JP7315724B2 - リシン置換を含むＲｏｍｏ１由来抗菌ペプチドおよびその変異体 - Google Patents

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Description

本発明は、Ｒｏｍｏ１タンパク質由来の抗菌ペプチドに関し、具体的には、Ｒｏｍｏ１タンパク質の２番目アルファヘリックス（α－ｈｅｌｉｘ２）領域のアミノ酸配列を有する多様なペプチドにおいてグラム陽性、グラム陰性、および多剤耐性バクテリアに対する抗菌活性を確認して、前記各ペプチドと各ペプチドを含む抗菌用組成物などを提供する。
バクテリア感染に対する治療手段として使用されている抗生剤の最も大きな問題点は、バクテリアの抗生剤耐性獲得である。英国政府のウェルカムトラスト報告書によれば、２０５０年には既存の抗生剤で治療できないスーパーバクテリアによって世界的に死亡者数が１，０００万人を超え、死亡原因においてスーパーバクテリア感染が癌を追い越す脅威になると見込まれる。
また、世界保健機関（ＷＨＯ）は、数多くの多剤耐性菌において危急段階（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｒｉｏｒｉｔｙ）にあるバクテリアとしては、カルバペネム耐性アシネトバクター菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、カルバペネム耐性緑膿菌（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびカルバペネム耐性腸内細菌属（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｓｐ．）菌種を選定し、最後の抗生剤として知られたカルバペネム系抗生剤に耐性を示すグラム陰性スーパーバクテリアを最優先に解決しなければならないと発表した。
一方、菌血症は、血液中に細菌が生きている場合をいい、感染の直接的または間接的な影響によって発生するのが敗血症である。すなわち、敗血症は人体に侵入した細菌が血液に感染することで現れる全身性炎症反応症侯群であって、感染後６時間経過後には生存率が３０％にならない疾病である。敗血症の原因菌は、連鎖状球菌、黄色ブドウ状球菌、大膓菌、肺炎菌、緑膿菌、真菌を含めて非常に多様であり、このような敗血症誘発原因菌の多様性によってその治療に困難がある。
現在まで、敗血症の治療は、主に免疫反応を抑制したり血液凝固を阻害するなど症状の緩和を目的とする治療が最善であり、根本的な治療のためには、初期に患者が感染した菌種の確認のための細菌の同定が必要であるが、上述のように、敗血症による即刻の全身炎症反応によって細菌の同定にかかる時間が確保できないという点に問題がある。また、仮に敗血症原因菌の同定に成功したとしても、その原因菌が抗生剤に対して耐性を有する多剤耐性バクテリアの場合、その治療に適切な薬物がないという点に問題がある。そこで、敗血症原因菌に対する同定なしに広範囲な細菌に対する抗菌活性を有する抗生剤の開発が必要であり、特に、多剤耐性バクテリアに対する抗菌活性を有する抗生物質の開発が要求されている。
上述のように、現在まで人類が使用している抗生剤の最も大きな問題点は、バクテリアの耐性獲得であり、これを解決するための多くの研究が進められており、特に、バクテリアの抗生剤耐性獲得を克服するために、抗菌ペプチド（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＡＭＰ）の開発が活発に進められている。動物または人間の防御タンパク質（ｈｏｓｔ ｄｅｆｅｎｓｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）由来の多様な抗菌ペプチドが開発されたが、人体免疫体系内で耐性獲得の可能性があり、血液内で短い半減期と人体に呈する毒性の問題および既存の抗生剤と比較して制限的な薬効を示すなどの問題があって実用化できないのが現状である。一例として、マガイニン（ｍａｇａｉｎｉｎ）は、１９９９年に米国で開発された抗菌ペプチドで、臨床第３相後にＦＤＡの承認を要請したが、その薬効が従来の抗生剤と比較して優れておらず承認が拒否された。また、２００３年にダプトマイシン（ｄａｐｔｏｍｙｃｉｎ）、２０１４年にオリタバンシン（ｏｒｉｔａｖａｎｃｉｎ）が米国食品医薬品局から承認を受けたが、両ペプチドとも、グラム陽性菌でのみ抗菌活性を示し、皮膚感染疾患にのみ適用できた。
上述のように、現在までその薬効と適用の制限によって、菌血症および敗血症などの細菌感染疾患の治療に適用可能な抗菌ペプチドは開発されておらず、本発明者らは、ミトコンドリア内膜に位置するＲｏｍｏ１タンパク質の２番目アルファヘリックス構造がグラム陽性、グラム陰性、および多剤耐性バクテリアで抗菌活性を示し、広範囲な細菌感染疾患の治療に適用できることを確認して、本発明を完成した。
WHO, Global Priority List of Antibiotic-Resistant Bacteria to Guide Research, Discovery, and Development of New Antibiotics (2017. 2. 27) Lee et al., J. Cell Biol., 217, 2059-2071, 2018
本発明が達成しようとする技術的課題は、リシン置換を含むＲｏｍｏ１タンパク質由来の抗菌ペプチドおよび前記ペプチドのアミノ酸の一部を置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させた、変形された抗菌ペプチドを提供することである。
また、本発明は、前記抗菌ペプチドを有効成分として含む抗生剤と前記抗菌ペプチドを含む食品および飼料添加剤、化粧料組成物、生物農薬、および抗菌用医薬部外品組成物を提供することを目的とする。
しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は上記の課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は以下の記載から当該技術分野における通常の技術者に明確に理解されるであろう。
一態様は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で構成されたＲｏｍｏ１タンパク質の配列のうち５２～７９番目アミノ酸領域から選択される任意のアミノ酸を基準としてカルボキシ（Ｃ－）末端方向に連続した７～２８個のアミノ酸配列を含む抗菌ペプチドを提供する。
一実施形態として、前記抗菌ペプチドを構成する１つ以上のアミノ酸配列が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）または欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）した抗菌ペプチドを提供する。
他の実施形態として、前記ペプチドは、配列番号２～１５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記ペプチドは、配列番号１６、３０、４０、および４５からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記配列番号１６のアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、配列番号１７～２９からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記配列番号３０のアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、配列番号３１～３９からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記配列番号４０のアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、配列番号４１～４４からなる群より選択されたいずれか１つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記配列番号４５のアミノ酸配列からなるペプチドは、例えば、配列番号４６～４７からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
さらに他の実施形態として、好ましくは、配列番号１７～２５、２７、３４、３７、３９、４２、および４４からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなるペプチドであってもよく、さらに好ましくは、配列番号２２、２３、および２４からなる群より選択される１つのアミノ酸配列を含むか、前記アミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列；または配列番号１３のアミノ酸配列に対して、下記の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む配列からなる抗菌ペプチドであってもよい。（ａ）は１番目アミノ酸ＫをＲに置換、（ｂ）は２番目アミノ酸ＴをＫまたはＲに置換、（ｃ）は５番目アミノ酸ＱをＫまたはＲに置換、（ｄ）は６番目アミノ酸ＳをＫ、Ｒ、またはＨに置換、（ｅ）は９番目アミノ酸ＴをＫまたはＲに置換、（ｆ）は１０番目アミノ酸ＦをＷに置換、（ｇ）は１６番目アミノ酸ＩをＬに置換、（ｈ）は２０番目アミノ酸ＩをＧまたはＬに置換であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記抗菌ペプチドは、少なくとも１つのメチオニンがノルロイシンまたはイソロイシンに置換されたものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記抗菌ペプチドは、３、４、５、７、８、９、１１、１７、１８、および１９番目アミノ酸のいずれか１つが欠損したか；または３または４番目アミノ酸、および７または８番目アミノ酸が欠損したものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記抗菌ペプチドは、Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列をさらに含み、前記Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列は、ＲまたはＫが１～３個繰り返す配列からなるものであってもよい。
他の態様は、配列番号２４のアミノ酸配列；または配列番号２４のアミノ酸配列において１番目のＫがＴに置換されるか、または１２番目アミノ酸ＴがＧに置換されたアミノ酸配列；または配列番号２４のアミノ酸配列において２番目アミノ酸がＴに置換されたアミノ酸配列からなる抗菌ペプチドを提供する。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、少なくとも１つのメチオニンがノルロイシンまたはイソロイシンに置換されたものであってもよい。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、下記の（ａ）～（ｓ）のいずれか１つの変異をさらに含むことができる。
