JP7239252B2 - 抗生物質耐性を減弱するための方法および組成物 - Google Patents

抗生物質耐性を減弱するための方法および組成物 Download PDF

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Description

分野
本発明は、一部として、ベータラクタマーゼを用いて抗生物質耐性を軽減するための組成物および方法を提供する。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１１月１日出願の米国特許仮出願第６２／４１５，６７９号および２０１７年２月１５日出願の米国特許仮出願第６２／４５９，０９２号の利益を主張するものであり、それらの各出願の内容は、全体として参照により本明細書に組み入られる。
配列表
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出されていて、全体として参照により本明細書に組み入られる、配列表を含む。２０１７年１０月３１日頃に作成されたＡＳＣＩＩのコピーは、１１．８ＫＢサイズで、ＳＹＮ－０２８ＰＣ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称である。
背景
抗生物質耐性は、細菌が、抗生物質を含む、薬物、化学物質、または感染を治癒もしくは予防するように設計された他の薬剤の効果を低減するように変化する際に、生じる。結果として生じた耐性菌は、生き残って増殖し続け、それにより抗生物質処置を回避する。
ＣＤＣによれば、米国では毎年、少なくとも２００万人が抗生物質耐性菌に感染し、これらの感染の直接的結果として、毎年、少なくとも２３０００人が死亡している。
抗生物質への細菌耐性を回避または軽減するための組成物および方法への緊急のアンメットメディカルニーズが今も存在する。
概要
したがって本発明は、幾つかの態様において、抗生物質耐性を促進することなく、または予防もしくは軽減することにより、対象への抗生物質投与を可能にするための組成物および方法を提供する。様々な態様において、本発明は、胃腸の（ＧＩ）マイクロバイオームをはじめとするマイクロバイオームを調整して、抗生物質への耐性を低減または予防するための治療性ベータラクタマーゼの使用に関する。様々な実施形態において、本発明は、例えばレジストームの存在の増加を低減または予防するために、抗生物質の投与前に対象のレジストーム状態を保持するための治療性ベータラクタマーゼの使用に関する。様々な実施形態において、本発明は、抗生物質が投与されても対象のレジストーム状態を低減するための治療性ベータラクタマーゼの使用に関する。
様々な態様において、本発明は、抗生物質に耐性であると決定された患者において、その抗生物質または異なる抗生物質より前にまたはそれと同時に、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９５％（または９７％、または９８％、または９９％、または１００％）の同一性があるアミノ酸配列を有する（かつ場合によりＡｍｂｌｅｒ Ｄ２７６Ｎ突然変異を有する）ベータラクタマーゼの有効量を投与することにより、感染を処置または予防するための方法に関する。
様々な実施形態において、患者は、抗生物質に耐性であり、ベータラクタマーゼが、同じ抗生物質への治療的応答を提供するか、または患者は、抗生物質に耐性であり、ベータラクタマーゼが、異なる抗生物質への治療的応答を提供する。
様々な実施形態において、抗生物質への耐性は、抗微生物感受性テスト（ＡＳＴ）または１種もしくは複数のシークエンシング法を用いて（例えば、患者からの生体試料（例えば、便またはＧＩ管液の吸引物）中の耐性に関連する１種または複数の遺伝子の存在、非存在またはレベルを検出して計測することにより）計測される。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、表Ａに列挙される遺伝子の１つである。様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ、バンコマシンおよび／またはマクロライド耐性遺伝子である。様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼまたはＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤ遺伝子のＣｆｘＡファミリーである。様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ａｃｒＥ、ａｃｒＦ、ａｃｒＳ、ＡｍｐＣ、ｂａｅＲ、ｃｆｘＡ、ｃｐｘＲ、ｅｒｍＹ、ｍａｒＡ、ｍｄｔＤ、ｍｄｔＮ、ｍｄｔＫ、ｐｂｐ２、ｐｂｐ４、およびＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤの１つまたは複数である。
様々な実施形態において、それに対し耐性が存在する、またはそれに対しベータラクタマーゼが治療的応答の誘導を支援する抗生物質は、ベータラクタム系、カルバペネム系、モノバクタム系、β－ラクタマーゼ阻害剤、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、リファマイシン系、マクロライド系、ケトライド系、リンコサミド系、ストレプトグラミン系、スルホンアミド系、オキサゾリジノン系、およびキノロン系から選択される異なる抗生物質である。
様々な実施形態において、本発明の方法は、様々な抗生物質への耐性の発生を予防または低減する。例えばそのような抗生物質としては、ペニシリン系およびセファロスポリン系を含む、β－ラクタム系抗生物質が挙げられる。
実施例のブタ試験の図式的タイムラインを示す。 ブタ糞便マイクロバイオーム中の全ての抗生物質耐性遺伝子の頻度のヒートマップ解析を示す。 ブタ糞便マイクロバイオーム中のベータラクタマーゼ遺伝子の頻度のヒートマップ解析を示す。 選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の変化を示す。このデータは、実施例１の試験由来である。 選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の変化を示す。このデータは、実施例１の試験由来である。 選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の変化を示す。このデータは、実施例２の試験（即ち、アモキシシリンまたはエルタペネム処置）由来である。 アモキシシリン単独（黒色）またはアモキシシリン＋ＳＹＮ－００４（白色）で処置されたイヌにおけるアモキシシリン血清レベルを示す。データは、曲線下面積（平均および標準偏差）として示される。１日目データを左パネルに示し、６日目データを右パネルに示す。データを、一元配置分散分析およびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を利用して比較し、ｐ値は、１日目について０．７０３、６日目について０．０９８であった。 主座標分析を示す。糞便マイクロバイオームの３成分の主座標分析。各動物の糞便マイクロバイオームを、Ｂｒａｙ－Ｃｕｒｔｉｓ距離尺度を利用して主座標分析をにより分析した。アモキシシリン単独の処置前（黄色）、処置後（緑色）。アモキシシリン＋ＳＹＮ－００４の処置前（桃色）および処置後（茶色）。右側の２つの円は、緑色のドットのみを含む。 選択されたベータラクタマーゼ遺伝子の頻度の変化を示す。選択された抗生物質遺伝子ＴＥＭ－１１３（左）およびＯＸＡ－１３６（右）の相対的頻度を、アモキシシリン単独（左パネル）またはアモキシシリン＋ＳＹＮ－００４（右パネル）について示す。各データポイントは、処置前～処置後の各動物のマイクロバイオームにおける相対的遺伝子頻度を表す。 選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の変化を示す。処置後に対して比較した処置前のアモキシシリン単独（黒色バー）またはアモキシシリン＋リバキサマーゼ（白色バー）に対する示された抗生物質耐性遺伝子の相対的頻度（平均）の変化。負の値は頻度の低下を示し、正の値は頻度増加を示す。遺伝子を水平軸に列挙する。
詳細な記載
様々な態様において、本発明は、抗生物質に耐性であると決定された患者において、この抗生物質または異なる抗生物質より前にまたはそれと同時に、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９５％（または９７％、または９８％、または９９％、または１００％）の同一性があるアミノ酸配列を有する（かつ場合によりＡｍｂｌｅｒ Ｄ２７６Ｎ突然変異を有する）ベータラクタマーゼの有効量を投与することにより、感染を処置または予防するための方法に関する。
様々な実施形態において、患者は、抗生物質に耐性であり、ベータラクタマーゼが、同じ抗生物質への治療的応答を提供するか、または患者は、抗生物質に耐性であり、ベータラクタマーゼが、異なる抗生物質への治療的応答を提供する。
様々な実施形態において、抗生物質への耐性は、抗微生物感受性テスト（ＡＳＴ）または１種もしくは複数のシークエンシング法を用いて（例えば、患者からの生体試料（例えば、便またはＧＩ管液の吸引物）中の耐性に関連する１種または複数の遺伝子の存在、非存在またはレベルを検出して計測することにより）検出される。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、表Ａに列挙される遺伝子の１つである。様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ、バンコマシンおよび／またはマクロライド耐性遺伝子である。様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼまたはＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤ遺伝子のＣｆｘＡファミリーである。様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ａｃｒＥ、ａｃｒＦ、ａｃｒＳ、ＡｍｐＣ、ｂａｅＲ、ｃｆｘＡ、ｃｐｘＲ、ｅｒｍＹ、ｍａｒＡ、ｍｄｔＤ、ｍｄｔＮ、ｍｄｔＫ、ｐｂｐ２、ｐｂｐ４、およびＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤの１つまたは複数である。
様々な実施形態において、それに対し耐性が存在する、またはそれに対しベータラクタマーゼが治療的応答の誘導を支援する抗生物質は、ベータラクタム系、カルバペネム系、モノバクタム系、β－ラクタマーゼ阻害剤、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、リファマイシン系、マクロライド系、ケトライド系、リンコサミド系、ストレプトグラミン系、スルホンアミド系、オキサゾリジノン系、およびキノロン系から選択される異なる抗生物質である。
処置の方法
様々な実施形態において、本発明は、抗生物質耐性を促進することのない、または予防もしくは軽減することによる、対象への抗生物質投与の方法に関する。様々な実施形態において、本発明は、胃腸の（ＧＩ）マイクロバイオームをはじめとするマイクロバイオームを調整して、抗生物質への耐性を低減または予防するための治療性ベータラクタマーゼの使用に関する。様々な実施形態において、本発明は、例えばレジストームの存在の増加を低減または予防するために、抗生物質の投与前に対象のレジストームの状態を保持するための治療性ベータラクタマーゼの使用に関する。様々な実施形態において、本発明は、抗生物質が投与されても対象のレジストームの状態を低減するための治療性ベータラクタマーゼの使用に関する。
したがって様々な実施形態において、本発明は、対象について抗生物質選択肢の増加を可能にする。例えば対象は、本明細書に記載される抗生物質のいずれかに対して耐性を有する微生物を宿していてよく、したがってそのような抗生物質での処置に応答する見込みがなくてよい。本発明のベータラクタマーゼの投与は、理論に結びつけるのを望むものではないが、耐性に不都合になるようにＧＩマイクロバイオームを調整することにより、それに対する耐性が予測される抗生物質であっても、抗生物質応答の確率を上昇させる。
様々な実施形態において、本発明は、治療性ベータラクタマーゼにより抗生物質耐性の出現を予防するための方法および組成物に関する。様々な実施形態において、本発明は、腸管マイクロバイオーム中の抗生物質耐性生物体の出現を予防するための方法および組成物に関する。
様々な実施形態において、本発明は、治療性ベータラクタマーゼにより抗生物質耐性を低減または排除するための方法および組成物に関する。様々な実施形態において、本発明は、治療性ベータラクタマーゼにより腸管マイクロバイオーム中の抗生物質耐性生物体を低減または排除するための方法および組成物に関する。
様々な実施形態において、本発明の方法は、抗生物質投与により加えられる選択的アンティビオティックプレッシャーにもかかわらず、対象のレジストームの維持または低減を可能にする。したがって様々な実施形態において、本発明は、耐性を担う日和見病原体の出現を低減または予防する。
様々な実施形態において、患者は、１種または複数の抗生物質に耐性である。例えば患者が耐性であることは、抗微生物感受性テスト（ＡＳＴ）または１種もしくは複数のシークエンシング法を用いて（例えば、患者からの生体試料（例えば、便またはＧＩ管液の吸引物）中の耐性に関連する１種または複数の遺伝子の存在、非存在またはレベルを検出して計測することにより）決定されてよい。さらに患者が耐性であることは、過去の１種または複数の抗生物質での処置の失敗により示されてよい。
様々な実施形態において、本発明は、処置の選択肢、例えば抗生物質の選択を評定するために、例えば本明細書に記載されるような、１種または複数の抗生物質耐性遺伝子のスクリーニングを可能にする。例えば幾つかの態様において、対象は、抗生物質が投与されるべきか、および／または本発明のベータラクタマーゼが抗生物質を補助するために投与されるべきか、を決定するために、抗生物質耐性遺伝子の状態について評価される。例として本発明は、幾つかの態様において、抗生物質処置の前に１種または複数の抗生物質耐性遺伝子について対象をスクリーニングすることを提供し、耐性を示す増加された発現があれば、そのような耐性を低減または排除するために本発明のベータラクタマーゼを共投与することを提供する。あるいは幾つかの態様において、本発明は、抗生物質処置の過程の早期に１種または複数の抗生物質耐性遺伝子について対象をスクリーニングすることを提供し、耐性を示す増加された発現が観察されれば、そのような耐性を低減または排除するために本発明のベータラクタマーゼを投与することを提供する。
様々な実施形態において、本発明は、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約９０％の、耐性遺伝子の耐性または発現における定量可能な変化をもたらす。幾つかの態様において、効果は、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、または約９０％またはより多くの定量可能な変化をもたらす。治療上の利益としては、耐性の進行を停止または緩徐化することも挙げられる。
様々な実施形態において、本発明の方法は、例えば少なくとも約２倍、または５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または２５倍、または５０倍の、耐性遺伝子の耐性または発現における定量可能な変化をもたらす。幾つかの態様において、本発明の方法は、対照試料（例えば、抗生物質に対し耐性でないもの）に比較して、例えば少なくとも約２倍、または５倍、または１０倍、または１５倍、または２０倍、または２５倍、または５０倍の、耐性遺伝子の耐性または発現における低減をもたらす。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、基質拡張型ＯＸＡ分類ＤベータラクタマーゼをコードするｂｌａＯＸＡ、基質拡張型分類ＡセリンベータラクタマーゼをコードするｂｌａＣＴＸ－Ｍ＿８２、ｂｌａＣＦＸ＿Ａ４、および基質拡張型セファロスポリン耐性分類ＣベータラクタマーゼをコードするＡｍｐＣなどのベータラクタマーゼ遺伝子；ＡｃｒＥＦ－ＴｏｌＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードするａｃｒＥなどの多剤排出トランスポーター系遺伝子（Ｌａｕ ａｎｄ Ｚｇｕｒｓｋａｙａ， ２００５， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８７：７８１５）；ＭｄｔＡＢＣ多剤排出トランスポーター系の応答調節因子をコードするｂａｅＲ（Ｎａｇａｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４：４１６１）；ＥｍｒＫＹ－ＴｏｌＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードするｅｍｒＹ（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３：２５７）；ＭｄｔＡＢＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードするｍｄｔＤ（Ｎａｇａｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４：４１６１）；主要促進剤スーパーファミリーからの多剤耐性排出ポンプをコードするｍｄｔＮ（Ｓｕｌａｖｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５：１１２６）；ペニシリン結合タンパク質２をコードするｐｂｐ２（Ｂｈａｒａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５９：５００３）；ペニシリン結合タンパク質４をコードするｐｂｐ４（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９７２０２）；ならびにアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードするアミノグリコシド＿ｓｔｒＡ（Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｇｅｎｅ ７５：２７１）およびテトラサイクリン排出ポンプの成分をコードするテトラサイクリン＿ｔｅｔ３９（Ａｇｅｒｓｏ ａｎｄ Ｇｕａｒｄａｂａｓｓｉ， ２００５， Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５５：５６６）である。
他の抗生物質耐性遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子データベース（ＡＲＤＢ）において提供され、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２００９） ３７（ｓｕｐｐｌ １）： Ｄ４４３－Ｄ４４７、ａｒｄｂ．ｃｂｃｂ．ｕｍｄ．ｅｄｕ．のＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ）、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｊｕｌｙ ２０１３ ｖｏｌ． ５７ ｎｏ． ７ ３３４８－３３５７、およびＮＣＢＩデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ のＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ））を参照されたい（それらの内容全体が参照により本明細書に組み入られる）。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、表Ａ：
Figure 0007239252000001
Figure 0007239252000002

Figure 0007239252000003

Figure 0007239252000004
に列挙される遺伝子の１つまたは複数である。
様々な実施形態において、耐性遺伝子は、テトラサイクリン耐性遺伝子である。様々な実施形態において、耐性遺伝子は、ＴＥＭ－１およびＣＭＹのようなβ－ラクタム（セファロスポリンを含む）耐性（ｂｌａ）に関与する遺伝子である。３００を超えるβ－ラクタム耐性遺伝子が同定されており、これらは、Ａｍｂｌｅｒ分類Ａ～Ｄに分類され、本発明の可能な遺伝子である。手短に述べると、分類Ａ、ＣおよびＤは、セリンプロテアーゼであり、一方で分類Ｂは、近年になり記載されたＮＤＭ－１のようなＺｎ２＋メタロプロテアーゼである。これらの酵素は全て、β－ラクタム環を加水分解することにより、β－ラクタム系抗生物質を分解する。メチシリン耐性スタフィロコッカス・アウレウスの修飾ペニシリン結合タンパク質２（ＰＢＰ２ａ）のようなβ－ラクタム耐性の非酵素的メカニズムも存在し、他の生物体も、類似の耐性メカニズムを利用する。
分類Ａベータラクタマーゼ（Ａｍｂｌｅｒ分類）は、セリンベータラクタマーゼを指し、ベータラクタマーゼの加水分解が、通常はアルファヘリックス２のアミノ酸位置７０にある、活性部位のセリンにより媒介される。分類Ａベータラクタマーゼとしては、Ｌｅｎ－１、ＳＨＶ－１、ＴＥＭ－１、ＰＳＥ－３／ＰＳＥ－３、ＲＯＢ－１、バチルシ・セレウス、例えば５／Ｂ １型、５６９／Ｈ １型および５６９／Ｈ ３型など、バチルス・アントラシスｓｐｐ．、バチルス・リッチェニフォルミス、例えばＰｅｎＰ、バチルス・ウェイヘンステファネンシス、バチルス・クラウシー、スタフィロコッカス・アウレウス、ＰＣ１、Ｓｍｅ－１、ＮｍｃＡ、ＩＭＩ－、ＰＥＲ－、ＶＥＢ－、ＧＥＳ－、ＫＰＣ－、ＣＭＥ－およびＣＴＸ－Ｍ型ベータラクタマーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
