JP7267606B2 - 検出方法 - Google Patents
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Description
すなわち、本発明は以下の通りである。
レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法。
[2]
臓器の漿膜側から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、[1]に記載の方法。
[3]
臓器の管腔内から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、[1]に記載の方法。
[4]
前記細胞染色剤が、スルフレチン、クルクミン、赤色3号(エリスロシン)および赤色106号からなる群より選ばれる1種類以上の染色剤である、[1]~[3]のいずれかに記載の方法。
[5]
細胞染色剤の投与が、臓器の漿膜側からの塗布、滴下または噴霧により行われる、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[6]
細胞染色剤の投与が、臓器の管腔内からの塗布、滴下または噴霧により行われる、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[7]
細胞染色剤の投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下注射投与、筋肉内注射投与、臓器内注射投与、胸腔内投与またはくも膜下投与である、[1]~[4]のいずれかに記載の方法。
[8]
レーザー照射が、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて行われる、[1]~[7]のいずれかに記載の方法。
[9]
[8]に記載の方法を使用し、がん細胞を可視化することを特徴とする、がん細胞の検出方法。
[10]
がんの存在が疑われる臓器において、がんが存在する場合に、所属リンパ節組織へのがんの浸潤を判定するための方法であって、リンパ節組織を覆う表面被膜の上から滴下、または、リンパ節内部に注射する方法で、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を当該リンパ節組織に投与し、次に、当該リンパ節組織に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することことを含む、[9]に記載の方法。
[11]
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する細胞の細胞質および核の形態について得られた可視化画像に基づいて細胞の種類を同定することを特徴とする、[9]に記載の方法。
[12]
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、[11]に記載の方法。
[13]
がんの存在が疑われる臓器において、赤色106号染色により臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該臓器組織内に存在するがん細胞および正常細胞周囲の毛細血管の走行パターンを比較し、がん細胞周囲で見られる毛細血管の消失および/または変形に基づき、がん細胞を検出することを特徴とする、[9]に記載の方法。
[14]
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、[13]に記載の方法。
[15]
臓器表面から0.05~1.0 mmまでの深さの細胞形態を可視化することを含む、[1]~[14]のいずれかに記載の方法。
[16]
さらに、がん組織の位置を、臓器におけるがん組織辺縁を蛍光染色することにより特定することを含む、[1]~[15]のいずれかに記載の方法。
[17]
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在するマイスナー神経叢またはアウエルバッハ神経叢を可視化することを含む、[9]に記載の方法。
[18]
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、[17]に記載の方法。
[19]
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、[17]に記載の方法。
[20]
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定されることを特徴とする、[17]に記載の方法。
[21]
さらに、がん細胞が検出されたことを音または光により通知することを含む、[9]~[20]のいずれかに記載の方法。
[22]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、漿膜側または管腔内からがん細胞を一個単位で除去し、がん患者を治療する方法。
[23]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、術後に漿膜側または管腔内から生体に残存するがん細胞を確認し、がん細胞一個単位で除去する方法。
[24]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、大腸がん患者を治療する方法。
[25]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、肺がん患者を治療する方法。
[26]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、前立腺がん患者を治療する方法。
[27]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、胃がん患者を治療する方法。
[28]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、食道がん患者を治療する方法。
[29]
[9]~[21]のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、膀胱がん患者を治療する方法。
[30]
クルクミンまたはスルフレチンによる臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する神経細胞の細胞質および核ならびに神経線維の形態、および/または神経線維・軸索を囲む髄鞘の形態について得られた可視化画像に基づいて、神経細胞の種類および神経ネットワークを同定する、[8]に記載の方法。
[31]
前記神経細胞が自律神経細胞であり、前記神経ネットワークがアウエルバッハ神経叢またはマイスナー神経叢である、[30]に記載の方法。
[32]