（ａ）１～１２、１４～１５、１７～２１番目アミノ酸のいずれか１つのアミノ酸が欠損；（ｂ）１４番目アミノ酸欠損；および１～８、１２、１５、または１８番目アミノ酸が欠損；（ｃ）１４番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および１～８、１２、または１５番目アミノ酸欠損；（ｄ）１４番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；および１、２、または１２番目アミノ酸欠損；（ｅ）１または２番目アミノ酸欠損；３または４番目アミノ酸欠損；および１８番目アミノ酸欠損；（ｆ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；（ｇ）３または４番目アミノ酸欠損；１４番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および５、６、７、８、１２、または１５番目アミノ酸欠損；（ｈ）１４番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；１または２番目アミノ酸欠損；３、４、７、または８番目アミノ酸欠損；（ｉ）１、２、５、または６番目アミノ酸欠損；７、８、または１１番目アミノ酸欠損；１４または１５番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；（ｊ）５または６番目アミノ酸欠損；１１番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および１または２、３または４、７または８、１２、および１４番目のいずれか１つのアミノ酸欠損；（ｋ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、および１５番目アミノ酸欠損；（ｌ）１、２、５、または６番目アミノ酸欠損；３および４番目アミノ酸欠損；１４、および１８番目アミノ酸欠損；（ｍ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および７または８、１２番目、および１５番目のいずれか１つのアミノ酸欠損；（ｎ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損；（ｏ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および７または８、１２、および１５番目アミノ酸の中から選択された２個のアミノ酸欠損；（ｐ）１または２番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸が欠損；（ｑ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および１または２、７または８、１２、および１５番目アミノ酸の中から選択された３個
のアミノ酸欠損；（ｒ）１または２番目アミノ酸欠損；３または４番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損；（ｓ）１または２番目アミノ酸欠損；３および４番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、１０および１４番目アミノ酸対、または１４および１８番目アミノ酸対がステープル化されたものであってもよい。前記ステープル化は、アミノ酸対がペンテニルアラニンまたはオクテニルアラニンに置換されて相互架橋結合したものであってもよい。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列をさらに含むことができ、前記Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列は、ＲまたはＫが１～３個繰り返す配列からなるものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記ペプチドは、１つ以上のアミノ酸配列が変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）されたものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記変異は、ペギレーション（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）、アセチレーション（ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）、カルボキシレーション（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ）、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）、またはアミデーション（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記ペプチドを構成するアミノ酸は、それぞれ独立してＬ－型またはＤ－型のアミノ酸であってもよいし、放射線または蛍光ラベルされたアミノ酸類似体であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記ペプチドは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および多剤耐性菌からなる群より選択される１つ以上の細菌に対して抗菌活性を有することができる。
さらに他の実施形態として、前記グラム陽性菌は、ブドウ状球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、およびストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）からなる群より選択される１つの属（Ｇｅｎｕｓ）に属する細菌であってもよいし、好ましくは、前記グラム陽性菌は、黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトマイセスシンデネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｉｎｄｅｎｅｎｓｉｓ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、およびストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群より選択される１つ以上の細菌であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記グラム陰性菌は、大膓菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、およびエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）からなる群より選択される１つの属（Ｇｅｎｕｓ）に属する細菌であってもよいし、好ましくは、前記グラム陰性菌は、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびエンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）からなる群より選択される１つ以上の細菌であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記多剤耐性菌は、ペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ）、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）、テトラサイクリン系（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｓ）、またはグリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）に属する１種以上の抗生物質に対する耐性を有する前記グラム陽性菌またはグラム陰性菌であって、好ましくは、前記多剤耐性菌は、メチシリン耐性ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、多剤耐性シュードモナス属（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス属（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、多剤耐性クレブシエラ属（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、多剤耐性アシネトバクター属（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、およびバンコマイシン耐性ブドウ状球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）からなる群より選択される１つの属（Ｇｅｎｕｓ）に属する細菌であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記多剤耐性菌は、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、多剤耐性緑膿菌（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、多剤耐性アシネトバクターバウマニ（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、多剤耐性クレブシエラニューモニエ（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、バンコマイシン耐性エンテロコッカスフェシウム（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅ．ｆａｅｃｉｕｍ）、およびバンコマイシン耐性黄色ブドウ状球菌（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からなる群より選択される１つ以上の細菌であってもよい。
さらに他の実施形態として、前記多剤耐性緑膿菌は、ピペラシリン（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｉｎ）、ピペラシリンタゾバクタム（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｉｎ－ｔａｚｏｂａｃｔａｍ）、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、メロペネム（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、およびシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）からなる群より選択される１種以上の抗生剤に対する耐性を有するものであってもよいし、前記多剤耐性アシネトバクターバウマニは、ピペラシリン、ピペラシリンタゾバクタム、セフタジジム、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、アミカシン、シプロフロキサシン、およびセフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）からなる群より選択される１種以上の抗生剤に対する耐性を有するものであってもよく、前記多剤耐性クレブシエラニューモニエは、ピペラシリンタゾバクタム、セフタジジム、セフェピム、イミペネム、ゲンタマイシン、およびシプロフロキサシンからなる群より選択される１種以上の抗生剤に対する耐性を有するものであってもよい。
さらに他の実施形態として、前記バンコマイシン耐性エンテロコッカスフェシウムは、バンコマイシンのほかにも、リファンピン（ｒｉｆａｍｐｉｎ）、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、ストレプトマイシン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、およびアンピシリン（ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ）からなる群より選択される１種以上の抗生剤に対する耐性を追加的に有するものであってもよいし、前記バンコマイシン耐性黄色ブドウ状球菌は、バンコマイシンのほかにも、オキサシリン（ｏｘａｃｉｌｌｉｎ）、ベンジルペニシリン（ｂｅｎｚｙｌｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）、アンピシリン、およびセファゾリン（ｃｅｆａｚｏｌｉｎ）からなる群より選択される１種以上の抗生剤に対する耐性を追加的に有するものであってもよい。
他の態様は、前記抗菌ペプチドを有効成分として含む抗生剤を提供する。
さらに他の態様は、前記抗菌ペプチドを有効成分として含む細菌性感染疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
さらに他の態様は、前記抗菌ペプチドを個体に投与するステップを含む細菌性感染疾患の予防または治療方法を提供する。
さらに他の態様は、細菌性感染疾患の予防または治療用薬剤の製造のための前記抗菌ペプチドの用途を提供する。
一実施形態として、前記細菌性感染疾患は、皮膚感染、食中毒、中耳炎、膀胱炎、腹膜炎、尿路感染、乳房炎、肺炎、心内膜炎、結膜炎、関節炎、子宮内膜炎、腺疫、菌血症、敗血症、およびニキビからなる群より選択される１つ以上の疾病であってもよく、好ましくは、肺炎または敗血症であってもよい。
