JP7235270B2

JP7235270B2 - 血糖値上昇抑制剤及び同血糖値上昇抑制剤の製造方法

Info

Publication number: JP7235270B2
Application number: JP2018021612A
Authority: JP
Inventors: 穣滝澤; 稜田中; 香寿美島田
Original assignee: ACE BIO PRODUCT CO., LTD.
Current assignee: ACE BIO PRODUCT CO., LTD.
Priority date: 2018-02-09
Filing date: 2018-02-09
Publication date: 2023-03-08
Anticipated expiration: 2038-02-09
Also published as: JP2019137631A

Description

本発明は、血糖値上昇抑制剤に関する。

高血糖症は、糖尿病のタイプや進行度に応じて違いはあるものの、通常、インスリン濃度低下や細胞レベルでのインスリン耐性によって引き起こされる。

インスリンによる血糖の制御ができず生体が高濃度のグルコースにさらされるとタンパク質修飾のために糖毒性が生じ、これが長く続くと糖尿病性神経障害や糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症などが発症することとなる。

従って、これら糖尿病合併症の発症を防止するために、血糖をコントロールする薬剤が種々提案されている。

例えば、α-グルコシダーゼ阻害剤は、2型糖尿病の高血糖、特に食後高血糖をコントロールするために使用される。α-グルコシダーゼ阻害剤は、食事等で摂取された炭水化物のグルコースへの分解を抑制し、グルコースの吸収量を減少させて血糖値の急激な上昇を抑える働きをする。

従って、消化酵素の競合的阻害剤という性質上、最大の効果が出るように食事の開始時に服用する必要があるが、その反面、空腹時には血糖値の抑制効果は期待できないという問題があった。

そこで、α－グルコシダーゼ阻害剤の血糖降下作用を効果的に増強させる血糖降下作用増強剤として、乳酸菌や酪酸菌を使用し、α－グルコシダーゼ阻害剤と乳酸菌等の菌との特異的な相乗効果を生起せしめて、絶食下においても血糖値降下作用を発現させるようにした血糖降下作用増強剤が提案されている（例えば、特許文献１参照。）。

特開２０１４－１４１５２６号公報

ところが、上記血糖降下作用増強剤は、α－グルコシダーゼ阻害剤の共存下にて相乗的に効果を発揮するものであり、α－グルコシダーゼ阻害剤の非存在下で効果を発揮するものとは考えられていなかった。

しかしながら、本発明者らは鋭意研究を行った結果、酪酸菌の発酵液にはα－グルコシダーゼ阻害剤の有無に拘わらず、血糖降下作用を有することを見出した。

本発明は、斯かる事情に鑑みてなされたものであって、α－グルコシダーゼ阻害剤の非存在下においても、血糖降下作用を発揮可能な血糖値上昇抑制剤を提供する。

上記従来の課題を解決するために、本発明に係る血糖値上昇抑制剤では、（１）酪酸菌C.butyricum（ただし、ボツリヌス毒素を産生する菌株を除く。）がGAM培地にて予め培養された１容量部のスターターを、2w/v％のコーンスターチと0.056w/v％のアミノ酸液と0.4w/v％の炭酸カルシウムを含む５容量部の滅菌済培養液に接種し、25～40℃にて18～48時間に亘り嫌気条件下でｐＨが5.2～4.5に至るまで培養して得られた発酵液からなり、前記発酵液は、前記酪酸菌が実質的に除去された上清画分であり、高血糖状態の動物に対し、同動物の体重１kgあたり0.3～1.0mlの量の前記発酵液を毎日継続的に飲用させて血糖値の正常化を行うための血糖値上昇抑制剤の製造方法とした。

本発明に係る血糖値上昇抑制剤によれば、酪酸菌C.butyricum（ただし、ボツリヌス毒素を産生する菌株を除く。）がGAM培地にて予め培養された１容量部のスターターを、2w/v％のコーンスターチと0.056w/v％のアミノ酸液と0.4w/v％の炭酸カルシウムを含む５容量部の滅菌済培養液に接種し、25～40℃にて18～48時間に亘り嫌気条件下でｐＨが5.2～4.5に至るまで培養して得られた発酵液からなり、前記発酵液は、前記酪酸菌が実質的に除去された上清画分であり、高血糖状態の動物に対し、同動物の体重１kgあたり0.3～1.0mlの量の前記発酵液を毎日継続的に飲用させて血糖値の正常化を行うための血糖値上昇抑制剤の製造方法としたため、α－グルコシダーゼ阻害剤の非存在下においても、血糖降下作用を発揮可能な血糖値上昇抑制剤や、血糖値上昇抑制剤の製造方法を提供することができる。

