JP7229474B2

JP7229474B2 - 半流動性選択培地

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Publication number: JP7229474B2
Application number: JP2018219624A
Authority: JP
Inventors: 剛山本; 真実池町; 北川真喜
Original assignee: KOBE CITY HOSPITAL ORGANIZATION; Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd
Current assignee: KOBE CITY HOSPITAL ORGANIZATION; Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co Ltd
Priority date: 2018-11-22
Filing date: 2018-11-22
Publication date: 2023-02-28
Anticipated expiration: 2038-11-22
Also published as: JP2020080714A

Description

特許法第３０条第２項適用１．「第２９回日本臨床微生物学会総会・学術集会プログラム・抄録集（日本臨床微生物学雑誌第２８巻Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ１）」、第４３２頁、０３－１９２、一般社団法人日本臨床微生物学会発行日：平成２９年１２月２５日

特許法第３０条第２項適用２．「第２９回日本臨床微生物学会総会・学術集会」開催日：平成３０年２月１１日開催場所：岐阜県岐阜市長良福光２６９５－２長良川国際会議場岐阜県岐阜市長良福光２６９５－２岐阜都ホテル

特許法第３０条第２項適用３．「第６７回日本感染症学会東日本地方会学術集会・第６５回日本化学療法学会東日本支部総会合同学会２０１８プログラム・抄録集」、第９１頁、Ｓ１０－２発行日：平成３０年１０月

特許法第３０条第２項適用４．「第６７回日本感染症学会東日本地方会学術集会・第６５回日本化学療法学会東日本支部総会合同学会２０１８」開催日：平成３０年１０月２６日開催場所：東京都文京区後楽１－３－６１東京ドームホテル

本発明は、薬剤耐性菌スクリーニング培地に関する。さらに詳細には、第三世代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌（Enterobacteriaceae）、特に基質特異的拡張型β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌を検出するための培地に関する。本発明は、さらに、これらの培地を使用する薬剤耐性菌の検出方法に関する。

薬剤耐性菌は、臨床的に重要な問題であり、病院内での拡散を防ぐため、微生物検査において、迅速かつ正確に検出することが求められている。耐性菌の判定は、耐性遺伝子の検出によるものが最も正確であるものの、実施できる機関は限定的である。そのため、現状では一般に、薬剤耐性菌は、菌の分離後、同定及び薬剤感受性検査を実施することにより、感受性成績から判定される。感受性成績によって判定できない菌については、さらに確認試験を実施することにより、耐性菌が判定される。

薬剤感受性成績によって判定可能な耐性菌としては、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、多剤耐性緑膿菌（ＭＤＲＰ）、ペニシリン耐性肺炎球菌（ＰＲＳＰ／ＰＩＳＰ）、多剤耐性アシネトバクター属菌（ＭＤＲＡ）、カルバペネム耐性腸内細菌科細菌（ＣＲＥ）、カルバペネム耐性緑膿菌、カルバペネム耐性セラチア、第三世代セファロスポリン耐性肺炎桿菌、第三世代セファロスポリン耐性大腸菌、フルオロキノロン耐性大腸菌、キノロン耐性淋菌（ＱＲＮＧ）などがある。

薬剤感受性成績のみでは判定できず、確認試験が必要となる耐性菌としては、ＥＳＢＬ産生菌、メタロ－β－ラクタマーゼ（ＭＢＬ）産生菌、β－ラクタマーゼ非産生アンピシリン耐性（ＢＬＮＡＲ）インフルエンザ菌などがある。これらについては、施設により検出可能な耐性菌が異なる。

これらの病原菌などの検出率を向上させるために、菌を分離する際、いくつかの耐性菌を対象とした薬剤耐性菌スクリーニング培地が使用されている。

腸内細菌用選択培地として、ＤＨＬ（Deoxycholate-Hydrogen Sulfide-Lactose）寒天培地が知られている。この培地は、サルモネラ（Salmonella）及びシゲラ（Shigella）を分離するために考案された培地である。エンテロバクター（Enterobacter）、ハフニア（Hafnia）、プロテウス（Proteus）、乳糖非発酵性大腸菌などの乳糖及び白糖を分解する菌がＤＨＬ培地で増殖すると、酸化によりｐＨが低下し、ｐＨ指示薬であるニュートラルレッドにより集落が赤色となる。一方、サルモネラやシトロバクター（Citorobacter）などの硫化水素産生菌は、培地中のチオ硫酸ナトリウム及びクエン酸鉄アンモニウムにより、黒色集落を形成する。また、シゲラは、無色透明ないし半透明の集落を形成する（非特許文献１、非特許文献２）。ＤＨＬ培地による培養では、ＥＳＢＬ産生の有無を判定することはできない。

