JP7308800B2 - スマートフォンｐｃｒデバイス - Google Patents

Description

本発明は、病原体を含有することが疑われる試料のような、生体試料を分析する分野に属する。この分野において、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を従来のスマートフォンと組み合わせて実行するデバイスおよび方法に関する。

近年、ポイント・オブ・ケア（ＰｏＣ）診断が増々重要となり、関心が寄せられている。多くの場合時間がかかり管理面で要求が厳しい患者試料の集中実験室への輸送の代わりに、または、例えば、病院のような、そのような現場において試料を採取する代わりに、より素早く効率的に診断結果を得ることは、多くの場合有利である。一例をあげるとすると、その場診断(in-situ diagnosis)であり、患者試料の採取から診断結果の送出まで、医師の診療室においてＰｏＣデバイスを使用して行われ、経済的に手頃であり、比較的扱いが容易である。また、このような手法は、潜在的にどこででも必要になる可能性がある、試料素材の集中実験室への発送に伴う、安定性の問題による試料劣化を含む、危険性を根絶する。

しかしながら、既存のＰｏＣデバイスは高または中スループットのアナライザ、あるいは統合型モジュラー実験室システムよりも通常小型であるが、毎日の状況で、即ち、医療現場の外側でこれらを利用可能にするには、大抵の場合未だ大き過ぎる。更に、このようなデバイスは、バッテリで給電し、したがって外部電源に頼らないのが理想的である。

これらの問題を解決するための当技術分野における手法の１つは、スマートフォンの使用を必要としている。何故なら、これらのデバイスは現在の社会において最も遍在するからである。これらは、携帯性および外部電源からの独立を含む、以上で明記した要件を満たす。実例を上げると、ＷＯ２０１７／０２５９８４は、等温リガーゼ仲介核酸増幅を実行するために、スマートフォンと共に使用するためのデバイスを開示する。このデバイスは従来のスマートフォンの特定のコンポーネントを活用するが、それでもなお、幅広い使用とは矛盾するとも言えるレベルの複雑さを呈する。例えば、この引用例において開示されているデバイスの特定のエレメントのために、医師の診療所における医療用員ではなく患者自身によって標準的なＰｏＣデバイスとして使用されるには、このデバイスが高価過ぎるおそれがある。また、使い易さも、実用における限定要因となる場合がある。

本開示は、当技術分野における欠点の一部を低減することができるデバイスおよび方法について記載する。

本開示の第１の態様は、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための熱サイクル・ユニットである。この熱サイクル・ユニットは、液体試料用注入ポートを有する筐体のような、複数のコンポーネントを含み、これらのコンポーネントはゲートを介して循環内部反応チャネルに接続されている。更に、熱サイクル・ユニットは、反応チャネルに熱接続され、異なる温度ゾーンを形成し、つまり反応チャネルに沿って熱勾配を形成することができるように、異なる温度に設定されるように構成された少なくとも２つの熱エレメントを含む。熱サイクル・デバイスをスマートフォンにドッキングするために、ドッキング・メカニズムが設けられ、一方増幅された核酸の検出を容易にするために、スマートフォンの内蔵光源からウィンドウを通って反応チャネルを通じてスマートフォンのカメラに光を誘導するように、光路が構成されている。

本明細書において開示する他の態様は、液体生体試料に対してＰＣＲを実行する方法である。この方法は、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット内に、その液体試料注入ポートを通じて、液体試料を注入し、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有する従来のスマートフォンに、熱サイクル・ユニットをドッキングすることから開始する。熱エレメントを異なる温度に設定することによって、結果的に得られる別個の温度ゾーン間に温度勾配を形成し、熱対流によって反応チャネルを通る液体試料の循環を促進する。試料が異なる温度ゾーンを通過する間に、ＰＣＲが実行され、別個の温度が従来のＰＣＲサイクルの複数の工程を誘起する。ＰＣＲの最中および／または後に、スマートフォンの光源からの光ビームを反応チャネルを通ってスマートフォンのカメラに導くことによって、増幅された核酸の検出を容易にする。

本明細書において説明する他の態様は、ＰＣＲを実行するための、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの使用、ならびに本明細書において説明する熱サイクル・ユニットと、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンとを含む分析システムである。

図１Ａは、本明細書において開示する熱サイクル・ユニットの流体チャネル・システムの実施形態を、その加熱エレメントと共に示す斜視図である。 図１Ｂは、筐体（１０）に埋め込まれた図１Ａの流体システムを示し、明確にするために筐体（１０）を透過的に描画する。 図１Ｃは、組み立てられた筐体（１０）の外側からの斜視図を示す。 図１Ｄは、筐体（１０）の下位（１３）部分の斜視図である。 図１Ｅは、筐体（１０）の上位（１４）部分の斜視図である。 図２Ａは、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）内において増幅される核酸の検出のための光路の例示的な実施形態の模式図を示す。 図２Ｂは、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）内において増幅される核酸の検出のための光路の例示的な実施形態の模式図を示す。 図２Ｃは、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）内において増幅される核酸の検出のための光路の例示的な実施形態の模式図を示す。 図２Ｄは、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）内において増幅される核酸の検出のための光路の例示的な実施形態の模式図を示す。 図３Ａは、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の流体システムの実施形態を、上から見た模式図で示す。 図３Ｂは、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の流体システムの実施形態を、上から見た模式図で示す。 図３Ｃは、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の流体システムの実施形態を、上から見た模式図で示す。 図３Ｄは、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の流体システムの実施形態を、上から見た模式図で示す。 図３Ａ～図３Ｅは、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の流体システムの実施形態を、上から見た模式図で示す。

本開示の第１の態様は、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための熱サイクル・ユニットであり、この熱サイクル・ユニットは、
－ゲートを通じて流体試料注入ポートに接続された循環流体経路を設ける反応チャネルと、
－液体試料注入ポートと、スマートフォンの光源およびカメラ上に配置されるように構成された光インターフェースとを含む筐体であって、光インターフェースが、光源からの光を反応チャネルを通じてスマートフォンのカメラまで誘導するために、熱サイクル・ユニット内において光路に接続される、筐体と、
－データ転送ポートおよびエネルギ転送ポートであって、組み合わせられてもまたは別個であってもよい、データ転送ポートおよびエネルギ転送ポートと、
－反応チャネルと熱接触する第１および第２熱エレメントを含む電気回路であって、第１熱エレメントが第２熱エレメントから空間的に分離され、第１および第２熱エレメントが、異なる所定の温度値に設定され、別個の温度ゾーンおよび反応チャネルに沿った熱勾配を確立するように構成される、電気回路と、
－熱サイクル・ユニットをスマートフォンに可逆的にドッキングするドッキング・メカニズムとを備える。

「スマートフォン」とは、本開示のコンテキストでは、移動体オペレーティング・システムと、音声、ＳＭＳ、およびインターネット・データ通信のための統合移動体広帯域セルラ・ネットワーク接続とを備えたハンドヘルド・パーソナル・コンピュータを意味する。全てではないにしろ、殆どのスマートフォンはＷｉ－Ｆｉにも対応する(support)。通例、スマートフォンは、はるかに大きいタブレット・コンピュータとは逆に、ポケット・サイズである。最新のスマートフォンは、通常、タッチスクリーン・カラー・ディスプレイと、表面全域に及ぶグラフィカル・ユーザ・インターフェースとを有し、ユーザが仮想キーボードを使用して画面上のアイコンをタイプ入力(type)および押下して、アプリ（ソフトウェア・コンポーネント）を有効化および／または管理することを可能にする。

スマートフォンの典型的な機能には、電話、ディジタル・カメラおよびビデオ・カメラ、ＧＰＳナビゲーション、メディア・プレーヤ、時計、ニュース、計算器、ウェブ・ブラウザ、ハンドヘルド・ビデオ・ゲーム・プレーヤ、懐中電灯、羅針盤、住所録、メモ帳、ディジタル・メッセージング、イベント・カレンダ等が含まれる。典型的なスマートフォンは、次のセンサ、磁力計、近接センサ、気圧計、ジャイロスコープ、または加速度計の内１つ以上を含む。２０１０年以降、スマートフォンは、Ａｐｐｌｅ Ｓｉｒｉ、Ａｍａｚｏｎ Ａｌｅｘａ、Ｇｏｏｇｌｅ Ａｓｓｉｓｔａｎｔ、ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ Ｃｏｒｔａｎａ、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ Ａｓｓｉｓｔａｎｔ、およびＳａｍｓｕｎｇ Ｂｉｘｂｙのような、統合仮想アシスタントを採用している。２０１２年以降に生産された殆どのスマートフォンは、高速移動体広帯域４Ｇ ＬＴＥを有する。