さらに他の態様は、前記抗菌ペプチドを含む抗菌用医薬部外品組成物、化粧料組成物、食品添加剤、および飼料添加剤を提供する。
本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体は、既存の抗生物質および抗生ペプチドより多様な種類の細菌に対して高い抗生能力を有することにより、細菌感染性疾患患者の血液内で多様な原因菌を初期に同時に除去することができる。特に、本発明のペプチドは、抗生剤耐性を有するバクテリアに対して高い抗菌能力を発揮し、既存の抗生剤適用の限界を超えて多剤耐性バクテリアによる感染性疾患の予防または治療剤として提供できる。また、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体は、耐性獲得の可能性が低く、毒性が低く、特に血液内で既存の抗菌ペプチドより高い抗菌能力があるという点から、広範囲な細菌性感染疾患の予防または治療を目的として医薬用、医薬部外用、食品および飼料添加用、農薬および化粧品添加用など多様な方面に利用されることが期待される。
ＫＵ－５８７８と従来の抗菌ペプチド（ＬＬ－３７、マガイニン２、およびダプトマイシン）とのグラム陽性およびグラム陰性バクテリアに対する抗菌活性を比較確認した図である。 ＫＵ－５８７８と従来の抗菌ペプチド（ＬＬ－３７、マガイニン２、およびダプトマイシン）との多剤耐性バクテリアに対する抗菌活性を比較確認した図である。 ＫＵ－５８７８と従来の抗生物質（イミペネム）とのグラム陽性およびグラム陰性バクテリアに対する抗菌活性を比較確認した図である。 ＫＵ－５８７８と従来の抗生物質（イミペネム）との多剤耐性バクテリアに対する抗菌活性を比較確認した図である。 ＫＵ－５８７８と従来の抗菌ペプチド（マガイニン２およびメリチン）とのヒト血管内皮由来細胞株（ＨＵＶＥＣ ｃｅｌｌ）に対する毒性を比較確認した図である。 ＫＵ－５８７８およびＫＵ－５８７８変異体（ＫＵ－５８７８－Ｋ４およびＫＵ－５８７８－Ｋ４－Ｄ）と従来の抗菌ペプチド（ＬＬ－３７、マガイニン２、およびメリチン）とのマウスの赤血球細胞に対する毒性を、赤血球溶血現象の程度により比較確認した図である。 ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＫＵ－５８７８の無毒性を、マウス体重の観察結果を通して確認した図である。
Ｒｏｍｏ１（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｍｏｄｕｌａｔｏｒ１）タンパク質は、ミトコンドリアの内膜に位置する膜タンパク質であって、ミトコンドリアの活性酸素の生成、ＴＮＦ－α信号伝達、細胞老化、癌の進行および浸潤、およびミトコンドリア内部のタンパク質輸送などに関与することが知られている。Ｒｏｍｏ１タンパク質の構造は２個のアルファヘリックスを含むタンパク質であって、１番目アルファヘリックス（α－ｈｅｌｉｘ１）は主に疎水性アミノ酸で構成されており、２番目アルファヘリックス（α－ｈｅｌｉｘ２）は親水性および疎水性の二面性を有する。
本発明者らは、Ｒｏｍｏ１タンパク質のα－ｈｅｌｉｘ１領域は水に溶けにくい性質を有するので研究から排除し、α－ｈｅｌｉｘ２領域のアミノ酸配列（５２－７９ａ．ａ．）を有する多様な長さのペプチドを合成してその抗菌活性を確認し、前記ペプチドの変異体から抗菌活性を確認して、本発明を完成した。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、Ｒｏｍｏ１タンパク質の５２－７９アミノ酸領域から選択される１つのアミノ酸を基準として、連続するアミノ酸配列を含みかつ、互いに長さが異なる数種のペプチドを合成し、緑膿菌および黄色ブドウ状球菌に対する前記各ペプチドの抗菌活性を、バクテリア殺菌最小濃度測定法を利用して確認した。その結果、Ｒｏｍｏ１タンパク質の５２－６２アミノ酸領域において任意のアミノ酸を基準として連続した１８個のアミノ酸配列を含むペプチドのすべてで緑膿菌と黄色ブドウ状球菌に対する抗菌活性を確認したが、なかでも特に、Ｒｏｍｏ１タンパク質の５８－７８アミノ酸配列を含むＫＵ－５８７８ペプチドで優れた抗菌活性を確認することができた（実施例１参照）。
このため、本発明者らは、Ｒｏｍｏ１由来抗菌ペプチドを提供する。
本明細書において、「Ｒｏｍｏ１由来ペプチド」は、配列番号１で表されるアミノ酸配列で構成されたＲｏｍｏ１タンパク質の５２－７９アミノ酸領域内の連続するアミノ酸配列を含むペプチドであり、「ペプチド」は、ペプチド結合によってアミノ酸残基が互いに結合して形成された線状の分子を意味する。前記Ｒｏｍｏ１由来ペプチドは、Ｒｏｍｏ１タンパク質を断片化して獲得することができ、当業界にて公知の化学的合成方法、特に固相合成技術または液相合成技術により製造できる。
さらに、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列で構成されたＲｏｍｏ１タンパク質の配列のうち５２～７９番目アミノ酸領域において任意のアミノ酸を基準として連続したアミノ酸配列を含むものであれば、その長さに限定されるものではないが、好ましくは７～２８ｍｅｒ、さらに好ましくは１８～２８ｍｅｒであってもよい。
より具体的には、前記抗菌ペプチドは、Ｒｏｍｏ１タンパク質の配列のうち５２－６２アミノ酸領域において任意のアミノ酸を基準として連続した１８個のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、好ましくは、配列番号２－１５からなる群、さらに好ましくは、配列番号５、８、９、１３、および１４からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸配列を含むものであってもよい。
本明細書において、アミノ酸配列は、Ｎ－末端からＣ－末端の順に並べられており、Ｒｏｍｏ１タンパク質の配列のうち特定領域から選択されるアミノ酸を基準として「連続するアミノ酸配列」とは、前記基準アミノ酸のＣ－末端方向に連続するアミノ酸配列を意味する。また、本明細書において、Ｒｏｍｏ１タンパク質の特定領域から選択される任意のアミノ酸を基準として連続する７～２８個のアミノ酸配列とは、前記Ｒｏｍｏ１タンパク質の特定領域から選択された基準アミノ酸を含み、前記基準アミノ酸のＣ－末端方向に連続するアミノ酸配列を含む計７～２８個のアミノ酸配列を意味する。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、前記Ｒｏｍｏ１由来抗菌ペプチドの適用範囲を確認するために、配列番号１３で表されるアミノ酸配列を含むＫＵ－５８７８ペプチドを代表に選定して、黄色ブドウ状球菌、枯草菌、腸内球菌、ストレプトマイセスシンデネンシス、エンテロコッカスフェカリス、ストレプトコッカスニューモニエ、大膓菌、クレブシエラニューモニエ、アシネトバクターバウマニ、緑膿菌、エンテロバクターアエロゲネス、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌、多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクターバウマニ、多剤耐性クレブシエラニューモニエ、バンコマイシン耐性エンテロコッカスフェシウム、およびバンコマイシン耐性黄色ブドウ状球菌に対する前記ペプチドの抗菌活性を確認した。その結果、本発明のＲｏｍｏ１由来抗菌ペプチドは、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および多剤耐性バクテリアのすべてで広範囲な抗菌活性を示すことが分かった（実施例２参照）。
また、より優れた抗菌活性を有するペプチドの探索のために、ＫＵ－５８７８を構成する各アミノ酸を、その性質によって、Ｘ１Ｘ１ＭＭＸ１Ｘ１ＧＧＸ１ＦＧＸ１ＦＭＡＩＧＭＧＩＲ（配列番号１６）、ＫＴＸ２Ｘ２ＱＳＧＧＴＦＧＴＦＸ２ＡＸ２ＧＸ２ＧＸ２Ｒ（配列番号３０）、ＫＴＭＭＱＳＧＧＴＸ３ＧＴＸ３ＭＡＩＧＭＧＩＲ（配列番号４０）、およびＫＴＭＭＱＳＸ４Ｘ４ＴＦＸ４ＴＦＭＸ４ＩＸ４ＭＸ４ＩＲ（配列番号４５）に区分して、各Ｘ１～Ｘ４のアミノ酸を置換したペプチドを合成してその抗菌活性を確認した。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、ＫＵ－５８７８ペプチドにおいて親水性残基を含むアミノ酸を正電荷を含むアミノ酸に置換する場合に抗菌活性の変化を確認した。ＫＵ－５８７８ペプチドにおいて親水性残基を含むアミノ酸の位置は、配列番号１６においてＸ１で表されており、Ｘ１位置のアミノ酸をそれぞれ独立して置換した。Ｒｏｍｏ１タンパク質のα－ｈｅｌｉｘ２領域において親水性アミノ酸を正電荷を含んでいるアミノ酸（Ｒ、Ｈ、またはＫ）または他の親水性アミノ酸（Ｔ、Ｓ、Ｑ、またはＮ）に置換する場合でその抗菌活性の変化を確認した。その結果、抗菌活性が維持されるか、それより優れた抗菌活性を示すことが分かった（実施例４－１参照）。
また、本発明の他の具体的な実施例において、本発明者らは、ＫＵ－５８７８ペプチドにおいてメチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を疎水性残基を含みその構造が類似するアミノ酸（Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＮｌｅ）に置換する場合と、疎水性残基を含むもののその構造が異なるアミノ酸（Ｆ、Ｙ、またはＷ）に置換する場合とでその抗菌活性の変化を確認した。ＫＵ－５８７８ペプチドにおいてメチオニン（Ｍ）およびイソロイシン（Ｉ）は、配列番号３０においてＸ２で表されており、Ｘ２位置のアミノ酸は、それぞれ独立して置換された。その結果、メチオニンをノルロイシン（Ｎｌｅ）に置換する場合にその抗菌活性が維持され、また、イソロイシンをトリプトファン（Ｗ）に置換する場合に抗菌活性が減少した。一方、イソロイシンをグリシンに置換する場合、抗菌活性が向上したペプチドが得られることを確認した（実施例４－３参照）。
また、本発明の他の具体的な実施例において、本発明者らは、ＫＵ－５８７８ペプチドにおいて疎水性残基を含むフェニルアラニン（Ｆ）を親水性アミノ酸またはその構造が類似する疎水性アミノ酸（Ｆ、Ｙ、またはＷ）、またはその構造が異なる疎水性アミノ酸（Ｍ、Ｌ、Ｉ、Ｖ、またはＮｌｅ）に置換する場合に、その抗菌活性の変化を確認した。ＫＵ－５８７８ペプチドにおいてフェニルアラニンは、配列番号４０においてＸ３で表されており、Ｘ３位置のアミノ酸は、それぞれ独立して置換された。その結果、フェニルアラニンをトリプトファン（Ｗ）に置換する場合、抗菌活性が向上したペプチドが得られることを確認した（実施例４－４参照）。
また、本発明の他の具体的な実施例において、本発明者らは、ＫＵ－５８７８においてアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）をそれぞれグリシンまたはアラニンに置換する場合に、抗菌活性の変化を確認した。ＫＵ－５８７８ペプチドにおいてアラニンとグリシンは、配列番号４５においてＸ４で表されており、Ｘ４位置のアミノ酸をそれぞれ独立して置換した。その結果、アラニンをグリシンに置換する場合、およびグリシンをアラニンに置換する場合、抗菌活性を示すが、ＫＵ－５８７８ペプチドと比較して減少した抗菌活性を示すことを確認した（実施例４－５参照）。
上記から、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドは、Ｒｏｍｏ１の５２－７９領域内において任意のアミノ酸を基準として連続する７－２８個のアミノ酸配列を含みかつ、その抗菌活性を示す範囲内で１つ以上のアミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を含むことができる。
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、ＫＵ－５８７８変異体の適用範囲を確認するために、ＫＵ－５８７８－Ｋ４を代表に選定し、多様な細菌に対する抗菌活性を確認した。その結果、ＫＵ－５８７８－Ｋ４も、ＫＵ－５８７８と同じく、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および多剤耐性バクテリアのすべてで広範囲な抗菌活性を示すことが分かった（実施例４－２参照）。
また、本発明者らは、具体的な実施例により、ＫＵ－５８７８およびＫＵ－５８７８－Ｋ４を構成するアミノ酸の一部または全部をＤ－型アミノ酸に置換したペプチドの場合にも、ＫＵ－５８７８と類似の抗菌活性を示し、特にウシ血清の存在下、ＫＵ－５８７８およびＫＵ－５８７８－Ｋ４の場合に抗菌活性が大きく減少するが、Ｄ－型アミノ酸に置換された変異体の場合に抗菌活性の減少幅が少ないことが分かった（実施例４－６参照）。