血液培養陽性検体から分離される起因菌の約３０％、尿路感染検体から分離される起因菌の約５０％は腸内細菌科細菌である。これらの細菌による感染症は、高齢者などのコンプロマイズドホストに重篤な状態を引き起こす可能性が極めて高いことから、短時間で薬剤耐性菌、特にＥＳＢＬ産生菌など第三世代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌の検出及び判定を行い、最適な治療薬を選択することは非常に重要である。また、薬剤耐性（ＡＭＲ）対策の一環として不適切な抗菌薬の使用を抑制する視点から、細菌検査室を持たない病院においても容易に実施できる第三世代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌の検出及び判定が望まれている。

特開２０００－３１６５９７号公報特開２０１２－９５６７８号公報

新細菌培地学講座、下II（第二版）、125～127頁、近代出版（１９８６年１１月１０日）栄研マニュアル（第１１版）、75～76頁、栄研化学株式会社（２０１１年１月）

本発明は、薬剤耐性細菌の迅速な検出及び判定を可能にする手段及び方法を提供することを目的とする。特に、薬剤耐性グラム陰性桿菌、中でも最も重要であるβ-ラクタマーゼ系薬耐性菌などの第三世代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌をスクリーニングする手段及び方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明者らは鋭意検討した結果、ＤＨＬ寒天培地の組成を改変し、ニュートラルレッドの代わりにフェノールレッドを含有させ、胆汁酸及び白糖を添加していない半流動性培地とすることにより、上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明によれば、
〔１〕ＤＨＬ寒天培地に基づく選択培地であって、フェノールレッドを含有し、ニュートラルレッド、胆汁酸及び白糖を添加していない半流動性の選択培地；
〔２〕肉エキス、ペプトン、乳糖、胆汁酸、チオ硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、フェノールレッド、水及び寒天を含有する半流動性の選択培地；
〔３〕培地１０００mL中に、ペプトン１０～３０ｇ（２０ｇ±１０ｇ）、肉エキス３～１０ｇ、乳糖５～１５ｇ（１０ｇ±５ｇ）、チオ硫酸ナトリウム１～５ｇ、クエン酸ナトリウム１～５ｇ、クエン酸鉄アンモニウム１～５ｇ、フェノールレッド１０～５０ｍｇ、寒天１．０～３．５ｇを含有する、前記〔１〕又は〔２〕記載の選択培地；
〔４〕バンコマイシン、クリスタルバイオレット、及び／又はセフポドキシムをさらに含有する、前記〔１〕～〔３〕のいずれか１項記載の選択培地；
〔５〕前記〔１〕～〔４〕のいずれか１項記載の培地に、生体由来検体を接種して培養した後、前記培地の色調を観察することを含む、腸内細菌又はブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の検出又は判定方法
が提供される。

本発明によれば、血液培養又は尿などの検体を用いて、４～６時間程度で腸内細菌、特に第三世代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌、又はシュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）などのブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌を検出することが可能となり、より早期での適切な治療薬の選択を可能にすることができる。本発明の培地及び方法によれば、ピペットを使わずに綿棒で接種することも可能であるため、中小の病院や療養型病院などの、細菌検査室の無い施設においても迅速に所定の菌の検出又は判定が可能になる。