また、前記発酵液は、前記酪酸菌が実質的に除去された上清画分であることとすれば、液状で清澄な血糖値上昇抑制剤を提供することができる。

また、高血糖状態の動物に対し、同動物の体重１kgあたり0.1～1.0mlの量の前記培養液を毎日継続的に飲用させて血糖値の正常化を行うための血糖値上昇抑制剤とすれば、飲用させた高血糖状態の動物においてより堅実かつ顕著な血糖値抑制効果を生起させることができる。

本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤の効果を示す説明図である。本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤の効果を示す説明図である。本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤の効果を示す説明図である。本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤の効果を示す説明図である。

本発明は、α－グルコシダーゼ阻害剤の非存在下においても、血糖降下作用を発揮可能な血糖値上昇抑制剤を提供するものであり、特に、酪酸菌（C.butyricum）の発酵液からなることを特徴とするものである。

ここで酪酸菌は、Clostridium butyricumに属する菌であれば特に限定されるものではないが、その他にも例えば、C. beijerinckinnや、C.sardinieniense、C.paraputrificum等を使用することができる。

また、発酵液は、所定の培養液に前述の酪酸菌を植菌して培養することで得られる液である。

培養液は発酵前後において経口摂取可能な組成を有するものであれば特に限定されるものではなく、医用や食用、飼料用の酪酸菌を培養するための公知の培地を利用することができる。

酪酸菌の培養もまた特に限定されるものではなく、公知の方法を採用することができる。一例を挙げるならば、25～40℃にて18～48時間、嫌気条件下での培養とすることができる。

発酵液は、酪酸菌が産生した酪酸によりｐＨが5.2～4.5程度に至った液が望ましい。ｐＨが5.3よりも高いと未だ十分に発酵代謝産物が培地中へ分泌されていない場合があるため好ましくなく、ｐＨが4.3よりも低いと乳酸産生のおそれがあり好ましくない。

得られた発酵液は、酪酸菌体が含まれている状態で血糖値上昇抑制剤として使用しても良く、また、酪酸菌体を除いた上で血糖値上昇抑制剤として使用しても良い。

発酵液に酪酸菌体が含まれている状態で血糖値上昇抑制剤として利用した場合には、酪酸菌体に由来する整腸作用や腸内活性化作用を生起させることができ、血糖値上昇抑制剤として更なる付加価値が備えられることとなる。

また、発酵液から酪酸菌体を除いた上で血糖値上昇抑制剤として利用した場合には、液状で清澄な血糖値上昇抑制剤とすることができる。なお、酪酸菌の除去はフィルタにて濾別することで行っても良く、また遠沈法により菌体を沈降させることで行っても良い。

また、酪酸菌による発酵前の培養液には、酪酸菌の発酵に必須の成分以外の補助成分を添加するようにしても良い。このような補助成分としては、例えば牛乳や豆乳、朝鮮人参、芋類、バナナ、玄米を挙げることができ、また、これらを２種以上添加することもできる。

またこれらの補助成分は、原形を留めた状態で添加しても良いが、酪酸菌による資化を促進させたり所定の代謝産物を効率良く産生させるために、粉砕したりペースト状とするのが望ましい。

そして、上述の如く酪酸菌による発酵により得られた発酵液は、動物に飲用させることで、血糖値上昇抑制剤として機能することとなる。

特に、投与対象となる動物が高血糖状態である場合、同動物の体重１kgあたり0.1～1.0mlの量の前記培養液を毎日継続的に飲用させることで、血糖値の正常化効果をより顕著に生起させることができる。

なお、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤は、薬用剤として使用可能であるのは勿論のこと、機能食品や一般食品、又はこれらを構成するための血糖値上昇抑制剤としても使用することが可能である。ただし、出願人が本願を権利化するにあたり、いずれかの態様に限定することは妨げない。