上記から、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドを構成するアミノ酸は、それぞれ独立してＬ－形態またはＤ－形態であってもよいし、各アミノ酸は、アミノ酸類似体、放射線ラベリングアミノ酸、または蛍光タグアミノ酸であってもよい。
一方、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドは、アミノ酸配列の一部部位を選定し、その活性を増加させるために、アミノ（Ｎ－）末端またはカルボキシ（Ｃ－）末端の変形を誘導することができる。このような変形により、本発明のペプチドは、生体内投与時の増加した半減期を有することができる。
本発明者らは、具体的な実施例により、Ｃ－末端がアミデーション（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）されたＫＵ－５８７８変異体の場合に抗菌活性が増加することを確認した（実施例５参照）。
したがって、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドのアミノ末端は、アセチル基、フルオレニルメトキシカルボニル基、ホルミル基、パルミトイル基、ミリスチル基、ステアリル基、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの保護基が結合可能であり、ペプチドのカルボキシ末端は、ヒドロキシ基（－ＯＨ）、アミノ基（－ＮＨ２）、アジド（－ＮＨＮＨ２）などに変形可能である。また、本発明のペプチドの末端またはアミノ酸のＲ－残基（Ｒ－ｇｒｏｕｐ）に脂肪酸（ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ）、糖鎖（ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｃｈａｉｎｓ）、すべてのナノ粒子（ゴールド粒子、リポソーム、ヘパリン、ヒドロゲルなど）、アミノ酸、担体タンパク質（ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）などを結合することができる。上述したアミノ酸の変形は、本発明のペプチドの力価（ｐｏｔｅｎｃｙ）と安定性を改善する作用をする。本明細書において、用語「安定性」は、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）の安定性だけでなく、保存安定性（常温、冷蔵、冷凍保管時の保存安定性を含む）も意味する。
一方、本発明のＲｏｍｏ１由来抗菌ペプチドは、これを構成する１つ以上のアミノ酸配列が欠失したペプチドであってもよい。上記により、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドを構成する１つ以上のアミノ酸を置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、変異（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、または欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）させたペプチドでも抗菌活性を確認できたことから、本発明は、Ｒｏｍｏ１由来ペプチド変異体を抗菌ペプチドとして提供することができる。
本発明において、「変異体」は、抗菌活性を示す範囲で前記Ｒｏｍｏ１由来ペプチドを構成する１つ以上のアミノ酸が置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、変異（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、および／または欠損（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）したペプチドを意味し、抗菌活性を示すものであれば、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドより優れた抗菌活性を示す変異体に制限されない。
本発明の抗菌ペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列；または配列番号１３のアミノ酸配列に対して、下記の（ａ）～（ｈ）の少なくとも１つのアミノ酸置換を含む配列からなるものであってもよい。
前記（ａ）は１番目アミノ酸ＫをＲに置換、（ｂ）は２番目アミノ酸ＴをＫまたはＲに置換、（ｃ）は５番目アミノ酸ＱをＫまたはＲに置換、（ｄ）は６番目アミノ酸ＳをＫ、Ｒ、またはＨに置換、（ｅ）は９番目アミノ酸ＴをＫまたはＲに置換、（ｆ）は１０番目アミノ酸ＦをＷに置換、（ｇ）は１６番目アミノ酸ＩをＬに置換、（ｈ）は２０番目アミノ酸ＩをＧまたはＬに置換であってもよい。実施例８および９によれば、本発明者は、ＫＵ－５８７８のアミノ酸配列を前記（ａ）～（ｈ）のいずれか１つに置換すれば、ペプチドの抗菌効果が向上することを確認した。
さらに他の実施形態として、前記抗菌ペプチドは、少なくとも１つのメチオニンがノルロイシンまたはイソロイシンに置換されたものであってもよい。ノルロイシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）は、メチオニンと比較すれば、硫黄（Ｓ）が炭素に置換されたことを除けば構造が同一であり、イソロイシンは、ノルロイシンと比較すれば、炭素数が同じアルキル置換基を有する共通点を有する。本発明者は、ＫＵ－５８７８のアミノ酸配列上にある４個のメチオニンのうち１～４個をノルロイシンに置換すれば抗菌活性が改善されることを確認した。（表１３参照）
さらに他の実施形態として、前記抗菌ペプチドは、３、４、５、７、８、９、１１、１７、１８、および１９番目アミノ酸のいずれか１つが欠損するか；または３または４番目アミノ酸、および７または８番目アミノ酸が欠損したものであってもよい。本願の実施例６、７によれば、ＫＵ－５８７８の３、４、５、７、８、９、１１、１７、１８、および１９番目アミノ酸のいずれか１つが欠損すると抗菌活性が増加し、ＫＵ－５８７８の一部のアミノ酸が置換されたペプチドに対しても同じ効果を期待することができる。
さらに他の実施形態として、前記抗菌ペプチドは、Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列をさらに含み、前記Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列は、ＲまたはＫが１～３個繰り返す配列からなるものであってもよい。実施例１０によれば、本発明者は、ＫＵ－５８７８のＣ末端にＲＲＲまたはＫＫからなるアミノ酸配列をさらに付加すると抗菌活性が増加することを確認した。
他の態様は、配列番号２４のアミノ酸配列；または配列番号２４のアミノ酸配列において１番目のＫがＴに置換されるか、または１２番目アミノ酸ＴがＧに置換されたアミノ酸配列；または配列番号２４のアミノ酸配列において２番目アミノ酸がＴに置換されたアミノ酸配列からなる抗菌ペプチドを提供する。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、少なくとも１つのメチオニンがノルロイシンまたはイソロイシンに置換されたものであってもよい。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、下記の（ａ）～（ｓ）のいずれか１つの変異をさらに含むことができる。
（ａ）１～１２、１４～１５、１７～２１番目アミノ酸のいずれか１つのアミノ酸が欠損；（ｂ）１４番目アミノ酸欠損；および１～８、１２、１５、または１８番目アミノ酸が欠損；（ｃ）１４番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および１～８、１２、または１５番目アミノ酸欠損；（ｄ）１４番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；および１、２、または１２番目アミノ酸欠損；（ｅ）１または２番目アミノ酸欠損；３または４番目アミノ酸欠損；および１８番目アミノ酸欠損；（ｆ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；（ｇ）３または４番目アミノ酸欠損；１４番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および５、６、７、８、１２、または１５番目アミノ酸欠損；（ｈ）１４番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；１または２番目アミノ酸欠損；３、４、７、または８番目アミノ酸欠損；（ｉ）１、２、５、または６番目アミノ酸欠損；７、８、または１１番目アミノ酸欠損；１４または１５番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；（ｊ）５または６番目アミノ酸欠損；１１番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および１または２、３または４、７または８、１２、および１４番目のいずれか１つのアミノ酸欠損；（ｋ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、および１５番目アミノ酸欠損；（ｌ）１、２、５、または６番目アミノ酸欠損；３および４番目アミノ酸欠損；１４、および１８番目アミノ酸欠損；（ｍ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および７または８、１２番目、および１５番目のいずれか１つのアミノ酸欠損；（ｎ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損；（ｏ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および７または８、１２、および１５番目アミノ酸の中から選択された２個のアミノ酸欠損；（ｐ）１または２番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸が欠損；（ｑ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および１または２、７または８、１２、および１５番目アミノ酸の中から選択された３個
のアミノ酸欠損；（ｒ）１または２番目アミノ酸欠損；３または４番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損；（ｓ）１または２番目アミノ酸欠損；３および４番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、１０および１４番目アミノ酸対、または１４および１８番目アミノ酸対がステープル化されたものであってもよい。前記ステープル化は、アミノ酸対がペンテニルアラニンまたはオクテニルアラニンに置換されて相互架橋結合したものであってもよい。
一具体例によれば、前記抗菌ペプチドは、Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列をさらに含むことができ、前記Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列は、ＲまたはＫが１～３個繰り返す配列からなるものであってもよい。
本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および多剤耐性バクテリアに対する抗菌活性を有していることから、本発明は、前記抗菌ペプチドを有効成分として含む細菌感染性疾患の予防または治療用薬学的組成物を提供することができる。