幾つかの態様において、耐性遺伝子は、例えば機能的グループ１、グループ２、グループ３またはグループ４ベータラクタマーゼから選択される、分類ＥＣ ３．５．２．６のベータラクタマーゼである（例えば、参照により本明細書に組み入れられるＢｕｓｈ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，３９： １２１１を参照されたい）。理論に結びつけるのを望むものではないが、グループ１は、クラブラン酸により充分に阻害されないセファロスポリナーゼからなり；グループ２は、活性部位特異性ベータラクタマーゼ阻害剤により概ね阻害される、ペニシリナーゼ、セファロスポリナーゼおよび基質拡張型ベータラクタマーゼからなり；グループ３は、ペニシリン、セファロスポリンおよびカルバペネムを加水分解し、ほぼ全てのベータラクタム含有分子によりわずかしか阻害されない、メタロベータラクタマーゼからなり；グループ４は、クラブラン酸により充分に阻害されないペニシリナーゼ、および／または分子／Ａｍｂｌｅｒ分類Ａ、もしくは分類Ｂ、もしくは分類Ｃ、もしくは分類Ｄベータラクタマーゼからなり（例えば、内容が参照により本明細書に組み入られるＡｍｂｌｅｒ １９８０， Ｐｈｉｌｏｓ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｌｏｎｄ Ｂ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ． ２８９： ３２１を参照されたい）、理論に結びつけるのを望むものではないが、分類Ａ、ＣおよびＤはセリンベータラクタマーゼ酵素の進化的に異なるグループの集まりであり、分類Ｂは、亜鉛依存性（「ＥＤＴＡ阻害性の」）ベータラクタマーゼ酵素の集まりである（参照により本明細書に組み入られるＡｍｂｌｅｒ Ｒ．Ｐ． ｅｔ ａｌ．， １９９１ ， Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ． ２７６： ２６９－２７０を参照されたい）。幾つかの実施形態において、抗生物質分解酵素は、セリンベータラクタマーゼまたは亜鉛依存性「ＥＤＴＡ阻害性」ベータラクタマーゼである。例えば、幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、場合によりＴＥＭ、ＳＨＶ、ＣＴＸ－Ｍ、ＯＸＡ、ＰＥＲ、ＶＥＢ、ＧＥＳ、およびＩＢＣベータラクタマーゼから選択される、基質拡張型ベータラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）である。さらに、ベータラクタマーゼは、場合によりＡｍｐＣ型β－ラクタマーゼ、カルバペネマーゼ、ＩＭＰ型カルバペネマーゼ（メタロ－β－ラクタマーゼ）、ＶＩＭ（ベローナ・インテグロンをコードするメタロ－β－ラクタマーゼ）、β－ラクタマーゼのＯＸＡ（オキサシリナーゼ）グループ、ＫＰＣ（Ｋ．ニューモニエのカルバペネマーゼ）、ＣＭＹ（分類Ｃ）、ＳＭＥ、ＩＭＩ、ＮＭＣおよびＣｃｒＡ、ならびにＮＤＭ（ニューデリーメタロ－β－ラクタマーゼ、例えばＮＤＭ－１）ベータラクタマーゼから選択される、阻害剤耐性β－ラクタマーゼであってもよい。
様々な実施形態において、本発明の方法は、
Figure 0007239252000005
 の１つまたは複数などの、セフトリアキソンに関連する耐性遺伝子の低減または除去に関する。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼ、バンコマイシンおよび／またはマクロライド耐性遺伝子である。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、β－ラクタマーゼまたはＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤ遺伝子のＣｆｘＡファミリーである。
様々な実施形態において、抗生物質耐性遺伝子は、ａｃｒＥ、ａｃｒＦ、ａｃｒＳ、ＡｍｐＣ、ｂａｅＲ、ｃｆｘＡ、ｃｐｘＲ、ｅｒｍＹ、ｍａｒＡ、ｍｄｔＤ、ｍｄｔＮ、ｍｄｔＫ、ｐｂｐ２、ｐｂｐ４、およびＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤの１つまたは複数である。
様々な実施形態において、本発明は、１種または複数の抗生物質耐性遺伝子の存在、非存在またはレベルを決定することにより、抗生物質耐性のスクリーニングまたは評定を可能にする。例示的な適切な試料としては、糞便試料（例えば、便）、ならびにＧＩ管内の流体の吸引物、胃腸管内の部位からの粘膜生検、および他の組織試料または組織ホモジネートが挙げられる。
抗生物質耐性検出の例示的方法は、当業者に公知である。例えば定量ＰＣＲは、同じプライマーを用いて既知量の対照配列を同時に共増幅することを含む。これは、ＰＣＲ反応を較正するために用いられ得る内部標準を提供する。定量ＰＣＲのための詳細なプロトコルは、例えばＩｎｎｉｓ， ｅｔ ａｌ． （１９９０） ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ． Ｎ．Ｙ．に提供されている。定量ＰＣＲ分析を用いるマイクロサテライト遺伝子座でのＤＮＡコピー数の測定は、例えばＧｉｎｚｏｎｇｅｒ， ｅｔ ａｌ．（２０００） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：５４０５－５４０９に記載されている。遺伝子についての公知の核酸配列は、遺伝子の任意の部分を増幅するプライマーを当業者に日常的に選択させるのに充分である。蛍光発生的定量ＰＣＲもまた、本発明の方法で用いることができる。蛍光発生的定量ＰＣＲにおいて、定量は、蛍光シグナル、例えばＴａｑＭａｎおよびＳｙｂｒグリーンの量に基づく。
他の適切な増幅法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９） Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４： ５６０， Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ， ｅｔ ａｌ．（１９８８） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、およびＢａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｇｅｎｅ ８９： １１７参照）、転写増幅法（Ｋｗｏｈ，ｅｔ ａｌ．（１９８９） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６： １１７３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ， ｅｔ ａｌ．（１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７： １８７４）、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲなどが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書で提供される方法のさらに別の実施形態において、個々の核酸分子（またはそれらの増幅産物）のシークエンシングが、実施される。一実施形態において、シークエンシングの前に核酸分子集団の単一核酸分子を単離するハイスループットパラレルシークエンシング技術が用いられてよい。そのような方策は、非限定的に、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（ゲノムアナライザー；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（２００５） Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ， ６：３７３－２０ ３８２）により、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（ＳＯＬｉＤシークエンサー； ｓｏｌｉｄ．ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ）により、Ｒｏｃｈｅ（例えば、４５４ ＧＳ ＦＬＸシークエンサー；Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｎａｔｕｒｅ， ４３７：３７６－３８０；米国特許第６，２７４，３２０号；同第６，２５８，５６８号；同第６，２１０，８９１号）その他により開発されたものなど、当業者に周知のシークエンシング機器および／または方策をはじめとするいわゆる「次世代シークエンシングシステム」を用いてよい。例えば国際特許公開第ＷＯ２０１０／００４２７３号に記載される通り、確率的シークエンシング（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅにより開発されたような）などの他のシークエンシング方策を用いてもよい。
本明細書に提供される方法のさらに別の実施形態において、ディープシークエンシングを用いて、耐性微生物体を同定および提供できる。これらの技術は、当該技術分野で公知である。
様々な実施形態において、１６Ｓ ｒＲＮＡが用いられる。様々な実施形態において、糞便ＤＮＡ試料は、試料中の個々の抗生物質耐性遺伝子を解析できる全ゲノムショットガンシークエンシング（ＷＧＳ）により分析される。
メタゲノムの全ゲノムショットガンシークエンシング（ＷＧＳ）は、特定試料中の微生物の採取物のほぼ完全なゲノム量の分析を可能にし、パンゲノムとも称される（シークエンシングの深さが、カバーされるパンゲノムの量に直接関係する）。用いられ得る例示的方法は、ＮＩＨ－Ｈｕｍａｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔのために開発された。手短に述べると、１６Ｓ ｒＲＮＡシークエンシング作業から利用可能な細菌ゲノムＤＮＡが、ＷＧＳに用いられると予測される。各試料から構築された個々のライブラリーを、ＨｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードし、２×１００ｂｐペアドエンドリードプロトコルを利用してシークエンシングする。Ｉｌｌｕｍｉｎａのペアドエンドライブラリーを、各試料から単離された全ゲノムＤＮＡから構築する。ＤＮＡは、およそ４００～６００ｂｐの断片にせん断された後、下流のデマルチプレキシングのための分子バーコードを含むＩｌｌｕｍｉｎａアダプターのライゲーションを受ける。これらの産物はその後、例えばＫＡＰＡ ＨｉＦｉ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｋａｐａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国マサチューセッツ州ウィルミントン所在）を用いて、ライゲーション媒介ＰＣＲ（ＬＭ－ＰＣＲ）により増幅される。例えばＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、米国カリフォルニア州ブレア所在）を用いる、ビーズ精製に続いて、ＬＭ－ＰＣＲ産物の定量およびサイズ分布を、例えばＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ電気泳動システム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国オハイオ州アクロン所在）を用いて決定する。ライブラリーを、プールあたり６種の同量試料でプールして、ＴｒｕＳｅｑ ＰＥ Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いるシークエンシングのために調製する。各ライブラリープールを、１％ＰｈｉＸ対照ライブラリーでスパイクされたＨｉＳｅｑ ２０００フローセルの１レーンにロードする。シークエンシングファイルを、ＣＡＳＡＶＡバージョン１．８．３（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でデマルチプレキシングする。品質フィルタリング、トリミングおよびデマルチプレキシングを、アダプターおよび品質トリミングのためのＴｒｉｍ Ｇａｌｏｒｅおよびｃｕｔａｄａｐｔを含むカスタムパイプラインと、低複雑度フィルタリングおよび配列デデュプリケーションのためのＰＲＩＮＳＥＱにより実施する。加えて、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｖ２．２．１を用いて、細菌種の分類のためにＭｅｔａＰｈｌＡｎマーカーへリードをマッピングする。糞便マイクロバイオームからの単離ＤＮＡ試料中の抗生物質耐性遺伝子の同定のために結果をマッピングするのに利用可能な複数のデータベースがあり、これらは、包括的抗生物質耐性データベース（ＣＡＲＤ）に加え、抗生物質耐性遺伝子データベース（ＡＲＤＢ、ａｒｄｂ．ｃｂｃＢ．ｕｍｄ．ｅｄｕのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ））およびＮＣＢＩデータベース（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂ（ｗｗｗ））を含む。
さらに、様々な実施形態において、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を用いて、特定の抗生物質耐性遺伝子の数の増加を検出する。抗生物質耐性遺伝子について公的に入手できるプライマーについて、利用可能な文献を調べることができ、または新しいプライマーを、例えばＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびアクセスの際に利用可能なゲノム情報を用いて、設計できる。定量ＰＣＲ試料分析を、ＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｃａｌ ９６ウェル反応プレート（０．１ｍｌ）およびＭｉｃｒｏＡｍｐ Ｏｐｔｉｃａｌ ３８４ウェル反応プレート、ＭｉｃｒｏＡｍｐ光学粘着フィルム （全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ならびにＰｅｒｆｅＣｔａ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＦａｓｔＭｉｘ、Ｌｏｗ Ｒｏｘ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍで実施できる。
様々な試料にまたがりｑＰＣＲ反応を正規化するために、試料中の１６Ｓ ｒＲＮＡのｑＰＣＲを実施でき、その後、抗生物質耐性遺伝子と１６Ｓ ｒＲＮＡの比率を正規化できる。
様々な実施形態において、本発明の方法は、以下の病原体の１つまたは複数による感染の処置または予防に用途を見出す：アエロモナス・ヒドロフィラ、バチルス属、例えばバチルス・セレウス、ビフィドバクテリウム属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、バークホリデリア属、Ｃ．ディフィシル、カンピロバクター属、例えばカンピロバクター・フェタスおよびカンピロバクター・ジェジュニ、クラミジア属、クラミドフィラ属、クロストリジウム属、例えばクロストリジウム・ボツリヌム、クロストリジウム・ディフィシル、およびクロストリジウム・パーフリンゲンス、コリネバクテリウム属、コクシエラ属、エルリチア属、腸内細菌科、例えばカルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）および基質拡張型ベータラクタマーゼ産生腸内細菌科（ＥＳＢＬ－Ｅ）、フルオロキノロン耐性腸内細菌科、エンテロコッカス属、例えばバンコマイシン耐性エンテロコッカスｓｐｐ．、基質拡張型ベータラクタム耐性腸球菌（ＥＳＢＬ）、およびバンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、エスケリキア属、例えば腸管凝集性大腸菌、腸管出血性大腸菌、腸管侵入性大腸菌、腸管病原性大腸菌、腸管毒素原性大腸菌（非限定的にＬＴおよび／またはＳＴなど）、大腸菌０１５７：Ｈ７、および多剤耐性大腸菌、フランシセラ属、ヘモフィルス属、ヘリコバクター属、例えばヘリコバクター・ピロリ、クレブシエラ属、例えばクレブシエラ・ニューモニエおよび多剤耐菌クレブシエラ、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、例えばリステリア・モノサイトゲネス、モルガネラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、ナイセリア属、オリエンティア属、プレジオモナス・シゲロイデス、抗生物質耐性プロテオバクテリア、プロテウス属、シュードモナス属、リケッチア属、サルモネラ属、例えばサルモネラ・パラティフィ、サルモネラｓｐｐ．、およびサルモネラ・ティフィ、シゲラ属、例えばシゲラｓｐｐ．、スタフィロコッカス属、例えばスタフィロコッカス・アウレウスおよびスタフィロコッカスｓｐｐ．、ストレプトコッカス属、トレポネーマ属、ビブリオ属、例えばビブリオ・コレレ、ビブリオ・パラヘモリティカス、ビブリオｓｐｐ．、およびビブリオ・バルニフィカス、ならびにエルシニア属、例えばエルシニア・エンテロコリチカ。
様々な実施形態において、本発明の方法は、抗生物質耐性菌、例えば抗生物質耐性プロテオバクテリア、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、カルバペネム耐性腸内細菌科（ＣＲＥ）、フルオロキノロン耐性腸内細菌科、および基質拡張型ベータラクタマーゼ産生腸内細菌科（ＥＳＢＬ－Ｅ）の感染の処置または予防に用途を見出す。
様々な実施形態において、それを必要とする患者は、外来環境、入院、および／または長期療法施設に居てよい。様々な実施形態において、それを必要とする対象は、血流感染（ＢＳＩ）、カテーテルもしくは血管内ラインでの感染（例えば、中心ライン感染）、慢性炎症性疾患、髄膜炎、肺炎、例えば人工呼吸関連肺炎、皮膚および軟組織感染、手術部位感染、尿管感染（例えば、抗生物質耐性尿管感染およびカテーテル関連尿管感染）、創傷感染、ならびに／または他の周知感染：抗生物質耐性感染および抗生物質感受性感染を有する、またはそのリスクがある。
様々な実施形態において、本発明の方法は、Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）および／またはＣ．ディフィシル関連疾患の処置または予防に用途を見出す。
様々な実施形態において、本発明の方法は、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）などの病原菌の異常増殖の処置または予防に用途を見出す。
様々な実施形態において、本発明の方法は、セフトリアキソン、セフォタキシム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフロキシム、ピペラシリンおよびバンコマイシンの１種または複数での患者の処置を可能にすることに用途を見出す。様々な実施形態において、本発明の患者は、セフトリアキソン、セフォタキシム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフロキシム、ピペラシリン、およびバンコマイシンのうちの１種または複数に耐性であり、本発明のベータラクタマーゼは、患者におけるセフトリアキソン、セフォタキシム、セファゾリン、セフォペラゾン、セフロキシム、ピペラシリンおよびバンコマイシンの１種または複数の治療的有効性を回復するように患者のマイクロバイオームを改変する。
ベータラクタマーゼ
幾つかの態様において、本発明は、例えば抗生物質耐性を低減または予防するための、１種または複数のベータラクタマーゼの使用を含む。本明細書で用いられるベータラクタマーゼは、ベータラクタムを加水分解する酵素を指す。ベータラクタム環のアミド結合の加水分解は、抗微生物剤を生物学的不活性にする。本明細書で用いられる分類Ａベータラクタマーゼ（Ａｍｂｌｅｒ分類）は、セリンベータラクタマーゼを指し、ベータラクタムの加水分解が、通常はアルファヘリックス２のアミノ酸位置７０にある、活性部位のセリンにより介在される。分類Ａベータラクタマーゼとしては、Ｌｅｎ－１、ＳＨＶ－１、ＴＥＭ－１、ＰＳＥ－３／ＰＳＥ－３、ＲＯＢ－１、バチルシ・セレウス、例えば５／Ｂ １型、５６９／Ｈ １型および５６９／Ｈ ３型など、バチルス・アントラシスｓｐ．、バチルス・リッチェニフォルミス、例えばＰｅｎＰ、バチルス・ウェイヘンステファネンシス、バチルス・クラウシー、スタフィロコッカス・アウレウス、ＰＣ１、Ｓｍｅ－１、ＮｍｃＡ、ＩＭＩ－、ＰＥＲ－、ＶＥＢ－、ＧＥＳ－、ＫＰＣ－、ＣＭＥ－およびＣＴＸ－Ｍ型ベータラクタマーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
様々な態様において、ベータラクタマーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（即ち、「ＳＹＮ－００４」または「リバキサマーゼ」または内容全体が参照により本明細書に組み入れられるＷＯ２０１１／１４８０４１に記載された「Ｐ３Ａ」）のアミノ酸配列を有する。突然変異をこの配列に施して、本発明の方法により用いられ得るベータラクタマーゼ誘導体を作製してもよい。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
TEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、配列の最初の残基に先行してＭｅｔおよび／またはＴｈｒを有してよい。様々な実施形態において、Ｍｅｔは、切断されてよい。本明細書に記載される突然変異が、最初の残基に先行するＭｅｔおよび／またはＴｈｒを含む配列に施されて、ベータラクタマーゼ誘導体を作製してよい。幾つかの実施形態において、先導するＴｈｒは、別の先導するアミノ酸（例えば、Ｌｙｓ）に比較して酵素の安定性をもたらし得る。例えばそのような残基は、アミノペプチダーゼに対する耐性上昇を付与し得る。
また本明細書で提供されるのは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２としてのＳＹＮ－００４のヌクレオチド配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２