以下、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤について、実際の製造過程や試験結果等を参照しながら詳説する。

〔１．血糖値上昇抑制剤の調製〕
血糖値上昇抑制剤の調製は次の通り行った。まず、100gのコーンスターチと、2.8gのアミノ酸液と、20gの炭酸カルシウムとを計量し、10Lのコルベンに計量した各原料を投入して攪拌しつつ温水で5Lにアップして培養液を得た。培養液はその後蒸気滅菌に供し、冷却した。

次に、滅菌済みの培養液に対し、GAM培地にて予め培養した酪酸菌スタータ1Lを接種し、37℃にて培養を行った。pHが4.9に達した時点で発酵を終了し、得られた液を酪酸菌を含有する酪酸菌の発酵液からなる血糖値上昇抑制剤Ａ１とした。なお、pHが4.9となるまでの時間は18時間であった。また酪酸菌の発酵液を遠心分離に供して上清画分を得て、酪酸菌が実質的に除去された酪酸菌発酵液からなる血糖値上昇抑制剤Ａ２を得た。

〔２．ラットを用いた効果の検討〕
次に、糖尿病モデルラットを用い、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤の効果と有用性について確認を行った。

実験操作にあたっては、法令等を遵守し、「国立大学法人東京農工大学動物実験等に関する規程」（平成19年4月1日）に基づいて実施した。

使用動物はSDラット（オリエンタル酵母）、メス20匹、オス10匹、体重約300g以上（229.6-591.2g）とした。

実験群はアロキサンによる糖尿病誘発後、血糖値上昇抑制剤Ａ１を投与する1群のみとし、計30匹のラットを用いて血糖値の推移を追った。合わせて血圧と心臓超音波検査での評価を行った。動物の個体識別は個別ケージへのラベリングによって行った。この番号は画像診断時のIDとしても利用し、一貫したデータ管理を実施した。

採血は、糖尿病誘発前および誘発から1週間ごとに行った。ラットを覚醒下で血圧測定用保定具を用い不動化し、30Gの注射針と1mlのシリンジで尾静脈から採血を行った。採取した血液サンプルを速やかに実験用簡易血糖測定器（Gulucose Pilot, technicon internal Inc.）の検査ストリップに滴下し、血糖値を得た。サンプル量不足と思われるエラーや異常値の場合は、再度採血を行った。

糖尿病の誘発は、アロキサン一水和物（和光純薬工業株式会社製）を生理食塩水にて200mg/kgに調整し、腹腔内投与することで行った。血糖値が300mg/dl以上となった時点で糖尿病が誘発されたとし、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤Ａ１を30μl/100g/dayにて飲水混和を開始した。血糖値の測定結果に効果が見られない場合には、2週間ごとに2倍、3倍量へと酪酸菌の投与量を増量し、血糖値が200mg/dl以下となった時点で実験を終了とした。

ところで、人医療において、糖尿病は高血圧とも関連すると言われる。そこで、糖尿病モデルの程度を検証するために、血圧測定を行った。検査タイミングは、糖尿病誘発前後および実験終了時の採血後とした。ラットを血圧測定用保定具にて不動化し、尾部で血圧測定器（マウス・ラット用無加温型非観血式血圧計 MK-2000、室町機械株式会社）を用いて行った。安定し、波形に問題ない5回をデータとして採用した。

また得られた各数値データに関して、統計解析処理ソフト（GraphPad PRIZM、ユサコ株式会社）を用いて統計解析を行った。p値が0.05以下を有意差ありとした。

なおデータからは、アロキサンを投与した30頭のうち、投与から1週間以内に死亡した9頭、および血糖値が上がらなかった8頭を除外し、全13頭について分析を行った。

次に、本検討の結果について説明する。図１は、効果が認められたeffect群（n=6）における血糖値の変動を示している。図１からも分かるように、13頭のうち酪酸菌発酵液の効果とみられる血糖値の低下が6頭で認められた。付言すれば、アロキサン投与後（post）では、アロキサン投与前（Pre）と比較して血糖値の有意な上昇が認められ、糖尿病が確実に惹起された。この上昇した血糖値は、酪酸菌液の投与によって後（Post）および酪酸菌投与後（ABP）の間にも有意差が認められた。

