CN110062623A - 用于减弱抗生素抗性的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明部分地提供了尤其可减轻抗生素抗性的治疗性β‑内酰胺酶。

Description

用于减弱抗生素抗性的方法和组合物
技术领域
本发明部分地提供了用于使用β-内酰胺酶来减轻抗生素抗性的组合物和方法。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2016年11月1日提交的美国临时申请No.62/415,679和2017年2月15日提交的美国临时申请No.62/459,092的权益，所述美国临时申请各自的内容据此全文以引用方式并入本文。
序列表
本申请包含序列表，该序列表已经通过EFS网以ASCII格式提交，并且据此全文以引用方式并入。大致于2017年10月31日创建的ASCII副本的大小为11.8KB，并且名为SYN-028PC_ST25.txt。
背景技术
当细菌以降低被设计用于治愈或预防感染的药物、化学品或其他剂(包括抗生素)的有效性的方式改变时，会发生抗生素抗性。由此产生的抗性细菌存活并继续繁殖，由此避免了抗生素治疗。
根据CDC，每年在美国，至少有200万人感染了抗抗生素的细菌，并且每年至少有23,000人直接死于这些感染。
对于用于避免或减轻细菌对抗生素的抗性的组合物和方法存在迫切且目前尚未得到满足的医学需求。
发明内容
因此，在一些方面，本发明提供了用于允许在不会促进抗生素抗性的情况下或通过防止或减轻抗生素抗性的情况下，将抗生素施用于受试者的组合物和方法。在各个方面，本发明涉及治疗性β-内酰胺酶用于调节微生物组(包括胃肠(GI)微生物组)以减少或防止对抗生素的抗性的用途。在各种实施方案中，本发明涉及治疗性β-内酰胺酶在施用抗生素之前保持受试者的耐药基因组状态，例如以减少或防止耐药基因组存在增加的用途。在各种实施方案中，本发明涉及治疗性β-内酰胺酶用于在尽管施用抗生素的情况下减少受试者的耐药基因组状态的用途。
在各个方面，本发明涉及一种用于通过在使用抗生素或不同抗生素之前或同时施用有效量的β-内酰胺酶来治疗或预防被确定为对所述抗生素具有抗性的患者的感染的方法，该β-内酰胺酶具有与SEQ ID NO:1至少95％(或97％、或98％、或99％、或100％)同一的氨基酸序列(并且任选地具有Ambler D276N突变)。
在各种实施方案中，患者对抗生素具有抗性并且β-内酰胺酶提供对同一抗生素的治疗响应，或者患者对抗生素具有抗性并且β-内酰胺酶提供对不同抗生素的治疗响应。
在各种实施方案中，使用抗微生物易感性测试(AST)或一种或多种测序方法(例如，通过检测来自患者的生物样品(例如，粪便或胃肠道液)中与抗性相关的一种或多种基因的存在、不存在或水平来进行确定)来确定对抗生素的抗性。
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是表A中列出的基因中的一种基因。在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶、万古霉素和/或大环内酯类抗性基因。在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶或VanRD/VanSD基因的CfxA家族。在各种实施方案中，抗生素抗性基因是以下项中的一者或多者：acrE、acrF、acrS、AmpC、baeR、cfxA、cpxR、ermY、marA、mdtD、mdtN、mdtK、pbp2、pbp4以及VanRD/VanSD。
在各种实施方案中，对其具有抗性或β-内酰胺酶有助于诱导治疗响应的抗生素是选自以下项的不同抗生素：β-内酰胺类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、四环素类、利福霉素类、大环内酯类、酮内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类、磺胺类、噁唑烷酮类和喹诺酮类。
在各种实施方案中，本发明方法防止或减少对各种抗生素的抗性的发作。例如，此类抗生素包括β-内酰胺抗生素，包括青霉素和头孢菌素。
附图说明
图1示出了实施例的猪研究的示意性时间线。
图2A示出了对猪粪便微生物组中所有抗生素抗性基因的频率的热图分析。图2B示出了对猪粪便微生物组中β-内酰胺酶基因的频率的热图分析。
图3示出了所选择的抗生素抗性基因的频率变化。数据来自实施例1的研究。
图4A和图4B示出了所选择的抗生素抗性基因的频率变化。数据来自实施例1的研究。
图5A至图5D示出了所选择的抗生素抗性基因的频率变化。数据来自实施例2的研究(即使用阿莫西林或厄他培南治疗)。
图6示出了用单独的阿莫西林(黑色)或阿莫西林+SYN-004(白色)治疗的狗中的阿莫西林血清水平。数据示出为曲线下面积(平均值和标准偏差)。第1天数据显示在左小图上，并且第6天数据显示在右小图上。使用单向ANOVA和Dunnett多重比较检验来比较数据，并且第1天数据的p值为0.703，第6天数据的p值为0.098。
图7示出了主坐标分析。粪便微生物组的三分量主坐标分析。使用Bray-Curtis距离度量，通过主坐标分析来分析来自每只动物的粪便微生物组。单独阿莫西林治疗前(黄色)、治疗后(绿色)。阿莫西林+SYN-004治疗前(粉红色)和治疗后(棕色)。右边的两个圆圈仅包括绿点。
图8示出了所选择的β-内酰胺酶基因的频率变化。显示了来自单独阿莫西林(左小图)或阿莫西林+SYN-004(右小图)的所选择抗生素抗性基因TEM-113(左)和OXA-136(右)的相对频率。每个数据点代表从治疗前到治疗后每只动物的微生物组的相对基因频率。
图9示出了所选择的抗生素抗性基因的频率变化。与治疗后相比，来自治疗前的单独阿莫西林(黑色条)或阿莫西林+ribaxamase(白色条)的所指示的抗生素抗性基因的相对频率(平均值)的变化。负值表示频率减小，正值表示频率增大。基因列在横轴上。
具体实施方式
在各个方面，本发明涉及一种用于通过在使用抗生素或不同抗生素之前或同时施用有效量的β-内酰胺酶来治疗或预防被确定为对所述抗生素具有抗性的患者的感染的方法，该β-内酰胺酶具有与SEQ ID NO:1至少95％(或97％、或98％、或99％、或100％)同一的氨基酸序列(并且任选地具有Ambler D276N突变)。
在各种实施方案中，患者对抗生素具有抗性并且β-内酰胺酶提供对同一抗生素的治疗响应，或者患者对抗生素具有抗性并且β-内酰胺酶提供对不同抗生素的治疗响应。
在各种实施方案中，使用抗微生物易感性测试(AST)或一种或多种测序方法(例如，通过检测来自患者的生物样品(例如，粪便或胃肠道液)中与抗性相关的一种或多种基因的存在、不存在或水平来进行确定)来检测对抗生素的抗性。
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是表A中列出的基因中的一种基因。在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶、万古霉素和/或大环内酯类抗性基因。在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶或VanRD/VanSD基因的CfxA家族。在各种实施方案中，抗生素抗性基因是以下项中的一者或多者：acrE、acrF、acrS、AmpC、baeR、cfxA、cpxR、ermY、marA、mdtD、mdtN、mdtK、pbp2、pbp4以及VanRD/VanSD。
在各种实施方案中，对其具有抗性或β-内酰胺酶有助于诱导治疗响应的抗生素是选自以下项的不同抗生素：β-内酰胺类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、四环素类、利福霉素类、大环内酯类、酮内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类、磺胺类、噁唑烷酮类和喹诺酮类。
治疗方法
在各种实施方案中，本发明涉及用于在不会促进抗生素抗性的情况下或通过防止或减轻抗生素抗性的情况下，将抗生素施用于受试者的方法。在各种实施方案中，本发明涉及治疗性β-内酰胺酶用于调节微生物组(包括胃肠(GI)微生物组)以减少或防止对抗生素的抗性的用途。在各种实施方案中，本发明涉及治疗性β-内酰胺酶在施用抗生素之前保持受试者的耐药基因组状态，例如以减少或防止耐药基因组存在增加的用途。在各种实施方案中，本发明涉及治疗性β-内酰胺酶用于在尽管施用抗生素的情况下减少受试者的耐药基因组状态的用途。
因此，在各种实施方案中，本发明允许增加受试者的抗生素选项。例如，受试者可能具有对本文所述的任何抗生素具有抗性的微生物，并且因此不太可能对使用此类抗生素的治疗产生响应。施用本发明的β-内酰胺酶通过(不希望受理论束缚)调节GI微生物组以不利于抗性而增加了抗生素响应的可能性，甚至对于预期具有抗性的抗生素也如此。
在各种实施方案中，本发明涉及用于使用治疗性β-内酰胺酶来防止出现抗生素抗性的方法和组合物。在各种实施方案中，本发明涉及用于防止肠道微生物组中出现抗生素抗性生物的方法和组合物。
在各种实施方案中，本发明涉及用于使用治疗性β-内酰胺酶来减少或消除抗生素抗性的方法和组合物。在各种实施方案中，本发明涉及用于使用治疗性β-内酰胺酶来减少或消除肠道微生物组中的抗生素抗性生物的方法和组合物。
在各种实施方案中，尽管通过抗生素施用而施加了选择性抗生素压力，但本发明方法允许维持或减少受试者的耐药基因组。因此，在各种实施方案中，本发明方法减少或防止携带抗性的机会致病菌的出现。
在各种实施方案中，患者对一种或多种抗生素具有抗性。例如，可以使用抗微生物易感性测试(AST)或一种或多种测序方法(例如，通过检测来自患者的生物样品(例如，粪便或胃肠道液)中与抗性相关的一种或多种基因的存在、不存在或水平来进行确定)来确定患者具有抗性。此外，可以通过先前用一种或多种抗生素治疗失败来指示患者具有抗性。
在各种实施方案中，本发明允许筛选例如如本文所述的一种或多种抗生素抗性基因，以评定治疗选项，例如抗生素的选择。例如，在一些实施方案中，评估受试者的抗生素抗性基因的状态，以确定是否应施用抗生素和/或是否应施用本发明的β-内酰胺酶来补充抗生素。举例来说，在一些实施方案中，本发明提供在抗生素治疗之前筛选受试者的一种或多种抗生素抗性基因，并且如果存在指示抗性的表达增强，则共施用本发明的β-内酰胺酶以减少或消除此类抗性。或者，在一些实施方案中，本发明提供在抗生素治疗过程中早期筛选受试者的一种或多种抗生素抗性基因，并且如果观察到指示抗性的表达增强，则施用本发明的β-内酰胺酶以减少或消除此类抗性。
在各种实施方案中，本发明方法导致抗性或抗性基因表达的例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％，或至少约90％的可定量变化。在一些实施方案中，效果将导致约10％、约20％、约30％、约50％、约70％，或甚至约90％或更大的可定量变化。治疗益处还包括停止或减缓抗性的进展。
在各种实施方案中，本发明方法导致抗性或抗性基因表达的例如至少约2倍、或5倍、或10倍、或15倍、或20倍、或25倍、或50倍的可定量变化。在一些实施方案中，本发明方法导致相对于对照样品(例如，不具有抗生素抗性)，抗性或抗性基因表达减少例如至少约2倍、或5倍、或10倍、或15倍、或20倍、或25倍、或50倍。
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶基因，诸如编码超广谱OXA D类β-内酰胺酶的blaOXA，编码超广谱A类丝氨酸β-内酰胺酶的blaCTX-M_82、blaCFX_A4，以及编码超广谱头孢菌素抗性C类β-内酰胺酶的AmpC；多药外排转运体系基因，诸如编码AcrEF-TolC多药外排转运体系的一组分的acrE(Lau和Zgurskaya，2005,J.Bacteriol.187:7815)；编码MdtABC多药外排转运体系的响应调节物的baeR(Nagakubo等人，2002,J.Bacteriol.184:4161)；编码EmrKY-TolC多药外排转运体系的一组分的emrY(Tanabe等人，1997,J.Gen.Appl.Microbiol.43:257)；编码MdtABC多药外排转运体系的一组分的mdtD(Nagakubo等人，2002,J.Bacteriol.184:4161)；以及编码来自主要易化子超家族的多药抗性外排泵的mdtN(Sulavik等人，2001,Antimicrob.Agents Chemother.45:1126)；编码青霉素结合蛋白2的pbp2(Bharat等人，2015,Antimicrob.Agents Chemother.59:5003)；编码青霉素结合蛋白4的pbp4(Sun等人，2014,PLoS One 9:e97202)；andaminoglycoside_strA(Scholz等人，1989,Gene 75:271)编码氨基糖苷磷酸转移酶，并且Tetracycline_tet39(Agerso和Guardabassi，2005,J.Antimicrob.Chemother.55:566)编码四环素外排泵的一组分。
其他抗生素抗性基因在抗生素抗性基因数据库(ARDB)中提供，参见Nucl.AcidsRes.(2009)37(增刊1):D443-D447，万维网(www)，在ardb.cbcb.umd.edu处，Antimicrob.Agents Chemother.2013年7月，第57卷第7期3348-3357，并且在NCBI数据库(万维网(www)，在ncbi.nlm.nih.gov处)中提供，这些数据库的全部内容据此以引用方式并入。
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是表A中列出的基因中的一种或多种基因：
在各种实施方案中，抗性基因是四环素抗性基因。在各种实施方案中，抗性基因是参与β-内酰胺(包括头孢菌素)抗性(bla)的基因，如TEM-1和CMY。已经鉴定出了超过300种β-内酰胺抗性基因，并且这些基因按照Ambler A至D类分类，并且是本发明的可能基因。简而言之，A、C和D类是丝氨酸蛋白酶，而B类是Zn2+金属蛋白酶，如最近描述的NDM-1。这些酶都通过水解β-内酰胺环来降解β-内酰胺抗生素。还存在β-内酰胺抗性的非酶促机制，如甲氧西林抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的改性青霉素结合蛋白2(PBP2a)，并且其他生物也使用类似的抗性机制。
A类β-内酰胺酶(Ambler分类)是指丝氨酸β-内酰胺酶，其中β-内酰胺的水解由活性位点中的丝氨酸介导，所述活性位点通常在α螺旋2中的氨基酸位置70处。A类β-内酰胺酶包括但不限于Len-1；SHV-1；TEM-1；PSE-3/PSE-3；ROB-1；蜡样芽胞杆菌(Bacilluscereus)，诸如5/B 1型、569/H 1型和569/H 3型；炭疽芽孢杆菌某些种(Bacillusanthrasis spp.)；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，诸如PenP；韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)；克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；PC1；Sme-1；NmcA；IMI-；PER-；VEB-；GES-；KPC-；CME-和CTX-M型β-内酰胺酶。
在一些实施方案中，抗性基因是EC 3.5.2.6类的β-内酰胺酶，例如选自第1、第2、第3或第4功能组的β-内酰胺酶(参见例如Bush等人，Antimicrob.Agents Chemother,39:1211，该文献的内容据此以引用方式并入)。不希望受理论束缚，第1组由克拉维酸不能很好地抑制的头孢菌素酶组成；第2组由一般由性定点β-内酰胺酶抑制剂抑制的青霉素酶、头孢菌素酶和广谱β-内酰胺酶组成；第3组由金属-β-内酰胺酶组成，所述金属-β-内酰胺酶水解青霉素、头孢菌素和碳青霉烯并且很难被几乎所有含β-内酰胺的分子抑制；并且第4组由无法被克拉维酸很好抑制的青霉素酶组成和/或由分子/Ambler A类、或B类、或C类或D类β-内酰胺酶组成(参见例如Ambler 1980,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.289:321，该文献的内容据此以引用方式并入)，不希望受理论束缚：A、C和D类聚集进化上不同的丝氨酸β-内酰胺酶组，并且B类为锌依赖性(“EDTA抑制的”)β-内酰胺酶(参见Ambler R.P.等人，1991,Biochem J.276:269-270，该文献的内容据此以引用方式并入)。在一些实施方案中，抗生素降解酶是丝氨酸β-内酰胺酶或锌依赖性(EDTA抑制的)β-内酰胺酶。例如，在一些实施方案中，β-内酰胺酶是超广谱β-内酰胺酶(ESBL)，任选地选自TEM、SHV、CTX-M、OXA、PER、VEB、GES和IBCβ-内酰胺酶。此外，β-内酰胺酶可以是抑制剂抗性β-内酰胺酶，任选地选自AmpC型β-内酰胺酶、碳青霉烯酶、IMP型碳青霉烯酶(金属-β-内酰胺酶)、VIM(Verona整合子编码的金属-β-内酰胺酶)、β-内酰胺酶的OXA(苯唑西林酶)组、KPC(肺炎克雷伯氏菌(K.pneumonia)碳青霉烯酶)、CMY(C类)、SME、IMI、NMC和CcrA，以及NDM(新德里金属-β-内酰胺酶，例如NDM-1)β-内酰胺酶。
在各种实施方案中，本发明方法涉及减少或去除与头孢曲松使用相关的抗性基因，诸如以下抗性基因至的一种或多种抗性基因：
基因 功能 存在于例如
blaCMY-2 AmpC型β-内酰胺酶 沙门氏菌属
blaTEM-1 Ambler A类β-内酰胺酶 沙门氏菌属