本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体が増殖および／またはその生長を妨げる前記グラム陽性菌の非制限的な例としては、ブドウ状球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、桿菌属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、およびストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）などがあり、好ましくは、黄色ブドウ状球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エンテロコッカスフェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、ストレプトマイセスシンデネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｉｎｄｅｎｅｎｓｉｓ）、エンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、および／またはストレプトコッカスニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）であってもよい。
また、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体が増殖および／またはその生長を妨げる前記グラム陰性菌の非制限的な例としては、大膓菌属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｓｐ．）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、およびエンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）などがあるが、好ましくは、大膓菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、アシネトバクターバウマニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、および／またはエンテロバクターアエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）であってもよい。
さらに、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体は、多剤耐性菌に対する抗菌活性を有していることから、Ｒｏｍｏ１由来ペプチドおよびその変異体が増殖および／またはその生長を妨げる前記多剤耐性菌は、ペニシリン系（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎｓ）、カルバペネム系（ｃａｒｂａｐｅｎｅｍｓ）、セファロスポリン系（ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎｓ）、キノロン系（ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ）、マクロライド系（ｍａｃｒｏｌｉｄｅｓ）、テトラサイクリン系（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｓ）、またはグリコペプチド系（ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅｓ）に属する１種以上の抗生物質に対する耐性を有する前記グラム陽性菌またはグラム陰性菌であってもよいし、好ましくは、メチシリン耐性ブドウ状球菌属（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、多剤耐性シュードモナス属（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス属（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、多剤耐性クレブシエラ属（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐ．）、多剤耐性アシネトバクター属（ｍｕｌｔｉｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、および／またはバンコマイシン耐性ブドウ状球菌属（ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）であってもよい。
本発明は、Ｒｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体を有効成分として含む薬学的組成物、すなわち抗生剤を提供することができ、本発明の薬学的組成物が予防または治療の対象とする「細菌性感染疾患」は、前記グラム陽性菌、グラム陰性菌、および／または多剤耐性菌の感染による疾患であってもよいし、好ましくは、前記細菌感染によって誘発される皮膚感染、食中毒、中耳炎、膀胱炎、腹膜炎、尿路感染、乳房炎、肺炎、心内膜炎、結膜炎、関節炎、子宮内膜炎、腺疫、菌血症、敗血症、および／またはニキビなどであってもよく、さらに好ましくは、敗血症または肺炎であってもよい。
また、本発明は、Ｒｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体を個体に投与するステップを含む細菌性感染疾患の予防または治療方法を提供する。
本発明において、「個体」とは、哺乳類であれば制限されないが、好ましくは、ヒトまたは家畜であってもよい。
本発明において、予防とは、本発明による薬学的組成物の投与によって前記グラム陽性菌、グラム陰性菌、および／または多剤耐性細菌の感染を遅延させるか、その感染による疾病の発病を遅延させるすべての行為を意味し、治療とは、本発明による薬学的組成物の投与によって前記細菌感染による症状が好転したり有利に変更されるすべての行為を意味する。
本発明において、薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、Ｒｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体のほかに公知の抗生物質を１種以上さらに含むことができ、薬学的組成物の製造に通常使用される適切な担体、賦形剤、および希釈剤をさらに含むことができる。
本発明において、「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、ビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）とも呼ばれ、細胞または組織内へのタンパク質またはペプチドの付加を容易にする化合物を意味するものであって、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は、生物体の細胞または組織内への多くの有機物の投入を容易にする通常使用される担体である。
本発明において、「希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）」とは、対象タンパク質またはペプチドの生物学的活性形態を安定化させるだけでなく、タンパク質またはペプチドを溶解させる水で希釈する化合物と定義される。バッファー溶液に溶解している塩は、当該分野にて希釈剤として使用される。通常使用されるバッファー溶液はホスフェートバッファー食塩水であり、これはヒト溶液の塩状態を模倣しているからである。バッファー塩は低い濃度で溶液のｐＨを制御できるため、バッファー希釈剤が化合物の生物学的活性を変形することは希である。これに使用されたアゼライン酸を含有する化合物は人間患者にそのものとして、または結合療法のように他の成分と共にまたは適当な担体や賦形剤と共に混合された薬剤学的組成物として、投与可能である。
また、本発明によるＲｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体を有効成分として含む細菌性感染疾患の予防または治療用薬学的組成物は、それぞれ通常の方法により、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの外用剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用可能であり、本発明の抗菌用組成物は、目的とする方法によって経口投与するか非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内または局所に適用）することができ、投与量は、患者の状態および体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、例えば、薬学的に許容可能な担体と混合された形態で約０．００１ｍｇ～１０００ｍｇ投与可能である。本発明の抗菌用組成物は、必要に応じて１日１回～数回に分けて投与することができ、単独で、または手術、ホルモン治療、薬物治療および生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用可能である。
また、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体は、細菌感染疾患の予防または改善を目的とする医薬部外品組成物を提供することができ、本発明の医薬部外品組成物は、他の医薬部外品または医薬部外品成分と共に使用可能であり、通常の方法により適宜使用可能である。前記医薬部外品組成物は、消毒清潔剤、シャワーフォーム、うがい薬、ウェットティッシュ、洗剤石鹸、ハンドウォッシュ、加湿器充填剤、マスク、軟膏剤、またはフィルタ充填剤などに利用可能であるが、これに限定されるものではない。
さらに、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体は、化粧料組成物の形態で提供できる。本発明による化粧料組成物の剤形は、スキンローション、スキンソフナー、スキントナー、アストリンゼント、ローション、ミルクローション、モイスチャーローション、栄養ローション、マッサージクリーム、栄養クリーム、モイスチャークリーム、ハンドクリーム、ファウンデーション、エッセンス、栄養エッセンス、パック、石鹸、クレンジングフォーム、クレンジングローション、クレンジングクリーム、ボディローションまたはボディクレンザーの形態であってもよい。本発明の化粧料組成物には、前記必須成分とともに、必要に応じて通常の化粧品に配合される他の成分と共に配合可能である。
同時に、本発明は、Ｒｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体を有効成分として含む食品組成物または飼料組成物を提供する。本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体を食品または飼料の添加物として使用する場合、前記Ｒｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体をそのまま添加するか他の食品、飼料、またはその成分と共に使用可能であり、通常の方法によって適宜使用可能である。有効成分の混合量は、使用目的（細菌の増殖および生長抑制による感染性疾患の予防、健康または治療的処置）によって好適に決定可能である。一般的に、飼料、食品または飲料の製造時、本発明のＲｏｍｏ１由来ペプチドおよび／またはその変異体は、原料に対して１５重量％以下、好ましくは１０重量％以下の量で添加される。しかし、健康および衛生を目的とするか、または健康調節を目的とする長期間の摂取の場合、前記量は前記範囲以下であってもよいし、安全性の面で何ら問題がないため、有効成分は前記範囲以上の量でも使用できる。前記食品および飼料の種類には特別な制限はない。
本発明では、アミノ酸配列をＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ命名法により、以下のように略語で記載した。
アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、アスパラギン（Ａｓｐ、Ｎ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）
本発明は、多様な変換が加えられて様々な実施例を有することができるが、以下、特定の実施例を図面に例示して詳細な説明に詳細に説明する。しかし、これは本発明を特定の実施形態に対して限定しようとするものではなく、本発明の思想および技術範囲に含まれるあらゆる変換、均等物乃至代替物を含むことが理解されなければならない。本発明を説明するにあたり、かかる公知の技術に関する具体的な説明が本発明の要旨をあいまいにしうると判断された場合、その詳細な説明を省略する。
［実施例］
実施例１．Ｒｏｍｏ１由来ペプチドの抗菌活性の確認および最適なペプチドの探索
