JP7225095B2 - 上皮腫瘍細胞培養 - Google Patents
上皮腫瘍細胞培養 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7225095B2 JP7225095B2 JP2019527184A JP2019527184A JP7225095B2 JP 7225095 B2 JP7225095 B2 JP 7225095B2 JP 2019527184 A JP2019527184 A JP 2019527184A JP 2019527184 A JP2019527184 A JP 2019527184A JP 7225095 B2 JP7225095 B2 JP 7225095B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cell
- epithelial tumor
- human
- cells
- ctos
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/76—Albumins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0656—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
- C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/70—Enzymes
- C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
- C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
本出願は、それらの各々が全体として参照により本明細書に組み入れられる2017年5月31日出願のPCT/CN2017/086556および2016年11月21日出願のPCT/CN2016/106619に対する優先権を特許請求する。
(a)実質的に単細胞の懸濁液へと解離した、ヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)であって、ヒト上皮腫瘍細胞を含む、CTOSと、
(b)フィーダー細胞と、
(c)少なくとも1つのRho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(Rho associated,coiled-coil containing protein kinase)(ROCK)阻害剤を含む定義された細胞培養培地と、場合により
(d)補充血清アルブミン(SA)と、を含み、
細胞培養培地が、解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約14日以内に上皮腫瘍細胞の少なくとも約10%の増殖を提供する、細胞培養培地を含む。
(A)ヒト上皮腫瘍細胞を含むヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)を実質的に単細胞の懸濁液中へと解離させることと、
(B)少なくとも1つのRho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤を含む定義された細胞培養培地中で、解離したCTOSとフィーダー細胞とを共培養することとを含み、
ステップ(A)および(B)の後約14日以内に細胞培養培地中で上皮腫瘍細胞の少なくとも約10%の増殖を提供する、方法を含む。
腫瘍含有試料を組織消化培地中で細片化およびインキュベートすることと、
ニコチンアミド、Wnt3A、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、WNT/β-カテニンシグナル伝達アゴニスト、およびROCK阻害剤を含む定義された無血清かつフィーダー非含有のCTOS成長培地中で、CTOSを形成するのに十分な時間、腫瘍含有試料を培養することと、を含む。
治療薬を本明細書に説明する細胞培養培地もしくは共培養へ、または本明細書に説明する方法によって調製された細胞培養培地もしくは共培養へ投与することと、
上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
上皮腫瘍細胞増殖における低下および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導が、治療薬へのヒト患者の応答性を示し、上皮腫瘍細胞増殖における低下および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、治療薬へのヒト患者の耐性を示す、方法も含まれる。
-組織消化培地、
-低細胞結合表面を有する組織培養プレート、
-定義された細胞培養培地、
-凍結フィーダー細胞、
-Rho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤、ならびに場合により、
-細胞増殖マーカーおよび/または細胞アポトーシスマーカー、
のいずれかの組み合わせを含む、試料調製キットも含まれる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
細胞培養培地であって、
(a)実質的に単細胞の懸濁液へと解離した、ヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)であって、ヒト上皮腫瘍細胞を含む、CTOSと、
(b)フィーダー細胞と、
(c)少なくとも1つのRho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(Rho associated,coiled-coil containing protein
kinase)(ROCK)阻害剤を含む定義された細胞培養培地であって、場合により、ノギンのような骨形成タンパク質(BMP)阻害剤およびR-スポンジン-1のようなWnt/β-カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない、定義された細胞培養培地と、場合により、
(d)補充血清アルブミン(SA)と、を含み、
前記細胞培養培地が、前記解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約14日以内に前記上皮腫瘍細胞の少なくとも約10%の増殖を提供する、細胞培養培地。
(項目2)
前記ヒトエクスビボ由来CTOSが、ヒト癌患者から取り出され、場合により外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される腫瘍含有試料から培養される、項目1に記載の細胞培養培地。
(項目3)
前記ヒト患者が、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している、項目1または2に記載の細胞培養培地。
(項目4)
前記上皮腫瘍細胞が、前記解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約14日以内に前記ヒト患者から取り出された前記腫瘍含有試料のクローン多様性を実質的に保持している、項目2または3に記載の細胞培養培地。
(項目5)
前記ヒト上皮腫瘍細胞が、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される、項目1~4のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目6)