blaVIM-1 Zn<sup>2+</sup>金属蛋白酶 肠杆菌科和其他
blaNDM-1 Zn<sup>2+</sup>金属蛋白酶 克雷伯氏菌属和其他肠杆菌科
floR 利胆醇特异性外排泵 肠沙门氏菌
blaSHV-18 Ambler A类β-内酰胺酶 肺炎克雷伯氏菌和大肠埃希氏杆菌
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶、万古霉素和/或大环内酯类抗性基因。
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是β-内酰胺酶或VanRD/VanSD基因的CfxA家族。
在各种实施方案中，抗生素抗性基因是以下项中的一者或多者：acrE、acrF、acrS、AmpC、baeR、cfxA、cpxR、ermY、marA、mdtD、mdtN、mdtK、pbp2、pbp4以及VanRD/VanSD。
在各种实施方案中，本发明方法允许筛选或评定抗生素抗性，例如通过确定一种或多种抗生素抗性基因的存在、不存在或水平。示例性的合适样品包括粪便样品(例如，粪便)，以及胃肠道中的流体抽出物，来自胃肠道中的一部位的粘膜活检物，以及其他组织样品或组织匀浆。
说明性抗生素抗性基因检测方法是本领域技术人员已知的。例如，定量PCR涉及使用相同的引物同时共扩增已知量的控制序列。这提供了可用于校准PCR反应的内标物。用于定量PCR的详细方案在例如Innis等人(1990)PCR Protocols,A Guide to Methods andApplications,Academic Press,Inc.N.Y.)中提供。使用定量PCR分析来测量微卫星基因座处的DNA拷贝数描述于例如Ginzonger等人(2000)Cancer Research 60:5405-5409中。已知的基因核酸序列足以使本领域技术人员能够常规选择引物来扩增基因的任何部分。荧光定量PCR也可用于本发明的方法中。在荧光定量PCR中，定量基于荧光信号(例如TaqMan和Sybrgreen)的量。
其他合适的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(参见例如Wu和Wallace(1989)Genomics 4:560，Landegren等人(1988)Science 241:1077，和Barringer等人(1990)Gene 89:117)、转录扩增(Kwoh等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:1173)、自我持续序列复制(Guatelli等人(1990)Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87:1874)、点PCR，以及连接接头PCR等。
在本文提供的方法的其他实施方案中，进行单独核酸分子(或它们的扩增产物)的测序。在一个实施方案中，可以使用在测序之前分离核酸分子群体的单一核酸分子的高通量平行测序技术。此类策略可以使用所谓的“下一代测序系统”，包括但不限于本领域中熟知的测序机器和/或策略，诸如由Illumina/Solexa开发的测序机器和/或策略(GenomeAnalyzer；Bennett等人，(2005)Pharmacogenomics,6:373-20382)、由AppliedBiosystems,Inc.开发的测序机器和/或策略(SOLiD测序仪；solid.appliedbiosystems.com)、由Roche开发的测序机器和/或策略(例如，454GS FLX测序仪；Margulies等人，(2005)Nature,437:376-380；美国专利号6,274,320；6,258,568；6,210,891)等等。也可以使用其他测序策略，诸如随机测序(例如，由Oxford Nanopore开发)，例如如在国际专利公开号WO 2010/004273中所述。
在本文提供的方法的其他实施方案中，可以使用深度测序来鉴定和定量抗性微生物。这些技术在本领域中是已知的。
在各种实施方案中，使用16S rRNA测序。在各种实施方案中，通过全基因组鸟枪法测序(WGS)来分析粪便DNA样品，WGS可以解析样品中的单独抗生素抗性基因。
宏基因组学的全基因组鸟枪法测序(WGS)使得能够分析特定样品中微生物集合的近乎全基因组内容，该近乎全基因组内容也被称为泛基因组(测序深度与所覆盖的泛基因组的量直接相关)。可以使用的说明性方法是为NIH-人类微生物组计划(NIH-HumanMicrobiome Project)开发的。简而言之，预期将可从16S rRNA测序工作获得的细菌基因组DNA用于WGS。将根据每个样品构建的单独文库加载到HiSeq平台(Illumina)上，并使用2×100bp配对末端读取方案进行测序。根据从每个样品中分离的总基因组DNA来构建Illumina配对末端文库。将DNA剪切成约400-600bp的片段，然后连接含有分子条码的Illumina接头以进行下游按样本分离(de-multiplexing)。然后使用例如KAPA HiFi DNA聚合酶(KapaBiosystems,Wilmington,MA,USA)，通过连接介导的PCR(LM-PCR)来扩增这些产物。在使用例如Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter,Brea,CA,USA)进行珠粒纯化后，使用例如LabChip GX电泳系统(PerkinElmer,Akron,OH,USA)来测定LM-PCR产物的定量和粒径分布。以每个汇集物6个样品将文库以等摩尔量汇集，并准备用于使用TruSeq PE聚类生成试剂盒(Illumina)进行测序。将每个文库汇集物加载到加有1％PhiX对照文库的HiSeq 2000流动池的一个泳道上。使用CASAVA第1.8.3版(Illumina)对测序文件进行按样本分离。由定制管线进行质量过滤、修整和按样本分离，该定制管线含有用于接头和质量修整的Trim Galore和cutadapt，以及用于低复杂度过滤和序列重复数据删除的PRINSEQ。此外，Bowtie2v2.2.1将用于将读数映射成MetaPhlAn标记，以用于进行细菌物种分类。有几个数据库可用于映射从粪便微生物组分离的DNA样品中抗生素抗性基因的鉴定结果，这些数据库包括综合抗生素抗性数据库(CARD)，以及抗生素抗性基因数据库(ARDB，万维网(www)，在ardb.cbcb.umd.edu处)和NCBI数据库(万维网(www)，在ncbi.nlm.nih.gov处)。
此外，在各种实施方案中，使用定量聚合酶链式反应(qPCR)来检测某些抗生素抗性基因数目的增加。可以查询可获得的文献以获得抗生素抗性基因的公开可得引物，或者可以设计新引物，例如使用Primer Express软件(Applied Biosystems)和在访问时可获得的基因组信息来设计。可以在QuantStudio 7实时PCR系统中，使用MicroAmp Fast Optical96孔反应平板(0.1ml)和MicroAmp Optical 384孔反应平板、MicroAmp光学粘合膜(均购自Applied Biosystems)和PerfeCta SYBR Green FastMix、Low Rox PCR Master Mix(Quanta Biosciences)来执行定量PCR样品分析。
为了跨各种样品归一化qPCR反应，可以进行样品中16S rRNA的qPCR，然后可以归一化抗生素抗性基因与16S rRNA的比率。
在各种实施方案中，本发明方法可用于治疗或预防以下病原体中的一种或多种病原体的感染：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、芽孢杆菌属(Bacillus)(例如，蜡样芽胞杆菌)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、博代氏杆菌属(Bordetella)、疏螺旋体属(Borrelia)、布鲁氏菌属(Brucella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、艰难梭菌(C.difficile)、弯曲杆菌属(Campylobacter)(例如，胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni))、衣原体属(Chlamydia)、嗜衣原体属(Chlamydophila)、梭菌属(Clostridium)(例如，肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens))、棒状杆菌属(Corynebacterium)、柯克斯氏体属(Coxiella)、埃立克体属(Ehrlichia)、肠杆菌科(例如，碳青霉烯抗性肠杆菌科(CRE)和超广谱产β-内酰胺酶肠杆菌科(ESBL-E)、氟喹诺酮抗性肠杆菌科)、肠球菌属(Enterococcus)(例如，万古霉素抗性肠球菌属、超广谱β-内酰胺抗性肠球菌(ESBL)和万古霉素抗性肠球菌(VRE))、埃希氏杆菌属(Escherichia)(例如，肠凝集性大肠埃希氏杆菌、肠出血性大肠埃希氏杆菌、肠侵袭性大肠埃希氏杆菌、肠致病性大肠埃希氏杆菌、产肠毒性大肠埃希氏杆菌(诸如但不限于LT和/或ST)、大肠埃希氏杆菌0157:H7和多药抗性细菌大肠埃希氏杆菌)、弗朗西斯氏菌属(Francisella)、嗜血杆菌属(Haemophilus)、螺杆菌属(Helicobacter)(例如，幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、克雷伯氏菌属(Klebsiella)(例如，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellia pneumonia)和多药抗性细菌克雷伯氏菌属(multi-drug resistant bacteria Klebsiella))、军团菌属(Legionella)、钩端螺旋体属(Leptospira)、李斯特菌属(Listeria)(例如，单核细胞增生性李斯特菌(Lysteria monocytogenes))、摩根氏菌属(Morganella)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、支原体属(Mycoplasma)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、东方体属(Orientia)、类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides)、抗生素抗性变形菌属(Proteobacteria)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、立克次氏体(Rickettsia)、沙门氏菌属(例如，副伤寒沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、沙门氏菌属某些种(Salmonella spp.)和伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))、志贺氏菌属(Shigella)(例如，志贺氏菌属某些种(Shigella spp.))、葡萄球菌属(Staphylococcus)(例如，金黄色葡萄球菌和葡萄球菌属某些种(Staphylococcus spp.))、链球菌属(Streptococcus)、密螺旋体属(Treponema)、弧菌属(Vibrio)(例如，霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、弧菌属某些种(Vibrio spp.)和创伤弧菌(Vibriovulnificus))，以及耶尔森氏菌属(Yersinia)(例如，小肠结肠炎耶尔森菌(Yersiniaenterocolitica))。
在各种实施方案中，本发明方法可用于治疗或预防感染抗生素抗性细菌，例如抗生素抗性变形菌、万古霉素抗性肠球菌(VRE)、碳青霉烯抗性肠杆菌(CRE)、氟喹诺酮抗性肠杆菌科，以及超广谱产β-内酰胺酶肠杆菌科(ESBL-E)。
在各种实施方案中，有需要的患者可以在门诊场合中、住院和/或在长期护理机构中。在各种实施方案中，有需要的受试者患有血流感染(BSI)、导管或血管内管道感染(例如，中心管道感染)、慢性炎性疾病、脑膜炎、肺炎(例如，呼吸机相关肺炎)、皮肤和软组织感染、手术部位感染、尿路感染(例如，抗生素抗性尿路感染和导管相关尿路感染)、伤口感染，和/或其他众所周知的感染：抗生素抗性感染和抗生素敏感性感染，或具有这些感染的风险。
在各种实施方案中，本发明方法可用于治疗或预防艰难梭菌感染(CDI)和/或艰难梭菌相关疾病。
在各种实施方案中，本发明方法可用于治疗或预防诸如万古霉素抗性肠球菌(VRE)之类的病原菌的过度生长。
在各种实施方案中，本发明方法可用于允许用头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢呋辛、哌拉西林和万古霉素中的一种或多种来治疗患者。在各种实施方案中，本发明患者对头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢呋辛、哌拉西林和万古霉素中的一种或多种具有抗性，并且本发明的β-内酰胺酶改变患者的微生物组以恢复头孢曲松、头孢噻肟、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢呋辛、哌拉西林和万古霉素中的一种或多种对患者的治疗功效。
β-内酰胺酶
在一些方面，本发明涉及一种或多种β-内酰胺酶例如用于减少或预防抗生素抗性的用途。如本文所用，β-内酰胺酶是指水解β-内酰胺的酶。β-内酰胺环的酰胺键的水解使得抗微生物剂无生物学活性。如本文所用，A类β-内酰胺酶(Ambler分类)是指丝氨酸β-内酰胺酶，其中β-内酰胺的水解由活性位点中的丝氨酸介导，所述活性位点通常在α螺旋2中的氨基酸位置70处。A类β-内酰胺酶包括但不限于Len-1；SHV-1；TEM-1；PSE-3/PSE-3；ROB-1；蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)，诸如5/B 1型、569/H 1型和569/H 3型；炭疽芽孢杆菌某些种(Bacillus anthrasis sp.)；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，诸如PenP；韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephanensis)；克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)；PC1；Sme-1；NmcA；IMI-；PER-；VEB-；GES-；KPC-；CME-和CTX-M型β-内酰胺酶。
在各个方面，β-内酰胺酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列(即，WO 2011/148041中所述的“SYN-004”或“ribaxamase”或“P3A”，该专利的全部内容据此以引用方式并入)。可以对该序列进行突变以产生可以由本发明方法利用的β-内酰胺酶衍生物。
SEQ ID NO:1
TEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK。
在一些实施方案中，β-内酰胺酶包含与SEQ ID NO:1具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，SEQ ID NO:1可以在序列的第一个残基之前具有Met和/或Thr。在各种实施方案中，可以切割Met。如本文所述，可以对包含第一残基之前的Met和/或Thr的序列进行突变以产生β-内酰胺酶衍生物。在一些实施方案中，相对于另一种前导氨基酸(例如，Lys)，前导Thr可以使酶的稳定性增加。例如，此类残基可赋予增强的对氨基肽酶的抗性。
本文还提供了SYN-004的核苷酸序列，如以下SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:2
atgactgagatgaaagatgattttgcgaagctggaagaacagtttgacgcaaaattgggcattttcgcgttggacacgggtacgaatcgtacggttgcctaccgtccggacgagcgcttcgccttcgcgagcacgatcaaagccctgaccgtcggcgtgctgctccagcaaaagagcatcgaggacctgaaccagcgcattacctacacccgtgatgatctggtgaactataatccgatcaccgagaaacacgttgataccggtatgaccctgaaagaactggcagatgcaagcctgcgctacagcgataacgcggctcagaatctgattctgaagcaaatcggtggtccggagagcttgaagaaagaactgcgtaaaatcggcgatgaagtcactaatccggagcgttttgagccggagctgaacgaagtgaatccgggtgaaacgcaagacacgagcaccgcgcgtgcgcttgtcacctccctgcgcgctttcgcactggaagataagctgccgtcggagaaacgcgagctgctgatcgactggatgaagcgcaatacgaccggcgacgcgctgattcgtgcgggcgttccggacggttgggaagtggctgacaagaccggtgcggcgagctacggcacccgtaacgatatcgcgatcatttggccacctaaaggtgacccggtcgtgctggccgtactgagcagccgtgacaagaaagacgcaaagtatgataacaagctgattgcagaggcgaccaaagttgttatgaaggcactgaacatgaatggtaag
