JP7304590B2 - 熱感受性が向上した突然変異udg - Google Patents
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Description
A、アラニンAlanine;R、アルギニンArginine;N、アスパラギンAsparagine;D、アスパラギン酸Aspartic acid;C、システインCysteine;E、グルタミン酸Glutamic acid;Q、グルタミンGlutamine;G、グリシンGlycine;H、ヒスチジンHistidine;I、イソロイシンIsoleucine;L、ロイシンLeucine;K、リシンLysine;M、メチオニンMethionine;F、フェニルアラニンPhenylalanine;P、プロリンProline;S、セリンSerine;T、スレオニンThreonine;W、トリプトファンTryptophan;Y、チロシンTyrosine;V、バリンValine;X、任意のアミノ酸。
XRD実験で明らかになったE.coli由来UDGタンパク質の三次元構造を(PDB code:2EUG)スーパーコンピューティングを利用して分子動力学シミュレーションを行った(分子動力学シミュレーションはすでに与えられたforce fieldを距離に対して微分してタンパク質を構成するすべての原子間のカを求めて、ニュートンの法則を利用して分子の運動を記述するシミュレーションである。(F=ma=-dU/dx))。AMBER force-fieldを利用して与えられた温度でタンパク質の構造の集合を分子動力学シミュレーションで求めて、これからタンパク質を構成するアミノ酸残基の間のすべての相互作用エネルギー、即ちエネルギーネットワークを計算した。
実施例1で選別された残基が各々アラニンで置換されたUDG遺伝子を下記のように製造した。
これのために野生型E.coli UDG遺伝子(配列番号2)にEZchange Site-directed Mutagenesis Kit(Enzynomics)及び表3のプライマーを使用者の指示のとおり用いて選別された残基に人為的に点突然変異を導入した。正しい突然変異が導入されたのか配列分析で確認した(ゼノテックまたはバイオニックス)。
続いて実施例2で発現したUDGタンパク質24種の中で熱感受度が増加した突然変異があるか確認するために、In vitro UDG activity assayを行った。該当実験は5’端の部分に、FAM蛍光物質が標識されており、中ほどにdUを一つ含んでいる完全に相補的な二本鎖DNAを基質として用いる実験方法である(図3及び図4参照)。
[熱処理以後50%基質を切断するために必要な酵素の量]/[熱処理以前の50%基質を切断するために必要な酵素の量]。
(1)精製
In vitro UDG activity assay方法を介した熱感受性評価実験を基に今後追加開発及び評価のために50%以上の熱感受性増加が確認されたD43AとK57A、そして野生型と類似の熱感受性を持つものと評価されたE157AとE215A及び野生型UDG合計5種のタンパク質に対する精製作業を行った。約50mgの発現したUDGが含まれた可溶性抽出物を1mlのNi-NTA resin(Qiagen)と混合して4℃低温条件で3時間overhead rotationしてUDGとNi-NTA resinの結合を誘導した。以後gravity column(Bio-rad)で混合液を移した後、20column volumeのW1 buffer(CB2000+5mM IDZ)、20column bufferのW2(D.W)、10column volumeのW3(2M NaCl+40%エチレングリコール)、10column volumeのW4 buffer(CB300+20mM IDZ)で順次洗浄した。最終的に60mM IDZが含まれたW4 bufferと250mM IDZが含まれたElution bufferを使用してタンパク質を溶出した。
候補突然変異UDGの熱感受性をより正確に測定するために、精製された突然変異UDGを使用してIn vitro UDG activity assayを行った。図3及び図4と同じ方法で実験を進めて添加されたUDGの量は0.2、1、2、5ng順に増加させて用いた。結果は、図6に記載されている。これに示された通り、熱処理以前には野生型と突然変異UDGに関係なく全0.2ngと1ngとの間で用いられた基質を98%以上切断するのを確認した。しかし、95℃で15分間熱処理過程を先に進めた場合には、D43AとK57Aクローンで野生型よりも約3~5倍以上活性をさらに多く低下させるのを確認することができた(0.2ng基準)。E157AとE215Aの場合にも、野生型に比べて熱による活性低下が約30%程度より大きいことが観察された(0.2ng基準)。