図１は、菌の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。パネルＡ～Ｈにおいて、接種した菌は、左から順に、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３、大腸菌（Escherichia coli）臨床分離株Ｋ４、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabillis）臨床分離株Ｂ３０であり、パネルＡ～Ｄはマクファーランド（Mcfarland；「ＭｃＦ」と略称することがある）０．５、パネルＥ～Ｈはマクファーランド３．０の菌液をそれぞれ使用した。図２は、菌の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。パネルＡ～Ｈにおいて、接種した菌は、左から順に、大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ１３８８３、エンテロバクター・クロアカ（Enterobacter cloacae）ＡＴＣＣ２３３５５、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）ＡＴＣＣ１３０４８であり、パネルＡ～Ｄはマクファーランド０．５、パネルＥ～Ｈはマクファーランド３．０の菌液をそれぞれ使用した。図３は、菌の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。パネルＡ～Ｈにおいて、接種した菌は、左から順に、セラチア・マルセスセンス（Serratia marcescens）ＡＴＣＣ８１００、モルガネラ・モルガニー（Morganella morganii）ＡＴＣＣ２５８３０、シュードモナス・エルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）ＡＴＣＣ１９６０６であり、パネルＡ～Ｄはマクファーランド０．５、パネルＥ～Ｈはマクファーランド３．０の菌液をそれぞれ使用した。図４は、菌の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。パネルＡ～Ｈにおいて、接種した菌は、左から順に、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）ＡＴＣＣ２９２１２、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）ＡＴＣＣ４３３００であり、パネルＡ～Ｄはマクファーランド０．５、パネルＥ～Ｈはマクファーランド３．０の菌液をそれぞれ使用した。図５は、菌名の確認実験の結果を示す写真である。パネルＡは、ＥＳＢＬ産生菌である大腸菌臨床分離株の４時間培養後のチューブ（左）と、そのスポットインドール試験の結果（右）を示す。パネルＢは、シュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３の４時間培養後のチューブ（左）と、そのオキシダーゼ試験の結果（右）を示す。図６は、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、菌の濃度は、左から順に、マクファーランド０．５（未希釈）、１０^－１倍希釈、１０^－２倍希釈、１０^－３倍希釈、１０^－４倍希釈、１０^－５倍希釈であり、これらの菌液、又はそれを含浸させた綿棒（ＦＬＯＱＳｗａｂｓ又はメンディップ）を使用して接種した。図７は、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３の接種菌数を調べた羊血液寒天培地の写真である。菌の濃度は、パネルＡ＝マクファーランド０．５（未希釈）、パネルＢ＝１０^－１倍希釈、パネルＣ＝１０^－２倍希釈、パネルＤ＝１０^－３倍希釈、パネルＥ＝１０^－４倍希釈、パネルＦ＝１０^－５倍希釈である。図８は、大腸菌（E. coli）臨床分離株Ｋ４の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、菌の濃度は、左から順に、マクファーランド０．５（未希釈）、１０^－１倍希釈、１０^－２倍希釈、１０^－３倍希釈、１０^－４倍希釈、１０^－５倍希釈であり、これらの菌液、又はそれを含浸させた綿棒（ＦＬＯＱＳｗａｂｓ又はメンディップ）を使用して接種した。図９は、大腸菌（E. coli）臨床分離株Ｋ４の接種菌数を調べた羊血液寒天培地の写真である。菌の濃度は、パネルＡ＝マクファーランド０．５（未希釈）、パネルＢ＝１０^－１倍希釈、パネルＣ＝１０^－２倍希釈、パネルＤ＝１０^－３倍希釈、パネルＥ＝１０^－４倍希釈、パネルＦ＝１０^－５倍希釈である。図１０は、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）臨床分離株Ｂ３０の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、菌の濃度は、左から順に、マクファーランド０．５（未希釈）、１０^－１倍希釈、１０^－２倍希釈、１０^－３倍希釈、１０^－４倍希釈、１０^－５倍希釈であり、これらの菌液、又はそれを含浸させた綿棒（ＦＬＯＱＳｗａｂｓ又はメンディップ）を使用して接種した。図１１は、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）臨床分離株Ｂ３０の接種菌数を調べた羊血液寒天培地の写真である。菌の濃度は、パネルＡ＝マクファーランド０．５（未希釈）、パネルＢ＝１０^－１倍希釈、パネルＣ＝１０^－２倍希釈、パネルＤ＝１０^－３倍希釈、パネルＥ＝１０^－４倍希釈、パネルＦ＝１０^－５倍希釈である。図１２は、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ１３８８３、大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２、プロテウス・ミラビリス（P. mirabillis）ＡＴＣＣ４３０７１の接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、左から順に、菌液（マクファーランド１．０）、菌液を含浸させた綿棒（ＦＬＯＱＳｗａｂｓ）、菌液を含浸させた綿棒（メンディップ）を使用して接種した。図１３は、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３の血液培養陽性ボトル培養液（上段）、血液培養陽性ボトル培養液の１０倍希釈液（中段）又は血液培養陽性ボトル培養液の遠心上清を接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、左は菌液、右は菌液を含浸させた綿棒（メンディップ）を使用して接種した。図１４は、大腸菌（E. coli）臨床分離株Ｋ４の血液培養陽性ボトル培養液（上段）、血液培養陽性ボトル培養液の１０倍希釈液（中段）又は血液培養陽性ボトル培養液の遠心上清を接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、左は菌液、右は菌液を含浸させた綿棒（メンディップ）を使用して接種した。図１５は、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）臨床分離株Ｂ３０の血液培養陽性ボトル培養液（上段）、血液培養陽性ボトル培養液の１０倍希釈液（中段）又は血液培養陽性ボトル培養液の遠心上清を接種後の本発明の半流動培地の色調の経時的な変化を調べた実験の結果を示す写真である。各パネルにおいて、左は菌液、右は菌液を含浸させた綿棒（メンディップ）を使用して接種した。図１６は、遺伝子型の異なる耐性菌を２４時間培養後の本発明の半流動培地の色調の変化を調べた実験の結果を示す写真である。左から順に、１：大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２、２：大腸菌（E. coli）ａｍｐＣ＋ＣＴＸ－Ｍ、３：クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＩＭＰ－１、４：クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＣＭＹ－２、５：クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＯＸＡ－４８、６：大腸菌（E. coli）ＡｍｐＣ、７：セラチア・マルセスセンス（S. marcescens）ＩＭＰ－１、８：大腸菌（E. coli）ＳＨＶＥＳＢＬ、９：クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＫＰＣ－２、１０：クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＥＳＢＬ＋ＡｍｐＣである。図１７は、グラム陰性桿菌が検出された血液培養液（右パネル）又は尿（左パネル）を使用して時間別累積陽性率、ならびに感度及び特異度を算出した実験の結果を示す図である。