atgactgagatgaaagatgattttgcgaagctggaagaacagtttgacgcaaaattgggcattttcgcgttggacacgggtacgaatcgtacggttgcctaccgtccggacgagcgcttcgccttcgcgagcacgatcaaagccctgaccgtcggcgtgctgctccagcaaaagagcatcgaggacctgaaccagcgcattacctacacccgtgatgatctggtgaactataatccgatcaccgagaaacacgttgataccggtatgaccctgaaagaactggcagatgcaagcctgcgctacagcgataacgcggctcagaatctgattctgaagcaaatcggtggtccggagagcttgaagaaagaactgcgtaaaatcggcgatgaagtcactaatccggagcgttttgagccggagctgaacgaagtgaatccgggtgaaacgcaagacacgagcaccgcgcgtgcgcttgtcacctccctgcgcgctttcgcactggaagataagctgccgtcggagaaacgcgagctgctgatcgactggatgaagcgcaatacgaccggcgacgcgctgattcgtgcgggcgttccggacggttgggaagtggctgacaagaccggtgcggcgagctacggcacccgtaacgatatcgcgatcatttggccacctaaaggtgacccggtcgtgctggccgtactgagcagccgtgacaagaaagacgcaaagtatgataacaagctgattgcagaggcgaccaaagttgttatgaaggcactgaacatgaatggtaag
幾つかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列同一性を有してよい。
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼ、例えばＳＹＮ－００４は、実質的なセフトリアキソン加水分解活性を有する。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼ、例えばＳＹＮ－００４は、Ｐ１Ａよりも実質的に効率的にセフトリアキソンを加水分解する。
例示的な実施形態において、ベータラクタマーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１との少なくとも６０％の配列同一性と、以下のＡｍｂｌｅｒ分類を有するアミノ酸配列を含む：位置２３２でのアラニン（Ａ）以外の疎水性残基；位置２３７でのアラニン（Ａ）以外の親水性残基；位置２３８でのアラニン（Ａ）以外の疎水性残基；位置２４０でのセリン（Ｓ）以外の親水性残基；および位置２７６でのアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性残基。幾つかの実施形態において、位置２３２でのアラニン（Ａ）以外の疎水性残基は、グリシン（Ｇ）である。幾つかの実施形態において、位置２３７でのアラニン（Ａ）以外の親水性残基は、セリン（Ｓ）である。幾つかの実施形態において、位置２３８でのアラニン（Ａ）以外の疎水性残基は、グリシン（Ｇ）である。幾つかの実施形態において、位置２４０でのセリン（Ｓ）以外の親水性残基は、アスパラギン酸（Ｄ）である。幾つかの実施形態において、位置２７６でのアスパラギン酸（Ｄ）以外は、アスパラギン（Ｎ）である。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎの１つまたは複数を含む。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎの全てを含み、その配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、即ちＰ４Ａである。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼおよび／または医薬組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも９０％、または９５％、または９７％、または９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３
EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK
幾つかの実施形態において、本発明のベータラクタマーゼのポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３由来であり、ＱＡＳＫＴアミノ酸のシグナルおよび付加をさらに含む（コード領域に下線を付している）：
Figure 0007239252000006
幾つかの実施形態において、本発明のベータラクタマーゼのポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼおよび／または医薬組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４と少なくとも９０％、または９５％、または９７％、または９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の例示的ポリヌクレオチドは、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、およびＤ２７６Ｎ突然変異体、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位（太字のＡＡＧＣＴＴ）ならびに追加のＫおよびＴアミノ酸の全ヌクレオチド配列であるＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５である。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の下線部分は、省略される。リーダーおよび付加ヌクレオチド（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位ならびにＫおよびＴアミノ酸－アミノ酸配列ＱＡＳＫＴの付加のため）に下線が付されている。
Figure 0007239252000007
幾つかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（下線部分を含む、または含まない）と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列同一性を有する。
様々な態様において、ベータラクタマーゼのポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（即ち、Ｐ２Ａ）の配列を有するか、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の１つまたは複数の突然変異に由来する。
ETGTISISQLNKNVWVHTELGYFNGEAVPSNGLVLNTSKGLVLVDSSWDNKLTKELIEMVEKKFQKRVTDVIITHAHADRIGGITALKERGIKAHSTALTAELAKNSGYEEPLGDLQTITSLKFGNTKVETFYPGKGHTEDNIVVWLPQYQILAGGCLVKSAEAKDLGNVADAYVNEWSTSIENVLKRYGNINSVVPGHGEVGDKGLLLHTLDLLK
幾つかの実施形態において、本発明のベータラクタマーゼのポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、または約６１％、または約６２％、または約６３％、または約６４％、または約６５％、または約６６％、または約６７％、または約６８％、または約６９％、または約７０％、または約７１％、または約７２％、または約７３％、または約７４％、または約７５％、または約７６％、または約７７％、または約７８％、または約７９％、または約８０％、または約８１％、または約８２％、または約８３％、または約８４％、または約８５％、または約８６％、または約８７％、または約８８％、または約８９％、または約９０％、または約９１％、または約９２％、または約９３％、または約９４％、または約９５％、または約９６％、または約９７％、または約９８％、または約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼおよび／または医薬組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６と少なくとも９０％、または９５％、または９７％、または９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Ｐ１Ａ（即ち、位置２７６がＤでありＮでないこと以外はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ａ／ＳＹＮ－００４およびＰ４Ａ、ならびにそれらの誘導体を含むベータラクタマーゼのさらなる配列は、例えば内容全体が参照により本明細書に組み入られるＷＯ２０１１／１４８０４１およびＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２６４５７に記載される。
さらに、ベータラクタマーゼのポリペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の最初の残基からさらなる上流の残基を含んでよい（例えば、ｐｅｎＰおよびｐｅｎＰ１のエクソラージ（ｅｘｏ－ｌａｒｇｅ）およびエクソスモール（ｅｘｏ－ｓｍａｌｌ）バージョンを含む、内容が参照により本明細書に組み入られるＪＢＣ ２５８（１８）： １１２１１， １９８３参照）。さらに、ベータラクタマーゼのポリペプチドはまた、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の最後の残基からさらなる下流の残基を含んでもよい。
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に比較して１つまたは複数（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０）の突然変異を含む。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、ＳＹＮ－００４の変異体、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２と少なくとも９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、９９．８、９９．９％の同一性を有する配列を含む。様々な態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の１つまたは複数のアミノ酸は、親水性アミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ）などの極性で正電荷の親水性アミノ酸；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）およびシステイン（Ｃ）などの極性で中性電荷の親水性アミノ酸；アスパラギン酸（Ｄ）もしくはグルタミン酸（Ｅ）などの極性で負電荷の親水性アミノ酸、またはヒスチジン（Ｈ）などの芳香族の極性で正電荷の親水性アミノ酸）もしくは疎水性アミノ酸（例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、またはバリン（Ｖ）などの疎水性脂肪族アミノ酸、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）またはチロシン（Ｙ）などの疎水性芳香族アミノ酸）などの天然由来のアミノ酸、または非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡ、δ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的アミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスム（ｓａｒｃｏｓｍｅ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えばβメチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎα－メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体）で置換される。幾つかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１は、配列の最初の残基の前にＭｅｔおよび／またはＴｈｅを有してよい。これらの残基は、上記と同様に突然変異されてよい。
例示的突然変異体は
Figure 0007239252000008
 を含む。
これらの突然変異体の全てにおいて、残基のナンバリングは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に対応する。これらの残基の番号を、例えばＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌｓ）またはＦＡＳＴＡ（ＦＡＳＴ－ＡＩＩ）の使用により、任意の従来の生物情報学的方法の利用を通してＡｍｂｌｅｒ番号（内容が参照により本明細書に組み入れられるＡｍｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， １９９１，Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓ Ａ β－ｌａｃｔａｍａｓｅｓ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ２７６：２６９－２７２）に変換してもよい。
様々な実施形態において、本発明で用いられるベータラクタマーゼは、大腸菌細胞などの細菌細胞で産生される（例えば、内容全体が参照により本明細書に組み入れられるＰＣＴ／ＵＳ１５／４７１８７参照）。
配合物／放出改変プロファイル
様々な実施形態において、本発明は、少なくとも１種のベータラクタマーゼを含む放出改変配合物を用い、ここで配合物は、ＧＩ管の１つまたは複数の領域にベータラクタマーゼの実質的量を放出する。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載された他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体である（例えば、先に記載された通り）。例えば配合物は、胃の後のＧＩ管の１つまたは複数の領域中に、ベータラクタマーゼ、例えばＳＹＮ－００４を少なくとも約６０％放出してよい。
様々な実施形態において、本発明の放出改変配合物は、即時放出（例えば、摂取時）のために設計される。様々な実施形態において、放出改変配合物は、持続放出プロファイル、即ち、長期間にわたる身体（例えば、ＧＩ管）での有効成分（複数可）の緩徐な放出を有してよい。様々な実施形態において、放出改変配合物は、遅延放出プロファイルを有してもよく、即ち、有効成分（複数可）を摂取時に直ちに放出せず；むしろ、例えば小腸（例えば、十二指腸、空腸、回腸の１つまたは複数）または大腸（例えば、盲腸、結腸の上行、横行、下行またはＳ字部分、および直腸）での放出のために、組成物が胃腸管においてより下部になるまで、有効成分（複数可）の放出の延期を有してよい。例えば組成物は、小腸または大腸に至るまで有効成分（複数可）の放出を遅延させるように腸溶性コーティングされてよい。幾つかの実施形態において、便の中に本発明の配合物の有効成分（複数可）の実質的量は存在しない。
様々な実施形態において、本発明の放出改変配合物は、胃の後の腸の１つまたは複数の領域にベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
様々な実施形態において、本発明の放出改変配合物は、小腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、小腸にベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、十二指腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、十二指腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、空腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、空腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、回腸および／または回盲接合部でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、回腸および／または回盲接合部でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
様々な実施形態において、本発明の放出改変配合物は、大腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、大腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、盲腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、盲腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、上行結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、上行結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、横行結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、横行結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、下行結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、下行結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
一実施形態において、本発明の放出改変配合物は、Ｓ字結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％を放出する。例えば放出改変配合物は、Ｓ字結腸でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）の少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を放出する。
様々な実施形態において、放出改変配合物は、胃でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）を実質的に放出しない。
特定の実施形態において、放出改変配合物は、特異的ｐＨでベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）を放出する。例えば幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、酸性環境において実質的に安定であり、中性付近～アルカリ性環境において実質的に不安定である（例えば、急速に溶解するか、または物理的に不安定である）。幾つかの実施形態において、安定性は、実質的に放出されないことを示し、一方不安定性は、実質的に放出されることを示す。例えば幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、約７．０以下、または約６．５以下、または約６．０以下、または約５．５以下、または約５．０以下、または約４．５以下、または約４．０以下、または約３．５以下、または約３．０以下、または約２．５以下、または約２．０以下、または約１．５以下、または約１．０以下のｐＨで実質的に安定である。幾つかの実施形態において、本発明の配合物は、低ｐＨのエリアで安定であり、それゆえ例えば胃では実質的に放出されない。幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、約１～約４またはより低いｐＨで実質的に安定であり、より高いｐＨ値で実質的に不安定である。これらの実施形態において、放出改変配合物は、胃で実質的に放出されない。これらの実施形態において、放出改変配合物は、小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）および／または大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の１つまたは複数）で実質的に放出される。幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、約４～約５またはより低いｐＨで実質的に安定であり、その結果、より高いｐＨ値で実質的に不安定であり、それゆえ胃および／または小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）で実質的に放出されない。これらの実施形態において、放出改変配合物は、大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の１つまたは複数）で実質的に放出される。様々な実施形態において、本明細書に列挙されるｐＨ値は、例えば空腹状態か、または食後状態かなど、対象の状態を考慮するために当該技術分野で公知の通り調整されてよい。
幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、胃液中で実質的に安定であり、腸液中で実質的に不安定であり、したがって小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）および／または大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の１つまたは複数）で実質的に放出される。
幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、胃液中で安定である、または酸性環境で安定である。これらの放出改変配合物は、約４～約５もしくはより低いｐＨの胃液、または約４～約５もしくはより低いｐＨの模擬胃液中で、放出改変配合物中のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）および／または追加の治療薬の約３０重量％以下を、約１５分、または約３０分、または約４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。本発明の放出改変配合物は、約４～約５もしくはより低いｐＨの胃液、または約４～約５もしくはより低いｐＨの模擬胃液中で、放出改変配合物中のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）および／または追加の治療薬の約０～約３０重量％、約０～約２５重量％、約０～約２０重量％、約０～約１５重量％、約０～約１０重量％、約５～約３０重量％、約５～約２５重量％、約５～約２０重量％、約５～約１５重量％、約５～約１０重量％を約１５分、または約３０分、または約４５分、または約６０分、または約９０分で放出してよい。本発明の放出改変配合物は、５以下のｐＨの胃液、または５以下のｐＨの模擬胃液中で、放出改変配合物中の総ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）および／または追加の治療薬の約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、または約１０重量％を約１５分、または約３０分、または約４５分、または約６０分、または約９０分で放出してよい。
幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、腸液中で不安定である。これらの改変配合物は、腸液または模擬腸液中で、放出改変配合物中のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）および／または追加の治療薬の約７０重量％以上を約１５分、または約３０分、または約４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、中性付近～アルカリ性環境で不安定である。これらの放出改変配合物は、約４～５もしくはより高いｐＨの腸液または約４～５もしくはより高いｐＨの模擬腸液中で、放出改変配合物中のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）および／または追加の治療薬の約７０重量％以上を、約１５分、または約３０分、または約４５分、または約６０分、または約９０分で放出する。中性付近またはアルカリ性環境で不安定な改変放出配合物は、約５より高いｐＨを有する流体（例えば、約５～約１４、約６～約１４、約７～約１４、約８～約１４、約９～約１４、約１０～約１４、または約１１～約１４のｐＨを有する流体）の中で、放出改変配合物中のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）および／または追加の治療薬の７０重量％以上を、約５～約９０分、または約１０～約９０分、または約１５～約９０分、または約２０～約９０分、または約２５～約９０分、または約３０～約９０分、または約５～約６０分、または約１０～約６０分、または約１５～約６０分、または約２０～約６０分、または約２５～約９０分、または約３０～約６０分で放出してよい。
模擬胃液および模擬腸液の例としては、「２００５ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ２３ＮＦ／２８ＵＳＰ ｉｎ Ｔｅｓｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」の２８５８頁に開示されるもの、ならびに／または当業者に公知の他の模擬胃液および模擬腸液、例えば酵素を用いずに調製された模擬胃液および／もしくは模擬腸液が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態において、放出改変配合物は、胃液中で、本質的に無傷のままである、または本質的に不溶性であり得る。放出改変配合物は、ｐＨ依存性である１種もしくは複数の遅延放出性コーティングを含んでよい。ｐＨ依存性である遅延放出性コーティングは、酸性環境（約５以下のｐＨ）で実質的に安定であり、中性付近～アルカリ性（約５より高いｐＨ）で実質的に不安定である。例えば遅延放出性コーティングは、小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数の１つまたは複数）および／または大腸（例えば、盲腸、上行結腸、横行結腸、下行結腸、およびＳ状結腸の１つまたは複数）中で見出されるような中性付近～アルカリ性環境で本質的に崩壊または溶解してよい。
あるいは放出改変配合物の安定性は、酵素依存性であり得る。そのような実施形態において、放出改変配合物は、酵素依存性である１種または複数の遅延放出性コーティングを含んでよい。酵素依存性である遅延放出性コーティングは、特定の酵素を含有しない流体中で実質的に安定であり、酵素を含有する流体中で実質的に不安定であろう。遅延放出性コーティングは、適当な酵素を含有する流体中で本質的に崩壊または溶解するであろう。酵素依存性の制御は、例えば、ガラクトマンナンなどの腸内酵素への暴露でのみ有効成分を放出する材料を使用することによりもたらされ得る。また放出改変配合物の安定性は、腸管フローラ中に存在する微生物酵素の存在下で酵素安定性に依存し得る。
様々な実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４またはそれら変異体）を含む放出改変配合物は、消化液中で実質的に安定である。例えば幾つかの実施形態において、投与から約１０、または９、または８、または７、または６、または５、または４、または３、または２、または１時間でベータラクタマーゼの約５０％、または約４０％、または約３０％、または約２０％、または約１０％未満の損失がある。
幾つかの実施形態において、二重パルス配合物が、提供される。様々な実施形態において、本発明は、腸に沿った異なる位置で、異なる時間に、および／または異なるｐＨで、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の複数の用量を放出する放出改変配合物を提供する。例示的実施形態において、放出改変配合物は、ベータラクタマーゼの第一の用量と、ベータラクタマーゼの第二の用量とを含み、第一の用量と第二の用量は、腸に沿った異なる位置で、異なる時間に、および／または異なるｐＨで放出される。例えば第一の用量は、十二指腸で放出され、第二の用量は、回腸で放出される。別の実施形態において、第一の用量は、空腸で放出され、第二の用量は、回腸で放出される。他の実施形態において、第一の用量は、小腸に沿った位置（例えば、十二指腸）で放出され、第二の用量は、大腸（例えば、上行結腸）に沿って放出される。様々な実施形態において、放出改変配合物は、少なくとも１用量、少なくとも２用量、少なくとも３用量、少なくとも４用量、少なくとも５用量、少なくとも６用量、少なくとも７用量、または少なくとも８用量のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を腸に沿った異なる位置で、異なる時間に、および／または異なるｐＨで放出してよい。さらに、本明細書の二重パルスの記載は、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）および追加の治療薬を放出する放出改変配合物に適用される。
様々な実施形態において、本発明は、医薬的に許容できる担体または賦形剤をさらに含み得る、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の放出改変配合物を使用する。当業者は、配合物が所望の使用および投与経路に適した任意の適切な形態であり得ることを、認識するであろう。
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼ（および／または追加の治療薬）を含む放出改変配合物の投与は、経口、静脈内、および非経口のいずれか１つである。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼ（および／または追加の治療薬）を含む放出改変配合物の投与は、例えば全身投与された抗生物質での妨害を予防するために、静脈内でない。他の実施形態において、投与経路としては、例えば経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または外用、詳細には耳、鼻、目、または皮膚への外用が挙げられる。
本明細書に記載されるベータラクタマーゼ（および／または追加の治療薬）を含む任意の放出改変配合物は、経口投与され得る。そのような本発明の配合物は、任意の他の簡便な経路により、例えば静脈内輸液またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通した吸収により、投与されてもよく、追加の治療薬と一緒に投与されてよい。投与は、全身または局所であり得る。幾つかの実施形態において、投与は、例えば、感染部位での抗生物質の加水分解を回避するために感染部位ではない。様々な送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへのカプセル化が公知であり、投与に用いられ得る。具体的実施形態において、処置が必要なエリアへ局所投与することが、望ましい場合がある。
経口使用のための適切な投与剤形としては、例えば錠剤、分散可能な粉末、顆粒およびカプセルが挙げられる。一実施形態において、放出改変配合物は、カプセルの形態である。別の実施形態において、放出改変配合物は、錠剤の形態である。さらに別の実施形態において、放出改変配合物は、ソフトゲルカプセルの形態である。さらなる実施形態において、放出改変配合物は、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセルの形態である。
幾つかの投与剤形において、本明細書に記載される薬剤は、クエン酸ナトリウム、第二リン酸カルシウムなどの少なくとも１種の不活性な薬学的に許容できる賦形剤もしくは担体、および／またはａ）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、ケイ酸、微結晶セルロース、および製菓用砂糖などの充填剤または増量剤、ｂ）カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、アカシア、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、およびヒドロキシメチルセルロースなどの結合剤、ｃ）グリセロールなどの保湿剤、ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウム、架橋ポリマー、例えばクロルポビドン（架橋ポリビニルピロリドン）、クロスカルメロースナトリウム（架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、デンプングリコール酸ナトリウムなどの崩壊剤、ｅ）パラフィン他の溶解遅延剤、ｆ）第四級アンモニウム化合物他の吸収促進剤、ｇ）例えばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロースなどの湿潤剤、ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土などの吸収剤、ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリルなどの滑沢剤、ならびにそのような賦形剤の混合物と混合される。当業者は、特定の賦形剤が経口投与剤形において２種以上の機能を有し得ることを認識するであろう。経口投与剤形、例えばカプセルまたは錠剤の場合、投与剤形は、緩衝剤を含んでもよい。
放出改変配合物は、表面活性剤を追加的に含み得る。本発明における使用に適した表面活性剤としては、任意の医薬的に許容できる非毒性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の組成物中での使用に適した界面活性剤の分類としては、ポリエトキシル化脂肪酸、ＰＥＧ脂肪酸ジエステル、ＰＥＧ脂肪酸モノおよびジエステル混合物、ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル、アルコール－オイルエステル交換生成物、ポリグリセリル化（ｐｏｌｙｇｌｙｃｅｒｉｚｅｄ）脂肪酸、プロピレングリコール脂肪酸エステル、プロピレングリコールエステル－グリセロールエステルの混合物、モノおよびジグリセリド、ステロールおよびステロール誘導体、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコールアルキルエーテル、糖エステル、ポリエチレングリコールアルキルフェノール、ポリオキシエチレン－オリオキシプロピレン（ｏｌｙｏｘｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）ブロックコポリマー、ソルビタン脂肪酸エステル、低級アルコール脂肪酸エステル、イオン性界面活性剤、ならびにそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、非限定的にラウリル硫酸ナトリウム、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート８０、およびクエン酸トリエチルを含む１種または複数の界面活性剤を含んでよい。
放出改変配合物はまた、可撓性および硬度などの所望の機械的性質を得るために医薬的に許容できる可塑化剤を含有し得る。そのような可塑化剤としては、トリアセチン、クエン酸エステル、クエン酸トリエチル、フタル酸エステル、セバシン酸ジブチル、セチルアルコール、ポリエチレングリコール、ポリソルベート、または他の可塑化剤が挙げられるが、これらに限定されない。
放出改変配合物はまた、１種または複数の塗布溶媒を含み得る。例えば遅延放出性コーティング組成物を塗布するのに用いられ得るより一般的な溶媒の幾つかとして、イソプロピルアルコール、アセトン、塩化メチレンおよび同様のものが挙げられる。
放出改変配合物は、１種または複数のアルカリ性材料も含み得る。本発明の組成物中での使用に適したアルカリ性材料としては、リン酸、炭酸、クエン酸などの酸のナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩、ならびに他のアルミニウム／マグネシウム化合物が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、アルカリ性材料は、水酸化アルミニウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウムおよび酸化マグネシウムなどの制酸材料から選択されてもよい。
固体経口投与剤形は、例えば本発明の薬剤と１種または複数の適切な賦形剤の造粒（例えば、湿式または乾式造粒）により調製され得る。あるいは本発明の薬剤は、流動床またはパンコーティングなどの従来の方法を利用して不活性コア（例えば、スクロース球またはシリカ球などのノンパレイル／糖球）上に積層でき、または当該技術分野で公知の方法を利用して活性化合物含有ペレットに押し出し球状化できる。実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）は、スクロース球上に噴霧コーティングされる。そのようなペレットはその後、従来の方法を利用して錠剤またはカプセルに組み込まれ得る。
懸濁液は、活性化合物に加えて、例えばエトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタンおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天、トラガカントなど、ならびにそれらの混合物などの懸濁剤を含有してよい。
経口組成物はまた、不活性希釈剤の他に、甘味剤、香味剤、および芳香剤などのアジュバントを含み得る。
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下および関節内注射および輸液）に適した投与剤形としては、例えば、溶液、懸濁液、分散物、エマルジョンおよび同様のもの挙げられる。それらは、使用の直前に滅菌注射可能媒体に溶解または懸濁され得る、滅菌固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造されてもよい。それらは、例えば当業者に公知の懸濁剤または分散剤を含有してよい。
ベータラクタマーゼ（および／または追加の治療薬）を含む配合物は、単位投与剤形で簡便に提供されてよく、製薬業界で周知の方法のいずれかにより調製されてよい。そのような方法は一般に、治療薬を１種または複数の付帯的成分を構成する担体と会合させるステップを含む。典型的には配合物は、治療薬を液体担体、微細化固体担体、またはその両方と均一にかつ緊密に会合させ、その後、必要に応じて、生成物を所望の配合物の投与剤形に成形すること（例えば、当該技術分野で公知の従来法を利用して、湿式または乾式造粒、粉末ブレンドなどを行い、その後、圧縮打錠すること）により調製される。
様々な実施形態において、本発明の放出改変配合物は、遅延放出性コーティングなどの１種または複数の放出改変コーティングを利用して、場合により他の追加の治療薬と共にＧＩ管へのベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の効果的で、遅延されるが実質的な送達を提供してよい。
一実施形態において、遅延放出性コーティングは、酸性環境で実質的に安定であり、中性付近～アルカリ性の環境で実質的に不安定な腸溶性薬剤を含む。一実施形態において、遅延放出性コーティングは、胃液中で実質的に安定な腸溶性薬剤を含有する。腸溶性薬剤は、例えば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタラート、酢酸フタル酸ポリビニル、カルボキシメチルエチルセルロース、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）型ポリマー（ポリ（メタクリル酸／メタクリル酸メチル））、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセタートスクシナート、トリメリト酸酢酸セルロース、シェラク、または他の適切な腸溶性コーティングポリマーの溶液または分散物から選択され得る。ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）型ポリマーとしては、例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標） ＦＳ ３０Ｄ、Ｌ ３０Ｄ－５５、Ｌ １００－５５、Ｌ １００、Ｌ １２，５、Ｌ １２，５Ｐ、ＲＬ ３０Ｄ、ＲＬ ＰＯ、ＲＬ １００、ＲＬ １２，５、ＲＳ ３０Ｄ、ＲＳ ＰＯ、ＲＳ １００、ＲＳ １２，５、ＮＥ ３０Ｄ、ＮＥ ４０Ｄ、ＮＭ ３０Ｄ、Ｓ １００、Ｓ １２，５、およびＳ １２，５Ｐが挙げられる。類似のポリマーとしては、Ｋｏｌｌｉｃｏａｔ（登録商標） ＭＡＥ ３０ ＤＰおよびＫｏｌｌｉｃｏａｔ（登録商標） ＭＡＥ １００ Ｐが挙げられる。幾つかの実施形態において、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標） ＦＳ ３０Ｄ、Ｌ ３０Ｄ－５５、Ｌ １００－５５、Ｌ １００、Ｌ １２，５、Ｌ １２，５Ｐ、ＲＬ ３０Ｄ、ＲＬ ＰＯ、ＲＬ １００、ＲＬ １２，５、ＲＳ ３０Ｄ、ＲＳ ＰＯ、ＲＳ １００、ＲＳ １２，５、ＮＥ ３０Ｄ、ＮＥ ４０Ｄ、ＮＭ ３０Ｄ、Ｓ １００、Ｓ １２，５、Ｓ １２，５Ｐ、Ｋｏｌｌｉｃｏａｔ（登録商標） ＭＡＥ ３０ ＤＰおよびＫｏｌｌｉｃｏａｔ（登録商標） ＭＡＥ １００ Ｐの１つまたは複数が用いられる。様々な実施形態において、腸溶性薬剤は、前述の溶液または分散物の組み合わせであってよい。一実施形態において、遅延放出性コーティングは、腸溶性薬剤ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標） Ｌ ３０ Ｄ－５５を含む。
特定の実施形態において、１種または複数のコーティング系添加剤は、腸溶性薬剤と共に用いられる。例えば、１種または複数のＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標）添加剤を、粘着防止剤コーティング添加剤として用いてよい。模範的なＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標）添加剤としては、ＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標） ＨＴＰ２０およびＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標） Ｔ２０が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、ＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標）ＨＴＰ２０は、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標） Ｌ ３０ Ｄ－５５コーティングと共に配合される。別の実施形態において、ＰｌａｓＡＣＲＹＬ（商標）Ｔ２０は、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）ＦＳ ３０Ｄコーティングと共に配合される。
別の実施形態において、遅延放出性コーティングは、溶液中のｐＨおよび／または酵素の存在に関わらず、水性溶液中の場合に時間の関数として分解し得る。そのようなコーティングは、水不溶性ポリマーを含んでもよい。水性溶液中のその溶解度は、それゆえｐＨに非依存性である。本明細書で用いられる用語「ｐＨ非依存性」は、ポリマーの水浸透性および医薬成分を放出するポリマーの能力が、ｐＨの関数でないこと、および／またはｐＨに非常にわずかしか依存しないことを意味する。そのようなコーティングを用いて、例えば持続放出性配合物、を調製してもよい。適切な水不溶性ポリマーとしては、溶液のｐＨに依存せずに、水性媒体、例えば水に実質的に不溶である、医薬的に許容できる非毒性ポリマーが挙げられる。適切なポリマーとしては、セルロースエーテル、セルロースエステル、またはセルロースエーテル－エステル、即ちセルロース骨格のヒドロキシ基の幾つかがアルキル基で置換されかつ幾つかがアルカノイル基で修飾されたセルロース誘導体、が挙げられるが、これらに限定されない。例としては、エチルセルロース、アセチルセルロース、ニトロセルロース、および同様のものが挙げられる。不溶性ポリマーの他の例としては、ラッカー、ならびにアクリル酸および／もしくはメタクリル酸エステルポリマー、少量の第四級アンモニウムを有するアクリラートもしくはメタクリラートのポリマーもしくはコポリマー、またはそれらの混合物および同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。不溶性ポリマーの他の例としては、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＳ（登録商標）、ＥＵＤＲＡＧＩＴ ＲＬ（登録商標）、およびＥＵＤＲＡＧＩＴ ＮＥ（登録商標）が挙げられる。本発明において有用な不溶性ポリマーとしては、ポリビニルエステル、ポリビニルアセタール、ポリアクリル酸エステル、ブタジエンスチレンコポリマー、および同様のものが挙げられる。一実施形態において、結腸送達は、緩やかに侵食するワックスプラグ（例えば、様々なＰＥＧ、例えばＰＥＧ６０００を含む）の使用により実現される。