Ｒｏｍｏ１タンパク質は２個のアルファヘリックス（α－ｈｅｌｉｘ）を含んでいる。本発明者らは、親水性および疎水性の二面性を有する２番目アルファヘリックス（α－ｈｅｌｉｘ２）領域を合成し、バクテリア殺菌最小濃度測定法（ｍｉｎｉｍｕｍ ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＭＢＣ）を利用してその抗菌活性を確認し、これをＫＵ－５２７９（Ｒｏｍｏ１タンパク質の５２－７９アミノ酸領域）と名付けた。次いで、人体適用に有利であり、抗菌活性に優れたペプチドを探索するために、Ｒｏｍｏ１タンパク質の５２－７９アミノ酸領域において任意のアミノ酸を基準として連続するアミノ酸配列を含む数種のペプチドを合成して、バクテリア殺菌最小濃度測定法により各ペプチドの抗菌活性を比較確認した（各ペプチドの情報は下記表１参照）。前記各ペプチドのバクテリア殺菌最小濃度測定法を利用した抗菌活性の確認は、具体的には下記のように行われた。
まず、緑膿菌（ＡＴＣＣ２７８５３）と黄色ブドウ状球菌（ＡＴＣＣ２９２１３）を３％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ）液体培地に３７℃、２００ｒｐｍの条件で４時間培養した後、再度同一の条件で５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度となるように３時間２次培養した。前記２次培養した各菌株の最終濃度が２×１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度となるようにＳＰ（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ：１０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１％ＴＳＢ）溶液で希釈して菌株溶液を用意した。
次いで、９６－ウェルマイクロプレートの各ウェルに濃度を異ならせて（０μｇ／ｍｌ～３００μｇ／ｍｌのペプチド）各ペプチドを分注し、前記用意された菌株溶液を１００μｌ（１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を入れて、混合して、３７℃恒温器で１時間反応させた。
そして、ＴＳ（Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ）３０ｇ／Ｌおよび寒天１５ｇ／Ｌを蒸留水に溶かし、滅菌した後、１００ｍｍの円形プレートに２５ｍｌを注いで、１日以上室温で固めて製造したＴＳ寒天プレートに前記ペプチドと菌株との反応溶液を１０μｌずつ一定の大きさに塗抹し、３７℃恒温器で１８時間培養した後、プレートでコロニーの生成を確認した。バクテリア殺菌最小濃度はコロニーがたった１つも生成されないペプチドの最小濃度と定義し、実験結果は下記表１の通りである。
Figure 0007315724000001
前記表１に示すように、ｐＣＭ１９とＫＵ－５２７９ペプチドは類似の殺菌力を示すが、ｐＣＭ１２の場合、低い殺菌力のため、バクテリア殺菌最小濃度測定法を利用して抗菌活性の測定が不可能であった。一方、２１個のアミノ酸残基で構成されているＫＵ－５８７８ペプチドの抗菌活性が最も優れており、ＫＵ－５８７８は、ＫＵ－５２７９より３倍優れた抗菌活性を有することを確認することができた。
実施例２．ＫＵ－５８７８の抗菌活性の確認
２－１．多様な細菌に対する抗菌活性の確認
前記実施例１で抗菌活性を確認したＲｏｍｏ１タンパク質の５２－７９アミノ酸領域またはその一部領域を含むペプチドが殺菌力を発揮する細菌の種類を確認するために、前記表１に示した合成ペプチドのうちＫＵ－５８７８を代表に選定して、下記表２に示した細菌に対する抗菌活性をバクテリア殺菌最小濃度測定法を利用して測定した。バクテリア殺菌最小濃度測定法は、前記実施例１の方法と同一である。
具体的には、各細菌を３％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ液体培地に３７℃、２００ｒｐｍの条件で４時間培養した後、再度同一の条件で５×１０６ＣＦＵ／ｍｌの濃度となるように３時間２次培養した。前記２次培養した各菌株の最終濃度が２×１０５ＣＦＵ／ｍｌの濃度となるようにＳＰ溶液で希釈して菌株溶液を用意した。
次いで、９６－ウェルマイクロプレートの各ウェルに濃度を異ならせて（０μｇ／ｍｌ～３００μｇ／ｍｌのペプチド）ＫＵ－５８７８ペプチドを分注し、前記用意された各菌株を１００μｌ（１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ）を入れて、混合して、３７℃恒温器で１時間反応させた。
そして、ＴＳ寒天プレートに前記ペプチドと菌株との反応溶液を１０μｌずつ一定の大きさに塗抹し、３７℃恒温器で１８時間培養した後、プレートでコロニーの生成を確認した。バクテリア殺菌最小濃度はコロニーがたった１つも生成されないペプチドの最小濃度と定義し、実験結果は下記表２の通りである。
一方、下記表２にて、多剤耐性緑膿菌、多剤耐性アシネトバクター、および多剤耐性クレブシエラは高麗大学アンアム病院の患者から分離した菌であって、多剤耐性緑膿菌の場合、ピペラシリン（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｉｎ）、ピペラシリンタゾバクタム（ｐｉｐｅｒａｃｉｌｉｎ－ｔａｚｏｂａｃｔａｍ）、セフタジジム（ｃｅｆｔａｚｉｄｉｍｅ）、イミペネム（ｉｍｉｐｅｎｅｍ）、メロペネム（ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ）、ゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ）、アミカシン（ａｍｉｋａｃｉｎ）、およびシプロフロキサシン（ｃｉｐｒｏｆｌｏｘａｃｉｎ）抗生剤に耐性を示し、多剤耐性アシネトバクターは、ピペラシリン、ピペラシリンタゾバクタム、セフタジジム、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、アミカシン、シプロフロキサシン、およびセフェピム（ｃｅｆｅｐｉｍｅ）抗生剤に耐性を示し、多剤耐性クレブシエラは、ピペラシリンタゾバクタム、セフタジジム、セフェピム、イミペネム、ゲンタマイシン、およびシプロフロキサシン抗生剤に耐性を示すことを確認し、実験に用いた。
Figure 0007315724000002
前記表２から確認できるように、ＫＵ－５８７８は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および多剤耐性バクテリアのすべてで広範囲な抗菌活性を示すことが分かった。
２－２．公知の抗菌ペプチドとＫＵ－５８７８の抗菌活性の比較確認
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗菌活性を確認したＫＵ－５８７８ペプチドがｉｎ ｖｉｖｏ、特に動物の血管内での細菌に対する殺菌力を効果的に発揮するかを確認するために、グラム陽性菌としては黄色ブドウ状球菌、グラム陰性菌としては緑膿菌、多剤耐性菌としてはメタシリン耐性黄色ブドウ状球菌および多剤耐性緑膿菌を代表に選定して、下記の実験を行った。
具体的には、黄色ブドウ状球菌、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌、緑膿菌、または多剤耐性緑膿菌を３％（ｗ／ｖ）ＴＳＢ液体培地に３７℃、２００ｒｐｍの条件で４時間培養した後、再度同一の条件で５×１０９ＣＦＵ／ｍｌの濃度となるように３時間２次培養した。前記２次培養した各菌株の最終濃度が１×１０５ＣＦＵ／μｌの濃度となるようにＰＢＳ溶液で希釈して菌株溶液を用意した。
次いで、１０週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の尾静脈に各菌株１００μｌを静脈注射（ＩＶ、Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を実施した。１時間後にＫＵ－５８７８を１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈注射した。対照群としてはＰＢＳを、陽性対照群としてはＬＬ－３７、マガイニン２、またはダプトマイシンをそれぞれ１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈注射した。
各薬物の静脈注射後４０分後にマウスの尾の端の約１ｃｍになる地点を手術用ハサミを用いて切断し、切断面の端の血液の１０μｌを採取してＰＢＳで希釈させた。希釈させた血液サンプルは予め用意したＴＳＢ寒天プレートに塗抹し、３７℃恒温器で１８時間培養した後、生成されたコロニーを計数して比較した。
その結果、図１および図２に示すように、マウス血管に残存するバクテリア数は薬物の静脈注射によって減少し、ＫＵ－５８７８の投与時に最も大きく減少することが分かった。上記から、ＫＵ－５８７８が抗菌活性を有することが公知のＬＬ－３７、マガイニン２、およびダプトマイシンより著しく優れた抗菌活性を示すことが分かった。
２－３．公知の抗生剤とＫＵ－５８７８の抗菌活性の比較確認
前記実施例２－２に続き、ｉｎ ｖｉｖｏにおけるＫＵ－５８７８ペプチドの抗菌活性を確認するために、グラム陽性菌としては黄色ブドウ状球菌、グラム陰性菌としては緑膿菌、クレブシエラニューモニエ、およびアシネトバクターバウマニ、多剤耐性菌としては多剤耐性緑膿菌、メチシリン耐性黄色ブドウ状球菌、多剤耐性クレブシエラニューモニエ、多剤耐性アシネトバクターバウマニを選定して、下記の実験を行った。
実験方法は前記実施例２－２の通りである。ただし、マウスに投与する各菌株の最終濃度は下記表３の通りであり、陽性対照群はマウスに前記各細菌を注射し、２４時間経過後にカルバペネム系抗生物質であるイミペネム３０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射（ＩＰ、Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）し、以後、１２時間間隔で計４回同量のイミペネムを腹腔投与した。各対照群と実験群の生存率を２４時間間隔で測定した。
Figure 0007315724000003
その結果、図３から確認されるように、グラム陽性またはグラム陰性バクテリアのみを注射したマウスの生存率は０－２０％、ＫＵ－５８７８を注射したマウスの場合は６０％、イミペネムを注射したマウスは約６０－８０％の生存率を示した。また、図４から確認できるように、多剤耐性バクテリアのみ注射したマウスは０－７％、ＫＵ－５８７８を注射したマウスの場合は６０－６７％、イミペネムを注射したマウスは７－２７％の生存率を示した。
実施例３．ＫＵ－５８７８の毒性の確認
前記実施例１および２でグラム陽性、グラム陰性、および多剤耐性細菌に対する殺菌力を確認したＲｏｍｏ１タンパク質の５２－７９アミノ酸領域またはその一部領域を含むペプチドが個体に適用可能であるかを確認するために、その毒性を測定しようとした。以下の実験では、前記表１に示した合成ペプチドのうちＫＵ－５８７８を代表に選定して、その毒性を確認した。
３－１．血管内皮細胞由来ヒューベック細胞（ＨＵＶＥＣ ｃｅｌｌｓ）に対する毒性の確認
ヒトの血管内皮細胞由来細胞株であるヒューベック細胞を９６－ウェルマイクロプレートに培養し、ＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｒｎ ｂｒｏｍｉｄｅ）試薬は２ｍｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳに溶かした後、０．２μｍ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｆｉｌｔｅｒで滅菌濾過して用意した。対照群としてＰＢＳを使用した。
ヒューベック細胞培地を新たに切り替え、ＫＵ－５８７８、メリチン、またはマガイニン２を濃度を異ならせて（０μｇ／ｍｌ～３００μｇ／ｍｌ）分注した。次いで、各ウェルにＭＴＴ試薬を１００μｌ処理し、３７℃で２時間恒温反応させた。次いで、細胞が分離されないように注意深く培地およびペプチドを除去し、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）１００μｌを添加し、分光光度計で５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。相対的細胞生存度を、対照群である非処理細胞の生存度の百分率として計算した。
