CN112457946A - 智能电话pcr装置 - Google Patents

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F Hoffmann La Roche AG
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Abstract

本公开文本涉及一种与常规智能电话一起使用的热循环单元以及使用所述热循环单元扩增核酸的方法。所述热循环单元利用所述智能电话的多个内置特征，并且因此所述热循环单元本身所需的复杂性相对较低。

Description

智能电话PCR装置
技术领域
本发明属于分析生物样品(诸如怀疑含有病原体的样品)的领域。在本领域中，其涉及一种结合常规智能电话进行聚合酶链反应(PCR)的装置和方法。
背景技术
近年来，即时检验(PoC)诊断已变得越来越重要和有趣。在很多情况下，以更快且更有效的方式获得诊断结果是有利的，而不是将患者的样品以通常耗时的且在物流上要求很高的方式运输到中央实验室，甚至在例如医院这样的场所采集样品。一个例子是现场诊断—从获取患者样品到提交诊断结果—在医生的诊所中使用经济实惠且相对易于操作的PoC装置进行现场诊断。此方法还消除了与另外可能有必要将样品材料运送到中心实验室相关联的危险，包括由于稳定性问题导致的样品降解。
然而，尽管现有的PoC装置通常比高工作量或中等工作量分析仪甚至集成模块化实验室系统更紧凑，但是它们通常仍然太大而无法在日常情况下(即，在医疗场所之外)使用。此外，理想地，此类装置将由电池供电，并且因此独立于外部电源。
解决这些问题的方法之一涉及使用智能电话，因为这些装置在现代社会中几乎无处不在。它们满足上文陈述的要求，包括便携性和独立于外部电源。例如，WO 2017/025984公开了一种与智能电话结合使用以进行等温、连接酶介导的核酸扩增的装置。尽管该装置利用常规智能电话的某些部件，但是它仍表现出可能与广泛使用相矛盾的复杂程度。例如，在该参考文献中公开的装置的某些元件可能使其太昂贵而不能被患者自身而不是医生诊所的医务人员用作标准的PoC装置。在实践中，易用性也可能是一个限制因素。
本公开文本描述了可以减少本领域中的一些缺点的装置和方法。
发明内容
本公开文本的第一方面是一种用于结合具有CPU、电源、显示器、光源和相机的智能电话进行聚合酶链反应(PCR)的热循环单元。所述热循环单元包括许多部件，诸如具有用于液体样品的入口端口的壳体，所述壳体通过闸门连接到循环内部反应通道。此外，所述热循环单元包括至少两个热元件，所述至少两个热元件热连接到所述反应通道并且被配置为设定为不同温度，使得它们能够形成不同的温度区，并且因此形成沿着所述反应通道的温度梯度。存在对接机构以便将所述热循环装置对接到所述智能电话，而光学路径被配置为将来自所述智能电话的内置光源的光经由所述反应通道通过窗口引导到所述智能电话的所述相机，以促进对扩增核酸的检测。
本文公开的另一方面是一种用于对液体生物样品进行PCR的方法。所述方法开始于经由本文所述的热循环单元的液体样品入口端口将液体样品注入所述热循环单元中，并且将所述热循环单元对接到具有CPU、电源、显示器、光源和相机的常规智能电话。通过将热元件设定为不同温度，在所得的不同温度区之间形成温度梯度，从而通过热对流促进液体样品循环通过反应通道。当样品通过不同的温度区时，由于不同的温度触发了常规PCR循环的步骤，因此进行PCR。在PCR期间和/或之后，来自智能电话的光源的光束被引导通过反应通道并进入智能电话的相机，由此促进对扩增核酸的检测。
本文描述的其他方面是本文描述的热循环单元用于进行PCR的用途，以及一种分析系统，所述分析系统包括本文描述的热循环单元和具有CPU、电源、显示器、光源和相机的智能电话。
附图说明
图1A示出了本文公开的热循环单元的流体通道系统以及热循环单元的加热元件的实施方案的透视图。
图1B显示了嵌入在热循环单元的壳体(10)中的图1A的流体系统，为清楚起见，所述壳体以透明方式描绘。
图1C从外部提供了组装的壳体(10)的透视图。
图1D和图1E是壳体(10)的下部(13)和上部(14)的透视图。
图2A-D表示用于检测在本文公开的热循环单元(1)内扩增的核酸的光学路径的示例性实施方案的示意图。
图3A-E以从上方观察的示意图示出了本文所述的热循环单元(1)的流体系统的实施方案。
具体实施方式
本公开文本的第一方面是一种用于结合具有CPU、电源、显示器、光源和相机的智能电话进行聚合酶链反应(PCR)的热循环单元，所述热循环单元包括：
-反应通道，所述反应通道提供循环流体路径，所述循环流体路径经由闸门连接到液体样品入口端口；
-壳体，所述壳体包括液体样品入口端口和光学接口，所述光学接口被配置为放置在所述智能电话的所述光源和所述相机上，所述光学接口连接到所述热循环单元内的光学路径以将来自所述光源的光经由所述反应通道引导到所述智能电话的所述相机；
-数据转移端口和能量转移端口，其中所述数据转移端口和所述能量转移端口可以组合或分离；
-电路，所述电路包括与所述反应通道热接触的第一热元件和第二热元件，其中所述第一热元件在空间上与所述第二热元件分离，并且其中所述第一热元件和所述第二热元件被配置为设定为不同的预定温度值，以便建立不同的温度区和沿着所述反应通道的温度梯度；
-对接机构，所述对接机构用于将所述热循环单元可逆地对接到所述智能电话。
在本公开文本的上下文中，“智能电话”是指具有移动操作系统和用于语音、SMS和因特网数据通信的集成移动宽带蜂窝网络连接的手持式个人计算机。大多数(如果不是全部)智能电话还支持Wi-Fi。智能电话通常是袖珍型的，而非更大的平板计算机。现代智能电话通常具有触摸屏彩色显示器，所述触摸屏彩色显示器的图形用户界面覆盖前表面并且使得用户能够使用虚拟键盘键入和按下屏幕上图标来激活和/或管理应用程序(软件部件)。