さらなる実施形態において、遅延放出性コーティングは、腸管フローラ中に存在する微生物酵素により分解されてよい。一実施形態において、遅延放出性コーティングは、小腸に存在する細菌により分解されてよい。別の実施形態において、遅延放出性コーティングは、大腸に存在する細菌により分解されてよい。
様々な実施形態において、本発明は、１種または複数のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含むベースコートを有するコア粒子と、コーティングされたコア粒子の上に配置された遅延放出性コーティングとを含む配合物を提供する。遅延放出性コーティングは、酸性環境および／もしくは胃液中で実質的に安定であり得、および／または中性付近～アルカリ性環境もしくは腸液中で実質的に不安定であり得、それによりコーティングされたコア粒子を腸液に暴露し得る。１種または複数のベータラクタマーゼを含むベースコートは、１種または複数の追加の治療薬をさらに含んでよい。場合により複数のベースコートが、コアに塗布されてよく、ベースコートのそれぞれが、ベータラクタマーゼおよび／または追加の治療薬を含有してよい。一実施形態において、コア粒子は、スクロースを含む。配合物は、当該技術分野で公知の方法により調製され得る。例えばベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）は、不活性コア（例えば、スクロースコアまたはセルロース球）に噴霧され得、腸溶性層（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ３０ Ｄ－５５）と共に噴霧乾燥されて、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）含有ペレットを形成し得る。
場合によりコア粒子は、１種もしくは複数のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）および／または１種もしくは複数の追加の治療薬を含んでよい。一実施形態において、ベータラクタマーゼの１種または複数の用量は、例えばマイクロスフェアの形態で、コア粒子中にカプセル化されてよい。例えばベータラクタマーゼは、ポリマー（例えば、ラテックス）と混和され、その後、スクロースコアを用いずに、微粒子のマイクロカプセル化酵素調製物に形成されてよい。こうして形成されたマイクロスフェアは、遅延放出性コーティングで場合により覆われてよい。
酵素を包含し易い微粒子（マイクロスフェア、集合体、その他など）を作製するための種々のアプローチが、公知である。それらは典型的には少なくとも２相を含み、１相は酵素を含有し、１相は微粒子のバックボーンを形成するポリマーを含有する。最も一般的なものが、ポリマーが第三の成分の添加により溶媒相から分離して作製される、コアセルベーション、または内部水相がタンパク質を含有し、中間の有機相がポリマーを含有し、溶媒が除去されてマイクロスフェアを形成し得るまで水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）二重エマルジョンを支持する外部水相安定化剤である、ｗ／ｏ／ｗエマルジョンなどの多相エマルジョンである。あるいはベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）および安定化賦形剤（例えば、トレハロース、マンニトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ポリビニルアルコール）が組み合わされ、水溶液から噴霧され収集される。粒子はその後、無水の水不混和性有機溶媒含有ポリマーに懸濁され、改変化合物を放出し、懸濁液を音波処理して粒子を分散させる。追加のアプローチは、水相を使用するが、有機溶媒を使用しない。具体的には、酵素、緩衝成分、ポリマーラテックス、ならびに安定化および放出改変賦形剤を、水に溶解／分散させる。水性分散液を噴霧乾燥し、ラテックスの合体と、合体されたラテックスの粒子中のタンパク質および賦形剤の取り込みを導く。放出改変剤が、酸性条件で不溶であるが、より高いｐＨ（カルボン酸など）で可溶である場合、マトリックスからの放出は、胃環境で阻害される。
幾つかの実施形態において、コーティングされたコア粒子に遅延放出性コーティングを塗布する前に、粒子を場合により、例えばｐＨ緩衝化合物などのアルカリ性化合物を含む医薬賦形剤を含む１つまたは複数の分離層で覆うことができる。分離層は、本質的に遅延放出性コーティングからコーティングされたコア粒子を分離する。
分離層は、典型的にはコーティング工程のための水および／または有機溶媒を用いるコーティングパン、コーティング造粒機または流動床装置などのコーティング機器を用いたコーティング手順または積層手順により、コーティングされたコア粒子に塗布され得る。別法として、分離層は、粉体塗膜技術を利用することによりコア材料に塗布され得る。層を分離するための材料は、単独で、または混合して用いられる、例えば糖、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびその他などの医薬的に許容できる化合物である。可塑化剤、着色剤、色素、充填剤、粘着防止剤および静電防止剤、例えばステアリン酸マグネシウム、二酸化チタン、タルクおよび他の添加剤などの添加剤もまた、分離層に含まれてよい。
幾つかの実施形態において、遅延放出性コーティングを有するコーティングされた粒子は、オーバーコート層でさらに覆われてよい。オーバーコート層は、他のコーティング組成物に関して記載される通り塗布され得る。オーバーコート材料は、単独で、または混合して用いられる、糖、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムおよびその他などの医薬的に許容できる化合物である。オーバーコート材料は、遅延放出性コーティングでコーティングされた粒子の潜在的凝集を防止でき、遅延放出性コーティングを圧縮工程の間の亀裂から防御でき、または打錠工程を増進できる。
様々な実施形態において、配合物は、複数の放出改変粒子またはペレットまたはマイクロスフェアを含んでよい。一実施形態において、配合物は、複数のペレットを含むカプセルの形態である。一実施形態において、配合物は、複数のマイクロスフェアを含むカプセルの形態である。
幾つかの実施形態において、放出改変配合物は、そこからベータラクタマーゼが放出される、複数のベータラクタマーゼ含有ペレット（例えば、ＳＹＮ－００４（または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）含有ペレット）で充填されたカプセルである。一実施形態において、カプセルは、ハードゼラチンカプセルなどのゼラチンカプセルである。別の実施形態において、カプセルは、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセルである。例えば配合物は、複数のペレットを含むカプセルの形態であってよい。例えば配合物は、例えばベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４、または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）を含有する複数の腸溶性コーティングペレットを含むゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）カプセルなどのカプセルの形態であってよい。そのような実施形態において、各ペレットが特定の時点または位置で放出されるように設計されたペレットの組み合わせが、用いられてよい。様々な実施形態において、ペレット（例えば、腸溶性コーティングペレット）は、胃を不変のまま通過し、その後、腸の１つまたは複数の領域中にベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４、または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）を放出するように設計される。幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼ含有ペレットは、異なる腸ｐＨ値でベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）を放出するように腸溶性コーティングされてよい。
様々な実施形態において、本発明の配合物は、複数の腸溶性コーティングされたベータラクタマーゼ含有ペレットを含むカプセル（例えば、ハードゼラチンまたはＨＰＭＣカプセル）の形態である。そのような実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ剤、およびその変異体）と、ベータラクタマーゼ、例えばＳＹＮ－００４またはその変異体が噴霧されたスクロース球と、結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））と、腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）と、可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）と、滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）と、乳化剤と、緩衝塩とを含む。
様々な実施形態において、本発明の配合物は、複数の腸溶性コーティングされたベータラクタマーゼ含有ペレットを含むカプセル（例えば、ハードゼラチンまたはＨＰＭＣカプセル）の形態である。そのような実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約１０～２０重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含む。例えばベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）は、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、その上にベータラクタマーゼ、例えばＳＹＮまたは変異体が噴霧された、約２０～３０重量％のスクロース球を含む。例えば、スクロース球は、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、または約３０重量％で存在してよい。様々な実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約３０～４０重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））を含む。例えば結合賦形剤は、約３０重量％、約３１重量％、約３２重量％、約３３重量％、約３４重量％、約３５重量％、約３６重量％、約３７重量％、約３８重量％、約３９重量％、または約４０重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約１５～２５重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）を含む。例えば、腸溶性ポリマーは、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、または約２５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約１．５～２．５重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）を含む。例えば可塑化剤は、約１．５重量％、約１．６重量％、約１．７重量％、約１．８重量％、約１．９重量％、約２重量％、約２．１重量％、約２．２重量％、約２．３重量％、約２．４重量％、約２．５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約０．５～１．５重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）を含む。例えば滑剤は、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１重量％、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、または約１．５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約０．１～１．０重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）を含む。例えば乳化剤は、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、または約１重量％で存在してよい。 幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約１～２重量％の緩衝塩をさらに含む。例えば緩衝塩は、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、約１．５重量％、約１．６重量％、約１．７重量％、約１．８重量％、約１．９重量％、または約２重量％で存在してよい。本明細書に記載される重量は、カプセル自体の重量を除いた全成分の総重量を指す。
幾つかの実施形態において、ペレット（または個々のペレット）は、約１６重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）；約２３重量％のスクロース；約３５重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））；約２１重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）；約２重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）；約１重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）；約０．５重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）；および約２重量％の緩衝塩を含む。本明細書に記載される重量は、カプセル自体の重量を除いた全成分の総重量を指す。
例えば、ペレット（または個々のペレット）は、約１５．８重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）；約２３．３重量％のスクロース球；約３５重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））；約２０．８重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）；約２．１重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）；約１．０重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）； 約０．４重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）；および約１．６重量％の緩衝塩を含む。本明細書に記載される重量は、カプセル自体の重量を除いた全成分の総重量を指す。
様々な実施形態において、本発明の配合物は、約７５ ｍｇのベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含むカプセル（例えば、ハードゼラチンまたはＨＰＭＣカプセル）の形態である。カプセルは、複数の腸溶性コーティングされたベータラクタマーゼ含有ペレットを含む。そのような実施形態において、配合物は、約１０～２０重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含む。例えば、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）は、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１５～２５重量％のスクロース球を含む。例えば、スクロース球は、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、または約２５重量％存在してよい。様々な実施形態において、配合物は、約２５～３５重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））を含む。例えば、結合賦形剤は、約２５重量％、約２６重量％、約２７重量％、約２８重量％、約２９重量％、約３０重量％、約３１重量％、約３２重量％、約３３重量％、約３４重量％、または約３５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１０～２５重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）を含む。例えば、腸溶性ポリマーは、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、または約２５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１．５～２．５重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）を含む。例えば、過疎化剤は、約１．５重量％、約１．６重量％、約１．７重量％、約１．８重量％、約１．９重量％、約２重量％、約２．１重量％、約２．２重量％、約２．３重量％、約２．４重量％、約２．５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約０．５～１．５重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）を含む。例えば滑剤は、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１重量％、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、または約１．５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約０．１～１．０重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）を含む。例えば乳化剤は、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、または約１％重量％で存在してよい。 幾つかの実施形態において、配合物は、約１～２重量％の緩衝塩を含む。例えば、緩衝塩は、約１重量％、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、約１．５重量％、約１．６重量％、約１．７重量％、約１．８重量％、約１．９重量％、または約２重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１０～２０重量％のゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルを含む。例えば、ゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルは、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％であってよい。
幾つかの実施形態において、約７５ｍｇのベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含む本発明の配合物。そのような実施形態において、配合物は、約１３重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）；約１９重量％のスクロース球；約２９重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））；約１７重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）；約２重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）；約１重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）； 約０．５重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）； 約１重量％の緩衝塩；および約１７重量％のゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルを含む。
例えば、配合物は、約１３．１重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）；約１９．４重量％のスクロース球；約２９．１重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））；約１７．３重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）；約１．７重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）；約０．９重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）；約０．４重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）；約１．３重量％の緩衝塩；および約１６．８重量％のゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルを含む。
