CN118425526A - 分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒 - Google Patents
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Abstract
提供分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒。所述分析方法具备：制备包含分析对象的肽和用于防止甲硫氨酸的氧化的具备蛋白质的抗氧化剂的试样；通过激光解吸电离法将肽电离；以及，将电离后的肽进行质量分离并检测。
Description
本申请是申请日为2019年1月28日、申请号为201980023278.1、发明名称为分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒的申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及分析方法、质谱分析用肽抗氧化剂和质谱分析用试剂盒。
背景技术
利用基质辅助激光解吸电离(MALDI)法等的质谱分析是用于解析肽等生物分子的强有力的手段。但是，通过MALDI法等将试样电离时，在试样板上配置试样后，试样中的肽有时发生氧化。
试样板上的肽的氧化在试样中的分子的浓度低、或试样板中包含对氧化进行催化的铜作为杂质、或试样中的氧浓度高等情况下容易发生。发生这种试样板上的肽的氧化时，会错误分析而使得比本来的试样的氧化状态更多地进行了氧化。
特别是肽的主链中的甲硫氨酸残基与其它氨基酸残基相比容易受到氧化。这种甲硫氨酸残基的氧化中，在很多情况下，侧链的硫原子通过氧化而转化为亚砜型。
专利文献1中提出了以将蛋白质/肽试样中的含甲硫氨酸的化学种收敛为甲硫氨酸氧化体作为目的的方法。这种方法导致试样的氧化状态变化。非专利文献1中，为了提高质谱分析对胰岛素等3000Da以上的高质量的肽的灵敏度，添加了牛血清白蛋白(BSA)、转铁蛋白等蛋白质，但没有记载抑制氧化的目的或效果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-292523号公报
非专利文献
非专利文献1：Gustavsson N,Kokke BP,Harndahl U,Silow M,Bechtold U,Poghosyan Z,Murphy D,Boelens WC,Sundby C.“A peptide methionine sulfoxidereductase highly expressed in photosynthetic tissue in Arabidopsis thalianacan protect the chaperone-like activity of a chloroplast-localized small heatshock protein,”The Plant Journal,(美国),Society for Experimental Biology,2002年3月1日,Volume 29,Issue 5,pp.545-553
发明内容
发明要解决的问题
期望抑制质谱分析中的肽的甲硫氨酸的氧化的、高效率的方法。
用于解决问题的方案
根据本发明的第1方式，分析方法具备：制备包含分析对象的肽和用于防止甲硫氨酸的氧化的抗氧化剂的试样，所述抗氧化剂具备蛋白质；通过激光解吸电离法将所述肽电离；以及，将电离后的所述肽进行质量分离并检测。
根据本发明的第2方式，第1方式的分析方法中，所述激光解吸电离法优选为基质辅助激光解吸电离法。
根据本发明的第3方式，第1或第2方式的分析方法中，所述蛋白质的浓度优选为27.5nM以上且不足275nM。
根据本发明的第4方式，第3方式的分析方法中，所述蛋白质的浓度优选不足260nM。
根据本发明的第5方式，第4方式的分析方法中，所述蛋白质的浓度优选为45.2nM以上且不足151nM。
根据本发明的第6方式，第1～第5中任一方式的分析方法中，所述抗氧化剂优选除了具备所述蛋白质之外还具备氨基酸和/或还原剂。
根据本发明的第7方式，第6方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂优选为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。
根据本发明的第8方式，第6或第7方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂的浓度优选为0.001mM以上且10mM以下。
根据本发明的第9方式，第1或第2方式的分析方法中，优选的是，所述肽使用亲和纯化而进行了纯化，所述蛋白质为所述亲和纯化所使用的配体，所述分析方法具备：在所述亲和纯化中，在使用洗脱液将所述肽洗脱前、或洗脱后，在所述洗脱液中添加氨基酸和/或还原剂。
根据本发明的第10方式，第9方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂优选为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。
根据本发明的第11方式，第9或第10方式的分析方法中，所述氨基酸和/或还原剂的浓度优选为0.0001mM以上且10mM以下。
根据本发明的第12方式，质谱分析用肽抗氧化剂用于防止甲硫氨酸的氧化，其包含蛋白质，用于通过激光解吸电离法将分析对象的肽电离的质谱分析中的试样的制备。
根据本发明的第13方式，第12方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，所述蛋白质的浓度优选为27.5nM以上且不足275nM。