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸可具有与SEQ ID NO:2至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％，或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性。
在一些实施方案中，β-内酰胺酶，例如SYN-004，具有显著的头孢曲松水解活性。在一些实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004)比P1A更有效地水解头孢曲松。
在说明性实施方案中，β-内酰胺酶包含与SEQ ID NO:1具有至少60％序列同一性的氨基酸序列和以下Ambler分类：位置232处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；位置237处除丙氨酸(A)以外的亲水性残基；位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基；位置240处除丝氨酸(S)以外的亲水性残基；和位置276处除天冬氨酸(D)以外的亲水性残基。在一些实施方案中，位置232处除丙氨酸(A)之外的疏水性残基是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，位置237处除丙氨酸(A)之外的亲水性残基是丝氨酸(S)。在一些实施方案中，位置238处除丙氨酸(A)以外的疏水性残基是甘氨酸(G)。在一些实施方案中，位置240处除丝氨酸(S)之外的亲水性残基是天冬氨酸(D)。在一些实施方案中，位置276处除天冬氨酸(D)以外的是天冬酰胺(N)。在一些实施方案中，β-内酰胺酶包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N中的一者或多者。在一些实施方案中，β-内酰胺酶包含A232G、A237S、A238G、S240D和D276N的全部，其序列为SEQ ID NO:3，即P4A。在一些实施方案中，β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ IDNO:3具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3
EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK
在一些实施方案中，本发明的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:3具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4衍生自SEQ ID NO:3，并且还包含信号和添加的QASKT氨基酸(编码区为加下划线的)：
MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAQASKTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYR PDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILK QIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTG DALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK
在一些实施方案中，本发明的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:4具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:4具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
本发明的说明性多核苷酸是SEQ ID NO:5，其为A232G、A237S、A238G、S240D和D276N突变体、Hind III位点(粗体的AAGCTT)和附加的K和T氨基酸的完整核苷酸序列。在一些实施方案中，省略了SEQ ID NO:5的加下划线部分。前导序列核苷酸和附加核苷酸(HindIII位点和K和T氨基酸——用于添加氨基酸序列QASKT)是加下划线的。
在一些实施方案中，本发明的多核苷酸具有与SEQ ID NO:5至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性(具有或不具有加下划线部分)。
在各个方面，β-内酰胺酶多肽具有SEQ ID NO:6(即，P2A)的序列，或是通过SEQ IDNO:6的一个或多个突变衍生的：
ETGTISISQLNKNVWVHTELGYFNGEAVPSNGLVLNTSKGLVLVDSSWDNKLTKELIEMVEKKFQKRVTDVIITHAHADRIGGITALKERGIKAHSTALTAELAKNSGYEEPLGDLQTITSLKFGNTKVETFYPGKGHTEDNIVVWLPQYQILAGGCLVKSAEAKDLGNVADAYVNEWSTSIENVLKRYGNINSVVPGHGEVGDKGLLLHTLDLLK。
在一些实施方案中，本发明的β-内酰胺酶多肽包含与SEQ ID NO:6具有至少约60％(例如，约60％、或约61％、或约62％、或约63％、或约64％、或约65％、或约66％、或约67％、或约68％、或约69％、或约70％、或约71％、或约72％、或约73％、或约74％、或约75％、或约76％、或约77％、或约78％、或约79％、或约80％、或约81％、或约82％、或约83％、或约84％、或约85％、或约86％、或约87％、或约88％、或约89％、或约90％、或约91％、或约92％、或约93％、或约94％、或约95％、或约96％、或约97％、或约98％、或约99％)的序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，β-内酰胺酶和/或药物组合物包含与SEQ ID NO:6具有至少90％、或95％、或97％、或99％、或100％序列同一性的氨基酸序列。
包括P1A(即SEQ ID NO:1，不同之处在于位置276是D而非N)、P2A、P3A/SYN-004和P4A以及它们的衍生物的附加β-内酰胺酶序列描述于例如WO 2011/148041和PCT/US2015/026457中，该等专利的全部内容据此以引用方式并入。
此外，β-内酰胺酶多肽可包含来自SEQ ID NO:1的第一残基的附加上游残基(参见例如JBC 258(18):11211,1983，该文献的内容据此以引用方式并入-包括penP和penP1的胞外大版本和胞外小版本)。此外，β-内酰胺酶多肽还可以包含来自SEQ ID NO:1的最后残基的附加下游残基。
在一些实施方案中，β-内酰胺酶包含相对于SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的一个或多个(例如，约1个、或约2个、或约3个、或约4个、或约5个、或约6个、或约7个、或约8个、或约9个、或约10个)突变。在一些实施方案中，β-内酰胺酶包括SYN-004的变体，例如与SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2具有至少95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、99.9％同一性的序列。在各种实施方案中，SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸被天然存在的氨基酸取代，所述天然存在的氨基酸为诸如亲水性氨基酸(例如，极性且带正电的亲水性氨基酸，诸如精氨酸(R)或赖氨酸(K)；极性且荷电中性的亲水性氨基酸，诸如天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、脯氨酸(P)和半胱氨酸(C)；极性且带负电的亲水性氨基酸，诸如天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)；或芳族、极性且带正电的亲水性氨基酸，诸如组氨酸(H))或疏水性氨基酸(例如，疏水性脂族氨基酸，诸如甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)或缬氨酸(V)；疏水性芳族氨基酸，诸如苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)或酪氨酸(Y)；或非经典氨基酸(例如，硒代半胱氨酸、吡咯赖氨酸，N-甲酰基甲硫氨酸β-丙氨酸、GABA和δ-氨基乙酰丙酸、4-氨基苯甲酸(PABA)、常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟氨基酸、设计者氨基酸(诸如β甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸)和一般氨基酸类似物)。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1可以在序列的第一个残基之前具有Met和/或Thr。这些残基可以如上所述进行类似的突变。
说明性突变体包括：
在所有这些突变体中，残基的编号对应于SEQ ID NO:1。可以通过使用任何常规生物信息学方法，例如通过使用BLAST(基本局部比对搜索工具)或FASTA(FAST-AII)而将这些残基编号转换成Ambler编号(Ambler等，1991,A standard numbering scheme for theClass Aβ-lactamases,Biochem.J.276:269-272，该文献的内容据此以引用方式并入)。
在各种实施方案中，本发明中使用的β-内酰胺酶是在诸如大肠埃希氏杆菌细胞的细菌细胞中产生的(参见例如PCT/US15/47187，该专利的全部内容据此以引用方式并入)。
制剂/改良释放特性
在各种实施方案中，本发明采用包含至少一种β-内酰胺酶的改良释放制剂，其中所述制剂将大量β-内酰胺酶释放到胃肠道的一个或多个区域中。在一些实施方案中，β-内酰胺酶是SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体(例如，如上所述)。例如，制剂可以在胃之后释放至少约60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004)进入胃肠道的一个或多个区域中。
在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂被设计用于立即释放(例如，在摄取时)。在各种实施方案中，所述改良释放制剂可具有缓释特性，即在很长一段时间内活性成分在体内(例如，胃肠道内)缓慢释放。在各种实施方案中，所述改良释放制剂可具有延迟释放特性，即在摄取时不立即释放活性成分；相反，推迟释放活性成分直至组合物在胃肠道中较低；例如，用于在小肠(例如，十二指肠、空肠，回肠中的一者或多者)或大肠(例如，盲肠，结肠的上行、横行、下行或乙状部分，以及直肠中的一者或多者)中释放。例如，组合物可以是包有肠溶衣的以延迟活性成分的释放，直至该活性成分到达小肠或大肠。在一些实施方案中，粪便中不存在大量本发明制剂的活性成分。
在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂在胃之后释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)进入肠道的一个或多个区域。例如，改良释放制剂在肠道中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂在小肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在小肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在十二指肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在十二指肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在空肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在空肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在回肠和/或回盲连接部中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在回肠和/或回盲连接部中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂在大肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在大肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在盲肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在盲肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在上行结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在上行结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在横行结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在横行结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在下行结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在下行结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，本发明的改良释放制剂在乙状结肠中释放至少60％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。例如，改良释放制剂在乙状结肠中释放至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在各种实施方案中，所述改良释放制剂基本上不在胃中释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶，以及它们的变体)。
在某些实施方案中，所述改良释放制剂在特定pH下释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。例如，在一些实施方案中，所述改良释放制剂在酸性环境中为基本上稳定的并且在近中性至碱性环境中为基本上不稳定的(例如，快速溶解或在物理上不稳定)。在一些实施方案中，稳定性指示不大量释放，而不稳定性指示大量释放。例如，在一些实施方案中，所述改良释放制剂在约7.0或更低、或约6.5或更低、或约6.0或更低、或约5.5或更低、或约5.0或更低、或约4.5或更小、或约4.0或更低、或约3.5或更低、或约3.0或更低、或约2.5或更低、或约2.0或更低、或约1.5或更低、或约1.0或更低的pH下为基本上稳定的。在一些实施方案中，本发明制剂在较低pH区域内是稳定的，因此基本上不在例如胃中释放。在一些实施方案中，所述改良释放制剂在约1至约4或更低的pH下为基本上稳定的，并且在更高的pH值下为基本上不稳定的。在这些实施方案中，所述改良释放制剂基本上不在胃中释放。在这些实施方案中，所述改良释放制剂基本上在小肠(例如十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)和/或大肠(例如，盲肠、上行结肠、横行结肠、下行结肠和乙状结肠中的一者或多者)中释放。在一些实施方案中，所述改良释放制剂在约4至约5或更低的pH下为基本上稳定的，并且因此在pH值更大时为基本上不稳定的，因此基本上不在胃和/或小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)中释放。在这些实施方案中，所述改良释放制剂基本上在大肠(例如，盲肠、上行结肠、横行结肠、下行结肠和乙状结肠中的一者或多者)中释放。在各种实施方案中，可以如本领域已知的那样调节本文所述的pH值以考虑受试者的状态，例如是处于禁食状态还是餐后状态下。
在一些实施方案中，所述改良释放制剂在胃液中为基本上稳定并且在肠液中为基本上不稳定的，因此基本上在小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)和/或大肠(例如，盲肠、上行结肠、横行结肠、下行结肠和乙状结肠中的一者或多者)中释放。