本明細書において開示する熱サイクル・ユニットと共に使用されるスマートフォンは、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを備える。これらのコンポーネントは、熱サイクル・ユニット内でＰＣＲを実行するために使用される。

本明細書において使用する場合、中央処理ユニット（ＣＰＵ）とは、本開示ではスマートフォンであるコンピュータ内部にある電子回路であり、命令によって指定される基本的算術、論理、制御、および入力／出力（Ｉ／Ｏ）演算を実行することによって、コンピュータ・プログラム（またはアプリ）の命令を実行する。従前より、「ＣＰＵ」という用語は、プロセッサ、更に具体的には、その処理ユニットおよび制御ユニット（ＣＵ）を指し、コンピュータのこれらの中核要素を、主メモリおよびＩ／Ｏ回路のような外部コンポーネントと区別する。

「電源」(power source)は、スマートフォン、および本明細書において開示する熱サイクル・ユニットの特定のコンポーネントに、エネルギを供給する。殆どの場合、本明細書において説明するコンテキストにおけるスマートフォンの電源は、再充電可能な電池であり、ある実施形態では、リチウムイオン・バッテリである。「電池」(electric battery)とは、外部接続を有する１つ以上の電気化学セルから成り、懐中電灯、スマートフォン、または電気自動車のような電気デバイスに給電するために設けられるデバイスである。１回使用（主要）バッテリとは異なり、いわゆる二次バッテリは再充電可能であり、したがって、スマートフォンのようなデバイスのためのバッテリ選択肢となっているのが通例である。このようなバッテリは、印加される電流を使用して、複数回放電および再充電することができる。電極の本来の組成は、逆電流によって復元することができる。その例には、車両において使用される鉛蓄電池、ならびにラップトップおよびスマートフォンのような携帯用電子機器に使用される前述のリチウムイオン・バッテリが含まれる。

本明細書において開示する熱サイクル・ユニットのある実施形態では、第１（１１５）および／または第２熱エレメント（１１６）が、ＣＰＵによって制御され、スマートフォン（２）の電源によって給電される。

本明細書において使用する場合、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ：Polymerase Chain Reaction）とは、試料における標的ポリヌクレオチドのセグメントの濃度を高めるための、当技術分野では周知の増幅方法を指し、試料は、単一ポリヌクレオチド種または複数のヌクレオチドでも可能である。一般に、ＰＣＲプロセスは、２つ以上の拡張可能なオリゴヌクレオチド・プライマのモル過剰を、所望の標的配列（１つ以上）を含む反応混合物に導入することから成り、プライマは、二重鎖標的配列の逆ストランドを補完する。反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で熱循環のプログラムを受け、その結果、ＤＮＡプライマが隣接する所望の標的配列の増幅が得られる。このような熱循環は、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットと逆転写酵素ＰＣＲを組み合わせることによって促進することができる。（ＲＴ－ＰＣＲ）とは、ＲＮＡ鋳型および逆転写酵素、または逆転写酵素活性を有する酵素を使用して、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ・プライマ伸長の複数のサイクルの前に、最初に一本鎖ＤＮＡ分子を産生するＰＣＲ反応である。マルチプレックスＰＣＲとは、通例２つよりも多いプライマを１回の反応に含ませることによって、１回の反応において１つよりも多い増幅産物を産生するＰＣＲ反応を指す。一般に、ＰＣＲサイクルは、大抵の場合９０°Ｃよりも高い温度における熱変性ステップを含み、二重鎖鋳型核酸の個々の鎖が互いに分離される。多くの場合５０°Ｃおよび６５°Ｃの間であるかなり低い温度において、プライマはそれぞれの鋳型鎖上のそれらの相補標的部位にアニールし、その後温度を殆ど７０°Ｃおよび８０°Ｃの間まで再度徐々に上げ、ここで耐熱核酸ポリメラーゼは、新生アンプリコンを拡張するための最大酵素活性を呈する。多種多様なＰＣＲ用途のための方法は、当技術分野では広く知られており、多くの文献(sources)、例えば、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology（分子生物学における現在の手順）, Section 15, John Wiley & Sons, Inc., New York (1994)に記載されている。

本明細書において説明するデバイスおよび方法は、保存ＰＣＲに厳格に限定されるのではない。何らかの修正を加えることにより、当業者であれば、核酸増幅のための異なる方法を実行することもできよう。このような増幅反応には、とりわけ、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼ・リガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ－ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ：Strand Displacement Amplification）、核酸増幅法（ＴＭＡ：Transcription Mediated Amplification）、およびＱβ－増幅が含まれる。

更に、本明細書において開示するデバイスは、抗体に基づくアッセイのコンテキストにおいても有用であるとして差し支えないことが想像できる。この場合、このデバイスは、複数の異なる専用温度ゾーンに液体試料を循環させる必要がない、簡素化したシステムとして具体化することができる。

また、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットは、定性的および定量的核酸増幅反応の双方に有用である。
生体試料における核酸の定性的検出は、実例をあげると、個人の感染を認識するために極めて重要である。したがって、微生物感染の検出のためのアッセイに重要な１つの要件は、偽陰性または擬陽性の結果を回避することである。何故なら、このような結果は、それぞれの患者の処置に関して、深刻な結果に至ることが、殆ど不可避であるからである。このため、特にＰＣＲに基づく方法では、定性的インターナル・コントロール核酸が、検出混合物に添加されることが多い。前記コントロールは、検査結果の有効性を確認するためには特に重要である。少なくともそれぞれの標的核酸に関する陰性結果の場合、定性的インターナル・コントロール反応は、所与の設定内で反応を実行しなければならない。即ち、定性的インターナル・コントロールを検出しなければならず、さもなければ検査自体が効力がないと見なされる。しかしながら、定性的な設定では、前記定性的インターナル・コントロールは、陽性結果の場合、必ずしも検出されなくてもよい。定性的検査では、反応の感度が保証され、したがって厳格に制御されることが特に重要である。その結果、阻害がわずかな状況においてでも、定性的インターナル・コントロールが検出されず、検査が無効と判断されるように、定性的インターナル・コントロールの濃度は、比較的低くなければならない。

一方、そして試料における標的核酸の存在または不在の単なる検出に加えて、前記核酸の量を判定することが重要な場合が多い。一例として、ウィルス性疾患の病期および重症度を、ウィルス量に基づいて評価することができる。更に、治療の成功を評価するために、いずれの治療でも、その監視には個人内に存在する病原体の量についての情報を必要とする。定量的アッセイでは、標的核酸の絶対量を判定するための基準として役割を果たす定量的標準核酸を導入する必要がある。定量化は、外部較正を参照することまたは内部定量的標準を実装することのいずれかによって、実施することができる。

本明細書において開示する熱サイクル・ユニットは、リアル・タイムＰＣＲ（定性的および定量的アッセイ双方）だけでなく、古典的なエンドポイントＰＣＲにも対応する（定性的および半定量的検出が可能である）。本明細書において説明する設定は、とりわけ、反応チャネル内において継続的にまたは定められた間隔で行われる反応を、熟練者が監視することを可能にする。実例をあげると、蛍光標識５’－ヌクレーゼ・プローブ（ＴａｑＭａｎフォーマット）を使用するＰＣＲにおいて、それぞれのアンプリコンの濃度上昇を、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの光路を通じて監視することができ、これによって、当業者にはわかるように、ＰＣＲ成長曲線の分析が可能になる。