根据本发明的第14方式，第12或第13方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，优选除了具备所述蛋白质之外还具备氨基酸和/或还原剂。
根据本发明的第15方式，第14方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，所述氨基酸和/或还原剂优选为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸、色氨酸、二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。
根据本发明的第16方式，第12～第15中任一方式的质谱分析用肽抗氧化剂中，所述激光解吸电离法优选为基质辅助激光解吸电离法。
根据本发明的第17方式，质谱分析用试剂盒具备第12～第16中任一方式的质谱分析用肽抗氧化剂、以及选自由试样板和基质组成的组中的至少一者。
发明的效果
根据本发明，能够高效抑制质谱分析中的肽的甲硫氨酸的氧化，比以往更准确地测定试样中的甲硫氨酸的氧化状态。
附图说明
图1为示出第一实施方式的分析方法的流程的流程图。
图2为示出第一实施方式的质谱分析用试剂盒的概要图。
图3为示出改变肽Aβ1-40的浓度时的质谱图中的对应于肽Aβ1-40的峰的图。
图4为示出改变BSA的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图5为示出添加到试样中的BSA的量与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图6为示出改变转铁蛋白的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图7为示出添加到试样中的转铁蛋白的量与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图8为示出改变胎球蛋白的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图9为示出添加到试样中的胎球蛋白的量与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图10为示出第二实施方式的分析方法的流程的流程图。
图11为示出第二实施方式的质谱分析用试剂盒的概要图。
图12为示出改变甘氨酸的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图13为示出添加到试样中的甘氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图14为示出改变L-甲硫氨酸的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图15为示出添加到试样中的L-甲硫氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图16为示出改变L-半胱氨酸的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图17为示出添加到试样中的L-半胱氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图18为示出改变L-组氨酸的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图19为示出添加到试样中的L-组氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图20为示出改变DTT的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。
图21为示出添加到试样中的DTT的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
图22为示出在包含L-甲硫氨酸或DTT的试样中添加BSA时和不添加BSA时的、基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的曲线图。
图23为示出第二实施方式的变形例的分析方法的流程的流程图。
图24为示出免疫沉淀的洗脱液的质谱图的图。
图25为示出免疫沉淀的洗脱液的L-甲硫氨酸浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。
附图标记说明
1、2…质谱分析用试剂盒；10…抗氧化蛋白质；20…基质；30…试样板；31…孔；40…低分子氧捕捉物质；C1、C2、C3…容器。
具体实施方式
以下参照图说明用于实施本发明的方式。
(第一实施方式)
第一实施方式的分析方法通过在用于质谱分析的试样中添加蛋白质作为抗氧化剂，从而防止试样中的肽的甲硫氨酸的氧化。
图1为示出本实施方式的分析方法的流程的流程图。步骤S1001中，制备包含分析对象的肽、以及用于防止甲硫氨酸的氧化的具备蛋白质的抗氧化剂的试样。分析对象的肽(以下称为对象肽)可以是氨基酸序列全部或部分进行了鉴定且包含甲硫氨酸的肽，也可以是氨基酸序列未知的肽。对象肽的氨基酸序列的残基数等没有特别限定，优选后述的实施例中使用的各肽那样的具有100以下或50以下的残基数的肽。
后述的实施例中使用了牛血清白蛋白(以下称为BSA)、转铁蛋白、胎球蛋白等蛋白质作为抗氧化剂，但作为抗氧化剂添加到试样中的蛋白质(以下称为抗氧化蛋白质)的种类没有特别限定。认为通过在试样中除了对象肽之外还存在容易氧化的分子，从而使被氧化的对象分散，抑制对象肽的氧化。