在一些实施方案中，所述改良释放制剂在胃液中为稳定的或在酸性环境中为稳定的。在pH为约4至约5或更低的胃液或pH为约4至约5或更低的模拟胃液中，在约15分钟、或约30分钟、或约45分钟、或约60分钟、或约90分钟内这些改良释放制剂释放约30重量％或更少的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的附加治疗剂。在pH为4-5或更低的胃液或pH为4-5或更低的模拟胃液中，在约15分钟、或约30分钟、或约45分钟、或约60分钟、或约90分钟内本发明的改良释放制剂可以释放约0重量％至约30重量％、约0重量％至约25重量％、约0重量％至约20重量％、约0重量％至约15重量％、约0重量％至约10重量％、约5重量％至约30重量％、约5重量％至约25重量％、约5重量％至约20重量％、约5重量％至约15重量％、约5重量％至约10重量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的附加治疗剂在pH为5或更低的胃液或pH为5或更低的模拟胃液中，在约15分钟、或约30分钟、或约45分钟、或约60分钟、或约90分钟内本发明的改良释放制剂可释放约1重量％、约2重量％、约3重量％、约4重量％、约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、约9重量％或约10重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的附加治疗剂。
在一些实施方案中，所述改良释放制剂在肠液中为不稳定的。在肠液或模拟肠液中，在约15分钟、或约30分钟、或约45分钟、或约60分钟、或约90分钟内这些改良释放制剂释放约70重量％或更多的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的附加治疗剂。在一些实施方案中，所述改良释放制剂在近中性至碱性环境中为不稳定的。在pH为约4-5或更高的肠液或pH为约4-5或更高的模拟肠液中，在约15分钟、或约30分钟、或约45分钟、或约60分钟、或约90分钟内这些改良释放制剂释放约70重量％或更多的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的附加治疗剂。在pH大于约5的流体(例如，pH为约5至约14、约6至约14、约7至约14、约8至约14、约9至约14、约10至约14、或约11至约14的流体)中，在约5分钟至约90分钟、或约10分钟至约90分钟、或约15分钟至约90分钟、或约20分钟至约90分钟、或约25分钟至约90分钟、或约30分钟至约90分钟、或约5分钟至约60分钟、或约10分钟至约60分钟、或约15分钟至约60分钟、或约20分钟至约60分钟、或约25分钟至约90分钟、或约30分钟至约60分钟内，在近中性或碱性环境中不稳定的所述改良释放制剂可以释放约70重量％或更多的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或所述改良释放制剂中的附加治疗剂。
模拟胃液和模拟肠液的示例包括但不限于在2005Pharmacopeia 23NF/28USP,Test Solutions，第2858页中公开的模拟胃液和模拟肠液和/或本领域技术人员已知的其他模拟胃液和模拟肠液，例如在没有酶的情况下制备的模拟胃液和/或肠液。
在一个实施方案中，在胃液中所述改良释放制剂可以基本上保持完整，或者可以基本上不溶。所述改良释放制剂可包括一种或多种pH依赖性的延迟释放包衣。pH依赖性的延迟释放包衣将为在酸性环境(pH为约5或更低)中基本上稳定的，并且在近中性至碱性环境(pH大于约5)中为基本上不稳定的。例如，延迟释放包衣可基本上在近中性至碱性环境中崩解或溶解，诸如在小肠(例如，十二指肠、空肠和回肠中的一者或多者)和/或大肠(例如，盲肠、上行结肠、横行结肠、下行结肠和乙状结肠中的一者或多者)中发现的。
或者，改良释放制剂的稳定性可以是酶依赖性的。在此类实施方案中，所述改良释放制剂可包括一种或多种酶依赖性的延迟释放包衣。酶依赖性的延迟释放包衣将为在不含特定酶的流体中基本上稳定的，并且为在含有酶的流体中基本上不稳定的。延迟释放包衣将基本上在含有适当酶的流体中崩解或溶解。酶依赖性控制可以例如通过使用仅在暴露于肠道中的酶时释放活性成分的材料(诸如半乳甘露聚糖)而产生。而且，改良释放制剂的稳定性可取决于在肠道菌群中存在的微生物酶存在下的酶稳定性。
在各种实施方案中，包含β-内酰胺酶(例如，SYN-004或其变体)的改良释放制剂在食糜中为基本上稳定的。例如，在一些实施方案中，在施用后约10小时、或9小时、或8小时、或7小时、或6小时、或5小时、或4小时、或3小时、或2小时、或1小时内，β-内酰胺酶活性损失少于约50％或约40重量％、或约30％、或约20％、或约10％。
在一些实施方案中，提供双脉冲制剂。在各种实施方案中，本发明提供了在沿着肠道的不同位置处、在不同时间和/或在不同pH下释放多种剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的改良释放制剂。在一个示例性实施方案中，所述改良释放制剂包含第一剂量的β-内酰胺酶和第二剂量的β-内酰胺酶，其中该第一剂量和该第二剂量在沿着肠道的不同位置处、在不同时间和/或在不同pH下释放。例如，第一剂量在十二指肠处释放，并且第二剂量在回肠处释放。在另一示例中，第一剂量在空肠处释放，并且第二剂量在回肠处释放。在其他实施方案中，第一剂量在沿着小肠(例如，十二指肠)的一位置处释放，而第二剂量沿着大肠(例如，上行结肠)释放。在各种实施方案中，所述改良释放制剂可在沿着肠道的不同位置处、在不同时间和/或在不同pH下释放至少一个剂量、至少两个剂量、至少三个剂量、至少四个剂量、至少五个剂量、至少六个剂量、至少七个剂量、或至少八个剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。此外，本文的双脉冲描述适用于释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和附加治疗剂的改良释放制剂。
在各种实施方案中，本发明使用β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的改良释放制剂，该改良释放制剂还可包含药学上可接受的载剂或辅料。如本领域技术人员应认识到的，所述制剂可以是适合于所需用途和施用途径的任何合适形式。
在一些实施方案中，包含β-内酰胺酶(和/或附加治疗剂)的改良释放制剂的施用为口服、静脉内和肠胃外中的任一种。在一些实施方案中，包含β-内酰胺酶(和/或附加试剂)的改良释放制剂的施用不是静脉内的，以便例如防止干扰全身施用的抗生素。在其他实施方案中，施用途径包括例如：口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外、舌下、鼻内、脑内、阴道内、透皮、直肠、吸入或局部施用，特别是施用至耳朵、鼻子、眼睛或皮肤。
包含如本文所述的β-内酰胺酶(和/或附加治疗剂)的任何改良释放制剂可以口服施用。这些本发明的制剂还可以通过任何其他方便的途径施用，例如通过静脉内输注或团注注射(bolus injection)、通过经由上皮或粘膜皮肤衬里(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与附加治疗剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。在一些实施方案中，施用不在感染部位进行以避免例如感染部位处的抗生素水解。各种递送体系是已知的，例如包封在脂质体、微粒、微胶囊、胶囊等中，并且可以用于施用。在具体的实施方案中，可能需要局部施用至需要治疗的区域。
用于口服使用的合适剂型包括例如固体剂型，诸如片剂、可分散粉剂、颗粒剂和胶囊剂。在一个实施方案中，所述改良释放制剂为胶囊形式。在另一个实施方案中，所述改良释放制剂为片剂形式。在另一个实施方案中，所述改良释放制剂为软凝胶胶囊的形式。在另一实施方案中，所述改良释放制剂是明胶或羟丙甲纤维素(HPMC)胶囊的形式。
在一些剂型中，将本文所述的试剂与至少一种惰性、药学上可接受的辅料或载体混合，所述至少一种惰性、药学上可接受的辅料或载剂为诸如柠檬酸钠、磷酸二钙等，和/或a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、硅酸、微晶纤维素和面包专用糖等，b)粘合剂，诸如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯胶、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、羟丙基纤维素和羟甲基纤维素等，c)润湿剂，诸如甘油等，d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐、碳酸钠、交联聚合物(诸如交聚维酮(交联聚乙烯吡咯烷酮)、交联甲基纤维素钠(交联羧甲基纤维素钠)、羧基乙酸淀粉钠等)，e)溶液阻滞剂，诸如石蜡等，f)吸收促进剂，诸如季铵化合物等，g)润湿剂，诸如十六醇和单硬脂酸甘油酯等，h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土等。和i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠、山嵛酸甘油酯等，以及此类辅料的混合物。本领域技术人员将认识到，特定的辅料可在口服剂型中具有两种或更多种功能。在口服剂型(例如胶囊剂或片剂)的情况下，剂型还可包含缓冲剂。
改良释放制剂可另外包含表面活性剂。适用于本发明的表面活性剂包括但不限于任何药学上可接受的无毒表面活性剂。适用于本发明组合物的表面活性剂的类别包括但不限于聚乙氧基化脂肪酸、PEG-脂肪酸二酯、PEG-脂肪酸单酯和PEG-脂肪酸二酯的混合物、聚乙二醇甘油脂肪酸酯、醇-油酯基转移产物、聚甘油化脂肪酸、丙二醇脂肪酸酯、丙二醇酯-甘油酯混合物、甘油单酯和甘油二酯的混合物、甾醇和甾醇衍生物的混合物、聚乙二醇脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇烷基醚、糖酯、聚乙二醇烷基酚、聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、脱水山梨糖醇脂肪酸酯、低级醇脂肪酸酯、离子表面活性剂，以及它们的混合物。在一些实施方案中，本发明的组合物可包含一种或多种表面活性剂，包括但不限于十二烷基硫酸钠、聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯40、聚山梨醇酯60、聚山梨醇酯80，以及柠檬酸三乙酯。
改良释放制剂还可含有药学上可接受的增塑剂，以获得所需的机械特性，例如柔性和硬度。此类增塑剂包括但不限于三乙酸甘油酯、柠檬酸酯、柠檬酸三乙酯、邻苯二甲酸酯、癸二酸二丁酯、鲸蜡醇、聚乙二醇、聚山梨醇酯，或其它增塑剂。
改良释放制剂还可包含一种或多种涂覆溶剂(application solvent)。可用于涂覆例如延迟释放包衣组合物的一些更常见溶剂包括异丙醇、丙酮、二氯甲烷等。
改良释放制剂还可包含一种或多种碱性材料。适用于本发明组合物的碱性材料包括但不限于酸(诸如磷酸、碳酸、柠檬酸)的钠盐、钾盐、钙盐、镁盐和铝盐，以及其它铝/镁化合物。此外，碱性材料可选自抗酸材料，诸如氢氧化铝、氢氧化钙、氢氧化镁和氧化镁。
固体口服剂型可以通过例如用一种或多种合适的辅料对本发明的试剂进行造粒(例如，湿法或干法造粒)来制备。或者，可以将本发明的试剂使用常规方法(诸如流化床或锅包衣法)分层到惰性核(例如，独粒(nonpareil)/糖球，诸如蔗糖球或二氧化硅球)上，或使用本领域中已知的方法挤出和球化成含有活性化合物的丸粒。在实施方案中，将β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)喷涂到蔗糖球上。然后可以使用常规方法将此类丸粒掺入片剂或胶囊中。
除活性剂外，悬浮液还可含有悬浮剂，诸如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂、黄蓍胶等，以及它们的混合物。
除惰性稀释剂外，口服组合物还可包含佐剂，诸如甜味剂、调味剂和芳香剂。
适于肠胃外施用(例如，静脉内，肌内、腹膜内、皮下和关节内注射和输注)的剂型包括例如溶液、悬浮液、分散体，乳液等。它们还可以以无菌固体组合物(例如，冻干组合物)的形式制造，所述无菌固体组合物可以在使用前立即溶解或悬浮在无菌可注射介质中。它们可含有例如本领域中已知的悬浮剂或分散剂。
包含β-内酰胺酶(和/或附加治疗剂)的制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域中熟知的任何方法制备。此类方法通常包括使治疗剂与载剂缔合的步骤，该步骤构成了一种或多种辅助成分。通常，通过以下方式来制备制剂：将治疗剂均匀且紧密地与液体载剂、细碎的固体载剂或两者缔合，以及然后如果需要的话，将产品成形为所需制剂的剂型(例如，湿法或干法造粒、粉末共混物等，然后使用本领域至已知的常规方法进行压片)。
在各种实施方案中，本发明的改良释放制剂可以利用一种或多种改良释放包衣，诸如延迟释放包衣，以提供将β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)任选地与其他附加治疗剂一起有效、延迟但实质性递送至胃肠道。
在一个实施方案中，延迟释放包衣包括在酸性环境中为基本上稳定的并且在近中性至碱性环境中为基本不稳定的肠溶试剂。在一个实施方案中，延迟释放包衣含有在胃液中为基本上稳定的肠溶试剂。肠溶试剂可选自例如甲基丙烯酸共聚物、邻苯二甲酸乙酸纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯、羧甲基乙基纤维素，以及型聚合物(聚(甲基丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸甲酯))、羟丙基甲基纤维素)乙酸琥珀酸酯、乙酸纤维素偏苯三酸酯、虫胶或其他合适的肠溶包衣聚合物的溶液或分散体。型聚合物包括例如FS 30D、L 30D-55、L 100-55、L100、L 12,5、L 12,5P、RL 30D、RL PO、RL 100、RL 12,5、RS 30D、RS PO、RS 100、RS 12,5、NE30D、NE 40D、NM 30D、S 100、S 12,5，以及S 12,5P。类似聚合物包括MAE 30DP和MAE 100P。在一些实施方案中，使用FS 30D、L 30D-55、L100-55、L 100、L 12,5、L 12,5P RL 30D、RL PO、RL 100、RL 12,5、RS 30D、RS PO、RS 100、RS 12,5、NE 30D、NE 40D、NM 30D、S 100、S 12,5S 12,5P、MAE 30DP和MAE 100P中的一者或多者。在各种实施方案中，肠溶试剂可以是前述溶液或分散体的组合。在一个实施方案中，延迟释放包衣包括肠溶试剂L 30D-55。
在某些实施方案中，将一种或多种包衣体系添加剂与肠溶试剂一起使用。例如，一种或多种PlasACRYLTM添加剂可用作抗粘剂包衣添加剂。示例性的PlasACRYLTM添加剂包括但不限于PlasACRYLTMHTP20和PlasACRYLTMT20。在一个实施方案中，将PlasACRYLTMHTP20配制为具有L 30D-55包衣。在另一个实施方案中，将PlasACRYLTMT20配制为具有FS 30D包衣。
在另一个实施方案中，延迟释放包衣可以在水溶液中随着时间推移而降解，而与溶液中的pH和/或酶的存在无关。这种包衣可包含水不溶性聚合物。因此，其在水溶液中的溶解度与pH无关。如本文所用的术语“非pH依赖性”是指聚合物的水渗透性及其释放药物成分的能力不是pH的函数和/或仅非常轻微地取决于pH。这些包衣可用于制备例如缓释制剂。合适的水不溶性聚合物包括药学上可接受的无毒聚合物，所述药学上可接受的无毒聚合物基本上不溶于水性介质(例如,水)中，与溶液的pH无关。合适的聚合物包括但不限于纤维素醚、纤维素酯或纤维素醚-酯，即纤维素骨架上的一些羟基被烷基取代并且一些羟基被烷酰基修饰的纤维素衍生物。示例包括乙基纤维素、乙酰纤维素、硝化纤维素等。不溶性聚合物的其他示例包括但不限于漆，以及丙烯酸和/或甲基丙烯酸酯聚合物，具有低季铵含量的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯的聚合物或共聚物，或它们的混合物等。不溶性聚合物的其他示例包括EUDRAGITEUDRAGIT以及EUDRAGIT可用于本发明的不溶性聚合物包括聚乙烯基酯、聚乙烯醇缩醛、聚丙烯酸酯，丁二烯苯乙烯共聚物等。在一个实施方案中，通过使用缓慢侵蚀的蜡塞(例如，各种PEGS，包括例如PEG6000)来实现结肠递送。
在另一个实施方案中，延迟释放包衣可以被肠道菌群中存在的微生物酶降解。在一个实施方案中，延迟释放包衣可以被存在于小肠中的细菌降解。在另一个实施方案中，延迟释放包衣可以被存在于大肠中的细菌降解。
在各种实施方案中，本发明提供了这样的制剂，所述制剂包含：具有底包衣的核心颗粒，所述底包衣包含一种或多种β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；以及设置在所述经包衣的核心颗粒上的延迟释放包衣。延迟释放包衣可为在酸性环境和/或胃液中是基本上稳定的，和/或在近中性至碱性环境或肠液中是基本上不稳定的，从而使经包衣的核心粒子暴露于肠液。包含一种或多种β-内酰胺酶的底包衣还可包含一种或多种附加治疗剂。任选地，可以将多层底包衣施加到核心上，每层底包衣可含有β-内酰胺酶和/或附加治疗剂。在一个实施方案中，核心粒子包含蔗糖。制剂可以通过本领域已知的方法制备。例如，可将β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)喷涂到惰性核心(例如，蔗糖核心或蔗糖球)上，并用肠溶层(例如，EUDRAGIT L30D-55)喷雾干燥以形成包含β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的丸粒。