本発明の培地はＤＨＬ寒天培地を改変したものである。ＤＨＬ寒天培地の組成は、若干の変動があり得るが、一般に、下記のような組成を有する。

ペプトン２０．０ｇ
胆汁酸塩１．０ｇ
肉エキス５．０ｇ
クエン酸ナトリウム１．０ｇ
チオ硫酸ナトリウム２．０ｇ
クエン酸鉄アンモニウム１．０ｇ
乳糖１０．０ｇ
白糖１０．０ｇ
ニュートラルレッド０．０３ｇ
寒天１５．０ｇ
（ｐＨ７．０±０．１）

本発明の培地は、以下の点でＤＨＬ寒天培地と相違する。
（１）本発明の培地は半流動性である。したがって、ＤＨＬ寒天培地と比較して、寒天含有量が低い。これにより、菌の増殖が促進され、短時間での検出又は判定が可能になるうえ、運動性を確認することが可能になる。
（２）ＤＨＬ寒天培地ではpH指示薬としてニュートラルレッドが使用されるのに対し、本発明の培地においてはフェノールレッドが使用される。これにより、培地色が赤色から黄色に変化することで糖分解が検出される。
（３）本発明の培地には白糖が添加されていない。これにより、乳糖分解菌（腸内細菌）の判別が可能となる。
（４）本発明の培地には胆汁酸塩が添加されていない。腸内細菌の増殖への影響を考慮したものである。本発明の培地においては、胆汁酸塩の代わりに、グラム陽性菌の抑制のためバンコマイシン（ＶＣＭ）及び／又はクリスタルバイオレット（ＣＶ）を使用することができる。

したがって、本発明の培地は、ペプトン、肉エキス、乳糖、チオ硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、フェノールレッド、水及び寒天を含有する。各成分の含有量は、基本的にはＤＨＬ寒天培地と同様であるが、培地１０００ｍＬ中に、ペプトン１０～３０ｇ（２０ｇ±１０ｇ）、肉エキス３～１０ｇ、乳糖５～１５ｇ（１０ｇ±５ｇ）、チオ硫酸ナトリウム１～５ｇ、クエン酸ナトリウム１～５ｇ、クエン酸鉄アンモニウム１～５ｇ、フェノールレッド１０～５０ｍｇ、寒天１．０～３．５ｇの範囲であることができる。