更具体而言，步骤S1001中，在包含对象肽的溶液(以下称为试样溶液)中以成为规定的浓度的方式添加抗氧化蛋白质。抗氧化剂蛋白质的浓度优选为27.5nM以上、更优选为35.0nM以上、更加优选为39.9nM以上、进一步优选为45.2nM以上。抗氧化蛋白质平均在各孔(well)中的物质的量优选为27.5fmol/well以上、更优选为35.0fmol/well以上、更加优选为39.9fmol/well以上、进一步优选为45.2fmol/well以上。抗氧化蛋白质平均在各孔中的量(质量换算)优选为1ng/well以上、进一步优选为3ng/well以上。抗氧化蛋白质的浓度越高或量越多，防止对象肽的氧化的效果越高，故而优选。
抗氧化蛋白质的浓度优选不足275nM、更优选不足260nM、更加优选不足151nM、进一步优选不足133nM。抗氧化蛋白质平均在各孔中的物质的量优选不足275fmol/well、更优选不足260fmol/well、更加优选不足151fmol/well、进一步优选不足133fmol/well。抗氧化蛋白质平均在各孔中的量(质量换算)优选不足30ng/well、进一步优选为10ng/well以下。抗氧化蛋白质的浓度过高或量过多时，容易发生由抗氧化蛋白质导致的电离抑制、污染物的生成，故不优选。
进而，制备包含基质和基质添加剂的溶液(以下称为含添加剂的基质溶液)。基质的种类没有特别限定，可以使用α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxycinnamicacid，以下称为CHCA)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-dihydroxybenzoic acid，以下称为DHB)或芥子酸等。基质添加剂的种类没有特别限定，可以使用亚甲基二膦酸(methylenediphosphonic acid，以下称为MDPNA)等。在步骤S1001结束后开始步骤S1003。
步骤S1003中，将通过步骤S1001制备的试样配置于质谱仪的试样板。含添加剂的基质溶液配置于试样板的各孔并使其干固后，将添加有抗氧化蛋白质的试样溶液加入到干固的基质中，使其干固。试样板可使用MALDI用的试样板，但在不使用基质的情况下，可使用激光解吸电离用的试样板。步骤S1003结束后，开始步骤S1005。
需要说明的是，质谱分析用的试样的制备方法不限定于上述方法，例如也可以在制备包含对象肽、抗氧化蛋白质、基质和基质添加剂的溶液后，将该溶液配置于试样板并使其干固。
步骤S1005中，配置于试样板的试样通过激光解吸电离法而发生电离。对于在步骤S1003干固的与试样板上的基质混合的试样，照射从质谱仪的激光装置射出的激光，引起试样的电离。激光可使用波长337nm的紫外光等，但只要适当进行电离，就没有特别限定。本实施方式中，示出了如上所述将基质与试样混合后照射激光进行电离的MALDI法的例子，但不使用基质的激光解吸电离法中也可应用本发明。步骤S1005结束后，开始步骤S1007。
步骤S1007中，对通过步骤S1005电离后的试样进行质量分离并检测。进行电离后的试样的质量分离的质谱仪的种类只要能够以期望的精度检测对象肽，就没有特别限定，在肽为数千Da以上的高质量的情况下，从准确地进行质量分离的观点出发，也优选飞行时间型质谱仪。由表示经质量分离的离子的强度的检测信号制作质谱图。例如，飞行时间型质谱仪中，基于预先获取的校准数据将飞行时间转换为m/z，在质谱图中显示对应于m/z的被检测到的离子的强度。此外，适宜地进行通过质谱分析测定的数据的解析。步骤S1007结束后，结束处理。
图2为示意性示出用于提供本实施方式的分析方法中使用的试剂等的质谱分析用试剂盒的图。质谱分析用试剂盒1具备：抗氧化蛋白质10、基质20和试样板30。
抗氧化蛋白质10用于通过激光解吸电离法、特别是MALDI法进行电离的试样的制备，其为用于防止对象肽的甲硫氨酸的氧化的质谱分析用肽抗氧化剂。基质20包含上述CHCA、DHB、或芥子酸等基质。基质20可以为固体状态，也可以为溶解于包含水和/或乙腈等的任意溶剂的状态。图2中，抗氧化蛋白质10和基质20分别容纳于容器C1和C2的内部，对容器C1和C2的种类、形状等没有特别限定。试样板30为激光解吸电离用、特别是MALDI用的试样板，形成有多个孔31，对孔31的形状、个数、配置的位置等没有特别限定。
需要说明的是，本实施方式的质谱分析用试剂盒至少具备抗氧化蛋白质10即可，对于基质20和试样板30，可以不具备，也可以具备它们中的任意一者或两者。
(第一实施方式的实施例)
以下，示出本实施方式的实施例，但本发明不限定于下述实施例。
＜1-1.包含抗氧化蛋白质的试样溶液的制备＞
制备了在3种肽Aβ1-40(Anaspec)、Aβ1-42(Anaspec)、APP669-711(肽研究所)的混合液中添加有BSA(Nacalai Tesque)、人转铁蛋白(Human transferrin)(Sigma-Aldrich)、牛胎球蛋白(Bovine fetuin)(Sigma-Aldrich)中任意蛋白质的试样溶液、以及未添加蛋白质的试样溶液。试样溶液的溶剂使用含有5mM盐酸的70％(v/v)乙腈。添加于试样溶液而得到的上述蛋白质的浓度为0.1、0.3、1、3、10、30、100ng/μL。此外，制备了不含上述3种蛋白质中的任一者、且以10、100、1000fmol/μL的各浓度包含Aβ1-40的试样溶液(以下称为Aβ1-40溶液)。
分析对象的肽(对象肽)的单字母符号的氨基酸序列和相应的序列表的序列号示于以下的表。Aβ1-40和Aβ1-42包含1残基的甲硫氨酸(M)，因此与侧链的硫原子对应的容易氧化的部位为1个位置，APP669-711包含2残基的甲硫氨酸，因此容易氧化的部位为2个位置。
[表1]
表
| 序列号 | 肽 | 序列 |
| 1 | Aβ1-40 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV |
| 2 | Aβ1-42 | DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA |
| 3 | APP669-711 | VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV |
<1-2.飞行时间型质谱分析>
使用CHCA作为质谱分析用的基质。基质溶液通过用70％(v/v)乙腈1mL溶解CHCA1mg而制备。将包含作为基质添加剂的MDPNA的0.4％(w/v)MDPNA溶液作为基质添加剂溶液。将基质溶液与基质添加剂溶液等量混合而制备含添加剂的基质溶液后，将含添加剂的基质溶液0.5μL滴加于MALDI用的试样板(μFocus MALDI plate 900μm、Hudson SurfaceTechnology，Inc.，Fort Lee，NJ)上的各孔，使其干固。然后，取由1-1制备的试样溶液1μL，滴加至上述试样板上的基质并使其干固。
使用MALDI法的飞行时间型质谱分析(以下称为MALDI-TOF MS)以线性模式进行，使用AXIMA Performance(Shimadzu/KRATOS，Manchester，UK)，以正离子模式检测。m/z值以峰的平均质量表示。m/z值使用人血管紧张素II(human angiotensin II)、人ACTH片段18-39(human ACTH fragment 18-39)、牛胰岛素氧化β链(bovine insulin oxidized beta-chain)和牛胰岛素(bovine insulin)作为外标来进行校准。
<1-3.关于肽的浓度和氧化状态>
图3为示出对将Aβ1-40溶液(10～1000fmol/μL)1μL滴加于试样板并使其干固而得到的试样(10～1000fmol/well Aβ1-40)进行质谱分析所得到的质谱图中的、对应于Aβ1-40的峰的图。肽越为低浓度，越比非氧化体更强地检测到氧化体，10fmol/well中为同等的峰高。
<1-4.基于蛋白质的氧化抑制的评价>
图4、图6和图8分别为示出改变BSA、转铁蛋白和胎球蛋白的各蛋白质的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。在不添加蛋白质(图中“无蛋白质添加”)的情况下将各肽(各肽的浓度500amol/μL)通过MALDI-TOF MS进行分析时，Aβ1-40和Aβ1-42突出地检测到氧化体的峰，APP669-711突出地检测到二氧化体(图中“氧化体(2处)”)的峰(图4、图6、图8)。
以0.1、0.3、1、3、10、30、100ng/μL的浓度添加有各蛋白质的试样中，逐渐提高添加量时，非氧化体成为主要的峰，抑制了各肽的氧化。此处，以0.1、0.3、1、3、10、30、100ng/μL的浓度添加有各蛋白质的情况下，在试样板上存在0.1、0.3、1、3、10、30、100ng/well的蛋白质。对于所使用的蛋白质、即BSA、转铁蛋白和胎球蛋白，全部观察到氧化抑制的效果。但是，添加量越多，非氧化体的峰反而变弱。认为蛋白质的添加量过多，发生了离子抑制。进而，添加量过多时，较强地检测到与源自蛋白质的污染物对应的峰(污染物峰)。本实施例中，污染物峰与对象肽所对应的峰的m/z不同，但如果在m/z取相近的值而这2个峰重叠的情况下，对象肽的特异性降低。鉴于这一点，优选根据对应于对象肽的峰的m/z，适当选择添加的蛋白质的种类。
关于对应于非氧化体的峰的强度高于对应于氧化体的峰、且呈清晰的峰形状的蛋白质的量的范围，对于BSA而言为3-10ng/well(对应于45.2-151fmol/well)，以将试样溶液滴加于试样板上时的浓度计为3-10ng/μL(对应于45.2-151nM)。转铁蛋白的上述范围为3-10ng/well(对应于39.9-133fmol/well)，以将试样溶液滴加于试样板上时的浓度计为3-10ng/μL(对应于39.9-133nM)。胎球蛋白的上述范围为1-10ng/well(对应于27.5-275fmol/well)，以将试样溶液滴加于试样板上时的浓度计为1-10ng/μL(对应于27.5-275nM)。若以重量(g)进行比较，则胎球蛋白即使在比其它抗氧化蛋白质低3倍的添加量1ng/well下，也确认到氧化抑制效果。若以物质的量(mol)进行比较，则BSA的45.2fmol/well、转铁蛋白的39.9fmol/well、胎球蛋白的27.5fmol/well这样的具有氧化抑制效果的物质的量(mol)的下限为相同程度。换言之，认为氧化抑制效果更取决于物质的量(mol)，而非重量(g)。另一方面，峰形状变得不清晰的蛋白质的量的范围对于BSA、转铁蛋白和胎球蛋白而言均为30ng/well以上，因此认为离子抑制取决于重量(g)。根据以上的数据，用于氧化抑制的蛋白质添加量适宜为27.5-275fmol/well(27.5-275nM)。
图5、7、9分别为示出添加到试样中的BSA、转铁蛋白和胎球蛋白的量与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。未添加蛋白质的试样中，对于Aβ1-40而言，氧化体的峰比非氧化体高8.5倍、对于Aβ1-42而言，氧化体的峰比非氧化体高6.1倍，对于APP669-711而言，氧化体(一氧化体(1处)与二氧化体(氧化体(2处))的峰强度相加而得到的值比非氧化体高11.6倍。另一方面，通过添加蛋白质，氧化体相对于非氧化体的比例减少，确认到最大96％的减少。根据以上的结果判明了：通过在试样中添加蛋白质而具有抑制氧化的效果，即使使用各种各样的蛋白质也具有效果。
(第二实施方式)
第二实施方式的分析方法通过在用于质谱分析的试样中除了添加蛋白质之外还添加氨基酸和/或还原剂作为抗氧化剂，从而防止试样中的肽的甲硫氨酸的氧化。