したがって、本開示の一態様は、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの定性的および／または定量的目的のための使用である。ある実施形態では、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットは、定量的ＰＣＲにおいて使用され、ある実施形態では、定量的リアル・タイムＰＣＲにおいて使用される。
「熱エレメント」(thermal element)は、本明細書において使用する場合、その温度を能動的または受動的に調節することができ、したがってその周囲の温度を調節することができる物体である。ある実施形態では、熱エレメントはペルチエ・エレメントを含むか、またはペルチエ・エレメントで構成される。また、ある実施形態では、これらは、抵抗器のような電気抵抗エレメントを含むか、または電気抵抗エレメントで構成される。他の実施形態では、これらは電着熱電エレメントを含むか、または電着熱電エレメントで構成される。「電着熱電エレメント」(electrodeposited thermoelectric element)とは、ｐ型およびｎ型エレメントの電着によって作られたまたは製造された熱電エレメントに関する。電着(electrodeposition)とは、電着(electrocoating)、電着(e-coating)、カチオン電着(cathodic electrodeposition)、陽極電着(anodic electrodeposition)、および電気泳動塗装(electrophoretic coating)、または電気泳動塗装(electrophoretic painting)を含むプロセスである。このプロセスの特徴(characteristic feature)は、液体媒体内に懸濁されたコロイド粒子が、電界の影響下で移動し（電気泳動）、電極上に堆積されることである。安定した懸濁を形成するために使用することができ、電荷を搬送することができる全てのコロイド粒子を電気泳動堆積において使用することができる。これには、ポリマー、顔料、染料、セラミクス、シリケート、メタロイド（＝半金属）、および金属のような材料が含まれる。このプロセスは、材料を任意の導電性表面に被着するのに有用である。電着は、ｐ型およびｎ型エレメントの非常に粒度が高い配列を可能にし、電着された熱電エレメントは、高い柔軟性を有し、むしろ少ない手間で個々に形状を変えることもできる。これは、スマートフォンのような移動体デバイスに伴う、限定された利用可能空間量を考慮すると、特に有利である。比較的小さな電着熱電エレメントを、本明細書において開示する熱サイクル・ユニットの内側に被着することができ、これらは、その筐体内において要求される場合がある、機械的柔軟性を有する。
「第１熱エレメント」(first thermal element)および「第２熱エレメント」(second thermal element)は、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの循環流体経路のような、熱伝導媒体に接続されると、互いの間に温度勾配を確立することができるように、互いに離間された別個のエレメントである。先に説明したように、従来のＰＣＲは、大抵の場合、変性、アニール、および伸長のために３つの異なる温度を拠り所にするが、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの実施形態には、第３熱エレメントを含むものがある。これらの実施形態では、第１熱エレメントが、変性温度（約９０～９５°Ｃ）に加熱されるように構成され、第２熱エレメントがアニール温度（約５０～６５°Ｃ）に加熱されるように構成され、第３熱エレメントが伸長温度（約７０～８０°Ｃ）に加熱されるように構成されることもある。

熱サイクル・ユニットをスマートフォンに可逆的にドッキングする「ドッキング・メカニズム」は、これら２つのコンポーネント間における物理的接続を容易にする。「可逆的ドッキング」(reversibly docking)とは、本明細書において使用する場合、それぞれの構造間のドッキングが、これらのコンポーネントのいずれの破壊も起こさずに、解除できることを意味する。実例をあげると、熱サイクル・ユニットは、その縁においてまたはその縁に沿って、可撓性の幅木を含むことができ、これをスマートフォンのフレーム上に圧入して係合することができる。ある実施形態では、ドッキング・メカニズムは、スナップ・フィット、圧入、ラッチ、およびフックから成る１群から選択された１つ以上のエレメントを含む。他の適した構造も、当業者には着想可能であろう。

本明細書において説明する熱サイクル・ユニットは、本技術分野において記載されている他のＰｏＣデバイスと比較して、多数の利点を組み合わせる。
実例をあげると、従来のスマートフォンの標準的なコンポーネントを高い割合で活用するので、熱サイクル・ユニットによって提供しなければならなかったはずの多くのコンポーネントの必要性を根絶する。その結果、コストを抑えて熱サイクル・ユニットを生産することができ、全体的な複雑さも低下する。実際、本明細書において開示する熱サイクル・ユニットは、使い捨て品として生産することさえも可能である。本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの１回使用は、相互汚染の危険性を回避するので有益である。相互汚染は、多くの場合、通例非常に敏感なポリメラーゼ連鎖反応の課題の１つである。実例をあげると、離れた領域に移動し、および／または特定の病原菌に罹患しそうなとき、個人が複数の使い捨て熱サイクル・ユニットを、彼自身または彼女自身で携行することができる。

本発明のコンテキストにおいて、「使い捨て」(disposable)または「消耗品」(consumable)は、限定された回数だけ使用され、実施形態によっては１回だけ使用され、次いで廃棄されるコンポーネントを意味する。本開示のコンテキストにおいて、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットは、ある実施形態では、使い捨てである。したがって、これは、本明細書において説明したように使用することができ、次いで定められた回数のＰＣＲ、例えば、１回のＰＣＲ、または複数回のＰＣＲを実行した後に、廃棄すればよい。先に論じたように、相互汚染は、ＰＣＲに関する重要な因子であり、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの１回使用が特に有利であると言って差し支えないのは、そのためである。血液試料のような生体試料に露出された熱サイクル・ユニットは、廃棄され、したがって、洗浄する、即ち、除染する必要はない。

本明細書において開示する熱サイクル・ユニットは、複数の適した材料で作ることができる。実例をあげると、金属または合金、あるいは非金属材料、もしくはその組み合わせで作られてもよい。非金属の中では、環状オレフィン・ポリマー（ＣＯＰ）またはコポリマー（ＣＯＣ）のような、プラスチックまたは硬質プラスチックが適した材料である。他の適した材料には、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリオキシメチレン（ＰＯＭ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン（ＡＢＳ）、または非プラスチック材料でさえも含まれる。

金属で作られた熱サイクル・ユニットは、高い堅牢性という利点を呈する(display)ことができる。このような設計は、特に、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットが、使い捨て品とは対照的に、耐久コンポーネントとして使用される実施形態では、特に有利であるのはもっともである。他方で、使い捨てコンポーネントの場合、前述のプラスチックのような、他の材料にすれば、有利であろう。

本明細書において説明する熱サイクル・ユニットを使用すると、実例をあげると、個人において病原性核酸が検出可能か否かについて、素早い分析を実行することができるが、それぞれの結果は必ずしも最終的な診断を表す必要はない。このような場合、個人には陽性結果、即ち、問題の病原菌の検出によって、医療機関において彼または彼女自身が検査を受けるように促せばよい。しかしながら、陰性結果の場合、これは不要でよい。

あるいは、生かまたは処理されたものかは関係なく、実験データを健康管理専門家に転送してもよい。このような転送は、スマートフォンを通信デバイスとして利用できるという利点がある。実例をあげると、セキュア・ワイヤレス接続を通じてデータを医療機関に転送してもよい。場合によっては、これらのデータを、対応する健康管理専門家によって解釈し、診断結果を個人に返送してもよい。

また、ある実施形態では、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの反応チャネルに、ＰＣＲ試薬を予め充填しておいてもよい。
このような試薬は、当業者には知られており、特異的および非特異的プライマおよびプローブ、ｄＮＴＰのようなデオキシヌクレオチド、バッファ、Ｍｇ^２＋またはＭｎ^２＋のような二価陽イオン、エキソヌクレアーゼ活性を有するまたは有さないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマまたはプローブに付着させることができるまたはできない蛍光染料またはクエンチャーのような染料、アプタマ、あるいは当業者には知られている他の成分(component)が含まれる。ある実施形態では、これらの試薬が、特定の標的核酸に特異的なプライマおよびプローブを含んでもよい。実例をあげると、熱サイクル・ユニットに、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ：Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus）の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマおよびプローブを予め充填しておいてもよく、一方他の熱サイクル・ユニットには、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ：Human Immunodeficiency Virus）の核酸配列に特異的にハイブリダイズするプライマおよびプローブを予め充填しておいてもよい。このように、例えば、特定の状況において個人がどの病原菌に露出されるおそれがあるかに応じて、病原菌核酸のような、特異的な全く異なる標的核酸を検出することを専用とする、特定の１組の熱サイクル・ユニットを個人が携行することができる。このような予め充填されている熱サイクル・ユニットを使い捨てコンポーネントとして設計することは特に有利である。実例をあげると、人道組織または医療機関の構成員に、本明細書において開示するような使い捨て熱サイクル・ユニットを、彼らのそれぞれの活動(operation)のエリアにおいて存在する病原菌の範囲に合わせて、複数組装備させてもよい。