また、図２に各個体の血糖値の変動を示す。図２からも分かるように、初期開始投与量の1倍量（30μl/100g/day）の酪酸菌液で効果が得られた個体は2例(No.11、No.19)であり、それ以外の個体では血糖値の減少に、2倍量（60μl/100g/day、No.4、No.7）、3倍量または（90μl/100g/day、No.22、No.27）の投与が必要であった。

また、図３に糖尿病の重症度が酪酸菌発酵液の効果に与える影響について検討を行った結果を示す。酪酸菌発酵液は効果のある個体とない個体に大きく分類された。この原因を探るために酪酸菌液の血糖値低下効果が認められた個体をeffect群（n=6）、効果が現れず死亡した個体をnon-effect群(n=7)とし、効果のあった個体とない個体において血糖値の比較を行った。その結果、アロキサン投与前の血糖値に有意差は認められず、アロキサン投与後（糖尿病誘発時）の血糖値でも有意差は認められなかったことから、酪酸菌液の効果の有無は糖尿病の重症度に依存しないことが示唆された。

次に血圧について、図４に各群のアロキサン投与前後の血圧を示す。なお、図４では、effect群はn=6の平均±標準偏差、non-effect群はn=7の平均±標準偏差で示しており、小数点以下第一位を四捨五入している。図４からも分かるように、effect群の酪酸菌投与後の結果においても有意な差は認められなかった。

これらの結果から、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤Ａ１によれば、不可逆的に膵島を破壊した場合でも、血糖値の低下だけでなくQOLの向上が酪酸菌液によって得られることが明らかとなった。また、軽度の膵炎や腸炎などの炎症性の疾患の際にも有効な補助剤となりうる可能性も示唆された。また、詳細な結果は割愛するが、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤Ａ２においても同様の血糖値上昇抑制効果が確認された。

〔３．ヒトによる効果の検証〕
次に、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤Ａ１がヒトの血糖値に対しどのような影響を及ぼすかについて検討を行った。被験者は79歳の男性であり、2016年以前より血糖等(HbA1c)に関する定期検査を実施している。今回、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤の血糖に対する知見を得るため、自主的に本製剤を60ml/日量を摂取する事で血糖指標であるHbA1cの推移を調査した。その結果を図５に示す。

図５からも分かるように、被験者が約1ヶ月の血糖値上昇抑制剤Ａ１の飲用した結果、飲用前のHbA1cの値より0.3％以上の低下傾向が確認された。

HbA1cの値は血糖値と違い、食前食後を問わず安定した血糖指標として用いられるものであり、血液中のヘモグロビンとグルコースの結合を示す値でこれらの指標を削減する事は疾病予防の観点からも大変有意義であるといえる。

上述してきたように、本実施形態に係る血糖値上昇抑制剤によれば、酪酸菌（C.butyricum）の発酵液からなることとしたため、α－グルコシダーゼ阻害剤の非存在下においても、血糖降下作用を発揮可能な血糖値上昇抑制剤を提供することができる。

最後に、上述した各実施の形態の説明は本発明の一例であり、本発明は上述の実施の形態に限定されることはない。このため、上述した各実施の形態以外であっても、本発明に係る技術的思想を逸脱しない範囲であれば、設計等に応じて種々の変更が可能であることは勿論である。

Claims

酪酸菌C.butyricum（ただし、ボツリヌス毒素を産生する菌株を除く。）がGAM培地にて予め培養された１容量部のスターターを、2w/v％のコーンスターチと0.056w/v％のアミノ酸液と0.4w/v％の炭酸カルシウムを含む５容量部の滅菌済培養液に接種し、25～40℃にて18～48時間に亘り嫌気条件下でｐＨが5.2～4.5に至るまで培養して得られた発酵液からなり、
前記発酵液は、前記酪酸菌が実質的に除去された上清画分であり、
高血糖状態の動物に対し、同動物の体重１kgあたり0.3～1.0mlの量の前記発酵液を毎日継続的に飲用させて血糖値の正常化を行うための血糖値上昇抑制剤の製造方法。