智能电话的典型功能性包括电话、数码相机和摄像机、GPS导航、媒体播放器、时钟、新闻、计算器、网络浏览器、手持式视频游戏机、手电筒、指南针、通讯录、笔记本、数字消息传送、事件日历等。典型的智能电话包括以下一个或多个传感器：磁力计、接近传感器、气压计、陀螺仪或加速度计。自2010年以来，智能电话采用了集成虚拟助手，诸如Apple Siri、Amazon Alexa、Google Assistant、Microsoft Cortana、BlackBerry Assistant和SamsungBixby。从2012年开始生产的大多数智能电话均具有高速移动宽带4G LTE。
与本文公开的热循环单元结合使用的智能电话包括CPU、电源、显示器、光源和相机。这些部件用于在热循环单元中进行PCR。
如本文所使用的中央处理单元(CPU)是计算机(在本公开文本中为智能电话)中的电子电路，所述智能电话通过执行基本算术、逻辑、由指令指定的控制和输入/输出(I/O)操作来执行计算机程序(或app)的指令。传统上，术语“CPU”是指处理器、更具体地是指其处理单元和控制单元(CU)，用于将计算机的这些核心元件与外部部件(诸如主存储器和I/O电路)区分开。
“电源”为智能电话以及本文公开的热循环单元的某些部件提供能量。在大多数情况下，本文所述的上下文中的智能电话的电源是可再充电电池，在一些实施方案中是锂离子电池。“电池”是由一个或多个电化学电池单元组成的装置，所述电化学电池单元具有外部连接以对电气装置(诸如手电筒、智能电话和电动汽车)供电。所谓的二次电池是可再充电的，并且因此通常是如智能电话等装置的首选电池，而不是一次性(原)电池相反。此类电池可使用施加的电流进行多次放电和充电；电极的原始组成可以通过反向电流而恢复。例子包括用于车辆的铅酸电池和用于便携式计算机(诸如膝上型计算机和智能电话)的上述锂离子电池。
在本文公开的热循环单元的一些实施方案中，第一热元件(115)和/或第二热元件(116)经由CPU控制并且由智能电话(2)的电源供电。
如本文所使用，术语“聚合酶链反应”(PCR)是指本领域众所周知的用于增加样品中靶多核苷酸的片段的浓度的扩增方法，其中样品可以是单一多核苷酸物质或多个多核苷酸。通常，PCR过程由将摩尔过量的两种或更多种可延展寡核苷酸引物引入包括一个或多个期望靶序列的反应混合物中组成，其中所述引物与双链靶序列的相反链互补。使反应混合物在DNA聚合酶的存在下进行热循环程序，从而扩增两侧为DNA引物的期望靶序列。如本文所述的热循环单元结合逆转录酶PCR(RT-PCR)可促进此类热循环，所述逆转录酶PCR是一种使用RNA模板和逆转录酶或具有逆转录酶活性的酶在依赖DNA的DNA聚合酶引物拉伸的多个循环之前产生单链DNA分子的PCR反应。多重PCR是指在单一反应中通常通过在单一反应中包括两种以上的引物来产生一种以上的扩增产物的PCR反应。通常，PCR循环包括通常在高于90℃的变性步骤，其中双链模板核酸的各个链彼此分离。在明显较低的温度(通常在50℃至65℃之间)下，引物退火到它们在各自模板链上的互补靶位点，然后温度再次升高到大部分在70℃至80℃之间，其中热稳定核酸聚合酶表现出其最大的酶活性以便延展新生扩增子。用于多种PCR应用的方法在本领域中是众所周知的，并且在许多来源中都有描述，所述来源例如Ausubel等人(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Section 15,John Wiley&Sons,Inc.,New York(1994)。
本文所述的装置和方法不严格限于保守的PCR。通过某些修改，技术人员还将能够执行用于扩增核酸的不同方法。此类扩增反应尤其包括连接酶链反应、聚合酶连接酶链反应、Gap-LCR、修复链反应、3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)和Qβ扩增。
可以进一步想到的是，本文公开的装置在基于抗体的测定法的上下文中可能是有用的。在这种情况下，所述装置可被体现为一种不需要将液体样品循环通过多个不同的专用温度区的不太复杂的系统。
同样，本文所述的热循环单元可用于定性和定量核酸扩增反应。
定性检测生物样品中的核酸对于例如识别个人感染至关重要。由此，用于检测微生物感染的测定法的一个重要要求是避免假阴性或假阳性结果，因为此类结果几乎不可避免地导致对相应患者的治疗产生严重后果。因此，尤其是在基于PCR的方法中，通常将定性内部对照核酸添加到检测混合物中。所述对照对于确认测试结果的有效性尤其重要：至少对于相应靶核酸呈阴性结果的情况下，定性内部对照反应必须在给定环境中执行反应，即，必须检测到定性内部对照，否则测试本身将被视为无效。然而，在定性设置中，在阳性结果的情况下，不一定必须检测所述定性内部控制。对于定性测试，确保反应的敏感度并且因此受到严格控制尤其重要。结果，定性内部对照的浓度必须相对较低，使得即使在轻度抑制的情况下也不能检测到定性内部对照，并且因此测试无效。
另一方面，并且除了仅检测样品中是否存在靶核酸之外，确定所述核酸的量通常也是很重要的。例如，可以基于病毒载量评估病毒性疾病的阶段和严重性。此外，对任何疗法的监测都需要关于个人体内的病原体数量的信息，以便评估疗法的成功性。对于定量测定法，需要引入用作确定靶核酸的绝对量的参考的定量标准核酸。可以通过参考外部校准或通过实施内部定量标准来实现定量。
本文公开的热循环单元允许进行典型的终点PCR(提供定性和半定量检测)以及实时PCR(定性和定量测定)。本文所述的设置尤其使得技术人员能够连续地或以限定的时间间隔监测在反应通道中发生的反应。例如，在使用荧光标记的5'核酸酶探针(TaqMan格式)的PCR中，可以经由本文所述的热循环单元的光学路径监测相应扩增子浓度的增加，由此能够分析PCR生长曲线，如本领域技术人员已知的。
因此，本公开文本的一方面是本文所述的热循环单元用于定性和/或定量目的的用途。在一些实施方案中，本文所述的热循环单元用于定量PCR，在一些实施方案中，用于定量实时PCR。