肉エキスは、一般に細菌又は細胞培地に使用されるものであればよく、魚類（たとえばカツオ、マグロなど）抽出物及び／又は動物肉抽出物の粉体などであることができる。ペプトンは、カゼインペプトン、カゼイン－酸水解物、獣肉ペプトン、植物性ペプトンなどがあるが、いずれであってもよい。好ましくは、カゼインペプトンである。

本発明の培地には、適切な選択剤を添加することができる。選択剤としては、バンコマイシン（ＶＣＭ）、クリスタルバイオレット（ＣＶ）、セフポドキシム（ＣＰＤＸ）などの第三世代セファロスポリン系薬などの一種又は二種以上を適宜使用することができるが、第三世代セファロスポリン系薬が好ましく、セフポドキシム（ＣＰＤＸ）が特に好ましい。これらの濃度は、４～２４ｍｇ／Ｌが好ましい。

本発明の培地は、当業者に公知の培地調製の一般的な方法で製造することができる。たとえば、各成分に水を加え、加温溶解後、１２１℃で１５分間滅菌した後、試験管などの所望の容器に分注して固まらせる。高層培地が好ましい。

本発明の培地は、典型的には、検体を培地に接種し、培養し、判定することにより使用することができる。

検体としては、細菌を含む可能性のある生体由来試料であればよく、特に限定されない。検体は、患者から採取したもの自体でもよく、それを培養したものであってもよい。具体的な例として、たとえば検体として血液培養を使用する場合、培養液遠心上清（たとえば、血液培養ボトルから抜き取った培養液を１，５００rpmで１５分間遠心分離した後の上清）、培養液１０倍希釈液（たとえば、血液培養ボトルから抜き取った培養液を生理食塩水で１０倍希釈したもの）、又は培養液（たとえば、血液培養ボトルから抜き取った培養液）のいずれかを、たとえば１００μＬ程度採取して接種に使用することができる。また、検体として尿を使用する場合は、原尿をそのまま、たとえば１００μＬ程度採取して接種に使用することができる。あるいは、原尿に浸した綿棒を培地に挿入し、試験管の長さで軸を折って培養することができる。

検体は、上記のとおり、検体の特性や採取方法に応じて、培地にピペットやスポイトで注入したり、刺し込むなど、任意の接種方法により培地に接種することができる。

培養は、通常、３５℃～３７℃で４時間～２４時間行う。一般に、好ましくは３５℃で４～２４時間培養する。当業者は、検出対象とする既知の量の菌を培養して経時変化を確認し、最適な培養時間を適宜決定することができる。

判定は、培養後、培地の色の変化及び菌の運動性に基づいて、以下のように行うことができる。
＜腸内細菌＞培地が黄変した場合は、乳糖分解が起こったと考えられ、ＥＳＢＬ産生菌などの第三代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌の疑いがある。黄変した培地をスポイトなどで抜き取り、スポットインドール試薬もしくはコバック試薬を用いることにより、インドール産生を確認することができる。その結果、インドール陽性の場合は大腸菌（E. coli）、インドール及び運動性が共に陰性の場合はクレブシエラ（Klebsiella spp.）と推定することができる。
培地が黒色化した場合は、硫化水素産生によるものと考えられ、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）などの硫化水素産生菌が存在すると推定することができる。

＜ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌（ＮＦＧＮＲ）＞
本発明の培地によれば、ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌をも検出することができる。培地表面部のみに菌体の増殖が認められ、培地色の変化が認められない（赤色）場合は、ブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の疑いがある。増殖部分をスポイトなどで抜き取り、オキシダーゼ試験を実施することができる。その結果、オキシダーゼ陽性の場合はシュードモナス・エルギノーサ（P. aeruginosa）と推定することができる。

具体的な例を用いて、以下の本発明をさらに説明する。

＜製造例１＞
培地成分をそれぞれ計量し、精製水１，０００ｍＬを加えて混ぜ、加温溶解後、１２１℃で１５分間滅菌した。溶解した培地を試験管（高さ１０ｃｍ、口径１．３ｃｍ）に３ｍＬずつ分注して冷却し、半流動の状態に固まらせた。