その結果、図５から確認されるように、ＫＵ－５８７８はヒューベック細胞において非常に低い毒性を示すことが分かった。
３－２．赤血球に対する毒性の確認
血液赤血球をＰＢＳで希釈した後、９００ｇで１０分間３回繰り返し遠心分離して洗浄した。前記希釈した赤血球溶液（１０％ｖ／ｖ ＰＢＳ）を９６－ウェルマイクロプレートに１００μｌずつ分注し、ＫＵ－５８７８、ＫＵ－５８７８－Ｋ４、ＫＵ－５８７８－Ｋ４－Ｄ、メリチン、マガイニン２、またはダプトマイシンを添加し、２００μｌとなるようにＰＢＳで満たして、３７℃のインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）で１時間培養して反応させた。次いで、前記反応溶液の上層液を分離し、分光光度計を用いて５５０ｎｍの波長で吸光度を測定した。対照群としてＰＢＳと０．１％トリトンＸ－１００（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００）溶液を使用した。
前記吸光度の測定結果に基づき、下記の数式１により赤血球細胞の破壊程度を計算して、その結果を図６に示した。
Figure 0007315724000004
その結果、図６から確認されるように、ＫＵ－５８７８は、高い濃度でも溶血現象がほとんど現れないことを確認した。ＫＵ－５８７８と同じく、ＫＵ－５８７８－Ｋ４およびＫＵ－５８７８－Ｋ４－Ｄも、マガイニン２、ダプトマイシン、およびメリチンと比較して赤血球の溶血現象がほとんど現れないことから、赤血球に対する毒性が非常に底いことが分かった。
３－３．ｉｎ ｖｉｖｏにおける毒性の確認
Ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける無毒性を確認したＫＵ－５８７８ペプチドがｉｎ ｖｉｖｏ、特に動物（個体）の血管に注射した時、個体に毒性を呈しないかを確認するために、１０週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）の尾静脈にＫＵ－５８７８を１００ｍｇ／ｋｇの濃度で投与した。この時、注射用量の最大体積は１５０μｌであった。注射後１時間マウスの行動を観察し、以後、２４時間間隔で１２日間マウスの体重変化を測定した。
その結果、ＫＵ－５８７８を投与したマウスはすべて生存し、図７に示すように、ＫＵ－５８７８はマウスの体重には全く影響を与えないことを確認することができた。
実施例４．ＫＵ－５８７８を構成する一部のアミノ酸が置換されたペプチドの抗菌活性の確認
４－１．配列番号１６のアミノ酸配列を含むＫＵ－５８７８変異体の抗菌活性の確認
次いで、より抗菌活性に優れたペプチドを探索するために、ＫＵ－５８７８の親水性残基を含むアミノ酸を正電荷を含んでいるリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）に置換した後、その変異体の抗菌活性をバクテリア殺菌最小濃度測定法を利用して比較確認した。実験は前記実施例１と同様の方法で行った。ＫＵ－５８７８変異体の具体的な情報および各細菌に対するＭＢＣ値は下記表４に示した。
Figure 0007315724000005
前記表４から確認できるように、Ｒｏｍｏ１タンパク質の５９、６２、６３、または６６番目アミノ酸をリシンに置換したペプチドと５９番目アミノ酸をアルギニンに置換したペプチドが、ＫＵ－５８７８より抗菌活性に優れていることが分かった。また、Ｒｏｍｏ１タンパク質の５８番目アミノ酸をアルギニンに置換したＫＵ－５８７８変異体も、ＫＵ－５８７８と類似の抗菌活性を示すことが分かった。上記の結果から、Ｒｏｍｏ１タンパク質のα－ｈｅｌｉｘ２領域における親水性アミノ酸を正電荷を含んでいるアミノ酸、特にリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）に置換する場合も、類似の抗菌活性を示すか、より優れた抗菌活性を示すことができることが分かる。
上記の結果から、Ｒｏｍｏ１タンパク質のα－ｈｅｌｉｘ２領域における親水性アミノ酸を正電荷を含んでいるアミノ酸、特にリシン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）に置換する場合も、類似の抗菌活性を示すか、より優れた抗菌活性を示すことができることが分かる。
４－２．ＫＵ－５８７８－Ｋ４の多様な細菌に対する抗菌活性の確認
前記実施例４－１で抗菌活性を確認したＫＵ－５８７８変異体が殺菌力を発揮する細菌の種類を確認するために、前記表４に示したＫＵ－５８７８変異体のうちＫＵ－５８７８－Ｋ４を代表に選定して、下記表５に示した細菌に対する抗菌活性をバクテリア殺菌最小濃度測定法を利用して測定した。バクテリア殺菌最小濃度測定法は前記実施例１の方法と同様に行った。
Figure 0007315724000006
前記表５から確認できるように、ＫＵ－５８７８－Ｋ４は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、および多剤耐性バクテリアのすべてで広範囲な抗菌活性を示すことが分かった。
４－３．配列番号３０のアミノ酸配列を含むＫＵ－５８７８変異体の抗菌活性の確認
前記実施例４－１でＫＵ－５８７８の親水性残基を正電荷を含むアミノ酸に置換する場合にも、その抗菌活性が維持されるか、より優れた抗菌活性を示すことを確認し、次いで、ＫＵ－５８７８の疎水性残基を含み残基の構造が類似するメチオニン（Ｍ）またはイソロイシン（Ｉ）を親水性または残基の構造が異なるアミノ酸に置換した後、抗菌活性を殺菌最小濃度測定法を利用して比較確認した。実験は前記実施例１と同様の方法で行った。ＫＵ－５８７８変異体の具体的な情報および各細菌に対するＭＢＣ値は下記表６に示した。
Figure 0007315724000007
前記表６から確認できるように、ＫＵ－５８７８において疎水性残基を含み残基の構造が類似するメチオニンまたはイソロイシンのうちの１個を親水性アミノ酸に置換した場合、抗菌活性が減少した。これに対し、メチオニンを類似の残基構造を有するノルロイシン（Ｎｌｅ）に置換する場合、抗菌活性の変化が大きくなかった。また、イソロイシンをグリシン（Ｇ）に置換する場合、抗菌活性が増加することが分かった。
４－４．配列番号４０のアミノ酸配列を含むＫＵ－５８７８変異体の抗菌活性の確認
次いで、ＫＵ－５８７８の抗菌活性に相応するか、それを上回る抗菌活性を有するＫＵ－５８７８変異体を探索するために、ＫＵ－５８７８において疎水性残基を含むフェニルアラニン（Ｆ）を親水性または残基の構造が異なるアミノ酸に置換した後、抗菌活性を殺菌最小濃度測定法を利用して比較確認した。実験は前記実施例１と同様の方法で行った。ＫＵ－５８７８変異体の具体的な情報および各細菌に対するＭＢＣ値は下記表７に示した。
Figure 0007315724000008
その結果、表７から確認できるように、ＫＵ－５８７８において疎水性残基を含む６７番フェニルアラニンを類似の残基構造を有するトリプトファンに置換する場合、抗菌活性が増加することが分かった。
４－５．配列番号４５のアミノ酸配列を含むＫＵ－５８７８変異体の抗菌活性の確認
前記実施例４－４に続き、ＫＵ－５８７８においてアラニン（Ａ）またはグリシン（Ｇ）をそれぞれグリシンまたはアラニンに置換した後、抗菌活性を殺菌最小濃度測定法を利用して比較確認した。実験は前記実施例１と同様の方法で行った。ＫＵ－５８７８変異体の具体的な情報および各細菌に対するＭＢＣ値は下記表８に示した。
Figure 0007315724000009
その結果、前記表８から確認できるように、ＫＵ－５８７８においてアラニンをグリシンに置換またはグリシンをアラニンに置換したペプチドは抗菌活性を示してはいるものの、ＫＵ－５８７８と比較して減少した抗菌活性を示すことが分かった。
４－６．ＫＵ－５８７８およびＫＵ－５８７８－Ｋ４を構成するアミノ酸の一部または全部をＤ－型アミノ酸に置換したペプチドの抗菌活性の確認
前記実施例１～５に続き、ＫＵ－５８７８およびＫＵ－５８７８－Ｋ４を構成するアミノ酸をＤ－型アミノ酸に置換したペプチド（ＫＵ－５８７８－Ｄ（ａｌｌ）およびＫＵ－５８７８－Ｋ４－Ｄ）を合成してその抗菌活性を比較確認した。ＫＵ－５８７８－Ｋ４－Ｄは、ＫＵ－５８７８－Ｋ４において５９番、６２番、６３番、６６番リシンアミノ酸残基をＤ－形態のアミノ酸に置換したペプチドであり、ＫＵ－５８７８－Ｄ（ａｌｌ）は、ＫＵ－５８７８のすべてのアミノ酸をＤ－形態のアミノ酸に置換したペプチドである。
ウシ血清（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ）の有無を異ならせて、前記実施例１の方法と同様に各ペプチドの殺菌最初濃度の測定を行って、その結果を下記表９に示した。
Figure 0007315724000010
前記表９から確認できるように、ウシ血清を追加した抗菌活性実験でＫＵ－５８７８とＫＵ－５８７８－Ｋ４は抗菌活性が低くなったが、ＫＵ－５８７８－Ｋ４－Ｄの場合、ＫＵ－５８７８－Ｋ４と比較して抗菌活性の減少幅が少ないことが分かった。
実施例５．ＫＵ－５８７８を構成する一部のアミノ酸が変異したペプチドの抗菌活性の確認
ＫＵ－５８７８の優れた抗菌活性とより高い安定性を有するペプチドを探索するために、ＫＵ－５８７８のＣ－末端をアミデーション（ａｍｉｄａｔｉｏｎ）後、ペプチドの抗菌活性をバクテリア殺菌最小濃度測定法を利用して比較確認した。実験は前記実施例１と同様の方法で行った。ＫＵ－５８７８変異体の具体的な情報および各細菌に対するＭＢＣ値は下記表１０に示した。
Figure 0007315724000011
前記表１０から確認できるように、ＫＵ－５８７８の末端が変異したペプチドの場合、抗菌活性が増加することが分かった。
実施例６．ＫＵ－５８７８において１個のアミノ酸が欠損したペプチドの抗菌活性評価
ＫＵ－５８７８（配列番号１３）のアミノ酸配列に対して１個のアミノ酸を欠損させた変異体を作製し、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１１に開示されている。
その結果、ＫＵ０５８７８のアミノ酸の順序を５８番～７８番にすれば、６０、６１、６２、６４、６５、６６、６８、７４、７５、または７６番目アミノ酸が欠損した場合、抗菌活性が増加した。同一のアミノ酸が連続していることを考慮すれば、６１番目のＭの欠損は６０番目のＭの欠損と同一であり、６５番目のＧの欠損は６４番目のＧの欠損と同一である。
配列番号１３を基準とすれば、３、４、５、７、８、９、１１、１７、１８、または１９番目アミノ酸が欠損した場合、抗菌活性が増加した。
Figure 0007315724000012
実施例７．ＫＵ－５８７８において２個以上のアミノ酸が欠損したペプチドの抗菌活性評価
ＫＵ－５８７８（配列番号１３）のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１２に開示されている。
６０番目のＭ、６４番目のＧを欠損させた場合を除いて大部分抗菌活性が低下した。同一のアミノ酸が連続していることを考慮すれば、６０番目のＭの欠損は６１番目のＭの欠損と同一であり、６４番目のＧの欠損は６５番目のＧの欠損と同一である。
配列番号１３を基準とすれば、３または４番目アミノ酸が欠損し、７または８番目アミノ酸が欠損した場合、抗菌活性が増加した。
Figure 0007315724000013
実施例８．ＫＵ－５８７８において１個のアミノ酸が置換されたペプチドの抗菌活性評価
ＫＵ－５８７８（配列番号１３）のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸を置換させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１３に開示されている。
配列番号１３を基準とすれば、１番目アミノ酸ＫをＲに置換、２番目アミノ酸ＴをＫまたはＲに置換、５番目アミノ酸ＱをＫまたはＲに置換、６番目アミノ酸ＳをＫ、Ｒ、またはＨに置換、９番目アミノ酸ＴをＫまたはＲに置換、１０番目アミノ酸ＦをＷに置換、１６番目アミノ酸ＩをＬに置換、２０番目アミノ酸ＩをＧまたはＬに置換した場合、抗菌活性が増加した。
また、下記表１３のＫＵ－５８７８－４Ｎｌｅを参照すれば、ＫＵ－５８７８の４個のメチオニンをすべてノルロイシン（Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ）に置換した結果、抗菌活性が改善されたことを確認した。これは、メチオニンとノルロイシンが硫黄が炭素に変更されたことを除けば、構造が同一であるためと推測される。
Figure 0007315724000014