如本文所使用，“热元件”是可以主动或被动地调整其温度并且因此调整其周围环境的温度的物体。在一些实施方案中，热元件包括珀耳帖元件或由珀耳帖元件组成。同样在一些实施方案中，它们包括诸如电阻器之类的电阻元件或由其组成。在其他实施方案中，它们包括电沉积热电元件或由其组成。“电沉积热电元件”涉及一种通过电沉积p型和n型元素而制作或制造的热电元件。电沉积是包括电涂覆、电子涂覆、阴极电沉积、阳极电沉积、电泳涂覆或电泳涂漆的过程。该过程的性能特征是悬浮在液体介质中的胶体颗粒在电场(电泳)的作用下迁移并且沉积在电极上。可用于形成稳定悬浮液并且可带有电荷的所有胶体颗粒均可用于电泳沉积。这包括诸如聚合物、颜料、染料、陶瓷、硅酸盐、准金属(＝半金属)和金属之类的材料。所述过程对于将材料涂敷到任何导电表面上都是有用的。由于电沉积使得经p型和n型元素以高度颗粒状排列电沉积的热电元件具有很高的柔韧性，并且可以用相当少的工作量就可以单独成形，这在可与诸如智能电话之类的移动装置结合使用的有限空间量方面特别有利。相对较小的电沉积热电元件可应用于本文公开的热循环单元的内部，并且它们具有在其壳体内可能需要的机械柔韧性。
“第一热元件”和“第二热元件”是彼此间隔开的不同元件，使得当它们连接到导热介质(诸如本文所述的热循环单元的循环流体路径)时，它们可以在彼此之间建立温度梯度。如上所述，由于常规PCR通常依赖于三个不同的温度来进行变性、退火和延展，因此本文所述的热循环单元的一些实施方案包括第三热元件。在这些实施方案的一些实施方案中，第一热元件被配置为加热到变性温度(约90℃至95℃)，第二热元件被配置为加热到退火温度(约50℃至65℃)，而第三热元件被配置为被加热到延展温度(约70℃至80℃)。
用于将热循环单元可逆地对接到智能电话的“对接机构”促进这两个部件之间的物理连接。如本文所使用，“可逆对接”是指可在不破坏任何部件的情况下撤回相应结构之间的对接。例如，热循环单元可包括在其边缘处或沿其边缘的柔性裙板，其可被按压配合到智能电话的框架上。在一些实施方案中，所述对接机构包括选自卡扣配合、压配合、闩锁、和钩的一个或多个元件。本领域技术人员可以设想其他合适的结构。
与本领域中描述的其他PoC装置相比，本文描述的热循环单元组合许多优点。
例如，它利用常规智能电话的高比例标准部件，因此消除对原本必须由热循环单元提供的许多其他部件的需求。结果，热循环单元可以较低的成本生产并且表现出较低的总体复杂性。实际上，本文公开的热循环单元甚至可以被生产为一次性物品。本文所述的热循环单元的单次使用对于避免交叉污染的风险可能是有益的，所述风险通常是通常非常敏感的聚合酶链反应的挑战之一。例如，当一个人穿越偏远地区和/或倾向于有某些病原体时，他或她自己可能会携带多个一次性热循环装置。
在本发明的上下文中，“一次性”或“可消耗的”是指仅使用有限次数、在一些实施方案中仅使用一次、然后丢弃的部件。在本公开文本的上下文中，在一些实施方案中，本文所述的热循环单元是一次性的。因此，可如本文所述的那样使用它，然后可在进行限定次数的PCR(例如，一次PCR或多次PCR)后将其丢弃。如上文所讨论的，交叉污染是与PCR相关的重要因素，这就是为什么本文所述的热循环单元的单次使用可能特别有利的原因。已经暴露于诸如血液样品之类的生物样品的热循环单元被丢弃，并且因此不需要被清洗，即，净化。
本文公开的热循环单元可由多种合适的材料制成。例如，它可以由金属或合金，或非金属材料或其组合制成。在非金属中，塑料或硬塑料是合适的材料，诸如环烯烃聚合物(COP)或共聚物(COC)。其他合适的材料包括聚丙烯(PP)、聚甲醛(POM)、聚碳酸酯(PC)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)或甚至非塑料材料。
由金属制成的热循环单元可以显示出高稳健性的优点。此设计在将本文所述的热循环单元用作耐用部件而不是一次性物品的实施方案中尤其有利。另一方面，在一次性部件的情况下，其他材料(诸如上文提及的塑料)可能是有利的。
尽管当使用本文公开的热循环单元时，可以执行快速分析，例如，是否可在个人体内检测到某些病原体核酸，但是相应结果不一定表示最终诊断。在此情况下，个人可能会获得阳性结果-检测到正讨论的病原体-在医疗机构中对其进行检测。然而，如果结果为阴性，则可能没有必要。
替代地，可将实验数据(无论是原始数据还是经过处理的数据)转发给医疗保健专业人员。此转移可有利地利用智能电话作为通信装置。例如，数据可经由安全的无线连接转移到医疗机构。在一些情况下，这些数据可由对应的医疗保健专业人员进行解译，并且诊断结果可被发回给个人。
同样，在一些实施方案中，本文所述的热循环单元的反应通道可以预填充有PCR试剂。
此类试剂是本领域技术人员已知的，并且包括特异性和非特异性引物和探针、脱氧核苷酸(诸如dNTP)、缓冲液、二价阳离子(诸如Mg2+或Mn2+)、具有或不具有核酸外切酶活性的DNA聚合酶、逆转录酶、染料(诸如荧光染料或淬火剂)，其可或可不附接到引物或探针、适体或技术人员已知的其他成分。在一些实施方案中，这些试剂可包括对某些靶核酸具有特异性的引物和探针。例如，热循环单元可以预填充与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的核酸序列特异性杂交的引物和探针，而另一热循环单元可以预填充与人体免疫缺损病毒(HIV)的核酸序列特异性杂交的引物和探针。因此，个人可携带某一组热循环单元，其专用于检测特定的不同靶核酸，诸如病原体核酸，这取决于例如在某种情况下个人可能暴露于哪些病原体。将此类预填充的热循环单元设计为一次性部件是特别有利的。例如，人道主义或医疗组织的成员可被配备如本文所公开的多组一次性热循环单元，以匹配其相应操作区域中存在的病原体的范围。
然而，本文公开的热循环单元不限于原始样品，诸如个人的未经处理的全血。在一些实施方案中，也可对原始样品进行预处理以分离核酸，此时可将包含后者的溶液引入本文公开的热循环单元中并如本文所述进行处理，而无需对本文所述的方法进行任何改造。