突然変異UDGの熱感受性増加度をより直接的に確認するために、放射性同位元素を活用した活性測定実験を行った。これのために最初に、放射性同位元素で標識された基質を準備した。基質準備のために用いられたDNAの配列は次のとおりである。基質1:5’-GGA ACA ATT CUG CGG CTT TAG-3’(配列番号160)、基質2:5’-CTA AAG CCG CAG AAT TGT TCC-3’(配列番号161)。まず基質1オリゴヌクレオチド20pmolを8.25pmolの[γ-32P]ATPとpolynucleotide kinase(Enzynomics)を利用して標識した。EDTAを入れて反応を中断させた後、基質2オリゴヌクレオチドを20pmolだけさらに添加した。該当反応液を最終1X Annealing buffer[125mM NaCl、25mM Tris-HCl(pH7.5)]条件で混合してPCR装置を利用して二つの一本鎖DNAを二本鎖DNAで混成化させた。最終的に10% SDS-PAGE及びゲル精製を介して純粋に分離した。
実施例4で精製されたタンパク質を利用して野生型とD43A突然変異UDGの融解温度を分析した。これのためにJ-815 CD spectrometer(Jasco、Japan)を製造者の方法のとおり利用して円偏光二色性(CD)分析を実施した。25℃から95℃まで温度を増加させながら2℃単位で222nmの楕円率を測定した。結果は、図8に記載されている。これに示された通りWTのTmは約44℃、D43A突然変異のTmは約39℃と測定されて突然変異UDGのTmが約5℃程度低いことが確認された。この結果は、D43A突然変異が野生型よりも酵素の三次元的構造安定性が低いことを意味し、従って突然変異の高い熱感受性を裏付ける結果である。
実施例4で精製されたタンパク質を利用して野生型とD43A突然変異UDGの様々な生化学的特性を様々なバッファー条件で測定した。まずpHを6.6から9まで異にしてUDGの活性変化を測定した結果、D43A突然変異と野生型で共に酵素活性に大きい影響を与えないことが確認された(図9参照)。
実施例4で精製されたタンパク質を利用して野生型とD43A突然変異UDGの最適反応温度を分析した。これのために5~95℃まで5℃間隔で酵素の活性を測定した。結果は、図13に記載されている。実験結果、野生型と突然変異共に45℃で最適活性を示すと確認された。しかし、熱感受性が高いと確認されたD43A突然変異の場合、35℃での活性が55℃活性の約3倍程度で測定されて(野生型の場合、略同じ)全般的な最適活性温度が野生型に比べて低い方に偏向していることが分かった(図13)。このような結果は、D43A突然変異の熱感受性が野生型に比べて高いため、現れたものと判断される。
最も広く用いられる大腸菌由来UDGの場合、Realtime PCRに適用した時PCR過程中に完全に不活性化されることなくPCR増幅産物を一部分解することによってRealtime PCRの効率を減少させる副作用があると観察されている。
より熱感受性が増加した突然変異を探すために、選別された残基を様々なアミノ酸に変化させては実験を行った。これのために、E.coli UDGと構造的類似性が高い様々な酵素を分子動力学シミュレーションを利用した自由エネルギー計算、多重配列整列及び常用ウェブサーバーを利用した安定性分析を介してD43位置に突然変異を誘発した時、最も熱安定性を減少させると計算された8種のアミノ酸残基を選別した。これらは各々C、G、K、H、I、P、R、V、Wであり、実施例2、3と同様に部位特異的突然変異導入後タンパク質発現及び精製を介して突然変異UDG 8種を確保した。これに用いられたプライマーセットは表3に開示されている。
次に前で確認された突然変異を互いに組み合わせた時、熱感受性がさらに増大するか確認するために、組み合わせ突然変異を製作した。一次に選別されたアミノ酸残基を組み合わせてsingle、double、triple、quadruple突然変異を製作して、新しい候補突然変異を追加して合計17種の突然変異UDGに対して、In vitro UDG activity assayを行った。結果は、図18に記載されており、実験結果、D43Aと組合わせたD43A/K57A、D43A/E157A、D43A/E215A、D43A/K57A/E157A、D43A/E157A/E215A、D43A/K57A/E157A/E215A突然変異で共に野生型より2倍以上増加した熱感受性を示すのを確認することができた。しかし、D43Aを含まない組み合わせ突然変異の場合、熱感受性増大効果が1.5倍以内であることを確認した。このような結果をまとめてみると、D43位置の突然変異がE.coli UDGの熱的安定性維持に重要な役割をすることを確認することができた。
より様々な熱感受性UDGを選別するために、E4、W7、Y19、F48、E52、H67、q71、H73、F77、R80、P87、L96、E112、L121、F144、F161、G214位置をアラニン、グルタミン酸、アルギニンまたはトリプトファンに変化させた突然変異UDGを製作した。選択された残基は、以前の実験と似ているように構造を基に自由エネルギー計算によって予測された。
本願に係る突然変異UDG中でD43A、D43C、D43H、D43R、D43V、D43Wを対象に比較実験を行った。
Claims (13)
- 配列番号1の配列で表される大腸菌由来の野生型UDG(Uracil DNA Glycosylase)タンパク質にW7A、E13A、q16A、Y19A、D43X、F48A、E52A、H67A、K57A、q71A、H73A、E112A、H134A、E142A、F144A、R156A、L162A、W164A、H180A、L183A、H202A、G214E、G214W、及びL224Aで構成される群から選択されるアミノ酸置換のうちの1つが導入された、野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質であって、