图10为示出本实施方式的分析方法的流程的流程图。步骤S2001中，制备如下的试样，即，所述试样包含：分析对象的肽(对象肽)、用于防止甲硫氨酸的氧化的蛋白质、以及具备除该蛋白质以外的氨基酸(游离氨基酸)和/或还原剂的抗氧化剂。对象肽可以是氨基酸序列全部或部分进行了鉴定且包含甲硫氨酸的肽，也可以是氨基酸序列未知的肽。对象肽的氨基酸序列的残基数等没有特别限定，优选实施例中使用的各肽那样的具有100以下、或50以下的残基数的肽。
上述抗氧化剂中所含的蛋白质(抗氧化蛋白质)的种类没有特别限定。与第一实施方式的情况同样地，认为通过在试样中除了对象肽之外还存在容易氧化的分子，从而使被氧化的对象分散，抑制对象肽的氧化。
更具体而言，步骤S2001中，在包含对象肽的溶液(试样溶液)中以成为规定的浓度的方式添加抗氧化蛋白质。抗氧化蛋白质的浓度没有特别限定，从促进由抗氧化蛋白质带来的抗氧化的观点出发，理想的是上述第一实施方式中被视为优选的浓度、物质量或质量的范围内。
本实施方式的抗氧化剂除了包含抗氧化蛋白质之外还包含氨基酸和/或还原剂。氨基酸和/或还原剂优选低分子化合物，该低分子化合物的分子量优选不足10000、更优选不足5000。另外，该低分子化合物的分子量优选小于上述抗氧化蛋白质的分子量。认为通过在试样溶液中存在捕捉氧的低分子化合物，从而抑制仅依靠抗氧化蛋白质无法防止的对象肽的氧化。以下，本实施方式中，将抗氧化剂中所含的游离氨基酸和/还原剂称为低分子氧捕捉物质。
低分子氧捕捉物质的浓度优选为0.001mM以上、更优选为0.01mM以上、进一步优选为0.1mM以上。低分子氧捕捉物质平均在各孔中的物质量优选为1pmol/well以上、更优选为10pmol/well以上、进一步优选为100pmol/well以上。低分子氧捕捉物质的浓度越高或量越多，防止对象肽的氧化的效果越高，故而优选。
低分子氧捕捉物质的浓度优选不足10mM、更优选不足1mM。低分子氧捕捉物质平均在各孔中的物质量优选不足10nmol/well、更优选不足1nmol/well。低分子氧捕捉物质的浓度过高或量过多时，发生电离抑制等，质谱分析的灵敏度有时降低，故不优选。
低分子氧捕捉物质中的氨基酸优选具有容易氧化的侧链的甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸和色氨酸中的至少一者。通过这些氨基酸的侧链接受氧，使试样溶液内的被氧化的对象分散，对象肽变得不易被氧化。
低分子氧捕捉物质中的还原剂如上所述优选为低分子化合物，没有特别限定，优选选自由二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙醇(2-ME)、三正丁基膦(TBP)、二硫赤藓糖醇(DTE)、抗坏血酸、多酚、焦亚硫酸钠、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少一种化合物。上述之中，多酚特别优选儿茶酸、异黄酮、鞣花酸、鞣酸。
进而，制备包含基质和基质添加剂的溶液(含添加剂的基质溶液)。基质的种类没有特别限定，可以使用CHCA、DHB或芥子酸等。基质添加剂的种类没有特别限定，可以使用MDPNA等。步骤S2001结束后，开始步骤S2003。
步骤S2003中，将通过步骤S2001制备的试样配置于质谱仪的试样板。含添加剂的基质溶液配置于试样板的各孔并使其干固后，将添加有抗氧化蛋白质、以及氨基酸和/或还原剂的试样溶液添加到干固的基质，并使其干固。试样板优选激光解吸电离用、特别是MALDI用的试样板。步骤S2003结束后，开始步骤S2005。
需要说明的是，质谱分析用的试样的制备方法不限定于上述方法，例如也可以在制备包含对象肽、抗氧化蛋白质、氨基酸和/或还原剂、基质和基质添加剂的溶液后，将该溶液配置于试样板并使其干固。
步骤S2005和步骤S2007分别与步骤S1005和步骤S1007同样，因此省去记载。步骤S2007结束后，结束处理。
图11为示意性示出用于提供本实施方式的分析方法中使用的试剂等的质谱分析用试剂盒的图。本实施方式的质谱分析用试剂盒2具备抗氧化蛋白质10、基质20、试样板30、以及包含氨基酸和/或还原剂的低分子氧捕捉物质40。
抗氧化蛋白质10以及低分子氧捕捉物质40用于通过激光解吸电离法、特别是MALDI法进行电离的试样的制备，其为防止对象肽的甲硫氨酸的氧化的质谱分析用肽抗氧化剂。基质20包含上述CHCA、DHB、或芥子酸等基质。基质20可以为固体状态，也可以为溶解于包含水和/或乙腈等的任意溶剂的状态。图11中，抗氧化蛋白质10、基质20以及低分子氧捕捉物质40分别容纳于容器C1、C2和C3的内部，对容器C1、C2和C3的种类、形状等没有特别限定。试样板30为激光解吸电离用的试样板，形成有多个孔31，对孔31的形状、个数、配置的位置等没有特别限定。
需要说明的是，本实施方式的质谱分析用试剂盒至少具备低分子氧捕捉物质40即可，对于抗氧化蛋白质10、基质20和试样板30，可以不具备，也可以具备它们中的任意一者、两者或全部。
(第二实施方式的实施例)
以下示出本实施方式的实施例，但本发明不限定于下述实施例。第一实施方式的实施例中，制作在Aβ1-40、Aβ1-42和APP669-711的混合液中添加有0.1、0.3、1、3、10、30或100ng/μL的BSA的试样溶液，进行质谱分析，研究了肽的氧化抑制(参照图4)。以下，在该试样溶液中进一步添加氨基酸和/或还原剂，进行了肽的氧化抑制的评价。
＜2-1.基于抗氧化蛋白质和氨基酸的肽的氧化抑制的评价＞