在本公开文本的上下文中，生物靶标材料的术语“分离”、“提纯”或“提取”涉及以下内容：在例如核酸之类的生物靶标材料可在诊断测定法中通过扩增等进行分析之前，它们通常必须从含有不同成分的复杂混合物的生物样品中提纯、分离或提取。在本文所述的上下文中，分枝杆菌在存在于痰样品中时包含多种不同的生物分子，并且在许多情况下，对于给定类型的分析，仅关注这些分子的一个子组。例如，在下游过程中要通过PCR分析的核酸可能需要与混合物中存在的其他生物分子分离。合适的分离方法是本领域技术人员已知的。
通常，第一步骤之一包括例如通过使用酶和/或化学试剂来释放细胞或病毒颗粒的内容物。该过程通常称为溶解。为了使溶解产物中的分析物富集，一种有用的结合核酸的方法需要将核酸选择性结合到离液盐溶液中的结合颗粒(诸如磁性颗粒)的玻璃或二氧化硅表面，并将核酸与污染物(诸如琼脂糖、蛋白质或细胞碎片)分离。当核酸结合到玻璃表面时，本文所使用的成分可能特别有用，因为所述成分已经含有离液剂，所述离液剂通常是此结合所必需的。
本公开文本的一方面还涉及一种用于对液体生物样品进行PCR的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述液体生物样品引入本文所述的热循环单元的所述液体样品入口端口中并且将所述热循环单元对接到具有CPU、电源、显示器、光源和相机的智能电话；
b)通过使用所述智能电话的所述CPU和所述电源将所述热循环单元的所述第一热元件和所述第二热元件的温度设定为不同值，并且由此建立不同的温度区和沿着所述反应通道的温度梯度；
c)通过使用所述温度梯度引起热对流来使所述液体生物样品循环通过所述反应通道的所述不同温度区，由此在所述不同的温度区内进行PCR的变性、退火和拉伸步骤；
d)在步骤c)期间或之后，通过将从所述智能电话的所述光源发出的光通过所述热循环单元的所述光学路径引导到所述智能电话的所述相机，来检测所述PCR的核酸扩增产物。
上述方法使得本领域技术人员能够利用热循环单元的有利结构，以便使用常规智能电话进行PCR。在一些实施方案中，上述方法不需要任何附加步骤。
同样在一些实施方案中，所述方法进一步包括处理在PCR期间或之后产生的数据。在此类实施方案中，可以通过在智能电话的屏幕上显示数据来方便地将数据呈现给用户。
因此，在一些实施方案中，本文公开的方法进一步包括在步骤d)之后处理检测数据并将结果输出到智能电话的显示器的步骤。
关于从样品入口端口通过闸门直至到达反应通道的样品注入，如本文所述，一些实施方式涉及样品处理。
因此，在一些实施方案中，本文所公开的方法进一步包括在通过所述液体样品入口端口插入所述热循环单元中之后但在将所述液体生物样品循环通过所述反应通道循环之前对所述液体生物样品进行预处理的步骤。
在一个更具体的实施方案中，预处理步骤包括从全血样品中分离血浆。
本文已经在热循环单元的上下文中描述了此类实施方案的优点。
当在功能上彼此连接时，本文公开的智能电话和热循环单元一起作为集成功能单元工作。
因此，本公开文本的一方面是一种用于进行PCR的分析系统，所述系统包括：
-如本文公开的热循环单元；
-智能电话，所述智能电话具有CPU、电源、显示器、光源和相机。
本文公开的热循环单元、分析系统、方法和用途的所描述实施方案适用于以上列出的任何类别。为了避免疑问，例如，在本文描述的热循环单元的上下文中描述的实施方案也适用于本文公开的分析系统或方法等等。
示例性实施方案
以下示例性实施方式旨在示出本文公开的热循环单元(1)的具体方面和变型，但它们不是限制性的。
图1A示出了本文所述的热循环单元(1)的内部的透视图。当作为功能单元工作时，所述内部可大致分为用于液体测定部件的反应通道(100)、用于热控制和数据管理的电路(110)以及用于检测的光学路径(120)。
图1B示出了壳体(10)内的相同元件，为了清楚起见，该图示是透明的。
反应通道(100)表示其中发生生化反应的流体系统。使待分析液体样品与试剂接触并一起培养以用于在反应通道(100)的循环流体路径(101)内进行核酸热扩增。在所描绘的实施方案中，循环流体路径(101)具有三角形形状。技术人员将明白，也可以设想其他几何形状，诸如圆形或多边形。在一些实施方案中，反应通道(100)由玻璃或透明塑料制成。在其他实施方案中，反应通道(100)是玻璃毛细管或玻璃毛细管的布置。在一些实施方案中，循环流体路径(101)的总长度可在0.5cm至15cm之间，或者在1cm至10cm之间，或者在2.5cm至7.5cm之间，或者为约5cm。在一些实施方案中，循环流体路径(101)的外径可在0.5mm至5mm之间，或者在1mm至3.5mm之间，或者为约2mm。在一些实施方案中，循环流体路径的体积可在25μl至500μl之间，或者在50μl至350μl之间，或者为约200μl。循环流体路径(101)通过闸门(102)流体地连接到液体样品入口端口(103)，在该图中所述闸门被体现为分离单元。样品入口端口(103)在其远端(相对于循环流体路径(101)加宽进入开口(1031)中以引入液体样品。在一些实施方案中，开口(1031)的尺寸使得能够引入刺血针、玻璃毛细管或用于从个人体内抽取和转移血液的类似装置。如所描绘的实施方案中所示的开口(1031)的加宽形状有助于将刺血针引导到入口端口(103)中，并且由此降低滑落和/或甚至破裂同时潜在地溢出血液样品的风险。同样相对于循环流体路径(101)，入口端口(103)的近端通向分离单元(102)，所述分离单元可包括吸收元件(1021)，诸如海绵状材料或羊毛。分别朝向入口端口(103)或其开口(1031)，吸收元件(1021)可通过胶带或另一种类型的屏障密封，所述屏障可在引入液体样品之前立即去除。例如，胶带可包括通过狭缝从壳体(10)突出的翼片以便于从外部到达。在此实施方案中，分离单元(102)内部的吸收元件(1021)可与循环流体路径(101)的内部流体接触，使得在其中流体路径被预填充有用于给定PCR测定法的相应试剂的实施方案中，吸收元件(1021)可能已经被流体路径(101)内部的液体生化试剂浸透了。在其他实施方案中，第二屏障可以包括在分离单元(102)与循环流体路径(101)之间，使得在去除第一密封件时液体样品可首先通过毛细作用力被吸入分离单元(102)的吸收元件(1021)中，然后在去除第二密封件时与流体路径(101)中的PCR试剂接触。在替代实施方案中，一个或多个密封件可以被体现为易碎隔膜，其可以容易地被诸如刺血针之类的抽血装置刺穿。在此实施方案中，可能不需要吸收元件(1021)。试剂混合物被隔膜屏蔽在循环流体路径(101)内，并且由此防止其变干。