任选地，核心粒子可包含一种或多种β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或一种或多种附加治疗剂。在一个实施方案中，可例如以微球的形式将一种或多种剂量的β-内酰胺酶包封在核心颗粒中。例如，β-内酰胺酶可以与聚合物(例如，胶乳)组合，然后在不使用蔗糖核心的情况下形成微粒状、微囊化的酶制剂。由此形成的微球可任选地用延迟释放包衣覆盖。
已知有多种用于产生适于包含酶的微粒(诸如微球、聚集体、其他)的方法。它们通常包括至少两个相，一个相含有酶，并且另一个相含有形成微粒主链的聚合物。最常见的是凝聚，其中通过添加第三组分使聚合物与其溶剂相分离，或者为多相乳液，诸如水包油包水(w/o/w)乳液，其中内部水相含有蛋白质，中间有机相含有聚合物，并且外部水相稳定剂支持w/o/w双重乳液，直到可以去除溶剂以形成微球。或者，将β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和稳定化辅料(例如，海藻糖、甘露醇、吐温80、聚乙烯醇)组合并从水溶液喷雾，并收集。然后将粒子悬浮在含有聚合物和释放改良化合物的干燥、与水不混溶的有机溶剂中，并对悬浮液进行超声处理以分散粒子。另一种方法使用水相而不使用有机溶剂。具体地，将酶、缓冲组分、聚合物胶乳和稳定化和释放改良辅料溶解/分散在水中。将水性分散体喷雾干燥，从而导致胶乳凝聚，并将蛋白质和辅料掺入凝聚胶乳的粒子中。当释放改良剂在酸性条件下不溶但在较高pH(诸如羧酸)下可溶时，则在胃环境中抑制从基质中进行释放。
在一些实施方案中，在将延迟释放包衣涂覆到经包衣的核心粒子之前，可任选地用一个或多个包含药用辅料的分离层覆盖该粒子，所述药用辅料包括碱性化合物，诸如pH缓冲化合物。分离层基本上将经包衣的核心粒子与延迟释放包衣分离。
可以通过通常与包衣设备(诸如包衣锅、包衣造粒机)一起使用的包衣或分层程序，或在流化床设备中使用用于包衣过程的水和/或有机溶剂，来将分离层施加到经包衣的核心粒子上。作为替代方案，可以通过使用粉末包衣技术将分离层施加至核心材料上。分离层的材料是单独或以混合物形式使用的药学上可接受的化合物，诸如糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠等。分离层中也可包含添加剂，诸如增塑剂、着色剂、颜料、填料、抗粘剂和抗静电剂，例如硬脂酸镁、二氧化钛、滑石和其它添加剂。
在一些实施方案中，具有延迟释放包衣的经包衣粒子可以进一步用外包衣层覆盖。可以如关于其他包衣组合物所述地施加外包衣层。外包衣材料是单独或以混合物形式使用的药学上可接受的化合物，诸如糖、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲纤维素、羧甲基纤维素钠等。外包衣材料可以防止包有延迟释放包衣的粒子的潜在附聚，保护延迟释放包衣在压实过程中不破裂，或增强压片过程。
在各种实施方案中，制剂可包含多种改良释放粒子或丸粒或微球。在一个实施方案中，制剂为包含多个丸粒的胶囊形式。在一个实施方案中，制剂为包含多个微球的胶囊形式。
在一些实施方案中，所述改良释放制剂是填充有多个含有β-内酰胺酶的丸粒(例如，含有SYN-004(或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的丸粒)的胶囊，β-内酰胺酶从所述丸粒中释放。在一个实施方案中，胶囊是明胶胶囊，诸如硬明胶胶囊。在另一个实施方案中，胶囊为羟丙甲纤维素(HPMC)胶囊。例如，制剂可以是包含多个丸粒的胶囊形式。例如，制剂可以是胶囊形式，所述胶囊为诸如明胶或羟丙甲纤维素(HPMC)胶囊，所述胶囊包含多个含有β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的肠溶包衣丸粒。在此类实施方案中，可以利用丸粒的组合，其中每个丸粒被设计成在特定的时间点或位置释放。在各种实施方案中，将丸粒(例如，肠溶包衣丸粒)设计为不改变地通过胃，然后释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)进入肠道的一个或多个区域中。在一些实施方案中，可以对含有β-内酰胺酶的丸粒进行肠溶包衣以在不同的肠道pH值下释放β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。
在各种实施方案中，本发明的制剂为胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)的形式，所述胶囊包含多个含有β-内酰胺酶的肠溶包衣丸粒。在此类实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)、蔗糖球(β-内酰胺酶(例如，SYN-004或变体)喷涂到该蔗糖球上)、粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))、肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)、增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)、助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)、乳化剂和缓冲盐。
在各种实施方案中，本发明的制剂为胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)的形式，所述胶囊包含多个含有β-内酰胺酶的肠溶包衣丸粒。在此类实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约10-20重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。例如，β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、或约20重量％存在。在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约20-30重量％的蔗糖球，β-内酰胺酶(例如，SYN-004或变体)喷涂到所述蔗糖球上。例如，蔗糖球可以约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％、约25重量％、约26重量％、约27重量％、约28重量％、约29重量％、或约30重量％存在。在各种实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约30-40重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))。例如，粘合剂辅料可以约30重量％、约31重量％、约32重量％、约33重量％、约34重量％、约35重量％、约36重量％、约37重量％、约38重量％、约39重量％、或约40重量％存在。在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约15-25重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)。例如，肠溶聚合物可以约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％、或约25重量％存在。在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约1.5-2.5重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)。例如，增塑剂可以约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％存在。在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约0.5-1.5重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)。例如，助流剂可以约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、或约1.5重量％存在。在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约0.1-1.0重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、或约1重量％存在。在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)还包含约1-2重量％的缓冲盐。例如，缓冲盐可以约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、或约2重量％存在。如本文所述的重量是指除胶囊本身的重量之外的所有组分的总重量。
在一些实施方案中，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约16重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；约23重量％的蔗糖球；约35重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约21重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约2重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约1重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.5重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；以及约2重量％的缓冲盐。如本文所述的重量是指除胶囊本身的重量之外的所有组分的总重量。
例如，丸粒(或每个单独的丸粒)包含约15.8重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；约23.3重量％的蔗糖球；约35重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约20.8重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L30D-55)；约2.1重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约1.0重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.4重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；和约1.6重量％的缓冲盐。如本文所述的重量是指除胶囊本身的重量之外的所有组分的总重量。
在各种实施方案中，本发明的制剂为胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)的形式，所述胶囊包含约75mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。胶囊包括多个含有β-内酰胺酶的肠溶包衣丸粒。在此类实施方案中，制剂包含约10-20重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。例如，β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、或约20重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约15-25重量％的蔗糖球。例如，蔗糖球可以约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％、或约25重量％存在。在各种实施方案中，制剂包含约25-35重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))。例如，粘合剂辅料可以约25重量％、约26重量％、约27重量％、约28重量％、约29重量％、约30重量％、约31重量％、约32重量％、约33重量％、约34重量％、或约35重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10-25重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)。例如，肠溶聚合物可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％、或约25重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约1.5-2.5重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)。例如，增塑剂可以约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、约2重量％、约2.1重量％、约2.2重量％、约2.3重量％、约2.4重量％、约2.5重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.5-1.5重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)。例如，助流剂可以约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、或约1.5重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.1-1.0重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、或约1重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约1-2重量％的缓冲盐。例如，缓冲盐可以以约1重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、或约2重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10-20重量％的明胶或HPMC胶囊。例如，明胶或HPMC胶囊可为约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、或约20重量％。
在一些实施方案中，本发明的制剂包含约75mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。在此类实施方案中，制剂包含约13重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；约19重量％的蔗糖球；约29重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约17重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约2重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约1重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.5重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1重量％的缓冲盐；以及约17重量％的明胶或HPMC胶囊。
例如，制剂包含约13.1重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；约19.4重量％的蔗糖球；约29.1重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约17.3重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约1.7重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约0.9重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.4重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1.3重量％的缓冲盐；以及约16.8重量％的明胶或HPMC胶囊。
