JP7287282B2 - 分析方法、質量分析用ペプチド酸化防止剤および質量分析用キット - Google Patents
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Description
本発明の第2の態様によると、第1の態様の分析方法において、前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法であることが好ましい。
本発明の第3の態様によると、第1または第2の態様の分析方法において、前記タンパク質の濃度は、27.5nM以上275nM未満であることが好ましい。
本発明の第4の態様によると、第3の態様の分析方法において、前記タンパク質の濃度は、260nM未満であることが好ましい。
本発明の第5の態様によると、第4の態様の分析方法において、前記タンパク質の濃度は、45.2nM以上151nM未満であることが好ましい。
本発明の第6の態様によると、第1から第5までのいずれかの態様の分析方法において、前記酸化防止剤は、前記タンパク質の他に、アミノ酸および/または還元剤をさらに備えることが好ましい。
本発明の第7の態様によると、第6の態様の分析方法において、前記アミノ酸および/または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、2-メルカプトエタノール、トリ‐n‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ-グリコール酸、N-アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化2-アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物であることが好ましい。
本発明の第8の態様によると、第6または第7の態様の分析方法において、前記アミノ酸および/または還元剤の濃度は、0.001mM以上10mM以下であることが好ましい。
本発明の第9の態様によると、第1または第2の態様の分析方法において、前記ペプチドは、アフィニティ精製を用いて精製されたものであり、前記タンパク質は、前記アフィニティ精製に用いたリガンドであり、前記アフィニティ精製において、前記ペプチドを溶出液を用いて溶出する前、または溶出した後に、前記溶出液にアミノ酸および/または還元剤を加えることと、を備えることが好ましい。
本発明の第10の態様によると、第9の態様の分析方法において、前記アミノ酸および/または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン、2-メルカプトエタノール、トリ‐n‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ-グリコール酸、N-アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化2-アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物であることが好ましい。
本発明の第11の態様によると、第9または第10の態様の分析方法において、前記アミノ酸および/または還元剤の濃度は、0.0001mM以上10mM以下であることが好ましい。
本発明の第12の態様によると、質量分析用ペプチド酸化防止剤は、メチオニンの酸化を防止するためのものであり、タンパク質を含み、レーザー脱離イオン化法により分析対象のペプチドをイオン化する質量分析における試料の調製に用いる。
本発明の第13の態様によると、第12の態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記タンパク質の濃度は、27.5nM以上275nM未満であることが好ましい。
本発明の第14の態様によると、第12または第13の態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記タンパク質の他に、アミノ酸および/または還元剤をさらに備えることが好ましい。
本発明の第15の態様によると、第14の態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記アミノ酸および/または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス(2‐カルボキシエチル)ホスフィン、2-メルカプトエタノール、トリ‐n‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ-グリコール酸、N-アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化2-アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物であることが好ましい。
本発明の第16の態様によると、第12から第15までのいずれかの態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法であることが好ましい。
本発明の第17の態様によると、質量分析用キットは、第12から第16までのいずれかの態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤と、試料プレートおよびマトリックスからなる群から選択される少なくとも一つとを備える。
第1実施形態の分析方法は、質量分析に用いられる試料に、タンパク質を酸化防止剤として加えることにより、試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防ぐものである。
なお、質量分析用の試料の調製方法は上記の方法に限定されず、例えば、対象ペプチド、酸化防止タンパク質、マトリックスおよびマトリックス添加剤を含む溶液が調製された後、この溶液が試料プレートに配置されて乾固されてもよい。
なお、本実施形態に係る質量分析用キットは、少なくとも酸化防止タンパク質10を備えていればよく、マトリックス20および試料プレート30については備えなくともよいし、いずれか一方または両方を備えていてもよい。
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