在其他实施方案中，生化试剂可以干燥形式(诸如冷冻干燥或真空干燥)预先放置在流体路径(101)内。这是本领域中的既定方法，从而提高试剂的稳定性并延长保存期限。入口端口(103)或分离单元(102)仍可分别包括隔膜。每当通过引入例如刺血针而使隔膜破碎时，被引入的液体样品都会溶解预先干燥的试剂，使得可能发生PCR实验所需的生化反应。例如，在使隔膜破碎时，可将液体样品加速到反应通道(100)中。回流防止器(104)可分别有助于将液体样品或反应混合物保持在反应通道(100)或其循环流体路径(101)内。
在其他实施方案中，作为上述分离单元(102)的部件的替代或补充，后者可包括血浆分离过滤器(1022)。对于全血样品，如上所述，将细胞/特定成分与液体基质分离可能是有利的。换句话说，血细胞被血浆分离过滤器(1022)阻挡，从而获得血浆。在本文公开的热循环单元(1)的一些实施方案中，全血样品可被引入到入口端口(103)的开口(1031)中并且通过反应通道(100)的分离单元(102)内的血浆分离过滤器(1022)进行过滤。因此，基本上或至少部分提纯的血浆可通过分离单元(102)到达循环流体路径(101)。使用血浆进行许多(生物)化学反应(包括PCR)的优势是本领域众所周知的。尤其是在微观水平上，全血及其血液成分有干扰此类反应的风险。例如，血液凝结可能发生在反应通道(100)内并且阻碍样品和试剂的通过。
在进入循环流体路径(101)之后，液体样品现(在当前实施方案中，至少部分地经提纯的血浆)沿由加热元件(115、116、117)建立的温度梯度的方向流动。所描绘的实施方案除了第一热元件(115)和第二热元件(116)之外还包括第三热元件(117)。如上所述，常规PCR通常包括在三个不同温度下培养相应的反应混合物，使得热元件115至117中的每一者分别对应于变性区(115)、退火区(116)和拉伸区(117)。首先通过由第一热元件表示的变性区(115)的反应混合物在足以将双链核酸(如果存在于液体样品中)分离成单链的温度下培养。沿着温度梯度之后，反应混合物然后到达第二热元件(116)，其被配置为将适合于PCR引物和在一些实施方案中的PCR探针的退火的温度提供给单链核酸模板。由于退火温度低于变性温度，因此本文所述的方法可受益于不同热元件彼此间隔开的情况。例如，在从第一热元件(115)转移到第二热元件(116)的情况下，位于这些热元件之间的部分反应混合物大部分暴露于环境温度下，即，通常通过毛细管(通常由玻璃或透明塑料制成)的薄壁促进热传导。在一些实施方案中，毛细管壁的厚度在10μm至1mm之间，或在50μm至0.5mm之间，或为约100μm。结果，这部分反应混合物可以其预设的退火温度到达第二热元件(116)之前从变性温度冷却到一定程度，因此有助于系统效率。例如，由第一热元件(115)加热到约94℃的一部分反应混合物在其到达第二热元件(116)的途中可能已经冷却至接近退火温度的温度，例如约60℃。除了环境温度的冷却效果之外，一些实施方案在上述的那些热元件之间进一步包括表示实际PCR循环区的其他热元件。例如，第四热元件(未示出)可被结合在第一热元件(115)与第二热元件(116)之间，以便主动地预冷却反应混合物的相应部分。为此目的，通常将此第四热元件设定为低于第二热元件(116)的退火温度的温度，以便实现反应混合物的更快冷却。第四热元件可例如被设定为约45℃或更低的温度。
类似地，当从由第二热元件(116)表示的退火区移向被指定用于拉伸的第三热元件(117)时，可在第二热元件(116)与第三热元件(117)之间实施又另一个热元件(未示出)。该第五热元件可例如保持退火温度与延展温度之间的温度，使得主动地防止反应混合物的相应部分的温度冷却到周围温度。
在已通过由第三热元件(117)表示的拉伸区之后的每个PCR循环中，反应混合物到达用于检测的光学路径(120)，在所描绘的实施方案中，所述光学路径包括棱镜(121)作为光学元件。在其他实施方案中，光学路径(120)可包括一个以上的棱镜和/或其他光学元件，诸如透镜或反射镜。后者的一些实施方案在本文其他地方更详细地描述。
在本文所述的热循环单元的一些实施方案中，所述光学路径(120)包括选自棱镜、透镜、导杆、滤光器、衍射光栅和反射镜的一个或多个元件。
简而言之，智能电话的光源光学地耦合到光学路径(120)。例如，在基于荧光的扩增子检测的情况下，来自智能电话的光被引导到通过光学路径(120)的一部分反应混合物。可经由滤光器等将反应混合物暴露于期望的激发波长的光。然后，在响应中通过待分析核酸或其检测探针的合适荧光团发出的光可通过允许发射波长通过的另一个滤光片，并且最终到达在其中可检测到生成的信号的智能电话相机。然后，安装在相应的智能电话上的合适的计算机程序(app)可处理和/或分析检测到的信号，或者原始数据可经由移动因特网连接传输到医疗保健专业人员或中央实验室等进行分析。
反应通道(100)或其循环流体路径(101)(在所描绘的实施方案中，三角毛细管系统)可以被体现为可移动单元，并且在一些实施方案中，是一次性单元。在此类实施方案中，本文公开的热循环单元(1)提供了包括所需电路(110)和光学路径(120)的可重复使用的支架。样品入口端口(103)和/或闸门(102)可已经与可移动循环流体路径(101)物理连接地设置，因此形成完整的可移动反应通道(100)，或者作为单独的单元，或者作为与上述支架热循环单元(1)成一体的可重复使用部分。