前記解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2または1日以内に前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100%増殖を提供する、項目1~5のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目7)
前記解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約7日以内に前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約20~30%の増殖を提供する、項目1~6のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目8)
前記解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約7日以内に前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約60%の増殖を提供する、項目1~7のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目9)
前記解離したCTOSと(b)および(c)との共培養後約14日以内に、前記ヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に約または少なくとも約5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1、または1000:1の比を提供し、前記ヒト上皮腫瘍細胞が、上皮細胞接着分子(EpCAM)および/またはCD133の細胞表面発現を場合により特徴とする、項目1~8のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目10)
前記定義された培地が、血清、場合によりウシ胎仔血清(FBS)を含む、項目1~9のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目11)
前記血清の濃度が、約1~5%の範囲であり、または約1%、2%、3%、4%、もしくは5%である、項目10に記載の細胞培養培地。
(項目12)
前記ROCK阻害剤が、Y27632、HA1100ヒドロクロリド、HA1077、およびGSK429286のうちの1つ以上から選択される、項目1~11のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目13)
Y27632の濃度が、約0.1~1000、0.5~1000、1~1000、5~1000、10~1000、50~1000、100~1000、500~1000μM、または約0.1~500、0.5~500、1~500、5~500、10~500、50~500、100~500μM、または約0.1~100、0.5~100、1~100、5~100、10~100、50~100μM、または約0.1~50、0.5~50、1~50、5~50、10~50μM、または約0.1~40、0.5~40、1~40、5~40、10~40μM、または約0.1~30、0.5~30、1~30、5~30、10~30μM、または約0.1~20、0.5~20、1~20、5~20、10~20μM、または約0.1~10、0.5~10、1~10、5~10μM、または約0.1~5、0.5~5、1~5μM、または約0.1~1もしくは0.5~1μMの範囲である、項目12に記載の細胞培養培地。
(項目14)
前記補充SAが、ウシ血清アルブミン(BSA)およびヒト血清アルブミン(HSA)から選択される、項目1~13のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目15)
前記補充SAの濃度が、約0.5mg/ml~約20mg/ml、あるいは約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、もしくは20mg/ml、または約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、もしくは20mg/ml未満、または約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、もしくは20mg/ml以下である、項目1~14に記載の細胞培養培地。
(項目16)
前記フィーダー細胞が、非増殖性線維芽細胞、場合によりヒト線維芽細胞である、項目1~15のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目17)
項目1~16のいずれか1項に記載の細胞培養培地を含む、低い細胞結合表面を有する組織培養プレート。
(項目18)
インビトロ細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞を培養または増殖させる方法であって、
(A)前記ヒト上皮腫瘍細胞を含むヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)を実質的に単細胞の懸濁液中へと解離させることと、
(B)少なくとも1つのRho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤を含む定義された細胞培養培地中で、前記解離したCTOSとフィーダー細胞とを共培養することであって、場合により、前記定義された細胞培養培地が、ノギンのような骨形成タンパク質(BMP)阻害剤およびR-スポンジン-1のようなWnt/β-カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでおらず、場合により前記細胞培養培地が補充血清アルブミン(SA)を含む、共培養することと、を含み、
前記方法が、ステップ(A)および(B)の後約14日以内に前記細胞培養培地中で前記上皮腫瘍細胞の少なくとも約10%の増殖を提供する、方法。
(項目19)
前記実質的に解離したCTOSが、低細胞結合表面を有する組織培養プレート中で共培養される、項目18に記載の方法。
(項目20)
前記ヒトエクスビボ由来CTOSが、ヒト癌患者から取り出され、場合により外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される腫瘍試料から培養される、項目19に記載の方法。
(項目21)
前記ヒト患者が、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している、項目19または20に記載の方法。
(項目22)
前記上皮腫瘍細胞が、ステップ(A)および(B)の後約14日以内に前記ヒト患者から取り出された前記腫瘍試料の前記クローン多様性を実質的に保持している、項目18または19に記載の方法。
(項目23)
前記ヒト上皮腫瘍細胞が、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される、項目18~22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
ステップ(A)および(B)の後約14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100%の増殖を提供する、項目18~23のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
ステップ(A)および(B)の後約7日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約20~30%の増殖を提供する、項目18~24のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