＜試験例１＞
既知の菌株の培養液を使用して、上記製造例１で製造した本発明の培地の経時変化を調べた。
供試菌株として、以下の菌株を使用した。
ＥＳＢＬ産生菌株として、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３、大腸菌（E. coli）臨床分離株Ｋ４、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）臨床分離株Ｂ３０；
ＥＳＢＬ非産生グラム陰性桿菌として、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ１３８８３、エンテロバクター・クロアカ（E. cloacae）ＡＴＣＣ２３３５５、エンテロバクター・アエロゲネス（E. aerogenes）ＡＴＣＣ１３０４８、セラチア・マルセスセンス（S. marcescens）ＡＴＣＣ８１００、モルガネラ・モルガニー（M. morganii）ＡＴＣＣ２５８３０、シュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）ＡＴＣＣ２７８５３、アシネトバクター・バウマニ（A. baumannii）ＡＴＣＣ１９６０６；
グラム陽性球菌として、エンテロコッカス・フェカーリス（E. faecalis）ＡＴＣＣ２９２１２、スタフィロコッカス・アウレウス（S. aureus）ＡＴＣＣ４３３００を使用した。

試験方法は以下のとおりであった。
（１）各菌株のマクファーランド０．５及びマクファーランド３．０の菌液を調製した。
（２）調製した各菌液１００μＬをピペットにて採取し、上記のとおりに製造した本発明の培地（チューブ）に接種した。
（３）好気的条件下３５℃で培養し、２時間、４時間、６時間、８時間の時点で培地の色調の経時変化を確認した。
結果を図１～４及び表２～５に示す。

以上の結果から、この実験の条件下では、ＥＳＢＬ産生菌は遅くとも６時間培養後までに明らかな黄変又は黒変が観察され、他の細菌とは明確に区別される様相を示した。これに対し、大腸菌、E. aerogenesは底部が若干黄変したものの経時的な変化は認められず、また、１８時間培養後には、底部の黄変が消失し、全面赤色となった。S. marcescens及びM. morganiiは、ＥＳＢＬ産生菌と比較すると増殖の立ち上がりは遅く、６時間培養以降で明らかな増殖を示した。P. aeruginosaは４時間培養以降、A. baumanniiは６時間培養以降に増殖が認められた。グラム陽性球菌は増殖しなかった。

＜試験例２＞
試験例１の一部の菌について、確認試験を行った。
（１）ＥＳＢＬ産生菌である大腸菌臨床分離株Ｋ４について、試験例１の実験の４時間培養後（マクファーランド３．０）のチューブからサンプル（黄変部）を採取し、定法によりスポットインドール試験を行った。スポットインドール試薬は、パラジメチルアミノシンナムアルデヒド１ｇを１０％（V/V）塩酸１００ｍＬに溶解することにより調製した。
（２） P. aeruginosa ＡＴＣＣ２７８５３について、試験例１の実験の４時間培養後（マクファーランド３．０）のチューブからサンプル（培地表面に増殖した部分）を採取し、オキシダーゼ綿棒（極東製薬工業）を使用してオキシダーゼ試験を行った。

結果を図５に示す。いずれの試験においても、問題なく陽性反応を確認することができた。本発明の培地での増殖性状とこれらの確認試験とを組合わせることにより、菌名の推定が可能であることが示された。

＜試験例３＞
菌液をそのまま使用した接種方法と、菌液を綿棒に浸して接種する方法とを比較した。
供試菌株として、以下の菌株を使用した。
ＥＳＢＬ産生菌株として、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３、大腸菌（E. coli）臨床分離株Ｋ４、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）臨床分離株Ｂ３０；
グラム陰性桿菌として、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ１３８８３、大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）ＡＴＣＣ４３０７１
を使用した。

綿棒は、ＦＬＯＱＳｗａｂｓ（商品名；COPAN FLOCHED SWABS）及びメンディップ病院用綿棒（商品名；日本綿棒）を使用した。なお、ＦＬＯＱＳｗａｂｓの含浸量は２９．６μＬ、メンディップ病院用綿棒の含浸量は１４４．６μＬであった。