具有可移动反应通道(100)的实施方案显示了几个优点。例如，可提供诸如毛细管圆形或三角形或其他多边形结构之类的循环流体路径(101)，其预填充有PCR所需的试剂，在一些实施方案中，所述试剂包括用于特定测定法的试剂，诸如靶特异性寡核苷酸。然后可例如以更昂贵的方式并因此以更高的质量来生产支架，因为它将被重复使用。此外，用户不必携带多个热循环单元(1)用于潜在的多种用途和不同的测定法，而是一个支架单元就足够了，同时可携带多个预填充的循环流体路径(101)，后者采取占用更少空间。
在其他实施方案中，热循环单元(1)被布置并设置为完整装置，在一些实施方案中即用型装置，包括作为整体单元的反应通道(100)。由此类实施方案赋予的优点包括消除了用户更换包含生物样品的毛细管系统的必要性，包括潜在的意外破裂的风险。
图1A和1B还示出了所描绘的实施方案的电路110，其包括上述热元件115、116、117。后者经由具有穿过电缆腔室113延伸的电缆的电缆导管(114)、通向在该实施方案中USB端口(111)所包括的能量转移端口(111a)的另一导管(112)而被供电。后者是一种方便的解决方案，因为它能够通过同一端口进行能量转移和数据转移的组合，就像许多其他电气装置的情况一样。对于本文所述的装置和方法，大多数(如果不是全部)当代智能电话都具有用于能量和数据转移的标准USB端口是重要的。
因此，在本文公开的热循环单元(1)的一些实施方案中，数据传输端口(111a)和能量传输端口(111b)组合在USB端口(111)中。至少，与某些智能电话的情况一样，具有相同目的的其他端口(例如，microUSB或Lightning端口)可经由市售适配器轻松连接到标准USB端口。因此，本文所述的热循环单元(1)的功能可由传输数据的相同连接来供电。实际上，在一些实施方案中，从热循环单元(1)接收的数据可导致调制从智能电话传输的电功率。例如，由热元件之一包括或连接到其中的温度传感器(未示出)可提交报告相应热元件的测量温度与期望值的偏差的数据，基于所述值，可相应地调整经由端口(111)从智能电话向该元件提供的功率。
图1C从外部示出了热循环单元(1)的组装的壳体(10)。样品入口端口(103)的开口(1031)以及USB端口(111)的开口(12)是可见的。另一个开口(13)可以被视为对应的智能电话(2)的对接机构的一部分。例如，它可为用于将热循环单元(1)夹紧到智能电话(2)的夹子的凹部。在其他实施方案中，开口(13)可以用作凹部，在所述凹部中将刺血针(未示出)存放在壳体(10)内。
除了电耦合之外，本文公开的热循环单元(1)还光学耦合到与其相互作用的智能电话(2)。在这种上下文中，在图1C中光学接口(11)被视为壳体(10)的一部分。在该图中，接口(11)被配置为保持诸如三棱镜之类的光导元件(121)。为了清楚起见，后者未在图1C中示出。
在图2A至2D中描绘了光学耦合的示例性实施方案。
图2A表示第一示例性实施方案，并且示出了由热循环单元(1)和智能电话(2)构成的光学路径(120)的截面侧视图。在该高度示意图中，热循环单元(1)经由其光学接口(11)附接到包含光源(24)和相机(25)的智能电话(2)的表面。对于许多当代的智能电话，这是智能电话的背面，即，不包含显示屏的面。有利地，光源(24)通常位于相机(25)附近，以便避免当用相机(202)拍照并使用光源(201)作为闪光灯时光强度的损失。因此，光学路径(120)的光导元件(121)的尺寸可以被设置成使得其适合大多数市售智能电话，即，它将桥接光源(24)与相机(25)之间的距离。在一些实施方案中，导光元件(121)是棱镜，诸如如图1所描绘的三角棱镜。此棱镜(121)赋予从光源(201)收集诸如散射光之类的光的附加优点。否则，出于照明反应混合物的目的，此光可能会丢失。在图1中从本文提供的透视图可更好地理解本实施方案中的棱镜(121)，因为图2中的“平置”三角棱镜(121)的横截面未示出其几何形状的细节。面向光源(24)的三角形的底部提供了相对较宽的区域，在所述区域中，散射或另外不定向的光可从三角形的锥形侧面的内表面沿光束方向反射，并且由此朝向附近有相机(25)的三角形的尖端引导。棱镜(121)的侧面或整个内表面可包括反射涂层(125)等，从而有助于减少光强度的损失。
由图2A中的光源(24)发射的光束的路径由一系列箭头(130)表示。在一些实施方案中，光源(24)是发光二极管(LED)、OLED、诸如氙气灯之类的卤素灯等。通常，此类光源形成白光，通常由多个单色光束组成。为了分析反应混合物中新形成的核酸，通常会利用特定波长的光。位于光源(24)与棱镜(121)之间的界面处的滤光器(123)可用于对期望的波长或波长范围进行滤波。而且，此滤光器(123)可例如通过滤除散射的环境光来有助于减少非期望的光学效应。反射涂层(125)有助于将来自光源(24)的光在其预期路径(130)上引导朝向并穿过循环流体路径(101)。取决于检测方法，光束例如可导致与待分析核酸相关联的荧光染料的激发。在此类实施方案中，相机(25)例如通过另一滤光器(124)检测相应的荧光团的发射波长的光，所述另一滤光器选择性地允许透射发射波长。
转到图2B，示出了关于光学检测系统的另一个实施方案。本质上，大多数元件与图2A中所示的元件相同。然而，可以推断，循环流体路径(121)在空间上朝向热循环单元(1)的上部外边缘稍微移位。以所描绘的实施方案的方式分离循环流体路径(121)导致将光束更有效地引导到并穿过反应混合物。
图2C是从与图2A和2B相同的角度观察的第三示例性实施方案的图。在该实施方案中，从光源(201)发射的主光束也穿过第一滤光器(123)进入棱镜(121)的主体，并且在棱镜(121)的内表面上从反射涂层(125)反射回来。在到达棱镜(121)的面向相机(202)的端部时，光束的一部分经由光学窗口(127)穿过循环流体路径(101)，棱镜(121)通过所述光学窗口光学地连接到反应通道(100)的循环流体路径(101)。然后，光束被位于循环流体路径(101)的远端内壁后面的反射镜(126)反射。在循环流体路径(101)内横穿反应混合物的光然后通过第二光学滤光器(124)到达相机(202)。
