 6). Se realizó PCR y secuenciación 454 de alta cobertura en células de cáncer de mama diseccionadas con captura láser, se analizaron las mutaciones específicas que se detectaron. Dos mutaciones TP53 estaban presentes en las células de cáncer de mama purificadas, lo que sugiere que estas mutaciones se originaron a partir del clon epitelial maligno y se censuraron (Tabla 7). Por el contrario, el resto de las mutaciones no se identificaron en las células de cáncer de mama, en consistencia con su origen en el componente leucocitario. Estas mutaciones incluían mutaciones somáticas en genes de leucemia conocidos (DNMT3A TET2, BCOR, y TP53) que estaban presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor. Un subconjunto de mutaciones específicas se validó mediante el uso de ADN original, incluidas las mutaciones en TET2 (Paciente 4: TET2 p.Q1702*) y BCOR (Paciente 12: BCOR p.P1613L). Se identificaron las dos mutaciones TET2 probablemente patogénicas como un alelo sin sentido (TET2 p.Q1702*) y se identificó una mutación en un residuo altamente conservado en TET2 comúnmente mutado en neoplasias mieloides (TET2 p.E1874K). En tres pacientes se identificaron mutaciones en el correpresor transcripcional BCOR que está dirigido por mutaciones somáticas en la leucemia mieloide. Es importante tener en cuenta que la mayoría de estas mutaciones estaban presentes en al menos el 5-20 % de las lecturas. Esto sugiere que estas mutaciones estaban presentes en subclones enriquecidos y no eran alelos raros que ocurrían en una minoría de células madre hematopoyéticas como se informó previamente en donantes normales. Se identificó una mediana de 7 mutaciones/caso en los nueve pacientes con mutaciones somáticas (Tabla 6). Se identificaron mutaciones en los glóbulos blancos que infiltran tumores en todos los subtipos de cáncer de mama y estaban presentes independientemente de la extensión del infiltrado de leucocitos según lo evaluado por evaluación histopatológica (Tabla 1).
Tabla 7. Secuenciación profunda de células tumorales mamarias
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Análisis de secuenciación de leucocitos circulantes
La secuenciación de los leucocitos circulantes de estos pacientes se realizó a continuación. Se obtuvieron prospectivamente muestras de sangre periférica de 8 de los 10 pacientes en los que se habían identificado mutaciones somáticas en sus leucocitos infiltrantes de tumor de manera compatible con HIPAa y aprobado por IRB. Se detectaron dos mutaciones (Paciente 2: DNMT3A p. Y533C, Paciente 12: BCOR p.P1613L) en leucocitos circulantes (tanto células mononucleares como granulocitos). Las 19 mutaciones restantes no fueron detectables por secuenciación en leucocitos circulantes debido a los límites de la cobertura de secuenciación. Es de notar, la mutación en DNMT3A estuvo presente a una frecuencia de alelo variante reducida 25 veces en comparación con los leucocitos infiltrantes de tumor (Tabla 8). No puede excluirse que estas otras mutaciones estuvieran presentes en las células circulantes con baja carga alélica, o de manera alternativa o adicional, en las células madre/progenitoras de la médula ósea de estos pacientes. Sin embargo, estos datos demuestran que las mutaciones somáticas están altamente enriquecidas en los leucocitos infiltrantes de tumor en comparación con el compartimento hematopoyético general.