様々な実施形態において、本発明の配合物は、約２５ｍｇのベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含むカプセル（例えば、ハードゼラチンまたはＨＰＭＣカプセル）の形態である。カプセルは、複数の腸溶性コーティングされたベータラクタマーゼ含有ペレットを含む。そのような実施形態において、配合物は、約５～１５重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含む。例えば、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）は、約５重量％、約６重量％、約７重量％、約８重量％、約９重量％、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、または約１５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１０～２０重量％のスクロース球を含む。例えば、スクロース球は、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％存在してよい。様々な実施形態において、配合物は、約１５～２５重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））を含む。例えば、結合賦形剤は、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、約２０重量％、約２１重量％、約２２重量％、約２３重量％、約２４重量％、または約２５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１０～２０重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）を含む。例えば、腸溶性ポリマーは、約１０重量％、約１１重量％、約１２重量％、約１３重量％、約１４重量％、約１５重量％、約１６重量％、約１７重量％、約１８重量％、約１９重量％、または約２０重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約１．０～２．０重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）を含む。例えば、可塑化剤は、約１．０重量％、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、約１．５重量％、約１．６重量％、約１．７重量％、約１．８重量％、約１．９重量％、または約２．０重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約０．１～１．０重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）を含む。例えば、滑剤は、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、または約１重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約０．１～１．０重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）を含む。例えば、乳化剤は、約０．１重量％、約０．２重量％、約０．３重量％、約０．４重量％、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、または約１重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約０．５～１．５重量％の緩衝塩を含む。例えば、緩衝塩は、約０．５重量％、約０．６重量％、約０．７重量％、約０．８重量％、約０．９重量％、約１．０重量％、約１．１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、または約１．５重量％で存在してよい。幾つかの実施形態において、配合物は、約３０～４０重量％のゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルを含む。例えば、ゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルは、約３０重量％、約３１重量％、約３２重量％、約３３重量％、約３４重量％、約３５重量％、約３６重量％、約３７重量％、約３８重量％、約３９重量％、または約４０重量％であってよい。
幾つかの実施形態において、約２５ｍｇのベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）を含む本発明の配合物。そのような実施形態において、配合物は、約１０重量％のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）；約１５重量％のスクロース球；約２２重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））；約１３重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）；約１重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）；約０．５重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）；約０．３重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）；約１重量％の緩衝塩；および約３８重量％のゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルを含む。
例えば、配合物は、約９．８重量のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）；約１４．５重量％のスクロース球；約２１．８重量％の結合賦形剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ））；約１３重量％の腸溶性ポリマー（例えば、ＥＵＤＲＡＧＩＴ Ｌ ３０ Ｄ－５５）；約１．３重量％の可塑化剤（例えば、クエン酸トリエチル）；約０．６重量％の滑剤（例えば、モノステアリン酸グリセリル）；約０．３重量％の乳化剤（例えば、ポリソルベート－８０）；約１．０重量％の緩衝塩；および約３７．７重量％のゼラチンまたはＨＰＭＣカプセルを含む。
本発明はまた、複数の用量のベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）および／または追加の治療薬を胃腸管に沿って放出する放出改変配合物を提供する。そのような実施形態において、そのような配合物の全体的な放出プロファイルは、例えば複数の粒子タイプまたは複数の層を利用することにより適合されてよい。一実施形態において、ベータラクタマーゼの第一の用量は、例えば小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）または大腸（例えば、盲腸、結腸の上行結腸、横行結腸、下行結腸またはＳ状結腸、および直腸の１つまたは複数）における放出用に配合され、一方で第二の用量は、例えば小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）または大腸（例えば、盲腸、結腸の上行結腸、横行結腸、下行結腸またはＳ状結腸、および直腸の１つまたは複数）の異なる領域における、遅延放出用に配合される。あるいは複数の用量が、小腸に沿った異なる位置で放出される。例えば一実施形態において、ベータラクタマーゼの第一の用量は、例えば小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）における、放出用に配合され、一方で第二の用量は、例えば小腸（例えば、十二指腸、空腸および回腸の１つまたは複数）の別の部分における、遅延放出用に配合される。別の実施形態において、ベータラクタマーゼの第一の用量は、例えば大腸（例えば、盲腸、結腸の上行結腸、横行結腸、下行結腸またはＳ状結腸、および直腸の１つまたは複数）における、放出用に配合され、一方で第二の用量は、例えば大腸（例えば、盲腸、結腸の上行結腸、横行結腸、下行結腸またはＳ状結腸、および直腸の１つまたは複数）の別の部分における、遅延放出用に配合される。
様々な実施形態において、本明細書に記載される薬剤は、医薬的に許容できる塩、即ち、過度の毒性、刺激、アレルギー反応および同様のものなしに、合理的な利益／リスク比に見合う、ヒトおよび他の動物の組織と接触での使用に適したそれらの塩の形態であってよい。医薬的に許容できる塩は、当該技術分野で周知である。塩は、治療剤の最終的な単離および精製の際にインサイチュで、または有利塩基官能基を適切な酸と反応させる、もしくは遊離酸の官能性を適当なアルカリ性部分と反応させることにより別個に、調製できる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバリン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩および同様のものが挙げられる。代表的なアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、および同様のもの、ならびに非限定的にアンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミン、および同様のものを含む、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミンカチオンが挙げられる。
様々な実施形態において、本発明の配合物は、複数の利点を提供する。例えば本発明者らは、それ自体難しい、タンパク質（即ち、ベータラクタマーゼ）の配合に成功した。これはさらにＧＩ管環境と組み合わされ、そこで本発明の配合物は様々な実施形態で薬物を放出する。さらに、様々な実施形態において、本発明の配合物は、例えば小腸において、様々な抗生物質の有害作用からのＧＩ管での良好な防御的被覆を可能にするのに充分に緩徐であるＧＩ管放出を提供する（より緩徐な放出に見合うベータラクタマーゼ半減期の増加により強調される利益）。さらに、例えばＥＵＤＲＡＧＩＴと反対に、本発明のペレットの薬物層をＨＰＣでコーティングすることにより、本発明の配合物は、配合物中のＥＵＤＲＡＧＩＴ量を最小にし、それにより可能性のある用量限定毒性および製造の複雑さを軽減する。
投与および投与量
本発明により投与されるベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の実際の用量が、例えば特定の投与剤形および投与様式により変動することは、察知されよう。ベータラクタマーゼの作用を改変し得る多くの因子（例えば、体重、性別、食事、投与時間、投与経路、排出速度、対象の状態、薬物併用、遺伝的素因、および反応感受性）は、当業者により考慮され得る。投与は、最大耐容用量内で、連続で、または１回もしくは複数の別個の投与で実施され得る。所与の条件の組み合わせに最適な投与速度は、従来の投与量の投与テストを利用して、当業者が確認できる。
ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の個々の用量は、例えば、単位投与剤形あたり約０．０１ｍｇ～約１，０００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約９５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約９００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約８５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約８００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約７５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約７００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約６５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約６００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約５５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約４５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約４００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約３５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約３００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約２５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約２００ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約１５０ｍｇ、約０．０１ｍｇ～約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ～約９０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約８０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約７０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約６０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約５０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約４０ｍｇの有効成分、単位投与剤形あたり約０．１ｍｇ～約３０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ、約０．１ｍｇ～約５ｍｇ、約０．１ｍｇ～約３ｍｇ、約０．１ｍｇ～約１ｍｇ、または単位投与剤形あたり約５ｍｇ～約８０ｍｇを含有する単位投与剤形（例えば、錠剤またはカプセル）で投与され得る。例えば単位投与剤形は、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、または約１，０００ｍｇ（全ての値およびその間の範囲を含む）であり得る。一実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の個々の用量は、２５ｍｇのベータラクタマーゼを含有する単位投与剤形で投与される。別の実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の個々の用量は、５０ｍｇのベータラクタマーゼを含有する単位投与剤形で投与される。さらなる実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の個々の用量は、７５ｍｇのベータラクタマーゼを含有する単位投与剤形で投与される。
一実施形態において、ベータラクタマーゼは、約０．０１ｍｇ～約１００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約１，０００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約９５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約９００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約８５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約８００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約７５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約７００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約６５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約６００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約５５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約５００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約４５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約４００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約３５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約３００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約２５０ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約２００ｍｇ日用量、約０．０１ｍｇ～約１５０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約１００ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約９５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約９０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約８５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約８０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約７５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約７０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約６５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約６０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約５５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約５０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約４５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約４０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約３５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約３０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約２５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約２０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約１５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約１０ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約５ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約３ｍｇ日用量、約０．１ｍｇ～約１ｍｇ日用量、または約５ｍｇ～約８０ｍｇ日用量の量で投与される。
様々な実施形態において、ベータラクタマーゼは、約０．０１ｍｇ、約０．０２ｍｇ、約０．０３ｍｇ、約０．０４ｍｇ、約０．０５ｍｇ、約０．０６ｍｇ、約０．０７ｍｇ、約０．０８ｍｇ、約０．０９ｍｇ、約０．１ｍｇ、約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇ、約０．９ｍｇ、約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約２５ｍｇ、約３０ｍｇ、約３５ｍｇ、約４０ｍｇ、約４５ｍｇ、約５０ｍｇ、約５５ｍｇ、約６０ｍｇ、約６５ｍｇ、約７０ｍｇ、約７５ｍｇ、約８０ｍｇ、約８５ｍｇ、約９０ｍｇ、約９５ｍｇ、約１００ｍｇ、約１５０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５５０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６５０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７５０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８５０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９５０ｍｇ、または約１，０００ｍｇ（全ての値およびその間の範囲を含む）の日用量で投与される。