图2D从面向智能电话(2)的背面的透视图示出了图2C的实施方案，其中热循环单元(1)经由夹子(16)附接到所述智能电话。USB适配器电缆(3)在智能电话(2)上的端口(21)与USB端口(111)之间建立了数据和电能转移，所述USB端口包括热循环单元(1)的壳体(10)中的开口(12)。为了使下面的元件可见，以透明方式示出了热循环单元(1)。光学接口(11)允许光源(201)将其光透射进并通过棱镜(121)，使得它在被毛细管(101)后面的反射镜(126)反射之前通过光学窗口(127)到达循环流体路径(101)。然后，由箭头(130)表示的该部分发射光最终到达智能电话的相机(202)。
图3示出了反应通道(100)的不同实施方案。这些图举例说明了温度梯度的生成和由此产生的流体运动。
在图3A中，反应通道(100)被配置为使得液体样品经由样品入口端口(103)被引入三角循环流体路径(101)。被设定为高于90℃的温度的第一热元件(115)用于形成变性区。第二热元件(116)被设定为约60℃的退火温度，而第三热元件(117)被设定为约70℃的拉伸温度。因此，第一热元件(115)与第二热元件(116)之间的温度差分别大于第二热元件(116)与第三热元件(117)或第一热元件(115)与第三热元件(117)之间的温度差。一旦设定了热元件的温度，液体流就将遵循最陡的温度梯度。因此，在所描绘的实施方案中，这将是如圆形箭头(106)以及直线箭头(105)所指示的顺时针方向。在图3A中是进一步可见的是回流防止器(104)，其有助于将反应混合物保持在循环流体路径(101)内。此回流防止器(104)可由例如隔膜、易碎密封件、在被刺血针、阀门等刺穿后自身重新闭合的橡胶来体现。技术人员知道用于防止回流的合适的其他手段。
图3B基本上描绘了从背面观察的图3A的实施方案，或者具有镜面对称设置(其中液体流是逆时针方向的)的实施方案。
图3C示出了圆形循环流体路径(101)，并且图3D示出了基本上矩形的路径。转到图3E，可以看出，也可设想五边形形状。取决于可用空间或其他情况，本领域技术人员能够实现其他几何结构。
从图3中的描绘可以推断，以使样品注入与遵循热梯度的流动方向对准的方式来布置样品入口端口(103)是有利的。尽管也可以倒流注入，但是对准注入赋予不引起液流紊流并有助于反应混合物沿着循环流体路径平滑且稳定地运动的优点。
实施例
在下文中，描述了一个实验以便示出使用本文所述的装置和分析系统来操作本文所述的方法的方式。
实验设置：
材料
热循环单元(本体)：
根据本文所述的两个不同实施方案的热循环单元是通过3D打印构建的，一组是具有封闭底盘的完全集成的热循环单元，另一组具有用于单独的可插入反应通道的可重新打开的壳体。
反应通道：
对于反应通道，将玻璃或聚丙烯制成的毛细管局部加热并弯曲成该实验中使用的三角形形状。切割松散端部，并且用水和含水70％(V/V)乙醇溶液彻底冲洗所得的循环流体路径。此外，使用二氯二甲基硅烷对毛细管的内壁进行了疏水化处理，因此使它们呈现化学惰性并防止例如核酸的非特异性附接。指定的样品注入端口用硅酮密封，并将血浆分离隔膜放置于注入端口与循环流路的界面处。用加热的针刺穿硅酮密封件，以便形成用于刺血针的入口孔以便样品注入。由于所用有机硅的弹性，入口孔是自密封的，因此它也可用作回流防止器。
电子零件：
作为控制单元，使用了市售的Arduino UNO R3芯片组件以及Arduino套件Max6675，以控制热元件。不同的温度设定如下：
第一热元件(变性)：95℃
第二热元件(退火)：55℃
第三热元件(拉伸)：72℃
样品材料：
为了测试PCR程序，使用了全血以及尿液样品，表示潜在的临床或法医样品等。
此外，采用来自市售的犯罪现场调查者PCR Basics Kit(Bio-Rad)的核酸。在添加液体样品之前，将该试剂盒中提供的PCR试剂预填充到反应通道中。
样品制备：
为了从某些液体样品中分离核酸，根据制造商的说明使用了商购的试剂盒“HP-System Viral Nucleic Acid Kit”(Roche Diagnostics,ID 3502295001)以及对应的滤管(ID 3502295001)。使用Plasma Separation Card(Roche Diagnostics,ID 8253480700)制备部分全血样品。
检测：
Crime Scene Investigator PCR Basics Kit包括溴化乙锭作为嵌入染料。在一些情况下，检测是通过从反应通道中抽取等分试样并通过常规的琼脂糖凝胶电泳将其分离、然后进行紫外线诱导的荧光检测来实现的。使用如本文公开的光学路径、由此利用使用中的智能电话的光源(闪光灯)和相机并形成如本文公开的集成系统是有利的。在一些情况下，在整个PCR中连续拍照，并且基于像素密度估计核酸的相对数量。在一些情况下，为此目的使用了市售的Android app“Vernier频谱分析”，但其他合适的app也是可用的，并且是本领域普通技术人员已知的。
智能电话：
根据相应制造商的说明，以下两个市售的智能电话与本文所述的热循环单元结合使用：
-三星Galaxy S6(2015年4月发布)
-联想ZUK Z2(2016年6月发布)。
方法
根据样品的来源提供样品。将尿液收集在合适的容器中，使用设置有本文所述的热循环单元的刺血针抽取全血，并将来自商业试剂盒的核酸样品提供在指定试管中。
对相应液体样品进行如上所述的样品制备过程，或经由样品入口端口将其直接引入附接到上文提及的智能电话之一的热循环单元中。全血样品在反应通道的分离单元内经由血浆分离过滤器现场过滤，或者在一些情况下在被引入样品入口端口之前进行外部过滤。
如上文所指示对热元件进行加热以便形成热梯度和所得液体流。允许引入反应通道的样品液体与预先设置的PCR试剂混合物混合，并沿着热梯度流过指定的不同温度区，因此在反应通道内实现聚合酶链反应。如上所述执行对扩增核酸的检测。