しかしながら、本明細書において開示する熱サイクル・ユニットは、個人の未処置全血のような、生の試料に制限されることはない。核酸を隔離するために、一次試料を予め処置しておき、後者を含有する溶液を、本明細書において開示する熱サイクル・ユニットに注入し、本明細書において説明するように処理することができ、実施形態によっては、本明細書において説明する方法の適応化(adaptation)を全く必要としない。

本開示のコンテキストにおいて、生体標的材料の「隔離」(isolation)、「純化」(purification)、または「抽出」(extraction)という用語は、以下のことに関係する。実例をあげると、核酸のような生体標的材料を診断アッセイにおいて増幅等によって分析できるようになる前に、これらは、通例、異なる成分の複雑な混合物を含有する生体試料から純化、隔離、または抽出しなければならない。本明細書において説明するコンテキストにおいて、マイコバクテリアが喀痰試料内に存在する場合、種々の異なる生体分子を含有し、多くの場合、これらの分子の小群だけが、所与の型の分析の対象となる。実例をあげると、下流プロセスにおいてＰＣＲによって分析される核酸は、混合物内に存在する他の生体分子から分離されなければならない場合がある。適した隔離方法は、当業者には知られている。

通例、第１ステップの内１つは、例えば、酵素および／または化学試薬を使用することによって、細胞またはウィルス粒子の内容物(contents)を放出するステップを含む。このプロセスは、一般に溶解(lysis)と呼ばれる。溶解産物における対象検体の増殖のために、核酸を結合するための有用な手順の１つは、カオトロピック塩溶液における磁気粒子のような、結合粒子のガラスまたはシリカ面への核酸の選択的結合、およびアガロース、タンパク質、または細胞デブリのような汚染物からの核酸の分離を伴う。本明細書において使用される組成(composition)は、核酸をガラス面に結合するときに、特に有用であるとして差し支えない。何故なら、この組成は、このような結合に通常必要なカオトロピック試薬を、既に含有するからである。

また、本開示の一態様は、液体生体試料に対してＰＣＲを実行する方法であり、この方法は、
ａ）液体生体試料を、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットの液体試料注入ポートに導入し、後者を、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンにドッキングするステップと、
ｂ）スマートフォンのＣＰＵおよび電源を使用することにより、熱サイクル・ユニットの第１および第２熱エレメントの温度を、異なる値に設定することによって、別個の温度ゾーンおよび反応チャネルに沿った温度勾配を確立するステップと、
ｃ）熱対流のために温度勾配を使用することによって、反応チャネルの別個の温度ゾーンを通って液体生体試料を循環させることによって、別個の温度ゾーン内において、変性、アニール、および伸長のＰＣＲステップを実行するステップと、
ｄ）ステップｃ）の間または後のいずれかにおいて、スマートフォンの光源から放出された光を、熱サイクル・ユニットの光路を通ってスマートフォンのカメラまで誘導することによって、ＰＣＲの核酸増幅産物を検出するステップと、
を含む。

以上で説明した方法は、当業者が、従来のスマートフォンを使用してＰＣＲを実施するために、熱サイクル・ユニットの有利な構造を活用することを可能にする。ある実施形態では、以上で説明した方法は、追加のステップを全く必要としない。

また、ある実施形態では、この方法は、更に、ＰＣＲの最中またはその後に生成されるデータの処理も含む。このような実施形態では、データをスマートフォンの画面上に表示することによって、ユーザに便利にデータを提示することができる。

したがって、ある実施形態では、本明細書において開示する方法は、更に、ステップｄ）の後に、検出データを処理し、結果をスマートフォンのディスプレイに出力するステップを含む。

反応チャネルに達するまでゲートを通して試料注入ポートから試料を注入することに関して、ある実施形態は、本明細書において述べるように、試料の処理を伴う。
したがって、ある実施形態では、本明細書において開示する方法は、更に、液体試料注入ポートを通して熱サイクル・ユニットに液体生体試料を挿入した後であるが、液体生体試料を反応チャネルを通して循環させる前に、液体生体試料を前処理するステップを含む。

更に具体的な実施形態では、この前処理ステップは、全血試料からの血漿の分離を含む。
このような実施形態の利点については、熱サイクル・ユニットのコンテキストにおいて、既に本明細書において説明した。

互いに機能的に接続されると、スマートフォンおよび本明細書において開示する熱サイクル・ユニットは、統合機能ユニットとして協働する。
したがって、本開示の一態様は、ＰＣＲを実施するための分析システムであり、このシステムは、
－本明細書において開示するような熱サイクル・ユニットと、
－ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンと、
を備える。

本明細書において開示する熱サイクル・ユニット、分析システム、方法、および使用の説明した実施形態は、先に列挙したカテゴリのいずれにも応用可能である。疑念を回避するために記すと、例えば、本明細書において説明する熱サイクル・ユニットのコンテキストにおいて説明した実施形態は、本明細書において開示する分析システムまたは方法等にも適用可能である。

例示的な実施形態
以下の例示的な実施形態は、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）の具体的な態様および異形を例示することを意図するが、これらは限定ではない。

図１Ａは、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の内部の斜視図を示す。機能ユニットとして動作する間、内部は、大まかに、液体アッセイ成分のための反応チャネル（１００）、熱制御およびデータ管理のための電気回路（１１０）、および検出のための光路（１２０）に分割することができる。

図１Ｂは、筐体（１０）内における同じエレメントを示すが、この図では、明確化のために透過的にしている。
反応チャネル（１００）は、生化学反応が行われる流体システムを表す。分析対象の液体試料は、反応チャネル（１００）の循環流体経路（１０１）内において、核酸の熱増幅のための試薬と接触させられ、これによって培養される。図示する実施形態では、循環流体経路（１０１）は、三角形状をなす。尚、円形または多角形形状のような、他の幾何学的形状も着想可能であることは、当業者には認められよう。ある実施形態では、反応チャネル（１００）は、ガラスまたは透過性プラスチックで作られる。他の実施形態では、反応チェンバ（１００）はガラス製のキャピラリまたはガラス製キャピラリの構造体(arrangement)である。循環流体経路（１０１）は、ある実施形態では、０．５ｃｍから１５ｃｍまでの間、または１ｃｍおよび１０ｃｍの間、または２．５ｃｍおよび７．５ｃｍの間の全長、あるいは約５ｃｍの全長を有するのでもよい。循環流体経路（１０１）の外径は、ある実施形態では、０．５ｍｍおよび５ｍｍの間、または１ｍｍおよび３．５ｍｍの間、または約２ｍｍであってもよい。循環流体経路の容積は、ある実施形態では、２５μｌおよび５００μｌの間、または５０μｌおよび３５０μｌの間、または約２００μｌであってもよい。循環流体経路（１０１）は、ゲート（１０２）を介して、液体試料注入ポート（１０３）に流体的に接続され、この図では、分離ユニットとして具体化されている。その遠端（循環流体経路（１０１）に関して）において、試料注入ポート（１０３）は広がって、液体試料を導入するための開口（１０３１）になる。開口（１０３１）は、ある実施形態では、ランセットの導入、ガラス・キャピラリまたは同様のデバイスが、個人から血液を引き出して転送することを可能にするような寸法を有する。図示する実施形態において見られる開口（１０３１）の広がった形状は、ランセットを注入ポート（１０３）に誘導するのに寄与し、これによって、血液試料が溢れる潜在的可能性があるが、ランセットが滑り落ちる危険性、および／または破壊される危険性を低減する。注入ポート（１０３）の近端は、この場合も循環流体経路（１０１）に関してであるが、分離ユニット（１０２）内に通じ、分離ユニット（１０２）は、海綿状材料またはフリースのような吸収エレメント（１０２１）を含んでもよい。注入ポート（１０３）またはその開口（１０３１）に向かって、それぞれ、接着性ストリップまたは他の型式のバリアによって、吸収エレメント（１０２１）を密閉してもよく、接着性ストリップまたは他の型式のバリアは、液体試料の導入直前に除去されればよい。実例をあげると、接着性ストリップは、外部からの到達に便利なスリットを抜けて筐体（１０）から突出するフラップを含んでもよい。このような実施形態では、分離ユニット（１０２）の内部にある吸収エレメント（１０２１）が循環流体経路（１０１）の内側と流体接触してもよく、所与のＰＣＲアッセイのためにそれぞれの試薬が循環流体経路（１０１）に予め充填されている実施形態では、流体経路（１０１）の内側にある液体生化学試薬に吸収エレメント（１０２１）が既に浸漬されていてもよい。他の実施形態では、分離ユニット（１０２）と循環流体経路（１０１）との間に第２バリアを含ませ、第１シールの除去時に、液体試料が最初に分離ユニット（１０２）の吸収エレメント（１０２１）に毛細管力によって引き込まれ、次いで、第２シールの除去時に、流体経路（１０１）内にあるＰＣＲ試薬と接触するようにしてもよい。代替実施形態では、一方または両方のシールが、ランセットのような採血デバイスによって容易に穿孔できる脆いメンブレーンとして具体化されてもよい。このような実施形態では、吸収エレメント（１０２１）は不要でよい。試薬混合物は、このメンブレーンによって循環流体経路（１０１）の内側に遮蔽され、これによって乾燥から保護される。