幾つかの実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、ＳＹＮ－００４または本明細書に記載される他のベータラクタマーゼ、およびその変異体）の適切な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ対象体重、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、または約１００ｍｇ／ｋｇ体重（全ての値およびその間の範囲を含む）の範囲である。別の実施形態において、ベータラクタマーゼの適切な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約９ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約８ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約７ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、０．０１ｍｇ／ｋｇ～約６ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約４ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約３ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約２ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１．５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ～約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
様々な実施形態において、ＳＹＮ－００４の用量は、約７５ｍｇ～約３００ｍｇの間、例えば、約７５ｍｇ、または約１００ｍｇ、または約１２５ｍｇ、または約１５０ｍｇ、または約１７５ｍｇ、または約２００ｍｇ、または約２２５ｍｇ、または約２５０ｍｇ、または約２７５ｍｇ、または約３００ｍｇである。
本発明の特定の実施形態によれば、ベータラクタマーゼは、例えば約１日１回、約１日おき、約３日ごと、約週に１回、約２週に１回、約月に１回、約２ヶ月に１回、約３ヶ月に１回、約６ヶ月に１回、または約年に１回投与されてよい。特定の実施形態において、ベータラクタマーゼは、１日１回より多く、例えば約１日２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、または約１０回投与されてよい。
抗生物質
様々な態様において、本発明は、抗生物質への耐性の生成を防ぐまたは低減するための方法を提供する。様々な実施形態において、対象は、抗生物質での処置を受けているか、または処置を最近受けた。様々な実施形態において、対象は、１種または複数の抗生物質を受けることになっている。
本明細書に記載される抗生物質は、様々な実施形態において、それに対し耐性が存在する抗生物質、またはそれに対し本発明のベータラクタマーゼの支援が治療的応答を誘導する抗生物質に関する。
例えば様々な実施形態において、本発明の方法は、本発明のベータラクタマーゼが抗生物質の前（例えば、１時間前、または２時間前、または３時間前、または６時間前、または９時間前、または１０時間前、または１２時間前、または１日前）に投与されて、理論に結びつけるのを望むものではないが、患者のマイクロバイオームを抗生物質に対しあまり耐性でなくしたがって応答するように調整する、レジメンに関する。
様々な実施形態において、抗生物質は、ベータラクタム系、カルバペネム系、モノバクタム系、β－ラクタマーゼ阻害剤、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、リファマイシン系、マクロライド系、ケトライド系、リンコサミド系、ストレプトグラミン系、スルホンアミド系、オキサゾリジノン系、およびキノロン系から選択される。
様々な実施形態において、抗生物質は、ペニシリン系（例えば、アンピシリン、アモキシシリン）、セファロスポリン系、クラバム系（またはオキサペナム系）、セファマイシン系およびカルバペネム系などのベータラクタム系抗生物質である。
様々な実施形態において、抗生物質はセファロスポリンであり、それは
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の１つまたは複数であり得る。
幾つかの実施形態において、抗生物質は、バンコマイシンである。
幾つかの実施形態において、抗生物質は、ストレプトマイシン、ネオマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、テトラサイクリン、ドキシサイクリン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、およびクラリスロマイシンから選択される。
幾つかの実施形態において、抗生物質は、トロバフロキサシン、シプロフロキサシン、ガチフロキサシン、およびモキシフロキサシンから選択される。
幾つかの実施形態において、用語「患者」および「対象」は、互換的に用いられる。幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、ホ乳動物、例えばヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、または非ヒト霊長類、例えばサル、チンパンジーもしくはヒヒである。他の実施形態において、対象および／または動物は、非ホ乳動物、例えばゼブラフィッシュである。幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、蛍光標識細胞（例えば、ＧＦＰを用いた）を含んでよい。幾つかの実施形態において、対象および／または動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
様々な実施形態において、本発明の方法は、ヒト対象の処置に有用である。幾つかの実施形態において、ヒトは、小児のヒトである。他の実施形態において、ヒトは、成人のヒトである。他の実施形態において、ヒトは、老年のヒトである。別の実施形態において、ヒトは、患者と称されてもよい。幾つかの実施形態において、ヒトは、女性である。幾つかの実施形態において、ヒトは、男性である。
特定の実施形態において、ヒトは、約１～約１８ヶ月齢、約１８～約３６ヶ月齢、約１～約５歳、約５～約１０歳、約１０～約１５歳、約１５～約２０歳、約２０～約２５歳、約２５～約３０歳、約３０～約３５歳、約３５～約４０歳、約４０～約４５歳、約４５～約５０歳、約５０～約５５歳、約５５～約６０歳、約６０～約６５歳、約６５～約７０歳、約７０～約７５歳、約７５～約８０歳、約８０～約８５歳、約８５～約９０歳、約９０～約９５歳または約９５～約１００歳の範囲の年齢を有する。
キット
本発明は、本明細書に記載される放出改変配合物の投与を簡便にし得るキットを提供する。キットは、本明細書に記載される放出改変配合物の少なくとも１種を含む、材料または成分の集合である。キット中で構成される成分の厳密な性質は、意図する目的に依存する。一実施形態において、キットは、ヒト対象を処置する目的で構成される。
使用説明書が、キットに含まれてよい。使用説明書は典型的には、本明細書に記載される関連の障害を処置するためなどの、キットの成分を用いて所望の転帰に影響を及ぼすのに利用される技術を記載する有形の表現を包含する。場合によりキットはまた、希釈剤、緩衝剤、医薬的に許容できる担体、シリンジ、カテーテル、アプリケータ、ピペッティングもしくは測定ツール、結束材料、または当業者に即座に認識される他の有用な装備などの他の有用な構成要素を含有する。
キット中に集められた材料および成分は、それらの操作性および利用性を保持する任意の簡便性かつ適切な方法での貯蔵を実践者に提供できる。例えば成分は、室温、冷蔵温度、または凍結温度で提供され得る。成分は典型的には、適切な包装材料中に含有される。様々な実施形態において、包装材料は、好ましくは滅菌された汚染物不含の環境を提供するように、周知の方法により構築される。包装材料は、キットおよび／または成分の内容および／または目的を示す外部ラベルを有してよい。
実施例
実施例１：抗生物質介在性のブタ腸管マイクロバイオーム崩壊試験計画
セフトリアキソンへの腸管微生物叢の暴露により誘発される抗生物質耐性遺伝子の増加を軽減するＳＹＮ－００４（リバキサマーゼ）の能力を、正常な２ヶ月齢子ブタで評価した。試験計画およびタイムラインについては表５および図１を参照されたい。動物を試験開始前に１４日間、馴化した。セフトリアキソン（ＣＲＯ）を７日間にわたり１日１回投与し、動物は、ＳＹＮ－００４（リバキサマーゼ）を抗生物質処置の前日に開始して連続９日間、受けた。糞便を、試験－７日目、－４日目、４日目、および８日目に採取した。糞便ＤＮＡを単離し、全ゲノムショットガンメタゲノミクス解析に供した。マイクロバイオーム中の抗生物質耐性遺伝子の収集物であるレジストーム共同体を、抗生物質耐性遺伝子のキューレーティッドデータベースへの比較により同定した。
Figure 0007239252000012
各群が５匹の正常な子ブタからなる２群を、この試験に用いた。群１の動物は、セフトリアキソン（ＩＶ、１日１回、５０ｍｇ／ｋｇ）で連続７日間処置され、群２の動物は、セフトリアキソン（ＩＶ、１日１回、５０ｍｇ／ｋｇ）を連続７日間、およびＳＹＮ－００４（リバキサマーゼ、経口、１日４回、７５ｍｇ／用量）をセフトリアキソン送達の前日に開始して連続９日間受けた。
図１は、ブタ試験の図式的タイムラインを示す。正常な子ブタ（２ヶ月齢、およそ５０ポンド（およそ２３キログラム））を、試験開始前に１４日間馴化した。各コホート５匹からなる２つのコホートを、この試験に用い、表５に示される通り、群１は、セフトリアキソンのみを受け、群２は、セフトリアキソンおよびＳＹＮ－００４（リバキサマーゼ）を受けた。便を４つのタイムポイント、つまり処置前の試験－７日目および－４日目の２回、ならびに処置中の試験４日目および８日目の２回、採取した。
総ＤＮＡを、製造業者の使用説明書に従い、ＭＯＢＩＯ Ｐｏｗｅｒ－Ｓｏｉｌ（登録商標） ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、メリーランド州ジャーマンタウン所在）を用いて、糞便標本から単離した。各ＤＮＡ試料を、Ｂｉｏｍｅｋ ＦＸ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州ブレア所在）を用いて、最終濃度０．５ｎｇ／μＬにヌクレアーゼ不含水３～１８μＬで標準化した。ライブラリーを、Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎｅ、カリフォルニア州サンディエゴ所在）を用いて構築した。各試料について、０．５ｎｇの投入物をタグメンテーション反応に用い、その後改変Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴプロトコルによるＮｅｘｔｅｒａ ｉ７およびｉ５インデックスプライマー、ならびに２Ｘ ＫＡＰＡマスターミックスを用いる１３サイクルのＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ産物を、１．０×スピードビーズを用いて精製し、ヌクレアーゼ不含水１５μｌで溶出した。最終的なライブラリーを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ蛍光測定（１００×最終希釈）により定量し、濃度は０．１～４．０ｎｇ／μｌの範囲であった。ライブラリーを、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎにより計測された濃度に基づいてプールし、キャリパーＬａｂＣｈｉｐＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム所在）に取り付けられた高感度チップにロードした。報告された塩基対サイズは、３０１～６８０ｂｐの範囲であった。６４の各プールを、１００ｂｐペアドエンドリード／試料を目的として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ｖ３ ｆｌｏｗｃｅｌｌの８レーンでランした。
集められていない（ｕｎａｓｓｅｍｂｌｅｄ）メタゲノムシーケンスリードを、記載された通り（Ｈａｓａｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ ＯＮＥ ９：ｅ９７６９９； Ｌａｘ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４５：１０４８）、ＣｏｓｍｏｓＩＤ， Ｉｎｃ．のバイオインフォマティクスソフトウエアパッケージ（ＣｏｓｍｏｓＩＤ Ｉｎｃ．、メリーランド州ロックビル所在）を用いて直接解析した。手短に述べると、生の集められていないショットガンシーケンスリードを、ＣｏｓｍｏｓＩＤ， Ｉｎｃ．の抗生物質耐性遺伝子のキューレーティッドデータベースに対してプローブした。シーケンシングデータの解析は、各遺伝子についての遺伝子カバレッジの割合％に基づき、各試料中の各遺伝子の頻度（％）を決定してヒートマップを作成することにより定量される、抗生物質耐性遺伝子の同定によるレジストーム解析を含んだ。
リバキサマーゼが抗生物質耐性の増加に影響を及ぼしたか否かを決定するために、糞便ＤＮＡの全ゲノムショットガンメタゲノミクスデータを、糞便マイクロバイオーム中の抗生物質耐性菌の集団の尺度として、抗生物質耐性遺伝子の存在について分析した。抗生物質処置の前および後（図２Ａおよび図２Ｂ）を比較した各動物の糞便マイクロバイオーム中の同定された抗生物質耐性遺伝子のヒートマップは、ＣＲＯがＣＲＯ＋リバキサマーゼマイクロバイオームに比較してより高い、処置後４日目の抗生物質耐性遺伝子の存在量に関連したことを示した。４日目に検出された耐性遺伝子のほとんどが、ベータラクタマーゼをコードしていた（図２Ａおよび図２Ｂ）。具体的には、基質拡張型ＯＸＡ分類Ｄベータラクタマーゼ（ＭｃＡｒｔｈｕｒ ａｎｄ Ｗｒｉｔｅ， ２０１５， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ２７：４５； Ｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， ｌａｈｅｙ．ｏｒｇ／ｓｔｕｄｉｅｓ／）をコードするｂｌａＯＸＡ遺伝子は、４日目のＣＲＯ動物５匹中２匹において高レベルで存在したが、ＣＲＯ＋リバキサマーゼコホート中に存在しないか、またはより低い頻度で観察された。同様に、基質拡張型分類Ａセリンベータラクタマーゼ（ＭｃＡｒｔｈｕｒ ｅｔ ａｌ．， ２０１３， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５７：３３４８）をコードするｂｌａＣＴＸ－Ｍ＿８２またはｂｌａＣＦＸ＿Ａ４遺伝子が、４日目にＣＲＯ動物２匹において高レベルで検出された。拡張型セファロスポリン耐性分類Ｃベータラクタマーゼをコードする追加のベータラクタマーゼ遺伝子ＡｍｐＣが、－７日目の抗生物質処置前動物の１匹を除く全匹に存在した。－７日目～－４日目に、ＡｍｐＣレベルが任意の抗生物質介在性選択メカニズムの前の両方のコホートで上昇した。しかし４日目までに、ＡｍｐＣ遺伝子頻度はＣＲＯコホートで増加し続けたが、ＡｍｐＣは、ＣＲＯ＋リバキサマーゼ動物で観察された－７日目の頻度と同様のレベルまで低下した。
図２Ａは、ブタ糞便マイクロバイオーム中の全ての抗生物質耐性遺伝子の頻度のヒートマップ解析を示す。糞便マイクロバイオームメタゲノムデータを、各試料中の相対的遺伝子頻度の尺度として遺伝子カバレッジの割合％に基づく抗生物質耐性遺伝子の存在について解析した。ヒートマップの各矢印は、示されたタイムポイント：－７日目、－４日目、または４日目での各動物を表す。抗生物質耐性遺伝子を図の最下部に示し、糞便試料の処置群および採取日を左に示し、動物番号（Ｐ１～Ｐ１０）を右に示す。
図２Ｂは、ブタ糞便マイクロバイオーム中のベータラクタマーゼ遺伝子の頻度のヒートマップ解析を示す。糞便マイクロバイオームのメタゲノムデータを、各試料中の相対的遺伝子頻度の尺度として遺伝子カバレッジの割合％に基づくベータラクタマーゼ遺伝子の存在について解析した。ヒートマップの各矢印は、示されたタイムポイント：－７日目、－４日目、または４日目での各動物を表す。抗生物質耐性遺伝子を図の最下部に示し、糞便試料の処置群および採取日を左に示し、動物番号（Ｐ１～Ｐ１０）を右に示す。
ベータラクタマーゼに加えて、他の耐性遺伝子が、抗生物質暴露に応答して頻度上昇を示した。これらの遺伝子の多くは、ベータラクタムを含む広範囲の抗生物質への耐性を付与する系である、多剤排出トランスポーター系の成分をコードする。追加の解析用に選択された遺伝子は、ＡｃｒＥＦ－ＴｏｌＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードするａｃｒＥ（Ｌａｕ ａｎｄ Ｚｇｕｒｓｋａｙａ， ２００５， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８７：７８１５）；ＭｄｔＡＢＣ多剤排出トランスポーター系の応答調節因子をコードするｂａｅＲ（Ｎａｇａｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４：４１６１）；ＥｍｒＫＹ－ＴｏｌＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードするｅｍｒＹ（Ｔａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９７， Ｊ． Ｇｅｎ． Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ４３：２５７）；ＭｄｔＡＢＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードするｍｄｔＤ（Ｎａｇａｋｕｂｏ ｅｔ ａｌ．， ２００２， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １８４：４１６１）；主要促進剤スーパーファミリーの多剤耐性排出ポンプをコードするｍｄｔＮ（Ｓｕｌａｖｉｋ ｅｔ ａｌ．， ２００１， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ４５：１１２６）を含む。ベータラクタマーゼに密接に関係する２種の遺伝子：ペニシリン結合タンパク質２をコードするｐｂｐ２（Ｂｈａｒａｔ ｅｔ ａｌ．， ２０１５， Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５９：５００３）、およびペニシリン結合タンパク質４をコードするｐｂｐ４（Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１４， ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ９：ｅ９７２０２）もまた、セファロスポリン耐性分類ＣベータラクタマーゼをコードするベータラクタマーゼＡｍｐＣに加えて選択した。各選択された遺伝子について、－４日目～４日目の相対的遺伝子頻度の平均の変化を、ＣＲＯまたはＣＲＯ＋リバキサマーゼコホートで比較した（図３）。相対的遺伝子頻度は、ＣＲＯコホートでは各遺伝子で上昇した。対照的に、遺伝子頻度は、レベルがベースラインをわずかに超えて上昇したｐｂｐ２以外のＣＲＯ＋リバキサマーゼ群の各遺伝子で低下した。最大上昇がｍｄｔＤ遺伝子で観察され、そのレベルはＣＲＯコホートで－４日目～４日目に２倍になったが、ｍｄｔＤレベルはＣＲＯ＋リバキサマーゼコホートでは低下した。
図３は、選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の変化を示す。処置前－４日目を処置後４日目と比較した、ＣＲＯ（黒色）またはＣＲＯ＋リバキサマーゼ（白色）処置動物について示された抗生物質耐性遺伝子の相対的頻度（平均）の変化を示す。負の値は、頻度低下を示し、正の値は、頻度上昇を示し、零の値は、遺伝子頻度の不変を表す。遺伝子を水平軸に列挙し、ａｃｒＥは、ＡｃｒＥＦ－ＴｏｌＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードし；ｂａｅＲは、ＭｄｔＡＢＣ多剤排出トランスポーター系の応答調節因子をコードし；ｅｍｒＹは、ＥｍｒＫＹ－ＴｏｌＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードし；ｍｄｔＤは、ＭｄｔＡＢＣ多剤排出トランスポーター系の成分をコードし；ｍｄｔＮは、主要促進剤スーパーファミリーからの多剤耐性排出ポンプをコードし；ｐｂｐ２は、ペニシリン結合タンパク質２をコードし；ｐｂｐ４は、ペニシリン結合タンパク質４をコードし；ＡｍｐＣは、分類Ｃベータラクタマーゼをコードする。
非ベータラクタム系抗生物質：アミノグリコシド系およびテトラサイクリン系への耐性を与える２種の抗生物質耐性遺伝子を、さらなる解析に選択した（図４Ａおよび４Ｂ）。アミノグリコシド＿ｓｔｒＡ（Ｓｃｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｇｅｎｅ ７５：２７１）は、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードし、テトラサイクリン＿ｔｅｔ３９（Ａｇｅｒｓｏ ａｎｄ Ｇｕａｒｄａｂａｓｓｉ， ２００５， Ｊ． Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ． Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． ５５：５６６）は、テトラサイクリン排出ポンプの成分をコードする。いずれの遺伝子も、処置前の試料（－７日目）では検出されなかった。－４日目に、両方の遺伝子が、１匹の動物（ブタ３）で検出された。抗生物質処置後４日目に、両方の遺伝子が、ＣＲＯでの処置動物５匹中４匹において、高レベルで検出された。対照的にＣＲＯ＋リバキサマーゼコホートにおいて、アミノグリコシド＿ｓｔｒＡレベルは、依然として全ての動物で低レベルであるか、または存在せず、ＣＲＯ＋リバキサマーゼコホートでは１匹のみが、高レベルのテトラサイクリン＿ｔｅｔ３９遺伝子を有すると同定された。
図４Ａおよび４Ｂは、選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の変化を示す。２種の選択された抗生物質耐性遺伝子：Ａ）アミノグリコシド＿ｓｔｒＡおよびＢ）テトラサイクリン＿ｔｅｔ３９の相対的頻度を、ＣＲＯ（青色）またはＣＲＯ＋リバキサマーゼ（橙色）処置動物から示す。各ドットは、処置前－７日目もしくは－４日目、または処置後４日目からの各動物のマイクロバイオームにおける相対的遺伝子レベルを表す。中央値を、各データセットで示す。