制备在3种合成肽Aβ1-40、Aβ1-42和APP669-711(参照第一实施方式的实施例的表)的混合液中与BSA 10ng/μL一起添加有氨基酸的试样溶液、以及未添加氨基酸的试样溶液。溶剂使用含有5mM盐酸的70％(v/v)乙腈。含氨基酸的试样溶液添加甘氨酸(NacalaiTesque)、L-甲硫氨酸(Nacalai Tesque)、L-半胱氨酸(Thermo Fisher Scientific)和L-组氨酸(Fluka)中的任意者作为氨基酸。如上所述，甲硫氨酸、半胱氨酸和组氨酸在侧链具有容易氧化的部位，但甘氨酸在侧链不具有容易氧化的部位。因此，甘氨酸用作比较例。添加的氨基酸的浓度对各个氨基酸分别为0.0001、0.001、0.01、0.1、1和10mM。在与第一实施方式的实施例同样的条件下，通过MALDI-TOF MS测定这些试样。
图12为示出改变甘氨酸的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。图13为示出添加到试样中的甘氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。即使除了添加BSA之外还以各种各样的浓度向试样溶液中添加甘氨酸，氧化体的峰也没有变化。换言之，未确认到由甘氨酸的添加带来的抑制肽的氧化的效果。
图14、16、18分别为示出改变L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-组氨酸的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。图15、17、19分别为示出添加到试样中的L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-组氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。试样溶液中分别添加有L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸和L-组氨酸的情况下，氧化体的峰降低，相对于非氧化体的氧化体的峰的比例减少。
关于氧化抑制的评价，将显著性水平设为p<0.05，通过新复极差法检验(Dunnett’s test)来进行。关于与无氨基酸添加的对照相比，利用3种肽之中的至少1种使氧化体的比例在统计学上显著减少的氨基酸浓度，L-甲硫氨酸的情况下为0.001-10mM、L-半胱氨酸的情况下为10mM、L-组氨酸的情况下为0.01-10mM。甘氨酸的情况下，未确认到统计学上显著的氧化体的减少。抑制氧化的效果最大的浓度在L-甲硫氨酸的情况下为100μM或1mM、L-半胱氨酸的情况下为1mM或10mM、L-组氨酸的情况下为1mM。关于L-组氨酸，成为10mM的高浓度时，离子抑制强，无法检测到峰。L-甲硫氨酸和L-半胱氨酸的情况下，也在10mM的浓度下存在灵敏度降低的倾向。显示氧化抑制的氨基酸共通的一点是，具有容易受到氧化的侧链。换言之，认为通过侧链捕捉氧，从而抑制了对象肽的氧化。
＜2-2.基于抗氧化蛋白质和还原剂的肽的氧化抑制的评价＞
制备在3种合成肽Aβ1-40、Aβ1-42、APP669-711的混合液中与BSA10ng/μL一起添加有还原剂DTT的试样溶液、以及未添加DTT的试样溶液。溶剂使用含有5mM盐酸的70％(v/v)乙腈。添加的DTT浓度为0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10mM。在与上述氨基酸的情况(2-1)同样的条件下，通过MALDI-TOF MS测定这些试样。
图20为示出改变DTT的浓度时的质谱图中的对应于各肽的峰的图。图21为示出添加到试样中的DTT的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。除了添加BSA之外还以各种各样的浓度向试样溶液中添加DTT时，在10μM以上的浓度下氧化体的峰降低，相对于非氧化体的氧化体的峰的比例减少。
关于氧化抑制的评价，将显著性水平设为p<0.05，通过新复极差法检验来进行。与无还原剂添加的对照相比，利用3种肽之中的至少1种使氧化体的比例在统计学上显著减少的DTT的浓度为10mM。添加有还原剂的情况下也显示出抑制试样板上的氧化。效果最大的浓度为10mM。需要说明的是，在10mM的浓度下存在灵敏度降低的倾向。
＜2-3.试样溶液中不含抗氧化蛋白质时的、基于氨基酸或还原剂的肽的氧化抑制的评价＞
制备在3种合成肽Aβ1-40、Aβ1-42和APP669-711的混合液中包含1mM L-甲硫氨酸且未添加抗氧化蛋白质的试样溶液、以及包含10mM DTT且未添加抗氧化蛋白质的试样溶液、以及在这些试样溶液中添加有10ng/μL BSA的试样溶液。溶剂使用含有5mM盐酸的70％(v/v)乙腈。在与上述氨基酸的情况(2-1)同样的条件下，通过MALDI-TOF MS测定这些试样。
图22为示出在包含L-甲硫氨酸或DTT的试样中添加有BSA的情况和未添加BSA的情况下的、基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的曲线图。在试样溶液中单独添加1mM L-甲硫氨酸或10mM DTT的情况下，相对于非氧化体的氧化体的峰的比例也减少，观察到抑制氧化的效果。通过除了添加这些之外还添加BSA，相对于非氧化体的氧化体的峰的比例进一步减少。其结果，通过在包含氨基酸和/或还原剂且不含抗氧化蛋白质的试样溶液中添加抗氧化蛋白质，显示出进一步抑制肽的氧化。
(第三实施方式)
第三实施方式的分析方法与第二实施方式的分析方法同样，通过在用于质谱分析的试样中除了添加蛋白质(抗氧化蛋白质)之外，还添加氨基酸和/或还原剂作为抗氧化剂，从而防止试样中的肽的甲硫氨酸的氧化。但是，本实施方式的分析方法中，通过亲和纯化将分析对象的肽(对象肽)纯化，将亲和纯化中洗脱液所含的配体用作抗氧化蛋白质。由此，能够有效地抑制对象肽的氧化，而无需将抗氧化蛋白质加入到试样溶液的操作。