他の実施形態では、生化学試薬が、凍結乾燥または真空乾燥のような乾燥形態で、流体経路（１０１）の内部に予め配置されていてもよい。これは、当技術分野では確立した方法であり、試薬の安定性を高め、貯蔵寿命を延ばす。注入ポート（１０３）または分離ユニット（１０２）は、それぞれ、更にメンブレーンも含んでもよい。実例をあげると、ランセットの導入によってメンブレーンが割れたときはいつでも、ＰＣＲ実験に必要な生化学反応が発生することができるように、導入される液体試料が、予め乾燥されている試薬を溶解する。メンブレーンが割れたとき、実例をあげると、液体試料を加速して反応チャネル（１００）に流入させてもよい。逆流防止手段(backflow preventer)（１０４）があれば、反応チャネル（１００）またはその循環流体経路（１０１）内部に、それぞれ、液体試料または反応混合物を維持するのに寄与する。

更に他の実施形態では、以上で説明した分離ユニット（１０２）のコンポーネントの代わりに、またはそれに加えて、後者は血漿分離フィルタ（１０２２）を備えてもよい。全血試料にとっては、前述のように、細胞／粒子成分を液体母材(liquid matrix)から分離することが有利になることがある。言い換えると、血漿が得られるように、血液細胞を血漿分離フィルタ（１０２２）によって堰き止める(hold back)。本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）のある実施形態では、全血試料を注入ポート（１０３）の開口（１０３１）内に導入し、反応チャネル（１００）の分離ユニット（１０２）内において、血漿分離フィルタ（１０２２）による濾過を受けることができる。したがって、実質的にまたは少なくとも部分的に純化された血漿が、分離ユニット（１０２）を通って、循環流体経路（１０１）に達することができる。ＰＣＲを含む多くの（生）化学反応に血漿を使用することの利点は、当技術分野では良く知られている。全血には、その粒子成分によって、特に微小規模レベルでのこのような反応に干渉するという危険性がある。実例をあげると、反応チャネル（１００）内に血液凝固が発生し、試料および試薬の通過を妨げるおそれがある。

循環流体経路（１０１）に入るとき、液体試料、この実施形態では、このときには少なくとも部分的に純化された血漿は、加熱エレメント（１１５、１１６、１１７）によって確立された熱勾配の方向に流れる。図示する実施形態は、第１（１１５）および第２（１１６）に加えて、第３熱エレメント（１１７）を含む。先に説明したように、従来のＰＣＲは、通例、熱エレメント１１５～１１７の各々が、変性ゾーン（１１５）、アニール・ゾーン（１１６）、および伸長ゾーン（１１７）にそれぞれ対応するように、３通りの別個の温度におけるそれぞれの反応混合物の培養を含む。第１熱エレメントによって表される変性ゾーン（１１５）を最初に通過した反応混合物は、二重鎖核酸が液体試料に存在する場合、二重鎖核酸を分離させるのに十分高い温度で培養され、一本鎖になる。温度勾配にしたがって、反応混合物は、次に第２熱エレメント（１１６）に達する。第２熱エレメント（１１６）は、ＰＣＲプライマ、そしてある実施形態では、ＰＣＲプローブを、一本鎖核酸鋳型にアニールするのに適した温度を供給するように構成されている。アニール温度は変性温度よりも低いので、本明細書において説明する方法は、別個の熱エレメントが互いに離間されるという状況から利点を得ることができる。実例をあげると、第１（１１５）から第２熱エレメント（１１６）への転送の場合、これらのエレメントの間に位置する反応混合物の部分は殆ど周囲温度に露出され、キャピラリ（大抵の場合ガラスまたは透過性プラスチックで作られる）の典型的に薄い壁によって、熱伝導が促進される。ある実施形態では、キャピラリの壁は、１０μｍおよび１ｍｍの間、または５０μｍおよび０．５ｍｍの間、または約１００μｍの厚さを有する。その結果、反応混合物のこの部分は、変性温度からある程度冷却することができ、その後、アニール温度が予め設定されている第２熱エレメント（１１６）に達するので、システムの効率に寄与する。実例をあげると、第１熱エレメント（１１５）によって約９４°Ｃに加熱された反応混合物の部分は、アニール温度に近い温度、実例をあげると、約６０°Ｃに、第２熱エレメント（１１６）に向かう途中で、既に冷却されているとしてよい。周囲温度の冷却効果に加えて、ある実施形態では、実際のＰＣＲ循環ゾーンを表す前述のものの間に、更に他の熱エレメントを備える。例えば、第４熱エレメント（図示せず）を第１（１１５）および第２熱エレメント（１１６）との間に組み込み、能動的に反応混合物のそれぞれの部分を予め冷却するようにしてもよい。この目的のために、このような第４熱エレメントは、反応混合物の冷却を一層迅速に行うために、通例、第２熱エレメント（１１６）のアニール温度よりも低い温度に設定される。例えば、第４熱エレメントは、約４５°Ｃ以下の温度に設定されてもよい。

同様に、第２熱エレメント（１１６）によって表されるアニール・ゾーンから、伸長に指定された第３熱エレメント（１１７）に向けて移動するとき、更に他の熱エレメント（図示せず）を、第２（１１６）および第３（１１７）熱エレメントの間に実装してもよい。この第５熱エレメントは、実例をあげると、反応混合物のそれぞれの部分の温度が、周囲温度に向かう冷却を能動的に防ぐように、アニール温度と伸長温度との間の温度を維持することができる。

各ＰＣＲサイクルにおいて、第３エレメント（１１７）によって表された伸長ゾーンを通過した後、反応混合物は、検出用光路（１２０）に到達する。図示の実施形態では、光路（１２０）は、光学エレメントとしてプリズム（１２１）を含む。他の実施形態では、１つよりも多いプリズムおよび／またはレンズもしくはミラーのような他の光学エレメントが、光路（１２０）に含まれてもよい。後者の実施形態のいくつかについて、本明細書の他の場所で更に詳しく説明する。

本明細書において説明する熱サイクル・ユニットのある実施形態では、光路（１２０）は、プリズム、レンズ、導波ロッド、光学フィルタ、回折格子、およびミラーから成る１群から選択された１つ以上のエレメントを含む。

端的に言うと、スマートフォンの光源は、光路（１２０）に光学的に結合されている。実例をあげると、アンプリコンの蛍光に基づく検出の場合、スマートフォンからの光を、光路（１２０）を通過する反応混合物の部分に誘導する。光学フィルタ等によって、反応混合物を所望の励起波長の光に露出することができる。応答して、分析対象の核酸またはその検出プローブの適した蛍光によって放出された光を、次に、発光波長の通過を許容する他のフィルタに通過させることができ、光は最終的にスマートフォンのカメラに到達し、生成された信号を検出することができる。適したコンピュータ・プログラム（アプリ）をそれぞれのスマートフォンにインストールしておき、検出した信号を処理および／または分析することができる。あるいは、分析のために、生データを移動体インターネット接続を通じて健康管理専門家または集中実験室などに送信してもよい。

反応チャネル（１００）またはその循環流体経路（１０１）は、図示する実施形態では、三角形のキャピラリ・システムであり、着脱可能な、そしてある実施形態では、使い捨てユニットとして具体化することができる。このような実施形態では、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）は、必要な電気回路（１１０）および光路（１２０）を含む再利用可能なスキャフォールド(scaffold)を提供する。試料注入ポート（１０３）および／またはゲート（１０２）は、着脱可能な循環流体経路（１０１）と既に物理的に接続した状態で提供され、完全な着脱可能な反応チャネル（１００）を形成することもでき、または別個のユニットとして、もしくは前述のスキャフォールド熱サイクル・ユニット（１）に統合した再利用可能な部品として、提供されてもよい。