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Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método in vitro para determinar si un paciente que tiene un tumor de mama es susceptible a la terapia con un agente conocido o indicado para tratar la leucemia, el método que comprende determinar si el paciente tiene una o más mutaciones genéticas somáticas presentes en los leucocitos infiltrantes de tumor del tumor de mama, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en KDM5C, CDK8, MPL, ARID1A, FLT3, FGFR1, JAK1, GLI1, EZH2, EP300, BCOR, NF1, SMARCB1, EPHA10, IRF4, INSR, EPHA2, SMO, DUSP27, NOTCH2, HNF1A, MYO18A, MET, RPTOR, ATP10A, PTCH1, BRCA1, NCOR2, PASD1, NEB, MUC4, POU2F2, HLA-A, ALK, TET2, HLA-B, FGFR4, GATA2, FLT1, ATM, ITK, FREM2, INPP4B, CSF1R, PIGN, SOX17, MLL4, TTC28, TNFSF9, TRRAP, DNMT3A, TP53, IDH2, EPHA7, WT1, PNRC1, EGFR, ETV6, SMARCA4, MLL2, MAP3K1, ALOX12B, ARID2, EPHA8, ERBB2, EPHA4, PBRM1, BCL6, HDAC2, MLL, CYLD, CEBPA, JAK3, ASXL1, KIT, MEF2B y ERG y en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están en una región de codificación, y resultan en una sustitución de aminoácido o un codón de parada prematuro.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en BCOR, NOTCH2, TET2, NF1, EZH2, JAK1, DNMT3A, y TP53.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas están presentes en TET2, DNMT3A o ASXL1.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la una o más mutaciones genéticas somáticas se seleccionan del grupo que consiste en ALK p.A892T, ALK p.H1030P, ALK p.L1145V, ALK p.R1209Q, ALOX12B p.D492N, ARID1A p.Q1365K, ASXL1 p.G792D, ATM p.A1211T, ATM p.P1564S, ATM p.R2105S, ATP10A p.P35A, BCL6 p.K558M, BCOR p.P1156L, BCOR p.P1613L, BCOR p.P1648L, BCOR p.V2931, BRCA1 p.S1613G, CDK8 p.v1691, CEBPA p.A79T, CSF1R p.R216Q, CYLD p.G173C, DNMT3A p.T260N, DNMT3A p.Y533C, DUSP27 p.Q737L, DUSP27 p.T1124N, EGFR p.A871E, EP300 p.G1777C, EP300 p.M1972T, EP300 p.Q2355L, EP300 p.R1737H, EPHA2 p.E302G, EPHA7 p.G592S, EPHA10 p.L80Q, ERG p.P299L, ETV6 p.P25S, EZH2 p.A478S, EZH2 p.A483S, FGFR1 p.G205D, FGFR1 p.M731V, FGFR4 p.S776F, FLT1 p.V1331I, FLT3 p.P439S, FLT3 p.Q394*, FREM2 p.G1608D, GATA2 p.A286P, GLI1 p.G162C, HLA-A p.A270S, HLA-A p.E176V, HLA-B p.R155S, HNF1A p.A562V, IDH2 p.K205R, IDH2 p.W164L, INPP4B p.K816E, INSR p.R162S, IRF4 p.A370V, IRF4 p.M1461, ITK p.D510N, JAK1 p.S260G, JAK3 p.Q1094*, KDM5C p.A612T, KIT p.G126E, KIT p.G93S, MAP3K1 p.S1002F, MEF2B p.P197R, MEF2B p.P279S, MET p.Q165K, MLL p.A2061T, MLL p.K3846M, MLL2 p.E4152K, MLL2 p.H4930L, MLL4 p.S214P, MPL p.E54V, MUC4 p.A2025V, MYO18A p.A958V, NCOR2 p.A1706T, NEB p.Y1092C, NF1 p.A1670V, NF1 p.K1517M, NF1 p.N2775S, NF1 p.Q2434H, NOTCH2 p.A21T, NOTCH2 p.P1101T, NOTCH2 p.S1708P, PASD1 p.Q213E, PIGN p.T569N, PNRC1 p.R97Q, POU2F2 p.L459F, PTCH1 p.I685M, RPTOR p.V476M, SMARCA4 p.D694E, SMARCB1 p.N154K, SMO p.A379V, SOX17 p.G178R, TET2 p.E1874K, TET2 p.Q1702*, TNFSF9 p.A58S, TP53 p.M169I, TP53 p.R248L, TP53 p.R283P, TRRAP p.S1073G, TTC28 p.K2346Q y WT1 p.T273I.
5. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde los leucocitos infiltrantes de tumor son células CD45 positivas.
6. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente es imatinib, daunorubicina, citarabina, decitabina, azacitidina, etopósido, mercaptopurina, prednisona, idelalisib, ibrutinib o ABT-199.
7. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el agente es decitabina.
8. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el agente es azacitidina.
9. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el agente comprende un anticuerpo específico de leucocitos.
10. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el agente comprende un anticuerpo anti-CD45, un anticuerpo anti-CD33 o un anticuerpo anti-CD20.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, en donde el anticuerpo anti-CD20 es rituximab.
12. El método de conformidad con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo específico de leucocitos se conjuga con un fármaco citotóxico.
13. El método de conformidad con la reivindicación 12, en donde el agente es un anticuerpo anti-CD33 conjugado con caliqueamicina.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, en donde el agente es gemtuzumab ozogamicina.
15. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el paciente no ha recibido quimioterapia neoadyuvante.
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