ステップ(A)および(B)の後約7日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも約60%の増殖を提供する、項目18~25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
ステップ(A)および(B)の後約14日以内に、前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に少なくとも約5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1、または1000:1の比を提供し、前記ヒト上皮腫瘍細胞が、上皮細胞接着分子(EpCAM)および/またはCD133の細胞表面発現を場合により特徴とする、項目18~26のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記定義された細胞培養培地が、血清、場合によりウシ胎仔血清(FBS)を含む、項目18~27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記血清の濃度が、約1~5%の範囲であり、または約1%、2%、3%、4%、もしくは5%である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記ROCK阻害剤が、Y27632、HA1100ヒドロクロリド、HA1077、およびGSK429286のうちの1つ以上から選択される、項目18~29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
Y27632の濃度が、約0.1~1000、0.5~1000、1~1000、5~1000、10~1000、50~1000、100~1000、500~1000μM、または約0.1~500、0.5~500、1~500、5~500、10~500、50~500、100~500μM、または約0.1~100、0.5~100、1~100、5~100、10~100、50~100μM、または約0.1~50、0.5~50、1~50、5~50、10~50μM、または約0.1~40、0.5~40、1~40、5~40、10~40μM、または約0.1~30、0.5~30、1~30、5~30、10~30μM、または約0.1~20、0.5~20、1~20、5~20、10~20μM、または約0.1~10、0.5~10、1~10、5~10μM、または約0.1~5、0.5~5、1~5μM、または約0.1~1もしくは0.5~1μMの範囲である、項目30に記載の方法。
(項目32)
前記補充SAが、ウシ血清アルブミン(BSA)およびヒト血清アルブミン(HSA)から選択される、項目18~31のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目33)
前記補充SAの濃度が、約0.5mg/ml~約20mg/ml、あるいは約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、もしくは20mg/ml、または約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、もしくは20mg/ml未満、または約0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.5、2.6、2.8、3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0、8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2、9.4、9.6、9.8、10.0、10.2、10.4、10.6、10.8、11.0、11.2、11.4、11.6、11.8、12.0、12.2、12.4、12.6、12.8、13.0、13.2、13.4、13.6、13.8、14.0、14.2、14.4、14.6、14.8、15.0、15.2、15.4、15.6、15.8、16.0、16.2、16.4、16.6、16.8、17.0、17.2、17.4、17.6、17.8、18.0、18.2、18.4、18.6、18.8、19.0、19.2、19.4、19.6、19.8、もしくは20mg/ml以下である、項目18~32のいずれか1項に記載の細胞培養培地。
(項目34)
前記フィーダー細胞が、非増殖性線維芽細胞、場合によりヒト線維芽細胞である、項目18~33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
場合により、
ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料を組織消化培地中で細片化およびインキュベートすることと、
ニコチンアミド、Wnt3A、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、WNT/β-カテニンシグナル伝達アゴニスト、およびROCK阻害剤を含む定義された無血清かつフィーダー非含有のCTOS成長培地中で、前記CTOSを形成するのに十分な時間、前記腫瘍含有試料を培養することと、を含み、前記ヒトエクスビボ由来CTOSが、前記腫瘍含有試料から培養される、項目18~34のいずれか1項に記載の方法。
(項目36)
前記組織消化培地が、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの1つ以上から選択されたプロテアーゼを含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記ニコチンアミドの濃度が、約0.1~1000、0.5~1000、1~1000、5~1000、10~1000、50~1000、100~1000、500~1000mM、または約0.1~500、0.5~500、1~500、5~500、10~500、50~500、100~500mM、または約0.1~100、0.5~100、1~100、5~100、10~100、50~100mM、または約0.1~50、0.5~50、1~50、5~50、10~50mM、または約0.1~40、0.5~40、1~40、5~40、10~40mM、または約0.1~30、0.5~30、1~30、5~30、10~30mM、または約0.1~20、0.5~20、1~20、5~20、10~20mM、または約0.1~10、0.5~10、1~10、5~10mM、または約0.1~5、0.5~5、1~5mM、または約0.1~1もしくは0.5~1mMの範囲である、項目35または36に記載の方法。
(項目38)
Wnt3Aの濃度が、約0.1~10,000または1~1000ng/ml、または約0.1~1000、1~1000、10~1000、20~1000、30~1000、40~1000、50~1000、60~1000、70~1000、80~1000、90~1000、100~1000、200~1000、300~1000、400~1000、500~1000、600~1000、700~1000、800~1000、900~1000ng/ml、または約0.1~500、1~500、10~500、20~500、30~500、40~500、50~500、60~500、70~500、80~500、90~500、100~500、200~500、300~500、400~500ng/ml、または約0.1~400、1~400、10~400、20~400、30~400、50~400、40~400、60~400、70~400、80~400、90~400、100~400、200~400、300~400ng/ml、または約0.1~300、1~300、10~300、20~300、30~300、40~300、50~300、60~300、70~300、80~300、90~300、100~300、200~300ng/ml、または約0.1~200、1~200、10~200、20~200、30~200、40~200、50~200、60~200、70~200、80~200、90~200、100~200ng/ml、または約0.1~150、1~150、10~150、20~150、30~150、40~150、50~150、60~150、70~150、80~150、90~150、100~150ng/ml、または約0.1~120、1~120、10~120、20~120、30~120、40~120、50~120、60~120、70~120、80~120、90~120、100~120ng/ml、または約0.1~100、1~100、10~100、20~100、30~100、40~100、50~100、60~100、70~100、80~100、90~100ng/mlに及ぶ、項目35~37のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