着脱可能な反応チャネル（１００）を有する実施形態は、様々な利点を示す。実例をあげると、キャピラリ円形構造、三角形構造、または他の多角形構造のような循環流体経路（１０１）に、ＰＣＲに必要な試薬を予め充填されて供給することもできる。ある実施形態では、標的特異的オリゴヌクレオチドのような特異的アッセイのための試薬が含まれる。スキャフォールドは再利用されるので、実例をあげると、コストがかかる方法で、したがって品質を高めて、スキャフォールドを生産することができる。更に、ユーザが、潜在的な複数回の使用および異なるアッセイの可能性のために、複数の熱サイクル・ユニット（１）を携行する必要はなく、１つのスキャフォールド・ユニットだけで十分であるが、複数の予め充填された循環流体経路（１０１）を携行することもできる。後者の方が(latter)占有する空間が少なくて済む。

他の実施形態では、熱サイクル・ユニット（１）は、完全なデバイスとして構成および提供され、ある実施形態では、反応チャネル（１００）を統合ユニットとして含み、直ぐに使えるデバイスとして構成および提供される。このような実施形態によって得られる利点には、意図しない破損という潜在的な危険性を含む、生体試料を収容するキャピラリ・システムをユーザが交換する必要性の根絶が含まれる。

図１Ａおよび図１Ｂは、図示する実施形態の電気回路（１１０）も示す。これは、先に説明した熱エレメント（１１５、１１６、１１７）を含む。後者は、ケーブル導管（１１４）によって電気的に供給される。ケーブルを有するケーブル導管（１１４）は、ケーブル・チェンバ１１３、他の導管（１１２）を通過して、エネルギ転送ポート（１１１ａ）に達する。エネルギ転送ポート（１１１ａ）は、この実施形態では、ＵＳＢポート（１１１）に含まれる。後者は、便利な解決策である。何故なら、これは、多くの他の電気デバイスにおけると同様に、同じポートによってエネルギ転送およびデータ転送の複合(combination)を可能にするからである。本明細書において説明するデバイスおよび方法にとって最も重要なことは、全てではないにしても殆どの現行のスマートフォンが、エネルギおよびデータ双方の転送のために標準的なＵＳＢポートを有することである。

したがって、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）のある実施形態では、データ転送ポート（１１１ａ）およびエネルギ転送ポート（１１１ｂ）は、ＵＳＢポート（１１１）内に組み合わされる。少なくとも、一部のスマートフォンの場合のように、同じ目的に供される他のポート（実例をあげると、マイクロＵＳＢまたはＬｉｇｈｔｎｉｎｇポート）が、市販のアダプタを経由して、標準的なＵＳＢポートに既に接続されていてもよい。しがたって、本明細書において説明する熱サイクル・ユニット（１）の機能は、データが送信される同じ接続によって強化する(powered)ことができる。実際、ある実施形態では、熱サイクル・ユニット（１）から受信されたデータが、スマートフォンから送信される電力の調節(modulation)に導くこともできる。実例をあげると、熱エレメントの１つによって構成されたまたは取り付けられた温度センサ（図示せず）が、それぞれの熱エレメントの測定温度の所望値からの逸脱を報告するデータを提出するのであれば、そのときにポート（１１１）を通じてこのエレメントにスマートフォンから供給される電力を、対応して調節することができる。

図１Ｃは、熱サイクル・ユニット（１）の筐体（１０）を組み立てたところを外部から示す。ＵＳＢポート（１１１）の開口（１２）だけでなく、試料注入ポート（１０３）の開口（１０３１）も見ることができる。対応するスマートフォン（２）のためのドッキング・メカニズムの一部として、他の開口（１３）も見ることができる。実例をあげると、開口（１３）は熱サイクル・ユニット（１）をスマートフォン（２）に挟み込むクリップのための窪みであってもよい。他の実施形態では、開口（１３）は、ランセット（図示せず）を筐体（１０）内に収容する窪みとして機能するのでもよい。

電気的結合に加えて、本明細書において開示する熱サイクル・ユニット（１）は、それが相互作用するスマートフォン（２）に光学的に結合される。このコンテキストでは、光インターフェース（１１）を図１Ｃにおける筐体（１０）の一部として見ることができる。この図では、インターフェース（１１）は、三角プリズムのような導光エレメント（１２１）を保持するように構成されている。後者は、明確化のために、図１Ｃには示されていない。

光結合の例示的な実施形態を図２Ａ～図２Ｄに示す。
図２Ａは、第１の例示実施形態を表し、熱サイクル・ユニット（１）およびスマートフォン（２）によって構成された光路（１２０）の側断面図を示す。この非常に模式的な図では、熱サイクル・ユニット（１）が、その光インターフェース（１１）を通じて、光源（２４）およびカメラ（２５）を内蔵したスマートフォン（２）の表面に取り付けられている。多くの現行スマートフォンの場合、これは、スマートフォンの背面側、即ち、ディスプレイを内蔵していない面である。有利なこととして、光源（２４）が大抵の場合カメラ（２５）の近くに配置されており、カメラ（２０２）によって写真を撮影し、光源（２０１）をフラッシュとして使用するときに、光強度の損失を回避する。したがって、光路（１２０）の導光エレメント（１２１）は、市販のスマートフォンの大部分に嵌合するように、即ち、光源（２４）とカメラ（２５）との間の距離を埋めるように、寸法を決めることができる。ある実施形態では、導光エレメント（１２１）は、図１に示した三角プリズムのような、プリズムである。このようなプリズム（１２１）は、光源（２０１）から、散乱光のような、光を収集するという追加の利点ももたらす。このような光は、そうでなければ、反応混合物を照らす目的には効果が得られないであろう。この実施形態におけるプリズム（１２１）は、図１において、そこで示される斜視図からの方が十分に評価することができる。何故なら、図２における「横たわった」三角プリズム（１２１）の断面図は、その外形を詳細に示さないからである。光源（２４）に面する三角形の底面は、比較的広いエリアを確保し(provide)、その中で散乱光またはそれ以外の無指向性光を、三角形の漸減する辺(tapered sides)の内面から、光ビームの方向に反射させることができ、これによって、近くにカメラ（２５）が位置する、三角形の頂点に向かって誘導することができる。プリズム（１２１）のこれらの辺、または内面全体が、反射コーティング（１２５）等を含んでもよく、光強度の損失を低減することに寄与する。

図２Ａにおいて光源（２４）によって放出された光ビームの経路は、一連の矢印（１３０）によって表されている。ある実施形態では、光源（２４）は、発光ダイオード（ＬＥＤ）、ＯＬＥＤ、キセノン・ランプのようなハロゲン等である。通例、このような光源は、多くの場合複数の単色ビームで構成される、白色光を生成する。反応混合物において新たに作られた核酸を分析するために、特定波長の光を活用することが多い。光源（２４）とプリズム（１２１）との間のインターフェースに配置された光学フィルタ（１２３）を使用して、所望の波長または波長範囲を濾波してもよい。また、このようなフィルタ（１２３）は、実例をあげると、散乱周囲光を排除することによって、望ましくない光効果を低減させるのにも寄与することができる。反射コーティング（１２５）は、光源（２４）からの光を、その意図する経路（１３０）上で、循環流体経路（１０１）に向かって誘導し、これを通過させるのに寄与する。検出方法に応じて、光ビームは、例えば、分析対象の核酸と関連付けられた蛍光染料の励起を起こすことができる。このような実施形態では、カメラ（２５）が、実例をあげると、発光波長の透過を選択的に許容する他の光学フィルタ（１２４）によって、それぞれの蛍光の発光波長の光を検出する。

図２Ｂに移ると、光学検出システムに関する他の実施形態が示されている。本質的に、エレメントの大部分は、図２Ａに示したものと同一である。しかしながら、循環流体経路（１２１）が熱サイクル・ユニット（１）の上外輪(upper outer rim)に向かって多少空間的にずらされていると推測することができる。図示する実施形態の方法で循環流体経路（１２１）を分離することによって、光ビームを反応混合物に向けそしてそれを通過させる一層効率的な誘導が得られる。