3種類のペプチドAβ1-40(Anaspec)、Aβ1-42(Anaspec)、APP669-711(ペプチド研究所)の混合液に、BSA(ナカライテスク)、Human
transferrin(Sigma-Aldrich)、Bovine fetuin(Sigma-Aldrich)のいずれかのタンパク質を添加した試料溶液と、タンパク質を添加していない試料溶液を調製した。試料溶液の溶媒には5 mM 塩酸を含有する70%(v/v) アセトニトリルを使用した。試料溶液に添加して得られた上記タンパク質の濃度は0.1, 0.3, 1, 3, 10, 30, 100 ng/μLであった。他に、上記3種類のタンパク質をいずれも含まず、Aβ1-40を10,100,1000 fmol/μLの各濃度で含む試料溶液(以下、Aβ1-40溶液と呼ぶ)を調製した。
質量分析用のマトリックスとしてCHCAを用いた。マトリックス溶液は、CHCA 1 mgを70%(v/v) アセトニトリル 1 mLで溶解することによって調製した。マトリックス添加剤としてMDPNAを含む、0.4%(w/v) MDPNA溶液をマトリックス添加剤溶液とした。マトリックス溶液とマトリックス添加剤溶液を等量混合して添加剤含有マトリックス溶液を調製した後、添加剤含有マトリックス溶液0.5μLをMALDI用の試料プレート(μFocus MALDI plate 900μm、Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ)上の各ウェルに滴下し、乾固させた。その後、1-1で調製した試料溶液を1μL取り、上記の試料プレート上のマトリックスへ滴下して乾固させた。
図3は、Aβ1-40溶液(10~1000fmol/μL)1μLを試料プレートへ滴下し乾固させて得た試料(10~1000fmol/well Aβ1-40)を質量分析して得たマススペクトルにおける、Aβ1-40に対応するピークを示す図である。ペプチドが低濃度になるほど非酸化体よりも酸化体が強く検出され、10fmol/wellでは同等のピークの高さになった。
図4、図6および図8は、それぞれBSA、transferrinおよびfetuinの各タンパク質の濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。タンパク質を添加しない(図中「タンパク質添加なし」)で各ペプチド(各ペプチドの濃度500amol/μL)をMALDI-TOF MSで分析すると、Aβ1-40とAβ1-42は酸化体が、APP669-711では二酸化体(図中「酸化体(2か所)」)のピークが突出して検出された(図4、図6、図8)。
ng/well(45.2-151 fmol/wellに対応)となり、試料溶液を試料プレート上に滴下する際の濃度としては3-10ng/μL(45.2-151 nMに対応)となった。transferrinにおける上記範囲は3-10 ng/well(39.9-133 fmol/wellに対応)となり、試料溶液を試料プレート上に滴下する際の濃度としては3-10ng/μL(39.9-133 nMに対応)となった。fetuinにおける上記範囲は1-10 ng/well(27.5-275 fmol/wellに対応)となり、試料溶液を試料プレート上に滴下する際の濃度としては1-10ng/μL(27.5-275 nMに対応)となった。重さ(g)で比較すると、fetuinは他よりも3倍低い添加量の1 ng/wellでも酸化抑制効果が確認された。物質量(mol)で比較すると、BSAでは45.2 fmol/well、transferrinでは39.9 fmol/well、fetuinでは27.5 fmol/wellと、酸化抑制効果がある物質量(mol)の下限は同程度だった。つまり、酸化抑制効果は重さ(g)よりも物質量(mol)に依存していると考えられる。一方、ピーク形状が不明確になるタンパク質の量の範囲はBSA、transferrinおよびfetuinの全てにおいて30 ng/well以上であるので、イオンサプレッションは重さ(g)に依存していると考えられる。以上のデータから、酸化抑制のためのタンパク質添加量は27.5-275 fmol/well(27.5-275 nM)が適している。
第2実施形態の分析方法は、質量分析に用いられる試料に、タンパク質に加えてアミノ酸および/または還元剤を酸化防止剤として加えることにより、試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防ぐものである。
なお、質量分析用の試料の調製方法は上記の方法に限定されず、例えば、対象ペプチド、酸化防止タンパク質、アミノ酸および/または還元剤、マトリックスならびにマトリックス添加剤を含む溶液が調製された後、この溶液が試料プレートに配置されて乾固されてもよい。
なお、本実施形態に係る質量分析用キットは、少なくとも低分子酸素捕捉物質40を備えていればよく、酸化防止タンパク質10、マトリックス20および試料プレート30については備えなくともよいし、いずれか1つ、2つまたは全部を備えていてもよい。
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。第1実施形態の実施例では、Aβ1-40、Aβ1-42およびAPP669-711の混合液に、BSAを0.1、0.3、1、3、10、30、または100ng/μL添加した試料溶液を作成して、質量分析を行い、ペプチドの酸化抑制を検討した(図4参照)。以下では、この試料溶液にさらにアミノ酸および/または還元剤を加えて、ペプチドの酸化抑制の評価を行った。
3種類の合成ペプチドAβ1-40、Aβ1-42およびAPP669-711(第1実施形態の実施例の表参照)の混合液に、BSA 10ng/μLと共にアミノ酸を添加した試料溶液と、アミノ酸を添加していない試料溶液とを調製した。溶媒は5 mM 塩酸を含有する70%(v/v) アセトニトリルを使用した。アミノ酸含有試料溶液は、アミノ酸としてグリシン(ナカライテスク)、L-メチオニン(ナカライテスク)、L-システイン(Thermo Fisher Scientific)およびL-ヒスチジン(Fluka)のいずれかが添加された。上述の通り、メチオニン、システインおよびヒスチジンは側鎖に酸化されやすい部位を有するが、グリシンは側鎖に酸化されやすい部位を有さない。従って、グリシンは比較例として用いた。添加されたアミノ酸の濃度は各アミノ酸毎に、0.0001、0.001、0.01、0.1、1および10 mMであった。これらの試料を第1実施形態の実施例と同様の条件で、MALDI-TOF MSにより測定した。