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による臓器組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、得られた細胞画像に基づいて、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別する、[9]に記載の方法。
[33]
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による消化管組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該消化管における5層構造(1.上皮と腺の層、2.粘膜筋板、3.粘膜下層、4.筋層、5.漿膜)について、正常組織とがん細胞の浸潤部の構造に関する画像の差異に基づいて、各層ごとに、がん浸潤の有無を判定する、[9]に記載の方法。
[34]
[9]に記載の方法を用いることを特徴とする、個体におけるがんの検出方法であって、可視化画像に基づき、正常細胞と比較して、細胞が異型であると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程、または、正常細胞と比較して、腺構造・陰窩構造の分布パターンの規則性が失われると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程を含む、がんの検出方法。
[35]
[17]
に記載の方法を用いることを特徴とする、進行がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程、またはがんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程を含む、進行がんの診断方法。
[36]
[17]に記載の方法を用いることを特徴とする、早期がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定される工程を含む、早期がんの診断方法。
[37]
[8]に記載の方法を使用する、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハン島の可視化方法。
[38]
[8]に記載の方法を使用する、舌または軟口蓋に存在する味蕾の可視化方法。
[39]
[8]に記載の方法を使用する、坐骨神経などの末梢神経の可視化方法。
[40]
[8]に記載の方法を使用する、脳組織の可視化方法。
[41]
前記脳組織が大脳皮質、海馬、扁桃体、視床下部または小脳である、[40]
に記載の方法。
[42]
[40]または[41]に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、脳疾患または脳症状の判定方法。
[43]
前記脳疾患または脳症状が、アルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性硬化症および脊髄小脳変性症を含む、[42]に記載の方法。
[44]
[8]に記載の方法を使用する、眼組織の可視化方法。
[45]前記眼組織が網膜である、[44]に記載の方法。
[46]
[44]または[45]に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、眼疾患または眼症状の判定方法。
[47]
前記眼疾患または眼症状が、黄斑変性、網膜変性、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、増殖性硝子体網膜症、緑内障、網膜剥離および網膜浮腫を含む、[46]
に記載の方法。
[48]
[10]に記載の方法を用いることを特徴とする、、腹腔鏡外科手術中に、当該リンパ節にがん細胞が存在するか否かを、リンパ節切除前に判定する方法。
[49]
リンパ節に転移したがん細胞を、がん細胞だけを一個単位でレーザー蒸散で破壊して、がん細胞の死骸を免疫細胞に認識させて、活性化されたリンパ球に、がんの原発巣のがん細胞を攻撃させることを特徴とする、がん免疫療法。
[50]
クルクミンの経口投与、腹腔内投与で、消化管、全身の脳と網膜の神経細胞の細胞体、味、匂いの感覚細胞、内分泌細胞、リンパ節、骨格筋、肺、膵臓、肝臓の細胞構造を可視化し、可視化した細胞構造をレーザー顕微内視鏡と蛍光顕微鏡で画像化することで、細胞の位置、数、形、大きさ、配列に異常をきたす全ての疾患を診断する方法。
[51]
[50]に記載の方法を用いることを特徴とする、レーザー照射で、問題のある細胞を、一個単位で破壊・除去する方法。
[52]
再生医療で移植したiPS細胞が未分化細胞・がん細胞になったときには、それらの細胞のみを、レーザーで破壊する治療法。
[53]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、子宮がん、卵巣がんのがん患者を治療する方法。
[54]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、乳がんのがん患者を治療する方法。
[55]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓がん、胆嚢がんのがん患者を治療する方法。
[56]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、舌がん、咽喉がん、喉頭がん、甲状腺がんを治療する方法。
[57]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、扁桃腺炎の原因を診断する方法。
[58]
扁桃腺に浸潤している白血球において、好中球が多く浸潤する場合は細菌感染性扁桃腺炎、好酸球が多く浸潤する場合はアレルギー性扁桃腺炎、リンパ球が多く浸潤する場合はウイルス感染性扁桃腺炎と判断する工程を含む、[57]に記載の方法。
[59]
[9]~[21], [38]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、味蕾、嗅上皮の感覚細胞の形態を解析し、味覚異常および/または嗅覚異常を診断する方法。
[60]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、骨格筋の形態を解析し、サルコペニアおよび/または重症筋無力症の病変を診断する方法。
[61]
[9]~[21]のいずれか1項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓のランゲルハンス島および/または甲状腺の内分泌細胞細胞の形態を解析し、糖尿病および/またはバセドー病を診断する方法。
(i)0.45%グリセリン、0.5%エタノールの溶液に、化学合成クルクミンを1mg/ml程度まで希釈したものを用いる。
(ii)沖縄クルクミン粉末1gを10mlのPBSで溶かして、1mg/ml程度までに希釈したものを用いる。