図２Ｃは、図２Ａおよび図２Ｂと同じ視線から見た、第３の例示的な実施形態の図である。この実施形態でも、光源（２０１）から放出された主ビームは第１光学フィルタ（１２３）は通過してプリズム（１２１）の本体に入射し、プリズム（１２１）の内面上の反射コーティング（１２５）で反射する。カメラ（２０２）に面するプリズム（１２１）の終端に達すると、光ビームの一部が、光ウィンドウ（１２７）を抜けて循環流体経路（１０１）を通過し、これによってプリズム（１２１）が反応チャネル（１００）の循環流体経路（１０１）に光学的に接続される。次いで、光ビームは、循環流体経路（１０１）の遠端内壁の後ろに配置されたミラー（１２６）によって反射される。循環流体経路（１０１）内部にある反応混合物を横断した光は、次いで第２光学フィルタ（１２４）を通過して、カメラ（２０２）に到達する。

図２Ｄは、クリップ（１６）によって熱サイクル・ユニット（１）が取り付けられたスマートフォン（２）の背面側に面する視点からの図２Ｃの実施形態を示す。ＵＳＢアダプタ・ケーブル（３）が、スマートフォン（２）上のポート（２１）とＵＳＢポート（１１１）との間におけるデータおよび電力双方の転送を確立する。ＵＳＢポート（１１１）は、熱サイクル・ユニット（１）の筐体（１０）内に開口（１２）を含む。下にあるエレメントが見えるように、熱サイクル・ユニット（１）は透過的に図示されている。光インターフェース（１１）は、その後、キャピラリ（１０１）の後ろにあるミラー（１２６）によって反射されるように、光源（２０１）がその光をプリズム（１２１）に入射および透過させて、光ウィンドウ（１２７）を抜けて、光が循環流体経路（１０１）に到達することを可能にする。次いで、放出光の内、矢印（１３０）によって表されるこの部分は、最終的にスマートフォンのカメラ（２０２）に到達する。

図３は、反応チャネル（１００）の異なる実施形態を示す。これらの図は、温度勾配の生成、および結果的に得られる流体運動を例示する。
図３Ａにおいて、反応チャネル（１００）は、液体試料が試料注入ポート（１０３）を通って三角形循環流体経路（１０１）に導入されるように構成されている。９０°Ｃよりも高い温度に設定された第１熱エレメント（１１５）は、変性ゾーンを形成する役割を果たす。第２熱エレメント（１１６）は、約６０°Ｃのアニール温度に設定され、一方第３熱エレメント（１１７）は、約７０°Ｃの伸長温度に設定されている。したがって、第１（１１５）および第２（１１６）熱エレメント間の温度差は、第２（１１６）および第３（１１７）または第１（１１５）および第３（１１７）熱エレメント間の温度差よりも、それぞれ、大きくなる。一旦熱エレメントの温度が設定されたなら、液体流は最も急な温度勾配に従う。図示する実施形態では、その結果、円形矢印（１０６）および直線矢印（１０５）によって示すように、時計回り方向となる。図３Ａにおいて更に見ることができるのは、反応混合物を循環流体経路（１０１）の内側に保持するのに寄与する逆流防止手段（１０４）である。このような逆流防止手段（１０４）は、例えば、メンブレーン、破れやすいシール、ランセットによって穿孔された後再度自己閉鎖するラバー、弁等によって具体化することができる。尚、当業者であれば、逆流を防止するのに適した他の手段も知っているであろう。

図３Ｂは、本質的に、背面から見た図３Ａの実施形態を示し、更に、液体流が反時計回りとなる、左右反転設定(mirror-inverted setup)とした実施形態も示す。
図３Ｃは、円形循環流体経路（１０１）を示し、図３Ｄは本質的に矩形のものを示す。図３Ｅに移ると、五角形状も考えられることがわかる。当業者であれば、利用可能な空間または他の状況に応じて、更に他の幾何学的構造も実施することができよう。

図３における図示から、試料の注入が、熱勾配に従う流れ方向と整列されるように試料注入ポート（１０３）を配置することが有利であることを推測することができる。逆の注入も可能であるが、注入を整列させることにより、液体流に乱流を生じさせない利点、循環流体経路に沿って反応混合物の円滑で安定した移動に寄与する利点が得られる。
例
以下では、本明細書において説明した方法を、本明細書において説明したデバイスおよび分析システムを用いて実行する方法を例示するために、実験について説明する。

実験の設定
材料
熱サイクル・ユニット（本体(corpus)）
本明細書において説明した２つの異なる実施形態による熱サイクル・ユニットを、３Ｄプリントによって組み立てた。一方のセットは、完全に集積され、閉じたシャーシを有する熱サイクル・ユニットであり、他方は、別個の挿入可能な反応チャネルのための再開放可能な筐体を有する。
反応チャネル：
反応チャネルについて、ガラスまたはポリプロピレン製のキャピラリを局所的に加熱し、この実験において使用される三角形状に折り曲げた。未処理の端部を切断し、その結果得られた循環流体経路を、水および水溶性７０％（Ｖ／Ｖ）エタノール溶液で完全に洗浄した。更に、キャピラリの内壁を、ジクロロ－ジメチルシランを使用して疎水化し、こうしてこれらを化学的に不活性にし、例えば、核酸の非特異的付着を防止した。指定された試料注入ポートをシリコーンで密閉し、注入ポートおよび循環流体経路の界面に、血漿分離メンブレーンを配置した。試料注入用ランセットに合わせて引き入れ開口を作成するため等で、シリコーン・シールに、加熱した針で穿孔した。採用したシリコーンの可撓性プロパティのために、引き入れ開口が自己再密閉するので、逆流防止手段としても機能した。

電子部品：
制御ユニットとして、市販のＡｒｄｕｉｎｏ ＵＮＯ Ｒ３チップ・アセンブリを、熱エレメントを制御するためのＡｒｄｕｉｎｏキットＭａｘ６６７５と共に使用した。

別個の温度を次のように設定した。
第１熱エレメント（変性） ：９５°Ｃ
第２熱エレメント（アニール）：５５°Ｃ
第３熱エレメント（伸長） ：７２°Ｃ
試料の材料：
ＰＣＲ手順を検査するために、潜在的な臨床または法医学試料等を表す、全血および尿試料を使用した。

更に、市販のＣｒｉｍｅ Ｓｃｅｎｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＰＣＲ Ｂａｓｉｃ Ｋｉｔ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）からの核酸を採用した。液体試料の追加に先立って、このキットの中に用意されているＰＣＲ試薬を、反応チャネル内に予め充填した。
試料の調製：
液体試料の一部から核酸を隔離するために、市販のキット「ＨＰ－Ｓｙｓｔｅｍ Ｖｉｒａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＩＤ３５０２２９５００１）を、製造業者の指導にしたがって、対応するフィルタ・チューブ（ＩＤ３５０２２９５００１）と共に使用した。全血試料の一部は、ｃｏｂａｓ（登録商標）Ｐｌａｓｍａ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｄ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＩＤ８２５３４８０７００）を使用して調製した。

検出：
Ｃｒｉｍｅ Ｓｃｅｎｅ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ ＰＣＲ Ｂａｓｉｃｓ Ｋｉｔは、挿入染料として臭化エチジウムを含んでいた。場合によっては、反応チャネルからアリコートを引き出し、従来のアガロースゲル電気泳動によってそれを分離し、これに続くＵＶ光誘発蛍光検出によって、検出を行った。本明細書において開示したように光路を使用し、これによって使用中のスマートフォンの光源（フラッシュ）およびカメラを活用し、本明細書において開示したように統合システムを構成する(create)ことは有利である。場合によっては、ＰＣＲの間連続的に写真を撮影し、画素密度に基づいて、核酸の相対量を推定した。場合によっては、市販のＡｎｄｒｏｉｄアプリ「Ｖｅｒｎｉｅｒ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ」（バーニヤ分光分析）をこの目的に使用したが、他の適したアプリも入手可能であり、当業者には知られている。