3種類の合成ペプチドAβ1-40、Aβ1-42、APP669-711の混合液に、BSA 10ng/μLと共に還元剤DTTを添加した試料溶液と、DTTを添加していない試料溶液を調製した。溶媒は5 mM 塩酸を含有する70%(v/v) アセトニトリルを使用した。添加されたDTT濃度は0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10 mMであった。これらの試料を上記アミノ酸の場合(2-1)と同様の条件で、MALDI-TOF MSにより測定した。
3種類の合成ペプチドAβ1-40、Aβ1-42およびAPP669-711の混合液に、1 mM L-メチオニンを含み酸化防止タンパク質が添加されていない試料溶液、および10 mM DTTを含み酸化防止タンパク質が添加されていない試料溶液、ならびに、これらの試料溶液に10ng/μL BSAを添加した試料溶液を調製した。溶媒は5 mM 塩酸を含有する70%(v/v) アセトニトリルを使用した。これらの試料を上記アミノ酸の場合(2-1)と同様の条件で、MALDI-TOF MSにより測定した。
第3実施形態の分析方法は、第2実施形態の分析方法と同様、質量分析に用いられる試料に、タンパク質(酸化防止タンパク質)に加えてアミノ酸および/または還元剤を酸化防止剤として加えることにより、試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防ぐものである。しかし、本実施形態の分析方法では、アフィニティ精製により分析対象のペプチド(対象ペプチド)が精製され、アフィニティ精製において溶出液に含まれるリガンドを酸化防止タンパク質として用いる。これにより、酸化防止タンパク質を試料溶液に加える操作を必要とせずに、対象ペプチドの酸化を効果的に抑制することができる。
なお、アフィニティ精製において、上述の溶出液に低分子酸素捕捉物質のアミノ酸および還元剤を予め加えておいてもよい。これにより、溶出後に低分子酸素捕捉物質を加えることを必要とせず、対象ペプチドの酸化が抑制された試料溶液を調製することができる。
なお、質量分析用の試料の調製方法は上記の方法に限定されず、例えば、対象ペプチド、上記リガンド、アミノ酸および/または還元剤、マトリックスならびにマトリックス添加剤を含む溶液が調製された後、この溶液が試料プレートに配置されて乾固されてもよい。
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
抗Aβ抗体(クローン6E10)をEpoxy磁性ビーズ(Thermo Fisher Scientific)に結合させ、免疫沈降用の抗Aβ抗体ビーズを用意した。ヒト血漿に合成ペプチドAβ1-40(40 pM)、Aβ1-42(10 pM)、APP669-711(10 pM)を添加したものを試料として用意した。合成ペプチド(対象ペプチド)がスパイクされた血漿250μLにDDMとNTMを含むTris緩衝液250μLを混合させた後、氷上で5分静置させた。その血漿を抗Aβ抗体ビーズと混ぜて、氷上で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズをDDMとNTMを含むTris緩衝液100μLで3回洗浄し、50 mM 酢酸アンモニウム緩衝液50μLで2回洗浄した後、DDMを含むグリシン緩衝液により抗体ビーズに結合している対象ペプチドを溶出させた。その溶出液をDDMを含むTris緩衝液と混合させた後、抗体ビーズと混ぜて、氷上で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズをDDMを含むTris緩衝液50μLで5回洗浄し、50 mM 酢酸アンモニウム緩衝液50μLで2回洗浄し、さらにH2O 30μLで一回洗浄した後、溶出液(5 mM 塩酸を含有する70%(v/v) アセトニトリル)5μLにより抗体ビーズに結合しているペプチドを溶出させた。溶出液はL-メチオニンを含有しているものと、含有していないものを使用した。L-メチオニン濃度は、0.0067~67μMを使用した。免疫沈降により溶出させた対象ペプチドを第2実施形態の実施例(2-1)と同様の条件で、MALDI-TOF MSにより測定した。
日本国特許出願2018年第013052号(2018年1月29日出願)
Claims (19)
- メチオニンを含むペプチドを分析対象とする分析方法であって、
前記分析対象のペプチドと、レーザ脱離イオン化質量分析計の試料プレート上でのメチオニンの酸化を防止するための、タンパク質を備える酸化防止剤とを含む混合試料を調製することと、
前記混合試料をレーザ脱離イオン化質量分析計の試料プレートに配置することと、
前記試料プレートに配置された混合試料をレーザー脱離イオン化法によりイオン化することと、
イオン化された前記混合試料中のペプチドのメチオニン酸化体及びメチオニン非酸化体とを質量分離して該メチオニン酸化体及び該メチオニン非酸化体の少なくとも一方を検出することと、を備え、
前記タンパク質が、前記混合試料中において自身の酸化が生じることで該混合試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防止するものであり、
前記酸化防止剤が、前記タンパク質の他に、側鎖に被酸化部位を有するアミノ酸をさらに備え、
前記アミノ酸が、前記混合試料中において前記側鎖が酸素を捕捉することにより該混合試料中のペプチドのメチオニンの酸化を抑制するものである、分析方法。 - 請求項1に記載の分析方法において、
前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法である分析方法。 - 請求項1に記載の分析方法において、
前記タンパク質の濃度は、27.5nM以上275nM未満である分析方法。 - 請求項3に記載の分析方法において、
前記タンパク質の濃度は、260nM未満である分析方法。 - 請求項4に記載の分析方法において、