结果
通过注入基于墨水的化学染料示出了在反应通道内引起稳定液体流动的原理。经由跟踪染料观察到该例子的实施方案的加热元件在加热时的液体运动。
如上所述，通过凝胶电泳或通过像素密度测量，在指定为阳性的样品中可检测到扩增核酸，从而证明本文所述的方法、装置和系统对核酸扩增的适用性。

Claims (15)

1.一种用于结合具有CPU、电源、显示器(203)、光源(201)和相机(202)的智能电话(2)来执行聚合酶链反应(PCR)的热循环单元(1)，所述热循环单元(1)包括：
-反应通道(100)，所述反应通道提供循环流体路径，所述循环流体路径经由闸门(102)连接到液体样品入口端口(103)；
-壳体(10)，所述壳体包括液体样品入口端口(103)和光学接口(11)，所述光学接口被配置为放置在所述智能电话(2)的所述光源(201)和所述相机(202)上，所述光学接口(11)连接到所述热循环单元(1)内的光学路径(120)，以将来自所述光源(201)的光经由所述反应通道(100)引导到所述智能电话(2)的所述相机(202)；
-数据转移端口(111a)和能量转移端口(111b)，其中所述数据转移端口(111a)和所述能量转移端口(111b)可以组合或分离；
-电路(110)，所述电路包括与所述反应通道(100)热接触的第一热元件(115)和第二热元件(116)，其中所述第一热元件(115)在空间上与所述第二热元件(116)分离，并且其中所述第一热元件(115)和所述第二热元件(116)被配置为设定为不同的预定温度值，以便建立不同的温度区和沿着所述反应通道(100)的温度梯度；
-对接机构，所述对接机构用于将所述热循环单元(1)可逆地对接到所述智能电话(2)。
2.根据权利要求1所述的热循环单元(1)，其中所述数据转移端口(111a)和所述能量转移端口(111b)组合在USB端口(111)中。
3.根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)，其中所述反应通道(100)中预填充有PCR试剂。
4.根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)，其中所述电路(110)进一步包括与所述反应通道(100)热接触的第三热元件(117)，其中所述第三热元件(117)在空间上与所述第一热元件(115)和所述第二热元件(116)分离。
5.根据权利要求4所述的热循环单元(1)，其中所述第一热元件(115)被配置为加热到PCR变性温度(约90℃至95℃)，所述第二热元件(116)被配置为加热到PCR退火温度(约50℃至65℃)，并且所述第三热元件(117)被配置为加热到PCR延展温度(约70℃至80℃)。
6.根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)，其中所述闸门(102)是用于生物样品的分离单元。
7.根据权利要求5所述的热循环单元(1)，其中所述分离单元(102)包括血浆分离过滤器(1022)。
8.根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)，其中所述第一热元件(115)和/或所述第二热元件(116)选自珀耳帖元件、电沉积热电元件和电阻元件。
9.根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)，其中用于将所述热循环单元(1)可逆地对接到所述智能电话(2)的所述对接机构包括选自卡扣配合、压配合、闩锁、和钩的一个或多个元件。
10.根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)，其中所述光学路径(120)包括选自棱镜、透镜、导杆、滤光器、衍射光栅和反射镜的一个或多个元件。
11.一种用于对液体生物样品进行PCR的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将所述液体生物样品引入根据前述权利要求中任一项所述的热循环单元(1)的所述液体样品入口端口(103)中并且将所述热循环单元对接到具有CPU、电源、显示器(203)、光源(201)和相机(202)的智能电话(2)；
b)通过使用所述智能电话(2)的所述CPU和所述电源将所述热循环单元的所述第一热元件(115)和所述第二热元件(116)的温度设定为不同值，并且由此建立不同的温度区和沿着所述反应通道(100)的温度梯度；
c)通过使用所述温度梯度引起热对流来使所述液体生物样品循环通过所述反应通道(100)的所述不同温度区，由此在所述不同的温度区内进行PCR的变性、退火和拉伸步骤；
d)在步骤c)期间或之后，通过将从所述智能电话(2)的所述光源(201)发出的光通过所述热循环单元(1)的所述光学路径(120)引导到所述智能电话(2)的所述相机(202)，来检测所述PCR的核酸扩增产物。
12.根据权利要求11所述的方法，其进一步包括在步骤d)之后处理检测数据并将结果输出到所述智能电话(2)的所述显示器(203)的步骤。
13.根据权利要求11或12中任一项所述的方法，其进一步包括在通过所述液体样品入口端口(103)插入所述热循环单元(1)中之后但在将所述液体生物样品循环通过所述反应通道(100)循环之前对所述液体生物样品进行预处理的步骤。
14.一种用于进行PCR的分析系统，所述系统包括：
-根据权利要求1至10中任一项所述的热循环单元(1)；
-智能电话(2)，所述智能电话具有CPU、电源、显示器(203)、光源(201)和相机(202)。
15.一种根据权利要求1至10中任一项所述的热循环单元(1)用于进行定性或定量实时PCR的用途。
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