セフトリアキソン処置は、子ブタ腸管マイクロバイオームにおける抗生物質耐性遺伝子の存在量を増加させ、一方でＳＹＮ－００４（リバキサマーゼ）は、この濃縮工程を減弱した。リバキサマーゼの存在下では、抗生物質耐性遺伝子の頻度は、低下したか、または抗生物質処置前レベルを維持した。注目すべきこととして、セフトリアキソンの存在下では、ベータラクタム系への耐性を付与する遺伝子のみではなく、抗生物質耐性遺伝子の多くの分類の頻度が増幅された。これらの抗生物質耐性遺伝子は、ベータラクタマーゼ、薬物排出ポンプ系の成分をコードする遺伝子、ならびにテトラサイクリンおよびアミノグリコシドへの耐性をコードする遺伝子を含んだ。
実施例２：抗生物質介在性ブタ腸管マイクロバイオーム崩壊試験計画の拡大
実施例１の試験を、経口アモキシシリンおよびＩＶエルタペネムに拡大した。
Figure 0007239252000013
およそ２ヶ月齢でおよそ２０ｋｇのヨークシャー子ブタを用いた。ブタは、出生日と７日齢に鉄／ペニシリン／Ｄｒａｘｘｉｎ ２ｍｌを受けた。抗生物質は、食物中で提供されなかった。ブタは、２１日目に離乳した。子ブタは、１日３回：午前７時の投与後、午後１２時の投与後および午後５時の投与後に摂餌した。
ブタ糞便ＤＮＡの全ゲノムショットガン配列解析を実施して、腸管微生物叢に及ぼす抗生物質の影響を評定し、糞便マイクロバイオーム中に存在する抗生物質耐性菌の尺度として抗生物質耐性遺伝子を定量した。両方の抗生物質が、腸管マイクロバイオームに対し顕著な変化を誘発した。抗生物質暴露の４日以内に、ベータラクタムおよび非ベータラクタム系抗生物質への耐性を付与するものを含む、広範囲の耐性遺伝子が、マイクロバイオーム中で検出された。
図５Ａは、エルタペネム処置による抗生物質耐性遺伝子ｔｅｔＳおよびｍｐｈＥ（左から右に向かって示す）の頻度の変化を示す。
図５Ｂは、エルタペネム処置によるバンコマイシン耐性遺伝子ｖａｎＲｃ３、ｖａｎＡ＿Ｃ、およびｖａｎＳｃ３（左から右に向かって示す）の頻度の変化を示す。
図５Ｃは、アモキシシリン処置によるベータラクタマーゼ遺伝子ＲＯＢ＿１、ＯＸＡ＿３４７、およびＣｂｌＡ＿１（左から右に向かって示す）の頻度の変化を示す。
図５Ｄは、エルタペネム処置によるベータラクタマーゼ遺伝子ＩＭＰ＿２７、ＯＸＡ＿２１２、およびＯＸＡ＿２７７の頻度の変化を示す。
対照が経口アモキシシリンおよびＩＶセフトリアキソンを投与された場合に、先のＩＶセフトリアキソンの結果と一致して、ＳＹＮ－００４が抗生物質耐性の緊急性および蔓延も軽減することが予期される。
実施例３：経口抗生物質介在性イヌ腸管マイクロバイオーム崩壊試験計画
経口アモキシシリンへの腸管微生物叢の暴露により誘発された抗生物質耐性遺伝子の増加を軽減するＳＹＮ－００４（リバキサマーゼ）遅延放出性配合物の能力を、正常な７ヶ月齢雌ビーグル犬で評価した。動物を投与開始前に２４日間、馴化した。動物（ｎ＝１０、５匹／コホート）は、１日３回の経口アモキシシリン（リンゴ果汁で再構成された４０ｍｇ／ｋｇ／用量）＋／－ ＳＹＮ－００４（１０ｍｇ） １カプセルを５日間受け、６日目の午前が最終投与であった。動物は、アモキシシリン＋／－ＳＹＮ－００４の合計１６用量を受けた。糞便試料を、抗生物質投与前および最終投与後に採取した。血液を、１日目の最初の抗生物質投与後、および６日目の最終投与後に採取した。各血液採取日に、血液を、各動物から７つのタイムポイント：０．５、１、２、３、４、６および８時間目に採取した。アモキシシリン血清レベルを、検証された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法とタンデム質量分析検出法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を利用して測定した。糞便試料から単離されたＤＮＡを、全ゲノムショットガンシーケンシングおよびメタゲノミクス解析に供した。
アモキシシリン血清レベルを、各血液採取日について各タイムポイントの平均＋標準偏差として各群でプロットした。曲線下面積を、各採血日（１日目および６日目）の各群について計算し、一元配置分散分析およびＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ７．０３ソフトウエア）を用いて統計学的に比較した。アモキシシリン血清レベルは、１日目および６日目のアモキシシリン単独とアモキシシリン＋ＳＹＮ－００４コホートについて、それぞれｐ＝０．７０３および０．０９８で有意には異ならなかった（図６）。これらのデータは、遅延放出性ＳＹＮ－００４配合物が胃腸管からのアモキシシリン全身吸収を妨害しなかったことを実証し、このＳＹＮ－００４配合物がイヌの小腸上部でのアモキシシリン吸収前に早期に放出されなかったことを示す。
糞便試料から単離されたＤＮＡを、全ゲノムシーケンシングに供し、ＣｏｓｍｏｓＩＤ， Ｉｎｃ．のバイオインフォマティクスソフトウエアパッケージを利用して解析した。解析は、糞便マイクロバイオーム中に存在する微生物叢の菌種の同定、および各遺伝子の遺伝子カバレッジの割合％に基づきかつ各試料中の各遺伝子の頻度（％）を決定することにより定量される抗生物質耐性遺伝子の同定を含んだ。
ＳＹＮ－００４が経口アモキシシリンにより誘発された損傷から糞便マイクロバイオームを防御するか否かを決定するために、マイクロバイオームの細菌集団を、三座標の主座標分析（ＣｏｓｍｏｓＩＤ， Ｉｎｃ． 、バイオインフォマティクスソフトウエア）を用いて比較した。ポイント間の距離は、試料多様性における差異の度合いを示し、ポイントが互いに接近する程、より類似している。アモキシシリン単独およびアモピシリン＋ＳＹＮ－００４コホートの両方からの処置前マイクロバイオームは、一緒に群化した（図７）。注目すべきこととして、アモピシリン＋ＳＹＮ－００４コホートからのアモキシシリン暴露後のマイクロバイオームもまた、処置前試料と共に群化した。対照的に、処置後試料５種中４種は、処置前クラスターから離れてプロットされた。処置後アモキシシリン単独の試料１種は、残りの試料と一緒に群化した。これらのデータは、経口アモキシシリンがＧＩ管内の微生物叢の集団を崩壊すること、およびＳＹＮ－００４が経口アモキシシリンにより誘発される損傷を軽減し得ること、を実証する。
ＳＹＮ－００４が抗生物質耐性遺伝子の存在量に影響を及ぼしたか否かを決定するために、レジストーム解析を実施した。処置前対処置後の選択された抗生物質耐性遺伝子の頻度の比較は、アモキシシリンが、アモキシシリン＋ＳＹＮ－００４コホートに比較して処置後の抗生物質耐性遺伝子のより高い存在量に関連したことを実証した。処置後に検出された耐性遺伝子の多くは、ベータラクタマーゼをコードしていた。注目すべきこととして、ＴＥＭおよびＯＸＡベータラクタマーゼ遺伝子は、アモキシシリン単独コホートにおいて６日目でのみ検出された（図８）。これらの遺伝子は、アモキシシリン暴露前には検出されなかった。
ベータラクタマーゼに加えて、他の耐性遺伝子が、抗生物質暴露に応答して頻度上昇を示した。これらの遺伝子の多くは、ベータラクタマーゼを含む広範囲の抗生物質への耐性を付与する系である多剤排出トランスポーター系の成分をコードしていた。複数の遺伝子を、さらなる解析のために選択した。各選択された遺伝子について、処置前から処置後の相対的遺伝子頻度の平均変化を、アモキシシリン単独またはアモピシリン＋ＳＹＮ－００４コホートで比較した（図９）。相対的遺伝子頻度は、アモキシシリン単独コホートでは各遺伝子で上昇した。対照的に、遺伝子頻度はアモピシリン＋ＳＹＮ－００４コホートでは各遺伝子で低下した。最大の上昇は、ｍａｒＡ遺伝子で観察され、そのレベルは処置前から処置後でほぼ２倍になり、一方でｍａｒＡレベルはアモピシリン＋ＳＹＮ－００４コホートではおよそ５０％低下した。
経口アモキシシリン暴露は、イヌ腸管マイクロバイオームにおける抗生物質耐性遺伝子の存在量を増加させ、一方でＳＹＮ－００４は、この濃縮工程を減弱した。ＳＹＮ－００４の存在下では、抗生物質耐性遺伝子の頻度は、低下した。注目すべきこととして、アモキシシリンの存在下では、ベータラクタム系への耐性を付与する遺伝子のみでなく、多くの分類の抗生物質耐性遺伝子の頻度が増幅された。これらの抗生物質耐性遺伝子は、ベータラクタマーゼ、薬物排出ポンプ系の成分をコードする遺伝子、ならびにマクロライド系およびアミノグリコシド系への耐性を付与する遺伝子を含んだ。
実施例４：ＩＶカルバペネム処置後の抗生物質耐性遺伝子の出現および増大の軽減
カルバペネム系抗生物質であるエルタペネムへの腸管微生物叢暴露により誘発された抗生物質耐性遺伝子の増加を軽減する、カルバペネマーゼＰ２Ａの能力を、正常な２ヶ月齢ブタで評価する。動物を投与開始前に２４日間、馴化する。動物（ｎ＝１６、８匹／コホート）は、エルタペネム（３０ｍｇ／ｋｇ／用量、ＩＶ、１日１回で４日間）＋／－２ＰＡ １カプセル（５０ｍｇ、ＰＯ、１日４回）を受ける。Ｐ２Ａを、抗生物質処置の前日に開始して、５日目の午前の最終投与１回まで継続する。糞便試料を抗生物質投与前および５日目のＰ２Ａの最終投与後に採取する。血液を、３日目の３回のエルタペネム投与後に採取する。血液を、エルタペネム後の３つのタイムポイント：１時間後、２時間後、および３時間後に採取する。エルタペネム血清レベルを、検証された液体クロマトグラフィー（ＬＣ）法とタンデム質量分析検出法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を利用して測定する。ＤＮＡを、糞便試料から単離し、全ゲノムショットガンシーケンシングおよびメタゲノミクス解析に供する。
エルタペネム血清レベルは、２種のコホート：エルタペネム単独またはエルタペネム＋Ｐ２Ａにおいて差があると予測されない。糞便試料から単離されたＤＮＡを、全ゲノムシーケンシングに供し、ＣｏｓｍｏｓＩＤ， Ｉｎｃ．のバイオインフォマティクスソフトウエアパッケージを利用して解析する。解析は、糞便マイクロバイオーム中に存在する微生物叢の菌種の同定、および各遺伝子の遺伝子カバレッジの割合％に基づきかつ各試料中の各遺伝子の頻度（％）を決定することにより定量される抗生物質耐性遺伝子の同定を含む。
主座標分析、ヒートマップ解析、および／またはさらなるメタゲノミクス解析を含むマイクロバイオーム分析は、エルタペネムが単独で微生物叢組成を変化させることによりマイクロバイオームへの崩壊を誘発することを実証すると予測される。対照的にエルタペネム＋Ｐ２Ａは、マイクロバイオームを保護し、マイクロバイオーム崩壊を軽減する。
ヒートマップ解析、主座標分析、および／またはさらなる遺伝子解析を含むレジストーム解析は、エルタペネムが単独で広範囲の抗生物質耐性遺伝子の増加および出現を誘発することを実証すると予測される。対照的に、抗生物質耐性遺伝子の出現および増加は、Ｐ２Ａの存在下で軽減される。
これらのデータは、ＩＶエルタペネムがＧＩ管中の微生物叢を崩壊すること、およびＰ２ＡがＩＶエルタペネムにより誘発された損傷を軽減し腸管マイクロバイオームを保護することを実証すると予測される。加えて、レジストーム解析は、エルタペネムが、カルバペネム系および他のベータラクタム系抗生物質への耐性を付与するものならびに、他の抗生物質類への耐性を付与する他のものを含む、広範囲の抗生物質耐性遺伝子の出現を誘発すること、ならびにＰ２Ａが抗生物質耐性遺伝子の出現および増大を軽減することを実証すると予測される。
定義
本明細書で用いられる「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、１以上を意味し得る。
さらに、参照される数字表示に関連して用いられる場合の用語「約」は、参照される数時表示プラスまたはマイナスその参照される数字表示の最大１０％を意味する。例えば言語「約５０％」は、４５％～５５％の範囲に及ぶ。
医療の用途に関連して用いられる場合の「有効量」は、該当する障害の病原性の割合における測定可能な処置、予防、または低減を提供するのに有効な量である。
本明細書で用いられる通り、活性および／または効果の読み出しが、薬剤または刺激の存在下で、そのようなモジュレーションの非存在下に比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはより多く、最大で約１００％（これを含む）などの有意な量、低減されれば、あるものは「減少される」。当業者に理解される通り、幾つかの実施形態において、活性が減少され、かつ幾つかの下流の読み出しが減少するが、その他は増加し得る。
反対に、活性および／または効果の読み出しが、薬剤または刺激の存在下で、そのような薬剤または刺激の非存在下に比較して、有意な量、例えば少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはより多く、最大かつ包括的に少なくとも約１００％、またはより多く、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍増加されれば、活性は「増加される」。
本明細書で参照される通り、組成の割合の全ては、他に断りがなければ、総組成物の重量％である。本明細書で用いられる言葉「包含する」およびその変形は、非限定的であることを意図し、リストにある項目の列挙がこの技術の組成物および方法においても有用であり得る他の類似項目を除外しない。同様に用語「できる」および「であってよい」ならびにそれらの変形は、非限定的であることを意図し、実施形態が特定の要素または特色を含み得る、または含んでよいという記述は、それらの要素または特色を含まない本発明の技術の他の実施形態を除外しない。
包含すること、含有すること、または有することなどの用語の同義語としての制限のない用語「含むこと」は、本発明を記載および主張するために本明細書で用いられるが、本発明またはその実施形態は、あるいは「からなる」または「から本質的になる」などの代替的用語を用いて記載されてもよい。
本明細書で用いられる言葉「好ましい」および「好ましくは」は、特定の状況下で特定の利益を与える技術の実施形態を指す。しかし他の実施形態が、同じまたは他の状況化で好ましい場合もある。さらに１つまたは複数の好ましい実施形態の記述は、他の実施形態が有用でないことを意味せず、技術の範囲から他の実施形態を除外する意図はない。
治療効果を実現するために必要とされる本明細書に記載された組成物の量は、特定の目的のために従来の手順に従って経験的に決定されてもよい。一般に、治療目的で治療薬（例えば、ベータラクタマーゼおよび／または本明細書に記載された追加の治療薬）を投与するために、治療薬は、薬理学的有効用量で与えられる。「薬理学的有効量」、「薬理学的有効用量」、「治療有効量」または「有効量」は、特に障害または疾患を処置するために、所望の生理学的効果を生成するのに充分な量、または所望の結果を実現することが可能な量を指す。本明細書で用いられる有効量は、例えば障害または疾患の症状の発生を遅延させる、障害または疾患の症状の経過を改変する（例えば、疾患の症状の進行を緩徐化する）、障害または疾患の１つまたは複数の症状または症状発現を低減または排除する、かつ障害または疾患の症状を回復させるために、充分な量を包含する。治療上の利益はまた、改善が達成されるかにかかわらず、根底にある疾患または障害の進行を停止することまたは緩徐化することを包含する。
有効量、毒性、および治療効果は、例えばＬＤ５０（集団の約５０％に対し致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の約５０％で治療有効性のある用量）を決定するために、細胞培養物、組織試料、組織ホモジネートまたは実験動物における標準的医薬手順により決定され得る。投与量は、使用される投与剤形および用いられる投与経路に応じて変化し得る。毒性効果と治療効果の間の用量比が、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表現され得る。幾つかの実施形態において、大きな治療指数を示す組成物および方法が、好ましい。治療有効用量は最初、例えば細胞培養アッセイを含む、インビトロアッセイから推定され得る。また用量は、細胞培養物または適当な動物モデルにおいて決定されるＩＣ５０を包含する循環血漿濃度範囲を実現するために動物モデルで配合され得る。血漿中の記載された組成物のレベルは、例えば高速液体クロマトグラフィーにより、測定され得る。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによりモニタリングされ得る。投与量は、医師により決定されて、必要に応じて調整されて、観察された処置効果に適合できる。
特定の実施形態において、効果は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約９０％の定量可能な変化をもたらす。幾つかの実施形態において、効果は、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、または約９０％、またはより多くの定量可能な変化をもたらす。治療上の利益はまた、改善が達成されるかにかかわらず、根底にある疾患または障害の進行を停止させるまたは緩徐化することを包含する。
本明細書で用いられる「処置の方法」は、本明細書に記載された疾患もしくは障害を処置するための組成物の使用、ならびに／または本明細書に記載された疾患もしくは障害を処置するための医薬の製造における使用および／もしくは複数の使用のための組成物に等しく適用可能である。
均等物
本発明を具体的実施形態に関連して記載したが、本発明が属する当該技術分野における公知の、または慣例的な実務に含まれる通り、そして本明細書の以前に示された本質的特性に適用され得る通り、そして添付の特許請求の範囲に含まれる通り、さらなる改良が可能であり、この適用が一般に本発明の原理に従い、本開示からのそのような逸脱を含む、本発明の任意の変更、使用、または適合に及ぶことは、理解されよう。
当業者は、日常的実験のみを利用して、本明細書に具体的に記載された具体的実施形態の数多くの均等物を認識し、またはそれを確認できよう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれるものとする。
参照による組み入れ
本明細書で参照される全ての特許および発行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。
本明細書で議論された発行物は、単に本出願の出願日以前のそれらの開示のために提供されている。本明細書では、本発明が先行の発明を考慮してそのような出願よりも前の日付けであるという資格を与えられないことの承認と解釈されるべきではない。
本明細書で用いられる全ての見出しは、単に組織化のためであり、本開示の限定を意図するものではない。任意の個々の段落の内容は、全ての段落に均等に適用可能であり得る。
参考資料
以下のものは、全体として参照により本明細書に組み入れられる：
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Claims (14)

  1. ベータラクタマーゼを含む、抗生物質に耐性であると決定された患者において感染を処置するまたは予防するために使用される組成物であって、前記ベータラクタマーゼは、ＳＥＱ．ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９５％の同一性があるアミノ酸配列およびＡｍｂｌｅｒ分類に基づく位置２７６でのアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性残基を有し、同一の前記抗生物質の投与より前にまたはそれと同時に、前記組成物が投与され、
    抗生物質への前記耐性が、前記患者からの生体試料中の抗生物質耐性に関連する２種以上の遺伝子の存在、非存在またはレベルを検出することにより決定され、
    抗生物質耐性に関連する前記２種以上の遺伝子が、ａｃｒＥ、ａｃｒＦ、ａｃｒＳ、ＡｍｐＣ、ｂａｅＲ、ｃｆｘＡ、ｃｐｘＲ、ｅｒｍＹ、ｍａｒＡ、ｍｄｔＤ、ｍｄｔＮ、ｍｄｔＫ、ｐｂｐ２、ｐｂｐ４、およびＶａｎＲＤ／ＶａｎＳＤから選択される２種以上の遺伝子である、組成物。
  2. 前記抗生物質への前記耐性が、抗微生物感受性テスト（ＡＳＴ）を用いて検出される、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記抗生物質への前記耐性が、１種もしくは複数のシークエンシング法を用いて決定される、請求項１に記載の組成物。
  4. 前記生体試料が、便である、請求項１に記載の組成物。
  5. 前記生体試料が、ＧＩ管液の吸引物である、請求項１に記載の組成物。
  6. 前記ベータラクタマーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９７％の同一性のあるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  7. 前記ベータラクタマーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９８％の同一性のあるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  8. 前記ベータラクタマーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と少なくとも９９％の同一性のあるアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  9. 前記ベータラクタマーゼが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の組成物。
  10. 前記抗生物質が、ベータラクタム系、カルバペネム系、モノバクタム系、β－ラクタマーゼ阻害剤、アミノグリコシド系、テトラサイクリン系、リファマイシン系、マクロライド系、ケトライド系、リンコサミド系、ストレプトグラミン系、スルホンアミド系、オキサゾリジノン系、およびキノロン系から選択される、請求項１に記載の組成物。
  11. 前記抗生物質が、ペニシリン系、セファロスポリン系、クラバム系、オキサペナム系、セファマイシン系、およびカルバペネム系から選択されるベータラクタム系抗生物質である、請求項１０に記載の組成物。
  12. 前記抗生物質が、バンコマイシンである、請求項１に記載の組成物。
  13. 前記感染が、Ｃ．ディフィシル感染（ＣＤＩ）および／またはＣ．ディフィシル関連疾患である、請求項１に記載の組成物。
  14. 前記感染が、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）の異常増殖である、請求項１に記載の組成物。
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