前記アミノ酸置換を示す各数字はアミノ酸残基の位置を示し、アルファベットはアミノ酸残基を示し、野生型残基は左側に示し、置換された残基は右側に示し、
前記突然変異UDGタンパク質がD43Xを含む場合、前記D43XのXはA、C、G、K、H、I、P、R、VまたはWアミノ酸残基のうちのいずれかである、野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質。 - 前記突然変異UDGタンパク質がD43Xを含む場合、前記D43Xは、D43A、D43C、D43H、D43R、D43VまたはD43Wの中の一つ以上を含むものである、請求項1に記載の野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質。
- 配列番号1の配列で表される大腸菌由来の野生型UDG(Uracil DNA Glycosylase)タンパク質にW7A、E13A、q16A、Y19A、D43X、F48A、E52A、H67A、K57A、q71A、H73A、E112A、H134A、E142A、F144A、R156A、L162A、W164A、H180A、L183A、H202A、G214E、G214W、及びL224Aで構成される群から選択されるアミノ酸置換のうちの1つと、E157AまたはE215Aアミノ酸置換とが導入された、野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質であって、
前記アミノ酸置換を示す各数字はアミノ酸残基の位置を示し、アルファベットはアミノ酸残基を示し、野生型残基は左側に示し、置換された残基は右側に示し、
前記突然変異UDGタンパク質がD43Xを含む場合、前記D43XのXはA、C、G、K、H、I、P、R、VまたはWアミノ酸残基のうちのいずれかである、野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質。 - 配列番号1の配列で表される大腸菌由来の野生型UDG(Uracil DNA Glycosylase)タンパク質にW7A、E13A、q16A、Y19A、D43X、F48A、E52A、H67A、K57A、q71A、H73A、E112A、H134A、E142A、F144A、R156A、L162A、W164A、H180A、L183A、H202A、G214E、G214W、及びL224Aで構成される群から選択されるアミノ酸置換のうちの1つと、E157AまたはE215Aアミノ酸置換とが導入され、上記アミノ酸置換から選択される二つ以上の置換の組み合わせを含み、該組み合わせはD43A/K57A、D43A/E157A、D43A/E215A、D43A/K57A/E157A、D43A/E157A/E215A、または、D43A/K57A/E157A/E215Aの置換から選択される二つ以上の置換の組み合わせである、野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質であって、
前記アミノ酸置換を示す各数字はアミノ酸残基の位置を示し、アルファベットはアミノ酸残基を示し、野生型残基は左側に示し、置換された残基は右側に示し、
前記突然変異UDGタンパク質がD43Xを含む場合、前記D43XのXはA、C、G、K、H、I、P、R、VまたはWアミノ酸残基のうちのいずれかである、野生型対比熱感受性が向上した突然変異UDGタンパク質。 - 請求項1乃至請求項4のうちのいずれか一項に記載の突然変異UDGタンパク質を含むRT、PCRまたはRT-PCR反応で反応物中の核酸汚染除去用キット。
- 請求項1乃至請求項4のうちのいずれか一項に記載の突然変異UDGタンパク質、PCR重合酵素及びPCR反応に必要な緩衝液を含む、PCRプレミックス組成物。
- 請求項1乃至請求項4のうちのいずれか一項に記載の突然変異UDGタンパク質、RT(Reverse Transcription)酵素及びRT反応に必要な緩衝液を含む、RTプレミックス組成物。
- 請求項1乃至請求項4のうちのいずれか一項に記載の突然変異UDGタンパク質、RT酵素、PCR重合酵素及びRT-PCR反応に必要な緩衝液を含む、RT-PCRプレミックス組成物。
- 請求項1乃至請求項4のうちのいずれか一項に記載の突然変異UDGタンパク質を、核酸を含む反応物の中で5乃至55℃で反応させる段階を含む、分析対象サンプルの核酸汚染除去方法。
- 前記反応物は、RT、PCRまたはRT-PCR反応に用いられるものである、請求項9に記載の方法。
- 請求項1乃至請求項4のうちのいずれか一項に記載の突然変異UDGタンパク質をコードする核酸。
- 請求項11に記載の突然変異UDGタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
- 請求項12に記載のベクターを含む原核細胞。
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