前記タンパク質の濃度は、45.2nM以上151nM未満である分析方法。 - 請求項1から5までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記酸化防止剤は、前記タンパク質および前記アミノ酸の他に、還元剤をさらに備える分析方法。 - 請求項6に記載の分析方法において、
前記アミノ酸は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、およびトリプトファンからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物であり、
前記還元剤は、ジチオトレイトール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、2-メルカプトエタノール、トリ‐n‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ-グリコール酸、N-アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化2-アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物である分析方法。 - 請求項6に記載の分析方法において、
前記アミノ酸および前記還元剤の濃度は、0.001mM以上10mM以下である分析方法。 - 請求項1または2に記載の分析方法において、
前記ペプチドは、アフィニティ精製を用いて精製されたものであり、
前記タンパク質は、前記アフィニティ精製に用いたリガンドであり、
前記アフィニティ精製において、前記ペプチドを溶出液を用いて溶出する前、または溶出した後に、前記溶出液に前記アミノ酸と、さらに還元剤とを加えることと、を備える分析方法。 - 請求項9に記載の分析方法において、
前記アミノ酸は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、およびトリプトファンからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物であり、
前記還元剤は、ジチオトレイトール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、2-メルカプトエタノール、トリ‐n‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ-グリコール酸、N-アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化2-アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物である分析方法。 - 請求項9に記載の分析方法において、
前記アミノ酸および前記還元剤の濃度は、0.0001mM以上10mM以下である分析方法。 - 請求項1~11のいずれか一項に記載の分析方法において、
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、フェツインからなる群から選択される少なくとも1つである、分析方法。 - 請求項1または2に記載の分析方法において用いられるペプチド酸化防止剤であって、
レーザー脱離イオン化法により分析対象のペプチドをイオン化する質量分析における試料の調製に用いられる、前記分析対象に含まれるメチオニンの酸化を防止するための、タンパク質および側鎖に被酸化部位を有するアミノ酸を含み、
前記タンパク質が、前記混合試料中において自身の酸化が生じることで該混合試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防止し、
前記アミノ酸が、前記混合試料中において前記側鎖が酸素を捕捉することにより該混合試料中のペプチドのメチオニンの酸化を抑制するものである、質量分析用ペプチド酸化防止剤。 - 請求項13に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記タンパク質の濃度は、27.5nM以上275nM未満である質量分析用ペプチド酸化防止剤。 - 請求項13に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記タンパク質および前記アミノ酸の他に、還元剤をさらに備える質量分析用ペプチド酸化防止剤。 - 請求項15に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記アミノ酸は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、およびトリプトファンからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物であり、
前記還元剤は、ジチオトレイトール、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン、2-メルカプトエタノール、トリ‐n‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ-グリコール酸、N-アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化2-アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物である質量分析用ペプチド酸化防止剤。 - 請求項13から16までのいずれか一項に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法である質量分析用ペプチド酸化防止剤。 - 請求項13から17までのいずれか一項に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記タンパク質が、ウシ血清アルブミン、トランスフェリン、フェツインからなる群から選択される少なくとも1つである、質量分析用ペプチド酸化防止剤。 - 請求項13から18までのいずれか一項に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤と、
試料プレートおよびマトリックスからなる群から選択される少なくとも一つとを備える質量分析用キット。
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