在各种实施方案中，本发明的制剂为胶囊(例如，硬明胶或HPMC胶囊)的形式，所述胶囊包含约25mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。胶囊包括多个包含β-内酰胺酶的肠溶包衣丸粒。在此类实施方案中，制剂包含约5-15重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。例如，β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)可以约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、约9重量％、约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、或约15重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10-20重量％的蔗糖球。例如，蔗糖球可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、或约20重量％存在。在各种实施方案中，制剂包含约15-25重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))。例如，粘合剂辅料可以约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、约20重量％、约21重量％、约22重量％、约23重量％、约24重量％、或约25重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约10-20重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L30D-55)。例如，肠溶聚合物可以约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约16重量％、约17重量％、约18重量％、约19重量％、或约20重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约1.0-2.0重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)。例如，增塑剂可以约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、约1.5重量％、约1.6重量％、约1.7重量％、约1.8重量％、约1.9重量％、或约2.0重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.1-1.0重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)。例如，助流剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、或约1重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.1-1.0重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)。例如，乳化剂可以约0.1重量％、约0.2重量％、约0.3重量％、约0.4重量％、约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、或约1重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约0.5-1.5重量％的缓冲盐。例如，缓冲盐可以约0.5重量％、约0.6重量％、约0.7重量％、约0.8重量％、约0.9重量％、约1.0重量％、约1.1重量％、约1.2重量％、约1.3重量％、约1.4重量％、或约1.5重量％存在。在一些实施方案中，制剂包含约30-40重量％的明胶或HPMC胶囊。例如，明胶或HPMC胶囊可以为约30重量％、约31重量％、约32重量％、约33重量％、约34重量％、约35重量％、约36重量％、约37重量％、约38重量％、约39重量％、或约40重量％。
在一些实施方案中，本发明的制剂包含约25mg的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。在此类实施方案中，制剂包含约10重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；约15重量％的蔗糖球；约22重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约13重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约1重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约0.5重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.3重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1重量％的缓冲盐；以及约38重量％的明胶或HPMC胶囊。
例如，制剂包含约9.8重量％的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)；约14.5重量％的蔗糖球；约21.8重量％的粘合剂辅料(例如，羟丙基纤维素(HPC))；约13重量％的肠溶聚合物(例如，EUDRAGIT L 30D-55)；约1.3重量％的增塑剂(例如，柠檬酸三乙酯)；约0.6重量％的助流剂(例如，单硬脂酸甘油酯)；约0.3重量％的乳化剂(例如，聚山梨醇酯-80)；约1.0重量％的缓冲盐；以及约37.7重量％的明胶或HPMC胶囊。
本发明还提供了沿胃肠道释放多个剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)和/或附加治疗剂的改良释放制剂。在此类实施方案中，可以通过利用例如多种粒子类型或多个层来调节此类制剂的总释放特性。在一个实施方案中，β-内酰胺酶的第一剂量可以被配制以用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)或大肠(例如，盲肠，结肠的上行、横行、下行或乙状部分，以及直肠中的一者或多者)中释放，而第二剂量被配制用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)或大肠(例如，盲肠，结肠的上行、横行、下行或乙状部分，以及直肠中的一者或多者)的不同区域中延迟释放。或者，在沿肠道的不同位置处释放多个剂量。例如，在一个实施方案中，β-内酰胺酶的第一剂量可以被配制为用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)中释放，而第二剂量被配制用于在例如小肠(例如，十二指肠、空肠、回肠中的一者或多者)的另一部分中延迟释放。在另一个实施方案中，β-内酰胺酶的第一剂量可以被配制为用于在例如大肠(例如，盲肠，结肠的上行、横行、下行或乙状部分，以及直肠中的一者或多者)中释放，而第二剂量被配制用于在例如大肠(例如，盲肠，结肠的上行、横行、下行或乙状部分，以及直肠中的一者或多者)的另一部分中延迟释放。
在各种实施方案中，本文所述的试剂可以是药学上可接受的盐的形式，即那些适合用于在没有过度毒性、刺激、过敏响应等的情况下与人和其他动物的组织接触，并且与合理的益处/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域中熟知的。盐可以在治疗剂的最终分离和纯化期间原位制备，或者通过使游离碱官能团与合适的酸反应或使游离酸官能团与合适的碱性部分反应来单独制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包括钠阳离子、锂阳离子、钾阳离子、钙阳离子、镁阳离子等，以及无毒的铵阳离子、季铵阳离子和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。
在各种实施方案中，本发明的制剂提供许多优点。例如，发明人已经成功地配制了蛋白质(即β-内酰胺酶)，此举本身为挑战性的。在各种实施方案中，本发明的制剂释放药物所处的胃肠道环境进一步加剧了该挑战性。此外，在各种实施方案中，本发明的制剂提供足够缓慢的胃肠道释放以允许实现胃肠道中的良好保护性覆盖，以免受例如小肠中的各种抗生素的不利影响，(由于与缓慢释放相称的β-内酰胺酶半衰期延长而增强的益处)。此外，例如，通过用HPC而不是EUDRAGIT对本发明的丸粒的药物物质层进行包衣，本发明的制剂使制剂中EUGRAGIT的量最小化，因此减轻了可能的剂量限制毒性和制造复杂性。
施用和剂量
应当理解，要根据本发明施用的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的实际剂量将根据例如具体的剂型和施用方式而变化。本领域技术人员可以考虑可改变β-内酰胺酶作用的许多因素(例如，体重、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、受试者的状况、药物组合、遗传倾向和反应敏感性)。施用可以在最大耐受剂量内连续进行或以一个或多个离散剂量进行。本领域技术人员可以使用常规剂量施用测试来确定一组给定条件下的最佳施用速率。
β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的单独剂量可以以单位剂型(例如，片剂或胶囊)施用，所述单位剂型包含例如约0.01mg至约1,000mg、约0.01mg至约950mg、约0.01mg至约900mg、约0.01mg至约850mg、约0.01mg至约800mg、约0.01mg至约750mg、约0.01mg至约700mg、约0.01mg至约650mg、约0.01mg至约600mg、约0.01mg至约550mg、约0.01mg至约500mg、约0.01mg至约450mg、约0.01mg至约400mg、约0.01mg至约350mg、约0.01mg至约300mg、约0.01mg至约250mg、约0.01mg至约200mg、约0.01mg至约150mg、约0.01mg至约100mg、约0.1mg至约90mg、约0.1mg至约80mg、约0.1mg至约70mg、约0.1mg至约60mg、约0.1mg至约50mg、约0.1mg至约40mg、约0.1mg至约30mg、约0.1mg至约20mg、约0.1mg至约10mg、约0.1mg至约5mg、约0.1mg至约3mg、约0.1mg至约1mg，或约5mg至约80mg的活性成分/单位剂型。例如，单位剂型可为约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg，或约1,000mg，包含所述范围之间的所有值和范围。在一个实施方案中，以含有25mg的β-内酰胺酶的单位剂型来施用单独剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。在另一实施方案中，以含有50mg的β-内酰胺酶的单位剂型来施用单独剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。在又一实施方案中，以含有75mg的β-内酰胺酶的单位剂型来施用单独剂量的β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)。
在一个实施方案中，以每天约0.01mg至约100mg、每天约0.01mg至约1,000mg、每天约0.01mg至约950mg、每天约0.01mg至约900mg、每天约0.01mg至约850mg、每天约0.01mg至约800mg、每天约0.01mg至约750mg、每天约0.01mg至约700mg、每天约0.01mg至约650mg、每天约0.01mg至约600mg、每天约0.01mg至约550mg、每天约0.01mg至约500mg、每天约0.01mg至约450mg、每天约0.01mg至约400mg、每天约0.01mg至约350mg、每天约0.01mg至约300mg、每天约0.01mg至约250mg、每天约0.01mg至约200mg、每天约0.01mg至约150mg、每天约0.1mg至约100mg、每天约0.1mg至约95mg、每天约0.1mg至约90mg、每天约0.1mg至约85mg、每天约0.1mg至约80mg、每天约0.1mg至约75mg、每天约0.1mg至约70mg、每天约0.1mg至约65mg、每天约0.1mg至约60mg、每天约0.1mg至约55mg、每天约0.1mg至约50mg、每天约0.1mg至约45mg、每天约0.1mg至约40mg、每天约0.1mg至约35mg、每天约0.1mg至约30mg、每天约0.1mg至约25mg、每天约0.1mg至约20mg、每天约0.1mg至约15mg、每天约0.1mg至约10mg、每天约0.1mg至约5mg、每天约0.1mg至约3mg、每天约0.1mg至约1mg，或每天约5mg至约80mg的量来施用β-内酰胺酶。
在各种实施方案中，以约0.01mg、约0.02mg、约0.03mg、约0.04mg、约0.05mg、约0.06mg、约0.07mg、约0.08mg、约0.09mg、约0.1mg、约0.2mg、约0.3mg、约0.4mg、约0.5mg、约0.6mg、约0.7mg、约0.8mg、约0.9mg、约1mg、约2mg、约3mg、约4mg、约5mg、约6mg、约7mg、约8mg、约9mg约10mg、约15mg、约20mg、约25mg、约30mg、约35mg、约40mg、约45mg、约50mg、约55mg、约60mg、约65mg、约70mg、约75mg、约80mg、约85mg、约90mg、约95mg、约100mg、约150mg、约200mg、约250mg、约300mg、约350mg、约400mg、约450mg、约500mg、约550mg、约600mg、约650mg、约700mg、约750mg、约800mg、约850mg、约900mg、约950mg、或约1,000mg(包含所述范围之间的所有值和范围)的每日剂量来施用β-内酰胺酶。
在一些实施方案中，β-内酰胺酶(例如，SYN-004，或本文所述的其他β-内酰胺酶试剂，以及它们的变体)的合适剂量在约0.01mg/kg受试者体重至约100mg/kg受试者体重的范围内，例如约0.01mg/kg体重、约0.02mg/kg体重、约0.03mg/kg体重、约0.04mg/kg体重、约0.05mg/kg体重、约0.06mg/kg体重、约0.07mg/kg体重、约0.08mg/kg体重、约0.09mg/kg体重、约0.1mg/kg体重、约0.2mg/kg体重、约0.3mg/kg体重、约0.4mg/kg体重、约0.5mg/kg体重、约0.6mg/kg体重、约0.7mg/kg体重、约0.8mg/kg体重、约0.9mg/kg体重、约1mg/kg体重、约1.1mg/kg体重、约1.2mg/kg体重、约1.3mg/kg体重、约1.4mg/kg体重、约1.5mg/kg体重、约1.6mg/kg体重、约1.7mg/kg体重、约1.8mg/kg体重、1.9mg/kg体重、约2mg/kg体重、约3mg/kg体重、约4mg/kg体重、约5mg/kg体重、约6mg/kg体重、约7mg/kg体重、约8mg/kg体重、约9mg/kg体重、约10mg/kg体重、约15mg/kg体重、约20mg/kg体重、约25mg/kg体重、约30mg/kg体重、约35mg/kg体重、约40mg/kg体重、约45mg/kg体重、约50mg/kg体重、约55mg/kg体重、约60mg/kg体重、约65mg/kg体重、约70mg/kg体重、约75mg/kg体重、约80mg/kg体重、约85mg/kg体重、约90mg/kg体重、约95mg/kg体重，或约100mg/kg体重，所述范围包含其间的所有值和范围。在其他实施方案中，β-内酰胺酶的合适剂量在约0.01mg/kg体重至约10mg/kg体重的范围内、在约0.01mg/kg体重至约9mg/kg体重的范围内、在约0.01mg/kg体重至约8mg/kg体重的范围内、在约0.01mg/kg体重至约7mg/kg体重的范围内、在0.01mg/kg体重至约6mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约5mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约4mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约3mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约2mg/kg体重的范围内、在约0.05mg/kg体重至约1.5mg/kg体重的范围内，或在约0.05mg/kg体重至约1mg/kg体重的范围内。
在各种实施方案中，SYN-004的剂量在约75mg至约300mg之间，例如约75mg、或约100mg、或约125mg、或约150mg、或约175mg、或约200mg、或约225mg、或约250mg、或约275mg、或约300mg。
根据本发明的某些实施方案，可以例如约每天一次，约每隔一天一次、约每三天一次、约每周一次、约每两周一次、约每月一次、约每两个月一次、约每三个月一次、约每六个月一次，或约每年一次地施用β-内酰胺酶。在某些实施方案中，β-内酰胺酶可以每天施用超过一次，例如每天约两次、约三次、约四次、约五次、约六次、约七次、约八次、约九次、或约十次。
抗生素
在各个方面，本发明提供了用于防止或减少抗生素抗性产生的方法。在各种实施方案中，受试者正在接受抗生素治疗或最近接受过抗生素治疗。在各种实施方案中，受试者将要接受一种或多种抗生素。
在各种实施方案中，本文所述的抗生素属于存在对其的抗性的抗生素，或属于本发明的β-内酰胺酶有助于诱导对其的治疗响应的抗生素。
例如，在各种实施方案中，本发明方法属于这样的方案，在所述方案中在抗生素之前(例如，在该抗生素之前1小时、或在该抗生素之前2小时、或在该抗生素之前3小时、或在该抗生素之前6小时、或在该抗生素之前9小时、或在该抗生素之前10小时、或在该抗生素之前12小时、或在该抗生素之前1天)施用本发明的β-内酰胺酶，以(不希望受理论束缚)将患者的微生物组调节成对该抗生素的抗性较低并且因此对该抗生素有响应。
在各种实施方案中，抗生素选自β-内酰胺类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、四环素类、利福霉素类、大环内酯类、酮内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类、磺胺类、噁唑烷酮类以及喹诺酮类。
在各种实施方案中，抗生素是β-内酰胺抗生素，诸如青霉素(例如，氨苄青霉素、阿莫西林)、头孢菌素、棒烷类(clavams)(或氧青霉烷类)、头霉素类和碳青霉烯类。