图23为示出本实施方式的分析方法的流程的流程图。步骤S3001中，使用亲和纯化将对象肽纯化。亲和纯化的方法只要能够使用蛋白质作为结合于支撑体的配体，就没有特别限定，可以使用免疫沉淀(IP)、染色质免疫沉淀(ChIP)、拉下实验或亲和色谱法等。使用抗体作为配体的情况下，该抗体可以固定于包括旋转柱(spin column)等的任意的柱、以及移液器吸头、微流路。
亲和纯化中，将包含对象肽的肽溶液与结合于支撑体的配体进行接触，使肽溶液中的对象肽结合于配体。配体的种类只要能结合于支撑体且能够与对象肽结合，就没有特别限定，可以使用能够特异性或非特异性结合于对象肽的抗体等。
对象肽结合于配体后，使用缓冲液以保持该结合的状态清洗支撑体，去除未结合于配体的肽溶液的成分。然后，通过使包含低pH或高pH的缓冲液等的洗脱液与支撑体接触，将对象肽洗脱。步骤S3001结束后，开始步骤S3003。
步骤S3003中，在包含对象肽的亲和纯化的洗脱液中添加氨基酸和/或还原剂，制备试样溶液。氨基酸和还原剂优选使用第二实施方式中的低分子氧捕捉物质的、氨基酸和还原剂。试样溶液中，包含亲和纯化所使用的配体。认为与上述实施方式的情况同样，通过在试样中除了对象肽之外还存在容易氧化的分子，使被氧化的对象分散，抑制对象肽的氧化。
需要说明的是，亲和纯化中，可以预先在上述洗脱液中添加低分子氧捕捉物质的氨基酸和还原剂。由此，能够制备抑制了对象肽的氧化的试样溶液，而无需在洗脱后添加低分子氧捕捉物质。
本实施方式中的低分子氧捕捉物质的浓度优选为0.0001mM以上、更优选为0.00067mM以上、更加优选为0.0067mM以上、进一步优选为0.067mM以上。低分子氧捕捉物质的浓度越高，防止对象肽的氧化的效果越高，故而优选。本实施方式中的低分子氧捕捉物质的浓度优选不足10mM、更优选不足1mM。低分子氧捕捉物质的浓度过高时，发生电离抑制等，质谱分析中的灵敏度有时降低，故不优选。
另外，制备包含基质和基质添加剂的溶液(含添加剂的基质溶液)。基质的种类没有特别限定，可以使用CHCA、DHB或芥子酸等。基质添加剂的种类没有特别限定，可以使用MDPNA等。步骤S3003结束后，开始步骤S3005。
步骤S3005中，将通过步骤S3003制备的试样配置于质谱仪的试样板。含添加剂的基质溶液配置于试样板的各孔并使其干固后，将添加有作为抗氧化蛋白质的上述配体、以及氨基酸和/或还原剂的试样溶液添加到干固的基质，使其干固。步骤S3005结束后，开始步骤S3007。
需要说明的是，质谱分析用的试样的制备方法不限定于上述方法，例如，也可以在制备包含对象肽、上述配体、氨基酸和/或还原剂、基质以及基质添加剂的溶液后，将该溶液配置于试样板并使其干固。
步骤S3007和步骤S3009分别与步骤S1005和步骤S1007同样，因此省去记载。步骤S3009结束后，结束处理。
(第三实施方式的实施例)
以下示出本实施方式的实施例，本发明不限定于下述实施例。
＜3-1.免疫沉淀法(IP)＞
使抗Aβ抗体(克隆6E10)结合于Epoxy磁性珠(Thermo Fisher Scientific)，准备免疫沉淀用的抗Aβ抗体珠。准备在人血浆中添加合成肽Aβ1-40(40pM)、Aβ1-42(10pM)、APP669-711(10pM)而成的物质作为试样。向掺入有合成肽(对象肽)的血浆250μL中混合包含DDM和NTM的Tris缓冲液250μL后，在冰上静置5分钟。将该血浆与抗Aβ抗体珠混合，在冰上振荡1小时。然后，将抗体珠用包含DDM和NTM的Tris缓冲液100μL清洗3次，用50mM乙酸铵缓冲液50μL清洗2次后，用包含DDM的甘氨酸缓冲液将结合于抗体珠的对象肽洗脱。将该洗脱液与包含DDM的Tris缓冲液混合后，与抗体珠混合，在冰上振荡1小时。然后，将抗体珠用包含DDM的Tris缓冲液50μL清洗5次，用50mM乙酸铵缓冲液50μL清洗2次，进而用H2O 30μL清洗一次后，用洗脱液(含有5mM盐酸的70％(v/v)乙腈)5μL将结合于抗体珠的肽洗脱。洗脱液使用含有L-甲硫氨酸的洗脱液、以及不含有L-甲硫氨酸的洗脱液。L-甲硫氨酸浓度使用0.0067～67μM。对于通过免疫沉淀而洗脱的对象肽，在与第二实施方式的实施例(2-1)同样的条件下通过MALDI-TOF MS进行测定。
图24为示出免疫沉淀的洗脱液的质谱图的图。图24中示出了m/z为4000～20000的范围，对应于Aβ1-40的峰示于图的左侧。在将人血浆通过免疫沉淀进行处理而得到的样品中混入源自抗体珠的IgG，使得在图24的洗脱液的质谱图中观察对应于IgG的峰。因此，无需为了抗氧化而添加BSA等蛋白质，但有可能通过添加氨基酸等低分子氧捕捉物质而进一步抑制氧化。于是，评价了是否通过添加甲硫氨酸而进一步抑制对象肽的氧化。
图25为示出免疫沉淀的洗脱液的L-甲硫氨酸的浓度与基于质谱图的各肽的氧化体相对于非氧化体的比的关系的曲线图。添加有L-甲硫氨酸的洗脱液与未添加L-甲硫氨酸的洗脱液相比，相对于非氧化体的氧化体的峰的比例减少。关于氧化抑制的评价，将显著性水平设为p<0.05，通过新复极差法检验来进行。L-甲硫氨酸的浓度为0.67μM以上的情况下，与无氨基酸添加的对照相比，利用3种对象肽之中的至少1种使氧化体的比例在统计学上显著减少。其结果，免疫沉淀后的样品中包含L-甲硫氨酸等低分子氧捕捉物质时，显示出抑制氧化。
本发明不限定于上述实施方式的内容。在本发明的技术构思的范围内考虑的其它方式也包括在本发明的范围内。
如下的优选权基础申请的公开内容作为引用文并入于此。
日本特许出愿2018年第013052号(2018年1月29日申请)
Claims (23)
1.一种分析方法，其为以包含甲硫氨酸的肽为分析对象的分析方法，其具备：
为了测定试样中的所述分析对象的肽所含的甲硫氨酸的氧化状态，制备包含所述分析对象的肽和用于防止甲硫氨酸在激光解吸电离质谱仪的试样板上的氧化的抗氧化剂的混合试样，所述抗氧化剂具备蛋白质；
将包含所述抗氧化剂的混合试样配置在激光解吸电离质谱仪的试样板的孔中；