試験方法は以下のとおりであった。
（１）各菌株のマクファーランド０．５の菌液を調製し、生理食塩水を用いて×１０^－５の段階希釈液を作製した。ただし、グラム陰性桿菌については希釈系列を作製せず、マクファーランド０．５の菌液のみを使用した。
（２）調製した各菌液を、上記のとおりに製造した本発明の培地（チューブ）に以下の３種の方法で接種した。
i) １００μＬをピペットにて接種
ii) 菌液に５秒間浸漬したＦＬＯＱＳｗａｂｓを挿入
iii) 菌液に５秒間浸漬したメンディップ病院用綿棒を挿入
（３）別途、接種した菌数を確認するため、羊血液寒天培地に調製した各菌液１００μＬをコンラージで塗布した。
（４）好気的条件下で３５℃で培養し、４時間、６時間、８時間、２４時間の時点で培地の色調の経時変化を確認した。
結果を図６～１２及び表６～１２に示す。

以上の結果から、この実験の条件下では、菌液又は綿棒のいずれを使用して接種しても、ＥＳＢＬ産生菌は遅くとも２４時間培養後までに明らかな黄変又は黒変が観察された。これに対し、ＥＳＢＬを産生しない菌は、経時的な変化は認められなかった。

＜試験例４＞
血液培養疑似検体を使用して、培地の経時変化を比較した。
供試菌株として、以下の菌株を使用した。
ＥＳＢＬ産生菌株として、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＡＴＣＣ７００６０３、大腸菌（E. coli）臨床分離株Ｋ４、プロテウス・ミラビリス（P. mirabilis）臨床分離株Ｂ３０を使用した。
綿棒は、メンディップ病院用綿棒（商品名；日本綿棒）を使用した。

試験方法は以下のとおりであった。
（１）血液培養ボトルにウマ脱線維血液１０ｍＬ及び各菌株のマクファーランド０．５の菌液１００μＬをそれぞれ添加し、３５℃で１８時間培養した。
（２）血液培養ボトルの底面が変色していることを確認した後、各ボトルから培養液を抜き取った。
（３）陽性ボトル培養液を、以下の３種の試料とした。
i) 陽性ボトル培養液（未処理）
ii) 陽性ボトル培養液を生理食塩水で１０倍希釈した希釈液
iii) １５００ｒｐｍ、１５分間遠心分離した後の遠心上清
（４）上記で調製した各試料を、上記のとおりに製造した本発明の培地（チューブ）に以下の２種のパターンで接種した。
i) １００μＬをピペットにて接種
ii) 菌液に５秒間浸漬したメンディップ病院用綿棒を挿入
（５）好気的条件下で３５℃で培養し、４時間、６時間、８時間、２４時間の時点で培地の色調の経時変化を確認した。
結果を図１３～１５及び表１３～１５に示す。

以上の結果から、比較した３種類の試料のいずれを使用しても、６時間培養でＥＳＢＬ産生菌の判定が可能であった。菌液１００μＬ接種と綿棒による接種の反応は同等であった。使用した血液がウマ脱線維血液であったため、陽性培養液及び遠心上清を使用した場合は、血液成分による赤味が残り、黄変が明瞭でなかった。最も簡便な方法は陽性培養液を１０倍希釈後に綿棒で接種する方法であった。

＜試験例５＞
遺伝子型が異なる既知の耐性菌９株及び非ＥＳＢＬ産生菌１株を用いて、上記製造例１で製造した本発明の培地の色調変化を確認した。
供試菌株として、以下の菌株を使用した。
ＥＳＢＬ産生及びａｍｐＣ菌株として、大腸菌（E. coli）ＳＨＶＥＳＢＬ、大腸菌（E. coli）ＡｍｐＣ、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＣＭＹ－２、大腸菌（E. coli）ＡｍｐＣ＋ＣＴＸ－Ｍ、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＥＳＢＬ＋ＡｍｐＣ；
カルバペネム耐性腸内細菌科細菌(ＣＲＥ菌)として、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＯＸＡ－４８、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＫＰＣ－２、クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＩＭＰ－１、セラチア・マルセスセンス（S. marcescens）ＩＭＰ－１；
非ＥＳＢＬ産生菌株として、大腸菌（E. coli）ＡＴＣＣ２５９２２
を使用した。