Figure 0007315724000015
実施例９．ＫＵ－５８７８において５９番アミノ酸置換に基づく多置換ペプチドの抗菌活性の確認
Ｕ－５８７８－Ｔ５９Ｋアミノ酸配列に対してＱ６２Ｋ、Ｓ６３Ｋ、Ｔ６６Ｋの置換を順次に追加し、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１４に開示されている。
前記Ｔ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｓ６３Ｋ、Ｔ６６Ｋの置換位置は、配列番号１３を基準として２、５、６、９番目アミノ酸に相当する。
Figure 0007315724000016
実施例１０．Ｃ末端にアミノ酸配列追加されたＫＵ－５８７８の抗菌活性の確認
ＫＵ－５８７８のＣ末端にアミノ酸の繰り返し配列を追加し、抗菌活性度を評価した。下記表１５によれば、ＫＵ－５８７８のＣ末端にＲ（ａｒｇｉｎｉｎｅ）繰り返し配列またはＫ（ｌｙｓｉｎｅ）配列を付加すると抗菌活性が増加した。
Figure 0007315724000017
実施例１１．ＫＵ－５８７８－Ｋ４変異体の抗菌活性の確認
ＫＵ－５８７８の配列においてＴ５９Ｋ、Ｑ６２Ｋ、Ｓ６３Ｋ、およびＴ６６Ｋの変異を有するＫＵ－５８７８－Ｋ４に基づくアミノ酸変異時、抗菌活性の変化を確認した。ＫＵ－５８７８－Ｋ４は以下にＫ４と略称することができる。
Ｋ４の配列は配列番号２４に開示されている。下記表１６にて、Ｋ４－Ｋ５８Ｔは、配列番号２４における１番目アミノ酸がＴに置換されたペプチドを意味し、Ｋ４－４ＭＩは、Ｋ４の配列に存在する４個のメチオニンのすべてがイソロイシンに置換されたペプチドを意味し、Ｋ４－Ｔ６９Ｇは、配列番号２４における１２番目アミノ酸がＧに置換されたペプチドを意味する。これらはすべてＫＵ－５８７８より抗菌活性が高かった。
Figure 0007315724000018
実施例１２．１個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して１つのアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１７に開示されている。
下記表１７によれば、配列番号２４の１番目～１２番目アミノ酸、１４～１５番目アミノ酸、１７～２１番目アミノ酸のうちの１つのアミノ酸が欠損した場合、５８７８より抗菌活性が高かった。
Figure 0007315724000019
実施例１３．２個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して２個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１８に開示されている。
下記表１８によれば、配列番号２４の１４番目アミノ酸が欠損し、１～８、１２、１５、および１８番目アミノ酸のいずれか１つのアミノ酸がさらに欠損した場合、５８７８より抗菌活性が高かった。
Figure 0007315724000020
実施例１４．３個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して３個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表１９に開示されており、５８７８より抗菌活性が高かった。
Figure 0007315724000021
実施例１５．４個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して４個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表２０に開示されている。
Figure 0007315724000022
実施例１６．５個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して５個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表２１に開示されている。
Figure 0007315724000023
実施例１７．６個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して６個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表２２に開示されている。
Figure 0007315724000024
実施例１８．７個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して７個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表２３に開示されている。
Figure 0007315724000025
実施例１９．８個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して８個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表２４に開示されている。
Figure 0007315724000026
実施例２０．９個のアミノ酸が欠損したＫ４ペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して９個のアミノ酸を欠損させ、抗菌活性を評価した。抗菌活性評価は下記表２５に開示されている。
Figure 0007315724000027
実施例２１．ペギル化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）されたＫ４の抗菌活性の確認
４個のアミノ酸が欠失したＫ４および８個のアミノ酸が欠失したＫ４をペギル化させ、抗菌活性を測定した。
下記表２６によれば、抗菌活性はペギル化前よりはやや減少したものの、５８７８よりははるかに優れた抗菌活性を示すことを確認した。
Figure 0007315724000028
実施例２２．ステープルペプチドの抗菌活性
Ｋ４のアミノ酸配列に対して２番目アミノ酸をＴに置換し（以下、Ｋ４－Ｋ５９Ｔと称することができる）、抗菌活性を評価した。
Ｋ４－Ｋ５９Ｔは配列番号２３のＫ３と比較すれば、２番目アミノ酸および９番目アミノ酸配列において差異がある他の配列である。下記表２７にて、ステープル化（ｓｔａｐｌｅｄ）は、一対のアミノ酸がペンテニルアラニンまたはオクテニルアラニンに置換され、これらが互いに架橋結合した場合を意味する。ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－１は１０および１４番目アミノ酸対がペンテニルアラニン（Ｓ５と表示）に置換されて相互架橋結合したものであり、ｓｔａｐｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ－２は１４および１８番目アミノ酸対がペンテニルアラニンに置換されて相互架橋結合したものである。
Ｋ４－Ｋ５９Ｔおよびステープル化されたＫ４－Ｋ５９Ｔに対する抗菌活性評価は下記表２７に開示されている。
Figure 0007315724000029
実施例２３．Ｃ末端に配列が付加されたＫ４変異体の抗菌活性の確認
Ｋ４の２欠失変異体のＣ末端またはＫ４の４欠失変異体のＣ末端にＲまたはＫアミノ酸を付加し、抗菌活性を測定した。下記表２８によれば、ＲまたはＫの単独または繰り返し配列が付加されたペプチドは抗菌活性が増加した。
Figure 0007315724000030
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されるものではないことは自明であろう。したがって、本発明の実質的な範囲は添付した請求項とそれらの等価物によって定義される。

Claims (6)

  1. 配列番号２４のアミノ酸配列；
    配列番号２４のアミノ酸配列において１番目アミノ酸ＫがＴに置換されるか、または１２番目アミノ酸ＴがＧに置換されたアミノ酸配列；または
    配列番号２４のアミノ酸配列において２番目アミノ酸がＴに置換されたアミノ酸配列からなる抗菌ペプチド。
  2. 請求項１に記載の抗菌ペプチドにおいて少なくとも１つのメチオニンがイソロイシンに置換された、抗菌ペプチド。
  3. 請求項１に記載の抗菌ペプチドにおいて下記の（ａ）～（ｓ）のいずれか１つの変異をさらに含む、抗菌ペプチド：
    （ａ）１～１２、１４～１５、１７～２１番目アミノ酸のいずれか１つのアミノ酸が欠損、
    （ｂ）１４番目アミノ酸欠損；および１～８、１２、１５、または１８番目アミノ酸が欠損、
    （ｃ）１４番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および１～８、１２、または１５番目アミノ酸欠損、
    （ｄ）１４番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；および３、４、または１２番目アミノ酸欠損、
    （ｅ）１または２番目アミノ酸欠損；３または４番目アミノ酸欠損；および１８番目アミノ酸欠損、
    （ｆ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損、
    （ｇ）３または４番目アミノ酸欠損；１４番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および５、６、７、８、１２、または１５番目アミノ酸欠損、
    （ｈ）１４番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；１または２番目アミノ酸欠損；および３、４、７、または８番目アミノ酸欠損、
    （ｉ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；１４または１５番目アミノ酸欠損；および１８番目アミノ酸欠損、
    （ｊ）５または６番目アミノ酸欠損；１１番目アミノ酸欠損；１５番目アミノ酸欠損；１８番目アミノ酸欠損；および１または２、３または４、７または８、１２、および１４番目のいずれか１つのアミノ酸欠損、
    （ｋ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、および１５番目アミノ酸欠損、
    （ｌ）５または６番目アミノ酸欠損；３および４番目アミノ酸欠損；および１４、および１８番目アミノ酸欠損、
    （ｍ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および７または８、１２、および１５番目のいずれか１つのアミノ酸欠損、
    （ｎ）１または２番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損、
    （ｏ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および７または８、１２、および１５番目アミノ酸の中から選択された２個のアミノ酸欠損、
    （ｐ）１または２番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸が欠損、
    （ｑ）３、４、１４、および１８番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；および１または２、７または８、１２、および１５番目アミノ酸の中から選択された３個のアミノ酸欠損、
    （ｒ）１または２番目アミノ酸欠損；３または４番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損、
    （ｓ）１または２番目アミノ酸欠損；３および４番目アミノ酸欠損；５または６番目アミノ酸欠損；７または８番目アミノ酸欠損；および１２、１４、１５、および１８番目アミノ酸欠損。
  4. 請求項１に記載の抗菌ペプチドにおいて１０および１４番目アミノ酸対、または１４および１８番目アミノ酸対がステープル化された、抗菌ペプチド。
  5. 前記ステープル化は、アミノ酸対がペンテニルアラニンまたはオクテニルアラニンに置換されて相互架橋結合したものである、
    請求項４に記載の抗菌ペプチド。
  6. 請求項１に記載の抗菌ペプチドにおいてＣ末端に連結されたアミノ酸配列をさらに含み、
    前記Ｃ末端に連結されたアミノ酸配列は、ＲまたはＫが１～３個繰り返す配列からなるものである、抗菌ペプチド。
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