スマートフォン：
それぞれの製造業者の指導にしたがって、以下の２機種の市販のスマートフォンを、本明細書において説明した熱サイクル・ユニットと共に使用した。
－Ｓａｍｓｕｎｇ Ｇａｌａｘｙ Ｓ６（２０１５年４月販売開始）
－Ｌｅｎｏｖｏ ＺＵＫ Ｚ２ （２０１６年６月販売開始）

方法
試料を、それらの起源(origin)に応じて用意した。尿は適したベッセル内に採取し、全血は、本明細書において説明した熱サイクル・ユニットに設けられたランセットを使用して抜き出し、市販のキットからの核酸試料は、指定された試験管内に用意した。

それぞれの液体試料に対して、先に説明したような試料調製プロセスを行い、または試料注入ポートを通じて、前述のスマートフォンの１つに取り付けられた熱サイクル・ユニットに直接導入した。全血試料は、現場において、反応チャネルの分離ユニット内にある血漿分離フィルタによって、または場合によっては外部で、試料注入ポートへの導入前に、濾過した。

熱勾配を発生させて、その結果、流体流を形成するために、先に指示したように熱エレメントを加熱した。反応チャネルに導入された試料液体は、予め配置したＰＣＲ試薬混合物と混ぜ合わされ、熱勾配に沿って、指定された異なる温度ゾーンを通過し、こうして反応チャネル内においてポリメラーゼ連鎖反応を行った。増幅核酸の検出は、先に説明したように行われた。

結果
インクに基づく化学染料の注入によって、反応チャネル内において安定した流体流を導入する原理を示した。この例の実施形態の熱エレメントの加熱時における液体の移動は、染料の追跡によって、見ることができた。

ゲル電気泳動によって、または先に説明したような画素密度測定によって、陽性と示された試料において、増幅された核酸が検出可能となり、本明細書において説明した方法、デバイス、およびシステムの、核酸増幅に対する適性を実証した。

Claims (16)

1. ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための熱サイクル・ユニットであって、
   －ゲートを介して液体試料注入ポートに接続された循環流体経路を備える反応チャネルと、
   －前記液体試料注入ポートと、前記スマートフォンの光源およびカメラ上に配置されるように構成された光インターフェースとを含む筐体であって、前記光インターフェースが、前記光源からの光を、前記反応チャネルを通って前記スマートフォンのカメラまで誘導するための導光エレメントであって、光を反射することのできる内部表面を有する導光エレメントを備え、前記導光エレメントの一部は、前記スマートフォンの光源およびカメラから離れる方向に前記導光エレメントの残りの部分に対して空間的にずらされて配置され、前記循環流体経路は、前記導光エレメントの前記空間的にずらされた部分に配置される、筐体と、
   －データ転送ポートおよびエネルギ転送ポートであって、組み合わせられても別々であってもよい、データ転送ポートおよびエネルギ転送ポートと、
   －前記反応チャネルと熱接触する第１および第２熱エレメントを含む電気回路であって、前記第１熱エレメントが前記第２熱エレメントから空間的に分離され、前記第１および第２熱エレメントが、別個の温度ゾーン、および前記反応チャネルに沿った温度勾配を確立するように、異なる所定の温度値に設定されるように構成される、電気回路と、
   －前記熱サイクル・ユニットを前記スマートフォンに可逆的にドッキングするドッキング・メカニズムと、
   を備える、熱サイクル・ユニット。
2. ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンと共にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実行するための熱サイクル・ユニットであって、
   －ゲートを介して液体試料注入ポートに接続された循環流体経路を備える反応チャネルと、
   －前記液体試料注入ポートと、前記スマートフォンの光源およびカメラ上に配置されるように構成された光インターフェースとを含む筐体であって、前記光インターフェースが、前記光源からの光を、前記反応チャネルを通って前記スマートフォンのカメラまで誘導するための導光エレメントを備え、前記循環流体経路は、前記スマートフォンの光源およびカメラから離れる方向に前記導光エレメントに対して空間的にずらされて配置され、前記光インターフェースは、前記導光エレメントを抜けて前記循環流体経路を通過する光を前記スマートフォンのカメラへ向けて反射するように配置されたミラーをさらに備える、筐体と、
   －データ転送ポートおよびエネルギ転送ポートであって、組み合わせられても別々であってもよい、データ転送ポートおよびエネルギ転送ポートと、
   －前記反応チャネルと熱接触する第１および第２熱エレメントを含む電気回路であって、前記第１熱エレメントが前記第２熱エレメントから空間的に分離され、前記第１および第２熱エレメントが、別個の温度ゾーン、および前記反応チャネルに沿った温度勾配を確立するように、異なる所定の温度値に設定されるように構成される、電気回路と、
   －前記熱サイクル・ユニットを前記スマートフォンに可逆的にドッキングするドッキング・メカニズムと、
   を備える、熱サイクル・ユニット。
3. 前記データ転送ポートおよび前記エネルギ転送ポートが、ＵＳＢポート内において組み合わされる、請求項１または２に記載の熱サイクル・ユニット。
4. 前記反応チャネルが、ＰＣＲ試薬を予め充填される、請求項１から３のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニット。
5. 前記電気回路が、更に、前記反応チャネルと熱接触する第３熱エレメントを含み、前記第３熱エレメントが前記第１および第２熱エレメントから空間的に離れている、請求項１から４のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニット。
6. 前記第１熱エレメントがＰＣＲ変性温度（９０～９５°Ｃ）に加熱されるように構成され、前記第２熱エレメントがＰＣＲアニール温度（５０～６５°Ｃ）に加熱されるように構成され、前記第３熱エレメントがＰＣＲ伸長温度（７０～８０°Ｃ）に加熱されるように構成される、請求項５に記載の熱サイクル・ユニット。
7. 前記ゲートが生体試料のための分離ユニットである、請求項１から６のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニット。
8. 前記分離ユニットが血漿分離フィルタを含む、請求項７に記載の熱サイクル・ユニット。
9. 前記第１および／または第２熱エレメントが、ペルチエ・エレメント、電着熱電エレメント、および電気抵抗エレメントから成る１群から選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニット。
10. 前記熱サイクル・ユニットを前記スマートフォンに可逆的にドッキングするドッキング・メカニズムが、スナップ・フィット、圧入、ラッチ、およびフックから成る１群から選択された１つ以上のエレメントを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニット。
11. 前記導光エレメントが、プリズム、レンズ、導光ロッド、光学フィルタ、回折格子、およびミラーから成る１群から選択された１つ以上のエレメントを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニット。
12. 液体生体試料に対してＰＣＲを実行する方法であって、
    ａ）前記液体生体試料を、請求項１から１１のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニットの液体試料注入ポートに導入し、前記熱サイクル・ユニットを、ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンにドッキングするステップと、
    ｂ）前記スマートフォンの前記ＣＰＵおよび電源を使用することによって、前記熱サイクル・ユニットの第１および第２熱エレメントの温度を異なる値に設定し、これによって、別個の温度ゾーンおよび前記反応チャネルに沿って温度勾配を確立するステップと、
    ｃ）熱対流のために前記温度勾配を使用することによって、前記反応チャネルの別個の温度ゾーンを通って前記液体生体試料を循環させることによって、前記別個の温度ゾーン内において、変性、アニール、および伸長のＰＣＲステップを実行するステップと、
    ｄ）ステップｃ）の間または後のいずれかにおいて、前記スマートフォンの光源から放出された光を、前記熱サイクル・ユニットの導光エレメントを通って前記スマートフォンのカメラまで誘導することによって、前記ＰＣＲの核酸増幅産物を検出するステップと、
    を含む、方法。
13. 更に、ステップｄ）の後に、前記検出されたデータを処理し、結果を前記スマートフォンのディスプレイに出力するステップを含む、請求項１２に記載の方法。
14. 更に、前記液体試料注入ポートを通して前記熱サイクル・ユニットに前記液体生体試料を挿入した後であるが、前記液体生体試料を前記反応チャネルを通して循環させる前に、前記液体生体試料を前処理するステップを含む、請求項１２または１３に記載の方法。
15. ＰＣＲを実行するための分析システムであって、
    －請求項１～１１のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニットと、
    －ＣＰＵ、電源、ディスプレイ、光源、およびカメラを有するスマートフォンと、
    を備える、分析システム。
16. 定性的または定量的リアル・タイムＰＣＲを実行するための請求項１～１１のいずれか１項に記載の熱サイクル・ユニットの使用。

Images