通过激光解吸电离法将配置在所述试样板的孔中的包含抗氧化剂的混合试样电离；以及
将电离后的包含所述抗氧化剂的混合试样中的肽的甲硫氨酸氧化体和甲硫氨酸非氧化体进行质量分离并检测该甲硫氨酸氧化体和该甲硫氨酸非氧化体中的至少一者，
所述蛋白质通过在包含所述抗氧化剂的混合试样中发生自身氧化而防止该混合试样中的肽的甲硫氨酸的氧化。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述激光解吸电离法为基质辅助激光解吸电离法。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，该还原剂包含有机化合物。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述蛋白质的浓度为27.5nM以上且不足275nM。
5.根据权利要求4所述的分析方法，其中，所述蛋白质的浓度不足260nM。
6.根据权利要求5所述的分析方法，其中，所述蛋白质的浓度为45.2nM以上且不足151nM。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂除了包含所述蛋白质之外还包含侧链具有被氧化部位的氨基酸，
所述氨基酸通过在所述混合试样中所述侧链捕捉氧而抑制该混合试样中的肽的甲硫氨酸的氧化。
8.根据权利要求7所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂除了包含所述蛋白质和所述氨基酸之外还包含还原剂，
所述氨基酸为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸和色氨酸组成的组中的至少1种化合物，
所述还原剂为选自由二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。
9.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，
所述混合试样中的所述还原剂的浓度为0.001mM以上且10mM以下。
10.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，
所述还原剂平均在各孔中的物质量为1pmol/well以上且10nmol/well以下。
11.根据权利要求1所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，
所述还原剂平均在各孔中的物质量为10pmol/well以上且1nmol/well以下。
12.根据权利要求1或2所述的分析方法，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，
所述肽使用亲和纯化而进行了纯化，
所述蛋白质为所述亲和纯化所使用的配体，
所述分析方法具备：在所述亲和纯化中，在用洗脱液将所述肽洗脱前、或洗脱后，在所述洗脱液中添加所述还原剂。
13.根据权利要求12所述的分析方法，其中，所述还原剂为选自由二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。
14.根据权利要求12所述的分析方法，其中，所述还原剂的浓度为0.0001mM以上且10mM以下。
15.根据权利要求1～15中任一项所述的分析方法，其中，所述蛋白质为选自由牛血清白蛋白、转铁蛋白、胎球蛋白组成的组中的至少1种。
16.一种质谱分析用肽抗氧化剂，其为权利要求1～3中任一项所述的分析方法中使用的肽抗氧化剂，
其包含蛋白质，所述蛋白质用于通过激光解吸电离法将分析对象的肽电离的质谱分析中的试样的制备，用于防止所述分析对象中所含的甲硫氨酸的氧化。
17.根据权利要求16所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述抗氧化剂包含还原剂，该还原剂包含有机化合物。
18.根据权利要求16所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述蛋白质的浓度为27.5nM以上且不足275nM。
19.根据权利要求16所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，除了具备所述蛋白质之外还具备侧链具有被氧化部位的氨基酸，
所述氨基酸通过在所述混合试样中所述侧链捕捉氧而抑制该混合试样中的肽的甲硫氨酸的氧化。
20.根据权利要求19所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，除了包含所述蛋白质和所述氨基酸之外还包含还原剂，
所述氨基酸为选自由甲硫氨酸、组氨酸、半胱氨酸和色氨酸组成的组中的至少1种化合物，
所述还原剂为选自由二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦、2-巯基乙醇、三正丁基膦、二硫赤藓糖醇、抗坏血酸、多酚、柠檬酸、葡萄糖、胡萝卜素、生育酚、巯基乙酸、N-乙酰半胱氨酸、羟胺、还原型谷胱甘肽、2-氨基乙基异硫脲氢溴酸盐和硫代甘油组成的组中的至少1种化合物。
21.根据权利要求16～20中任一项所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述激光解吸电离法为基质辅助激光解吸电离法。
22.根据权利要求16～21中任一项所述的质谱分析用肽抗氧化剂，其中，所述蛋白质为选自由牛血清白蛋白、转铁蛋白、胎球蛋白组成的组中的至少1种。
23.一种质谱分析用试剂盒，其具备：
权利要求16～22中任一项所述的质谱分析用肽抗氧化剂；以及
选自由试样板和基质组成的组中的至少一者。
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