試験方法は以下のとおりであった。
（１）各菌株のマクファーランド０．５の菌液を調製した。
（２）調製した各菌液１００μＬをピペットにて採取し、上記のとおりに製造した本発明の培地（チューブ）に接種した。
（３）好気的条件下３７℃で培養し、２４時間の時点で培地の色調を確認した。
結果を図１６に示す。

ＥＳＢＬ産生菌以外のＡｍｐＣ産生菌やＣＲＥでも、培地が黄変することが確認された。クレブシエラ・ニューモニエ（K. pneumoniae）ＯＸＡ－４８及びセラチア・マルセスセンス（S. marcescens）ＩＭＰ－１については、他と比較して色調変化が弱く、若干赤みが残ったが、薬剤感受性菌とは区別することができた。したがって、第三世代セファロスポリン系薬耐性腸内細菌は、本培地で発育し、培地の黄変が認められた。。

＜試験例６＞
本発明の培地を使用した細菌検出又は判定方法による時間別累積陽性率、ならびに感度及び特異度を算出した。
供試菌株として、臨床検体の血液培養であって、グラム陰性桿菌が検出された４２株（ＥＳＢＬ産生菌として１２株（大腸菌（E. coli）１０株、その他２株）；非ＥＳＢＬ産生菌として３０株（大腸菌（E. coli）１５株、クレブシエラ（Klebsiella sp.）５株、エンテロバクター３株、シュードモナス・エルギノーザ（P. aeruginosa）４株、その他３株））を用いた。
グラム染色でグラム陰性桿菌が確認された尿検体も使用した。

試験方法は以下のとおりであった。
（１）血液培養陽性となり、グラム陰性桿菌が認められた培養液又はグラム染色でグラム陰性桿菌が確認された尿を２ｍＬ採取し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心した。
（２）上記（１）で得られた上清各１００μＬをピペットにて採取し、上記のとおりに製造した本発明の培地（チューブ）にそれぞれ接種した。
（３）好気的条件下３７℃で培養し、２、４、６、２４時間の時点で培地の色調を判定し、時間別累積陽性率、及び６時間後及び２４時間後の感度及び特異度を以下のようにして算出した。
感度（陽性率）＝「培地が陽性となったＥＳＢＬ産生菌の件数／ＥＳＢＬ産生菌の件数」
特異度＝「培地が陽性となったＥＳＢＬ産生菌の件数／培地が陽性となった件数」
結果を図１７に示す。

血液培養を用いた実験（ＥＳＢＬ産生腸内細菌株ｎ＝４）においては、６時間後の感度は７５％、特異度は８０％であり、２４時間後の感度は１００％、特異度は７５％であった。
同様の実験を、血液培養液の代わりに、グラム染色でグラム陰性桿菌が確認された尿を使用して実施したところ（ただし、ＥＳＢＬ産生腸内細菌株ｎ＝４）、６時間後の感度は１００％、特異度は１００％であり、２４時間後の感度は１００％、特異度は９６％であった。

Claims

ＤＨＬ寒天培地に基づく基質特異的拡張型β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌又はブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の選択培地であって、肉エキス、ペプトン、乳糖、チオ硫酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸鉄アンモニウム、フェノールレッド、水及び寒天を含有し、ニュートラルレッド、胆汁酸塩及び白糖を添加していない半流動性の選択培地。
培地１０００ｍＬ中に、ペプトン１０～３０ｇ（２０ｇ±１０ｇ）、肉エキス３～１０ｇ、乳糖５～１５ｇ（１０ｇ±５ｇ）、チオ硫酸ナトリウム１～５ｇ、クエン酸ナトリウム１～５ｇ、クエン酸鉄アンモニウム１～５ｇ、フェノールレッド１０～５０ｍｇ、寒天１．０～３．５ｇを含有する、請求項１記載の選択培地。
バンコマイシン、クリスタルバイオレット、及び／又はセフポドキシムをさらに含有する、請求項１又は２記載の選択培地。
第三世代セファロスポリン系薬をさらに含有する、請求項１又は２記載の選択培地。
請求項１～４のいずれか１項記載の培地に、生体由来検体を接種して培養した後、前記培地の色調を観察することを含む、基質特異的拡張型β－ラクタマーゼ（ＥＳＢＬ）産生菌又はブドウ糖非発酵グラム陰性桿菌の検出又は判定方法。