(i)、(ii)ともに、使用直前に、滅菌フィルターで無菌化したものを、生体に投与する。
観察までの染色時間は、粘膜表面または臓器表面に直接塗布する場合は投与後1~30分間、経口投与する場合は投与後30分~1時間、静脈内投与する場合は投与後3分~1時間、腹腔内投与する場合は投与後3分~1時間、皮下注射投与する場合は投与後3分~1時間、筋肉内注射投与する場合は投与後3分~1時間、臓器内注射投与する場合は投与後5分~30分間、胸腔内投与またはくも膜下投与する場合は投与後3分~1時間とする。
〔細胞染色液の調製〕
クルクミン(東京化成、カタログ番号C2302、純度97.0%)100 mgをエタノール5 mLに懸濁し、さらにエタノールで10倍希釈した。これを同量のグリセリンと混合し、さらにグリセリンで10倍希釈した。この混合液を同量の精製水と混合し、クルクミン染色液とした。赤色106号については、その粉末を生理的食塩水で1mg/mLに溶解した溶液を、染色液とした。
〔動物〕
試験には、日本エスエルシー株式会社から購入したC57BL/6Nマウスを用いた。性別は雄、8週齢、体重20~25グラムのマウスを用いてすべての試験を行った。
〔大腸がんモデルマウス作製法〕
大腸がんモデルマウスは、C57BL/6Nマウスに、生理食塩水で溶解したアゾキシメタン(azoxymethane, AOM)10 mg/kgを週1回間隔で4回腹腔投与して作製した。
〔レーザー照射の条件〕
多光子レーザー顕微鏡はオリンパス社製FVMPE-RSを用い、照射波長は800 nmとした。レーザー照射は、フルパワー出力の5.8~48.2%の出力で行った。共焦点レーザー顕微鏡はオリンパス社製FV1000を用い、照射波長は488nmおよび594nmとした。488nmのレーザー照射は、フルパワー出力の15~29.4%の出力で、また594nmのレーザー照射は、フルパワー出力の13~13.5%の出力で行った。照射の方向および漿膜側または内腔側からの染色については、図中に記載した。
Claims (14)
- がん細胞を可視化することを特徴とする、がん細胞の検出に用いる細胞染色剤であって、該細胞染色剤が、クルクミンまたはスルフレチンであり、がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在するマイスナー神経叢またはアウエルバッハ神経叢を可視化することを含む細胞染色剤。
- がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、請求項1に記載の細胞染色剤。
- がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、請求項1に記載の細胞染色剤。
- がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定されることを特徴とする、請求項1に記載の細胞染色剤。
- 生体染色検査に用いる細胞染色剤であって、該細胞染色剤がクルクミンまたはスルフレチンであり、クルクミンまたはスルフレチンによる臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する神経細胞の細胞質および核ならびに神経線維の形態、および/または神経線維・軸索を囲む髄鞘の形態について得られた可視化画像に基づいて、神経細胞の種類および神経ネットワークを同定することを特徴とする、細胞染色剤。
- 前記神経細胞が自律神経細胞であり、前記神経ネットワークがアウエルバッハ神経叢である、請求項5に記載の細胞染色剤。
- がん細胞の検出に用いる細胞染色剤であって、該細胞染色剤がクルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号であり、クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による消化管組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該消化管における5層構造(1.上皮と腺の層、2.粘膜筋板、3.粘膜下層、4.筋層、5.漿膜)について、正常組織とがん細胞の浸潤部の構造に関する画像の差異に基づいて、各層ごとに、がん浸潤の有無を判定することを特徴とする、細胞染色剤。
- 進行がんの診断のための請求項1に記載の細胞染色剤であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程、またはがんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程を含む、細胞染色剤。
- 早期がんの診断のための請求項1に記載の細胞染色剤であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定される工程を含む、細胞染色剤。
- 扁桃腺炎の原因を診断するための細胞染色剤であって、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いてレーザーを照射することを特徴とする、細胞染色剤。
- 扁桃腺に浸潤している白血球において、好中球が多く浸潤する場合は細菌感染性扁桃腺炎、好酸球が多く浸潤する場合はアレルギー性扁桃腺炎、リンパ球が多く浸潤する場合はウイルス感染性扁桃腺炎と判断する工程を含む、請求項10に記載の細胞染色剤。
- 味覚異常および/または嗅覚異常を診断するための細胞染色剤であって、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いてレーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法を用いることを特徴とする、味蕾、嗅上皮の感覚細胞の形態を解析することを特徴とする、細胞染色剤。
- サルコペニアおよび/または重症筋無力症の病変を診断するための細胞染色剤であって、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いてレーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法を用いることを特徴とする、骨格筋の形態を解析することを特徴とする、細胞染色剤。
- 糖尿病および/またはバセドー病を診断するための細胞染色剤であって、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いてレーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法を用いることを特徴とする、膵臓のランゲルハンス島および/または甲状腺の内分泌細胞の形態を解析することを特徴とする、細胞染色剤。
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