在各种实施方案中，抗生素是头孢菌素，所述头孢菌素可以是以下项中的一者或多者：
在一些实施方案中，抗生素是万古霉素。
在一些实施方案中，抗生素选自链霉素、新霉素、庆大霉素、妥布霉素、四环素、强力霉素、阿奇霉素、红霉素，以及克拉霉素。
在一些实施方案中，抗生素选自曲伐沙星、环丙沙星、加替沙星，以及莫西沙星。
在一些实施方案中，术语“患者”和“受试者”可互换使用。在一些实施方案中，受试者和/或动物是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、兔、绵羊，或非人灵长类动物，诸如猴子、黑猩猩或狒狒。在其他实施方案中，受试者和/或动物是非哺乳动物，诸如斑马鱼。在一些实施方案中，受试者和/或动物可包含荧光标记的细胞(用例如GFP标记的)。在一些实施方案中，受试者和/或动物是包含荧光细胞的转基因动物。
在各种实施方案中，本发明的方法可用于治疗人类受试者。在一些实施方案中，人是儿童。在其他实施方案中，人是成年人。在其他实施方案中，人是老年人。在其他实施方案中，人可以被称为患者。在一些实施方案中，人是女性。在一些实施方案中，人是男性。
在某些实施方案中，人的年龄在约1个月大至约18个月大、约18个月大至约36个月大、约1岁至约5岁、约5岁至约10岁、约10岁至约15岁、约15岁至约20岁、约20岁至约25岁、约25岁至约30岁、约30岁至约35岁、约35岁至约40岁、约40岁至约45岁、约45岁至约50岁、约50岁至约55岁、约55岁至约60岁、约60岁至约65岁、约65岁至约70岁、约70岁至约75岁、约75岁至约80岁、约80岁至约85岁、约85岁至约90岁、约90岁至约95岁、或约95岁至约100岁的范围内。
试剂盒
本发明提供了可以简化本文所述的改良释放制剂的施用的试剂盒。该试剂盒是材料或组件/组分的组合，包括本文所述的改良释放制剂中的至少一种改良释放制剂。试剂盒中配置的组件/组分的确切性质取决于其预期目的。在一个实施方案中，所述试剂盒配置用于治疗人类受试者。
试剂盒中可包括使用说明书。使用说明书通常包括有形表达，该有形表达描述了在使用试剂盒的组件/组分来影响所需结局(诸如用于治疗本文所述的相关病症)时使用的技术。任选地，该试剂盒还包含其他有用的组件/组分，诸如稀释剂、缓冲剂、药学上可接受的载剂、注射器、导管，涂药器、移液或测量工具、包扎材料，或本领域技术人员将容易认识到的其他有用的用具。
装配在试剂盒中的材料和组件/组分可以以保持其可操作性和实用性的任何方便和适当的方式提供给从业者商店(practitioner store)。例如，可以在室温、冷藏温度或冷冻温度下提供组件。所述组件通常包含在合适的包装材料中。在各种实施方案中，通过众所周知的方法来构建包装材料，优选地以提供无菌、无污染的环境。包装材料可具有外部标签，该外部标签指示试剂盒和/或其组件的内容物和/或目的。
实施例
实施例1：抗生素介导的猪肠道微生物组破坏研究设计
在正常的两月龄仔猪中评价了SYN-004(ribaxamase)减轻因肠道微生物群落暴露于头孢曲松而引起的抗生素抗性基因增殖的能力。关于研究设计和时间线，参见表2和图1。在研究开始之前使动物适应14天。每天施用头孢曲松(CRO)一次，持续7天，并且使动物在抗生素治疗前一天开始接受SYN-004(ribaxamase)，连续9天。在第-7研究日、第-4研究日、第4研究日和第8研究日收集粪便。分离粪便DNA并进行全基因组鸟枪宏基因组学分析。通过与策划的抗生素抗性基因数据库进行比较，来鉴定群落耐药基因组，微生物组中的抗生素抗性基因的集合。
表2：仔猪肠道微生物组研究设计
在该研究中使用两组，每组各5只正常仔猪。将第1组动物用头孢曲松(IV，每天1次，50mg/kg)治疗连续7天，并使第2组动物接受头孢曲松(IV，每天1次，50mg/kg)连续7天且在头孢曲松递送前一天开始接受SYN-004(ribaxamase，口服，每天4次，75mg/剂)连续9天。
图1示出了猪研究的示意性时间线。在研究开始前，使正常仔猪(2个月大，约50lbs)适应14天。使用各5只动物的两个群组来进行该研究，第1组接受单独的头孢曲松，并且第2组接受头孢曲松和SYN-004(ribaxamase)，如表2所示。在4个时间点处收集粪便，该4个时间点中的两个时间点在治疗前的第-7研究日和第-4研究日，还有两个在治疗期间的第4研究日和第8研究日。
使用MOBIODNA分离试剂盒(Qiagen,Germantown,MD)，按照制造商的说明书从粪便样本中分离总DNA。使用Biomek FX液体处理器(Beckman Coulter LifeSciences,Brea,CA)将每个DNA样品在3-18uL的不含核酸酶的水中归一化，以实现0.5ng/uL的最终浓度。使用Nextera XT文库制备试剂盒(Nextera XT Library Prep Kit)(illumine,San Diego,CA)来构建文库。对于每个样品，在标记片段化(tagmentation)反应中使用0.5ng的输入，然后按照经修改的Nextera XT方案，使用Nextera i7和i5索引引物以及2X KAPA主混合物进行13个循环的PCR扩增。使用1.0X速度珠粒来纯化PCR产物，并在15ul不含核酸酶的水中洗脱。通过PicoGreen荧光测定(100倍最终稀释度)来对最终文库进行定量，并且浓度范围为0.1-4.0ng/ul。将文库基于通过PicoGreen测定的浓度来汇合，并加载到Caliper LabChipGX(Perkin Elmer,Waltham,MA)上运行的高灵敏度(HS)芯片上。报道的碱基对大小在301-680bp的范围内。将各个为64的汇集物在Illumina HiSeq v3流动池的8个泳道上跑样，从而靶向100bp配对末端读段/样品。
如所述(Hasan等人，2014,PLoS ONE 9:e97699；Lax等人，2014,Science 345:1048)，使用CosmosID,Inc.的生物信息学软件包(CosmosID Inc.,Rockville,MD)来直接分析未装配的宏基因组测序读段。简而言之，针对CosmosID,Inc.策划的抗生素抗性基因数据库来探测原始未装配的鸟枪序列读段。测序数据的分析包括通过基于每个基因的基因覆盖百分比鉴定出抗生素抗性基因来进行耐药基因组分析，并通过测定每个样品中每个基因的频率(％)和热图的产生来进行定量。
为了确定ribaxamase是否影响抗生素抗性的增殖，分析粪便DNA全基因组鸟枪宏基因组数据以得知抗生素抗性基因的存在，作为粪便微生物组中抗生素抗性细菌群体的量度。在抗生素治疗之前和之后比较的每只动物的粪便微生物组中鉴定出的抗生素抗性基因的热图(图2A和图2B)显示，与CRO+ribaxamase微生物组相比，CRO与治疗后第4天较高的抗生素抗性基因丰度相关。在第4天检测到的大多数抗性基因是经编码的β-内酰胺酶(图2A和图2B)。具体地，编码超广谱OXA D类β-内酰胺酶的blaOXA基因(McArthur和Write，2015,Curr Opion Microbiol 27:45；Bush等人，2016,lahey.org/studies/)在第4天以高水平存在于五只CRO动物中的两只中，而在CRO+ribaxamase群组中不存在或观察到以较低频率存在。类似地，在第4天在CRO动物中的两只中检测到了高水平的编码超广谱A类丝氨酸β-内酰胺酶的blaCTX-M_82或blaCFX_A4基因(McArthur等人，2013,Antimicrob AgentsChemother.57:3348)。在抗生素治疗之前在第-7天，在除了一只动物之外的所有动物中都存在编码超广谱头孢菌素抗性C类β-内酰胺酶的附加β-内酰胺酶基因AmpC。从第-7天到第-4天，在任何抗生素介导的选择机制之前，两个群组中的AmpC水平都增加。然而，到第4天，在CRO群组中AmpC基因频率继续增加，而在CRO+ribaxamase动物中观察到AmpC降低至与第-7天频率相似的水平。
图2A示出了对猪粪便微生物组中所有抗生素抗性基因的频率的热图分析。基于基因覆盖百分比，分析粪便微生物组宏基因组数据以得知抗生素抗性基因的存在，作为每个样品中相对基因频率的量度。热图的每一行代表在指定时间点第-7天、第-4天或第4天的单独动物。抗生素抗性基因显示在附图的底部，治疗组和粪便样本的收集日在左侧，并且动物编号在右侧(P1-P10)。
图2B示出了对猪粪便微生物组中β-内酰胺酶基因的频率的热图分析。基于基因覆盖百分比，分析粪便微生物组宏基因组数据以得知β-内酰胺酶基因的存在，作为每个样品中相对基因频率的量度。热图的每一行代表在指定时间点第-7天、第-4天或第4天的单独动物。抗生素抗性基因显示在附图的底部，治疗组和粪便样本的收集日在左侧，并且动物编号在右侧(P1-P10)。
除β-内酰胺酶外，其他抗性基因也表现出响应于抗生素暴露的频率增大。这些基因中的许多基因编码多药外排转运体系的组分，所述体系赋予对多种抗生素(包括β-内酰胺类)的抗性。被选择用于附加分析的基因包括：编码AcrEF-TolC多药外排转运体系的组分的acrE(Lau和Zgurskaya，2005,J.Bacteriol.187:7815)；编码MdtABC多药外排转运体系的响应调节物的baeR(Nagakubo等人，2002,J.Bacteriol.184:4161)；编码EmrKY-TolC多药外排转运体系的组分的emrY(Tanabe等人，1997,J.Gen.Appl.Microbiol.43:257)；编码MdtABC多药外排转运体系的组分的mdtD(Nagakubo等人，2002,J.Bacteriol.184:4161)；以及编码来自主要易化子超家族的多药抗性外排泵的mdtN(Sulavik等人，2001,Antimicrob.Agents Chemother.45:1126)。除了编码头孢菌素抗性C类β-内酰胺酶的β-内酰胺酶AmpC之外，还选择两个与β-内酰胺酶密切相关的基因，即编码青霉素结合蛋白2的pbp2(Bharat等人，2015,Antimicrob.Agents Chemother.59:5003)和编码青霉素结合蛋白4的pbp4(Sun等人，2014,PLoS One 9:e97202)。对于每个选择的基因，比较CRO或CRO+ribaxamase群组中从第-4天到第4天的相对基因频率的平均值的变化(图3)。CRO群组中每个基因的相对基因频率都增加。相比之下，除了pbp2之外，CRO+ribaxamase组中每个基因的基因频率都降低，pbp2的水平仅升高为略高于基线。观察到了mdtD基因的最大增加，从第-4天到第4天在CRO群组中mdtD基因的水平翻倍，而在CRO+ribaxamase群组中mdtD水平降低。
图3示出了所选择的抗生素抗性基因的频率变化。显示了与治疗后第4天相比，来自治疗前第-4天的CRO(黑色)或CRO+ribaxamase(白色)治疗动物的指示抗生素抗性基因的相对频率(平均值)的变化。负值表示频率降低，正值表示频率升高，并且零值表示基因频率没有变化。基因在横轴上列出：编码AcrEF-TolC多药外排转运蛋白的组分的acrE；编码MdtABC多药外排转运体系的响应调节物的baeR；编码EmrKY-TolC多药外排转运体系的组分的emrY；编码MdtABC多药外排转运体系的组分的mdtD；编码来自主要易化子超家族的多药抗性外排泵的mdtN；编码青霉素结合蛋白2的pbp2；编码青霉素结合蛋白4的pbp4；以及编码C类β-内酰胺酶的AmpC。
选择赋予对非β-内酰胺抗生素即氨基糖苷类和四环素的抗性的两种抗生素抗性基因来进行进一步分析(图4A和图4B)。氨基糖苷_strA(Scholz等人，1989,Gene 75:271)编码氨基糖苷磷酸转移酶，并且四环素_tet39(Agerso和Guardabassi，2005,J.Antimicrob.Chemother.55:566)编码四环素外排泵的组分。在治疗前样品中未检测到任何基因(第-7天)。在第-4天，在所述动物中的一只动物(猪3)中检测到了两种基因。在抗生素治疗后第4天，在用CRO治疗的5只动物中的4只中检测到了高水平的两种基因。相比之下，在CRO+ribaxamase群组中，氨基糖苷酶_strA水平在所有动物中保持较低或不存在，并且CRO+ribaxamase群组中的仅一只动物被鉴定为具有高水平的四环素_tet39基因。
图4A和图4B示出了所选择的抗生素抗性基因的频率变化。显示了来自CRO(蓝色)或CRO+ribaxamase(橙色)治疗动物的两种所选择的抗生素抗性基因A)氨基糖苷_strA和B)四环素_tet39的相对频率。每个点代表每个动物的微生物组中从治疗前第-7天或第-4天或治疗后第4天的相对基因水平。中位数显示在每个数据集中。
头孢曲松治疗增加了猪肠道微生物组中抗生素抗性基因的丰度，而SYN-004(ribaxamase)减弱了这种富集过程。在存在ribaxamase的情况下，抗生素抗性基因频率降低或维持在抗生素治疗前的水平。值得注意的是，在头孢曲松的存在下，许多类抗生素抗性基因的频率扩大，而不仅仅是赋予β-内酰胺抗性的基因的频率扩大。这些抗生素抗性基因包括编码药物外排泵体系的组分的β-内酰胺酶基因，以及编码对四环素和氨基糖苷类的抗性的基因。
实施例2：抗生素介导的猪肠道微生物组破坏研究设计的扩展
将实施例1的研究扩展成口服阿莫西林和IV厄他培南。
表3.仔猪肠道微生物组研究设计
使用约20kg的大致2月龄约克郡仔猪。使猪在出生当天接受2ml铁/青霉素/Draxxin，并在7日龄时再次接受2ml铁/青霉素/Draxxin。不在食物中提供抗生素。使猪在21天时断奶。在上午7点给药后、在中午12点给药后、在下午5点给药后对仔猪饲喂3次。
执行猪粪便DNA的全基因组鸟枪序列分析，以评估抗生素对肠道微生物组的影响，并将抗生素抗性基因定量作为粪便微生物组中存在的抗生素抗性细菌的量度。两种抗生素都引起肠道微生物组的显著变化。在抗生素暴露的4天内，在微生物组中检测到了广谱的抗性基因，包括赋予对β-内酰胺和非β-内酰胺抗生素的抗性的那些基因。
图5A示出了在厄他培南治疗后抗生素抗性基因tetS和mphE(从左至右示出)的频率变化。
图5B示出了在厄他培南治疗后万古霉素抗性基因vanRc3、vanA_C和vanSc3(从左至右示出)的频率变化。
图5C示出了在阿莫西林治疗后β-内酰胺酶基因ROB_1、OXA_347和CblA_1(从左至右示出)的频率变化。
图5D示出了厄他培南治疗后β-内酰胺酶基因IMP_27、OXA_212和OXA_277的频率变化。
预期当向受试者施用口服阿莫西林和IV头孢曲松时，SYN-004也将减轻抗生素抗性的出现和传播，这与上文IV头孢曲松的结果一致。
实施例3口服抗生素介导的犬肠道微生物组破坏研究设计
在正常的七月龄雌性小猎犬中评价SYN-004(ribaxamase)的延迟释放制剂减轻由因肠道微生物组暴露于口服阿莫西林而引起的抗生素抗性基因的增殖的能力。在开始给药之前使动物适应24天。使动物(n＝10，每群组5只动物)接受口服阿莫西林(40mg/kg/剂，在苹果汁中复溶)每日三次+/-一粒SYN-004(10mg)胶囊，持续5天，其中最后一个剂量在第6天早晨。使动物接受16个总剂量的阿莫西林+/-SYN-004。在抗生素给药前和最后一个剂量后收集粪便样品。在第1天第一个抗生素剂量后和第6天最后一个剂量后采血。在每个采血日，在7个时间点0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、和8小时从每只动物采血。使用经验证的液相色谱(LC)方法和串联质谱检测(LC/MS/MS)来测量阿莫西林血清水平。使从粪便样品中分离的DNA经受全基因组鸟枪法测序和宏基因组学分析。
将每个采血日每组的阿莫西林血清水平作为每个时间点的平均值+标准偏差绘图。计算每个采血日(第1天和第6天)每组的曲线下面积，并使用单向ANOVA和Dunnett多重比较检验(Graph Pad Prism 7.03软件)进行统计学比较。在第1天和第6天单独阿莫西林与阿莫西林+SYN-004群组的阿莫西林血清水平没有显著差异，分别p＝0.703和0.098(图6)。这些数据表明延迟释放的SYN-004制剂不干扰胃肠道的阿莫西林全身吸收，并且表明这种SYN-004制剂在狗的上部小肠中发生阿莫西林吸收之前不会过早释放。
对从粪便样品中分离的DNA进行全基因组测序，并使用CosmosID,Inc.的生物信息学软件包进行分析。分析包括鉴定粪便微生物组中存在的微生物群物种，并基于每个基因的基因覆盖百分比来鉴定抗生素抗性基因，并通过测定每个样品中每个基因的频率(％)进行定量。
为了确定SYN-004是否保护粪便微生物组免受口服阿莫西林引起的损伤，使用三坐标主坐标分析(CosmosID,Inc.生物信息学软件)来比较微生物组细菌群体。点之间的距离表示样品多样性的差异程度，其中点越靠近在一起，则越相似。来自单独阿莫西林和阿莫西林+SYN-004群组的治疗前微生物组都聚集在一起(图7)。值得注意的是，来自阿莫西林+SYN-004群组的阿莫西林暴露后微生物组还与治疗前样品聚簇。相比之下，4/5的治疗后样品被绘图为远离治疗前的簇。一个治疗后的单独阿莫西林样品与其余样品聚簇。这些数据表明，口服阿莫西林会破坏胃肠道中的微生物群群体，并且SYN-004可以减轻口服阿莫西林引起的损害。
为了确定SYN-004是否影响抗生素抗性基因的丰度，执行耐药基因组分析。对所选择的抗生素抗性基因在治疗前与治疗后的频率的比较表明，与阿莫西林+SYN-004群组相比，阿莫西林与治疗后较高的抗生素抗性基因丰度相关。治疗后检测到的抗性基因中的许多抗性基因是经编码的β-内酰胺酶。值得注意的是，仅在第6天时在单独阿莫西林群组中检测到了几种TEM和OXAβ-内酰胺酶基因(图8)。在阿莫西林暴露之前未检测到这些基因。
除β-内酰胺酶外，其他抗性基因也表现出响应于抗生素暴露的频率增大。这些基因中的许多基因编码多药外排转运体系的组分，所述体系赋予对多种抗生素(包括β-内酰胺类)的抗性。选择几种基因以进行进一步分析。对于每个所选择的基因，比较单独阿莫西林或阿莫西林+SYN-004群组中从治疗前到治疗后相对基因频率的平均值的变化(图9)。单独阿莫西林群组中每个基因的相对基因频率都升高。相比之下，阿莫西林+SYN-004群组中每个基因的基因频率都降低。观察到了marA基因的最大升高，marA基因水平从治疗前到治疗后几乎翻倍，而在阿莫西林+SYN-004群组中marA水平降低了约50％。
口服阿莫西林暴露增加了犬肠道微生物组中抗生素抗性基因的丰度，而SYN-004减弱了该富集过程。在SYN-004存在下，抗生素抗性基因频率降低。值得注意的是，在阿莫西林的存在下，许多类抗生素抗性基因的频率扩大，而不仅仅是赋予β-内酰胺抗性的基因的频率扩大。这些抗生素抗性基因包括编码药物外排泵体系的组分的β-内酰胺酶基因，以及编码对大环内酯类和氨基糖苷类的抗性的基因。
实施例4：在IV碳青霉烯治疗后抗生素抗性基因的出现和增殖的减轻
在正常的两月龄猪中评价碳青霉烯酶P2A减轻因肠道微生物群暴露于碳青霉烯抗生素厄他培南而引起的抗生素抗性基因的增殖的能力。在开始给药之前使动物适应24天。使动物(n＝16，每群组8只动物)接受厄他培南(30mg/kg/剂，IV，每天一次，持续4天)+/-一粒P2A胶囊(50mg，PO，每天4次)。P2A在抗生素治疗前一天开始，并在第5天早晨继续一次最终剂量。在抗生素给药前和第5天最后一剂P2A后收集粪便样品。在第3天在3次厄他培南剂量后采血。在3个时间点，即厄他培南后1小时、2小时和3小时进行采血。使用经验证的液相色谱(LC)方法和串联质谱检测(LC/MS/MS)来测量厄他培南血清水平。从粪便样品中分离DNA，并使其进行全基因组鸟枪测序和宏基因组学分析。
预计两个群组单独厄他培南或厄他培南+P2A中的厄他培南血清水平没有不同。对从粪便样品中分离的DNA进行全基因组鸟枪测序，并使用CosmosID,Inc.的生物信息学软件包进行分析。分析包括鉴定粪便微生物组中存在的微生物群物种，并基于每个基因的基因覆盖百分比来鉴定抗生素抗性基因，并通过测定每个样品中每个基因的频率(％)进行定量。
预计包括主坐标分析、热图分析和/或其他宏基因组学分析在内的微生物组分析将证明，单独厄他培南通过改变微生物群组成而导致对微生物组的破坏。相比之下，厄他培南+P2A保护微生物组并减轻微生物组破坏。
预计包括热图分析、主坐标分析和/或其他基因分析在内的耐药基因组分析将证明，单独厄他培南会导致广泛的抗生素抗性基因增殖和出现。相比之下，在P2A存在下抗生素抗性基因的出现和增殖被减轻。
预计这些数据表明，IV厄他培南破坏了胃肠道中的微生物群群体，而P2A减轻IV厄他培南引起的损伤并保护肠道微生物组。此外，预计耐药基因组分析表明，厄他培南引起广泛的抗生素抗性基因的出现，包括那些赋予对碳青霉烯类和其他β-内酰胺抗生素抗性的基因，以及其他赋予对其他抗生素类别的抗性的基因，并且P2A减轻抗生素抗性基因的出现和增殖。
定义
如本文所用，“一(a/an)”或“该(the)”可以表示一个或多于一个。
此外，当与提及的数字指示结合使用时，术语“约”表示提及的数字指示加或减该提及的数字指示的至多10％。例如，语言“约50％”涵盖45％至55％的范围。
当与医学用途结合使用时，“有效量”是有效提供可测量的治疗、预防或降低目标病症的发病率的量。
如本文所用，如果在试剂或刺激物存在下，活性和/或效应的读数相对于不存在这种调节降低了显著量，诸如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多，至多至且包括至少约100％，则某些物质“降低”。如本领域普通技术人员将理解的，在一些实施方案中，活性降低并且一些下游读数将降低，而其他读数可升高。
相反，如果在试剂或刺激物存在下，活性和/或效应的读数相对于不存在这种调节升高例如至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％或更多，至多至且包括至少约100％或更多、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍，则活性“升高”。
如本文所述，除非另有说明，否则所有组成百分比均以总组合物的重量计。如本文所用，词语“包括(包含)”，以及它们的变体旨在是非限制性的，使得列表中的项目的叙述不排除其他类似项目可能也可用于本技术的组合物和方法中。类似地，术语“可以”和“可”以及它们的变体旨在是非限制性的，使得叙述实施方案可以或可包括某些要素或特征不排除不包含本技术的其他实施方案不含有这些要素或特征。
尽管本文使用开放式术语“包括(包含)”作为诸如包含(包括)、含有或具有的术语的同义词来描述和要求保护本发明，但是本发明或其实施方案可以替代地使用诸如“由...组成”或“基本上由......组成”的替代术语来描述。
如本文所用，词语“优选的”和“优选地”是指在某些情况下提供某些益处的技术的实施方案。然而，在相同或其他情况下，其他实施方案也可以是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的描述并非暗示其他实施方案是无用的，并且并非旨在将其他实施方案排除在本技术的范围之外。
为实现治疗效果所需的本文所述组合物的量可根据用于特定目的的常规程序而凭经验确定。通常，为了施用治疗剂(例如，β-内酰胺酶和/或本文所述的附加治疗剂)以用于治疗目的，以药理学有效剂量来给予治疗剂。“药理学有效量”、“药理学有效剂量”、“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生所需生理效果的量或能够实现所需结果的量，特别是对于治疗病症或疾病。如本文所用的有效量将包括足以例如延迟病症或疾病的症状的发展、改变病症或疾病的症状的病程(例如，减缓疾病症状的进展)、减少或消除病症或疾病的一种或多种症状或表现，以及逆转病症或疾病的症状的量。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，而无论是否实现改善。
有效量、毒性和治疗功效可通过以下方式来测定：对细胞培养物、组织样品、组织匀浆或实验动物进行标准药学程序，例如以测定LD50(对群体的约50％致死的剂量)和ED50(对群体约50％治疗有效的剂量)。剂量可根据采用的剂型和所利用的施用途径而变化。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数，并且可以表示为比率LD50/ED50。在一些实施方案中，表现出大治疗指数的组合物和方法为优选的。最初可以根据体外测定估计治疗有效剂量，体外测定包括例如细胞培养测定。此外，可以在动物模型中配制剂量以实现包括在细胞培养物中或在合适的动物模型中测定的IC50的循环血浆浓度范围。所述血浆中组合物的水平可以例如通过高效液相色谱法来测量。可以通过合适的生物测定来监测任何特定剂量的影响。剂量可由医生确定，并根据需要调节以适配观察到的治疗效果。
在某些实施方案中，效果将导致至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约50％、至少约70％或至少约90％的可定量变化。在一些实施方案中，效果将导致约10％、约20％、约30％、约50％、约70％，或甚至约90％或更大的可定量变化。治疗益处还包括停止或减缓潜在疾病或病症的进展，而无论是否实现改善。
如本文所用，“治疗方法”同样适用于组合物用于治疗本文所述疾病或病症的用途，和/或于一种和/或多种组合物用于制备用于治疗本文所述疾病或病症的药物的用途。
等同物
虽然已经结合本发明的具体实施方案描述了本发明，但是应该理解，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖本发明的任何变型、使用或改编，所述任何变型、使用或改编一般地遵循本发明原理，并且包括在本发明所属领域内的已知或惯常实践范围内并且可以应用于上文所述的基本特征并且如下在所附权利要求的范围内所述的相对于本公开的此类偏离。
仅通过使用常规实验，本领域技术人员将认识到或能够确定本文具体描述的具体实施方案的许多等同物。这些等同物旨在包含在以下权利要求的范围内。
以引用方式并入
本文引用的所有专利和出版物均全部内容据此以引用方式并入。
本文论述的出版物仅仅是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认由于在先发明而使本发明无权先于这些出版物。
如在此所使用的，所有标题仅用于组织，并不旨在以任何方式限制本公开。任何单个小节的内容可能等同地适用于所有小节。
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以下参考文献由此全文以引用方式并入
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<210> 1
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成序列
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Lys Leu Gly Ile Phe Ala Leu Asp Thr Gly Thr Asn Arg Thr Val Ala
20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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Leu Gly Asp Leu Gln Thr Ile Thr Ser Leu Lys Phe Gly Asn Thr Lys
115 120 125
Val Glu Thr Phe Tyr Pro Gly Lys Gly His Thr Glu Asp Asn Ile Val
130 135 140
Val Trp Leu Pro Gln Tyr Gln Ile Leu Ala Gly Gly Cys Leu Val Lys
145 150 155 160
Ser Ala Glu Ala Lys Asp Leu Gly Asn Val Ala Asp Ala Tyr Val Asn
165 170 175
Glu Trp Ser Thr Ser Ile Glu Asn Val Leu Lys Arg Tyr Gly Asn Ile
180 185 190
Asn Ser Val Val Pro Gly His Gly Glu Val Gly Asp Lys Gly Leu Leu
195 200 205
Leu His Thr Leu Asp Leu Leu Lys
210 215

Claims (30)

1.一种用于治疗或预防被确定为对抗生素具有抗性的患者的感染的方法，所述方法包括在所述抗生素或不同抗生素之前或同时，施用有效量的具有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列的β-内酰胺酶。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述患者对所述抗生素具有抗性，并且所述β-内酰胺酶提供对同一抗生素的治疗响应。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述患者对所述抗生素具有抗性，并且所述β-内酰胺酶提供对所述不同抗生素的治疗响应。
4.如权利要求1所述的方法，其中使用抗微生物易感性测试(AST)来检测所述对抗生素的抗性。
5.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中使用一种或多种测序方法来测定所述对抗生素的抗性。
6.如权利要求5所述的方法，其中通过检测与来自所述患者的生物样品中的抗性相关联的一种或多种基因的存在、不存在或水平来测定所述对抗生素的抗性。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述生物样品是粪便。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述生物样品是胃肠道液的抽吸物。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述与抗生素抗性相关的一种或多种基因是表A中列出的一种或多种基因。
10.如权利要求7所述的方法，其中与抗生素抗性相关的一种或多种基因是以下项中的一者或多者：acrE、acrF、acrS、AmpC、baeR、cfxA、cpxR、ermY、marA、mdtD、mdtN、mdtK、pbp2、pbp4以及VanRD/VanSD。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述与抗生素抗性相关的一种或多种基因是表A中列出的一种或多种基因
12.如权利要求8所述的方法，其中所述与抗生素抗性相关的一种或多种基因是以下项中的一者或多者：acrE、acrF、acrS、AmpC、baeR、cfxA、cpxR、ermY、marA、mdtD、mdtN、mdtK、pbp2、pbp4以及VanRD/VanSD。
13.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶具有与SEQ ID NO:1具有至少97％同一性的氨基酸序列。
14.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶具有与SEQ ID NO:1具有至少98％同一性的氨基酸序列。
15.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶具有与SEQ ID NO:1具有至少99％同一性的氨基酸序列。
16.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述β-内酰胺酶具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
17.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗生素选自β-内酰胺类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、四环素类、利福霉素类、大环内酯类、酮内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类、磺胺类、噁唑烷酮类以及喹诺酮类。
18.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述不同抗生素选自β-内酰胺类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、四环素类、利福霉素类、大环内酯类、酮内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类、磺胺类、噁唑烷酮类以及喹诺酮类。
19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述抗生素或不同抗生素是选自以下的β-内酰胺抗生素：青霉素、头孢菌素、棒烷类、氧青霉烷类、头霉素类以及碳青霉烯类。
20.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗生素是万古霉素。
21.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述感染是艰难梭菌感染(CDI)和/或艰难梭菌相关疾病。
22.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述感染是万古霉素抗性肠球菌(VRE)的过度生长。
23.一种用于治疗或预防患者感染的方法，所述方法包括：
(a)通过测定相对于对照样品，与抗生素抗性相关的一种或多种基因的水平，来筛选所述患者对一种或多种抗生素的抗性；以及
(b)在一种或多种抗生素之前或同时，向被筛选出的对所述一种或多种抗生素具有抗性的患者施用有效量的具有与SEQ ID NO:1具有至少95％同一性的氨基酸序列的β-内酰胺酶。
24.如权利要求23所述的方法，其中与抗生素抗性相关的一种或多种基因是表A中列出的一种或多种基因
25.如权利要求23所述的方法，其中所述与抗生素抗性相关的一种或多种基因是以下项中的一者或多者：acrE、acrF、acrS、AmpC、baeR、cfxA、cpxR、ermY、marA、mdtD、mdtN、mdtK、pbp2、pbp4以及VanRD/VanSD。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述抗生素选自β-内酰胺类、碳青霉烯类、单环内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、氨基糖苷类、四环素类、利福霉素类、大环内酯类、酮内酯类、林可酰胺类、链阳菌素类、磺胺类、噁唑烷酮类以及喹诺酮类。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述抗生素是选自以下的β-内酰胺抗生素：青霉素、头孢菌素、棒烷类、氧青霉烷类、头霉素类以及碳青霉烯类。
28.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述抗生素是万古霉素。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述感染是艰难梭菌感染(CDI)和/或艰难梭菌相关疾病。
30.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述感染是万古霉素抗性肠球菌(VRE)的过度生长。
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