前記BMP阻害剤がノギンであり、前記ノギンの濃度が、場合により約0.1~10,000または1~1000ng/ml、または約0.1~1000、1~1000、10~1000、20~1000、30~1000、40~1000、50~1000、60~1000、70~1000、80~1000、90~1000、100~1000、200~1000、300~1000、400~1000、500~1000、600~1000、700~1000、800~1000、900~1000ng/ml、または約0.1~500、1~500、10~500、20~500、30~500、40~500、50~500、60~500、70~500、80~500、90~500、100~500、200~500、300~500、400~500ng/ml、または約0.1~400、1~400、10~400、20~400、30~400、50~400、40~400、60~400、70~400、80~400、90~400、100~400、200~400、300~400ng/ml、または約0.1~300、1~300、10~300、20~300、30~300、40~300、50~300、60~300、70~300、80~300、90~300、100~300、200~300ng/ml、または約0.1~200、1~200、10~200、20~200、30~200、40~200、50~200、60~200、70~200、80~200、90~200、100~200ng/ml、または約0.1~150、1~150、10~150、20~150、30~150、40~150、50~150、60~150、70~150、80~150、90~150、100~150ng/ml、または約0.1~120、1~120、10~120、20~120、30~120、40~120、50~120、60~120、70~120、80~120、90~120、100~120ng/ml、または約0.1~100、1~100、10~100、20~100、30~100、40~100、50~100、60~100、70~100、80~100、90~100ng/mlの範囲である、項目35~38のいずれか1項に記載の方法。
(項目40)
前記Wnt/β-カテニンシグナル伝達アゴニストがR-スポンジン-1であり、前記R-スポンジン-1の濃度が場合により、約0.1~10,000もしくは1~1000もしくは100~1000ng/ml、または約0.1~10,000、1~10,000、10~10,000、20~10,000、30~10,000、40~10,000、50~10,000、60~10,000、70~10,000、80~10,000、90~10,000、100~10,000、200~10,000、300~10,000、400~10,000、500~10,000、1000~10,000、5000~10,000ng/ml、または約0.1~5000、1~5000、10~5000、20~5000、30~10,000、40~5000、50~5000、60~5000、70~5000、80~5000、90~5000、100~5000、200~5000、300~5000、400~5000、500~5000、1000~5000ng/ml、または約0.1~1000、1~1000、10~1000、20~1000、30~1000、40~1000、50~1000、60~1000、70~1000、80~1000、90~1000、100~1000、200~1000、300~1000、400~1000、500~1000、600~1000、700~1000、800~1000、900~1000ng/ml、または約0.1~800、1~800、10~800、20~800、30~800、40~800、50~800、60~800、70~800、80~800、90~800、100~800、200~800、300~800、400~800、500~800、600~800、700~800ng/ml、または約0.1~700、1~700、10~700、20~700、30~700、40~700、50~700、60~700、70~700、80~700、90~700、100~700、200~700、300~700、400~700、500~700、600~700ng/ml、または約0.1~600、1~600、10~600、20~600、30~600、40~600、50~600、60~600、70~600、80~600、90~600、100~600、200~600、300~600、400~600、500~600ng/ml、または約0.1~500、1~500、10~500、20~500、30~500、40~500、50~500、60~500、70~500、80~500、90~500、100~500、200~500、300~500、400~500ng/mlの範囲である、項目35~39のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
前記ROCK阻害剤がY27632であり、Y27632の濃度が場合により、約0.1~1000、0.5~1000、1~1000、5~1000、10~1000、50~1000、100~1000、500~1000μM、または約0.1~500、0.5~500、1~500、5~500、10~500、50~500、100~500μM、または約0.1~100、0.5~100、1~100、5~100、10~100、50~100μM、または約0.1~50、0.5~50、1~50、5~50、10~50μM、または約0.1~40、0.5~40、1~40、5~40、10~40μM、または約0.1~30、0.5~30、1~30、5~30、10~30μM、または約0.1~20、0.5~20、1~20、5~20、10~20μM、または約0.1~10、0.5~10、1~10、5~10μM、または約0.1~5、0.5~5、1~5μM、または約0.1~1もしくは0.5~1μMの範囲である、項目35~40のいずれか1項に記載の方法。
(項目42)
治療薬に対するヒト患者の応答性を検査する方法であって、
前記治療薬を項目1~15のいずれか1項に記載の細胞培養培地へ、または項目17~41のいずれか1項に記載の方法によって調製された細胞培養培地へ投与することと、
上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
上皮腫瘍細胞増殖における低下および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導が、前記治療薬への前記ヒト患者の応答性を示し、上皮腫瘍細胞増殖における低下および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、前記治療薬への前記ヒト患者の耐性を示す、方法。
(項目43)
前記解離したCTOSを共培養するのと同じ日に前記治療薬を投与することを含む、項目42に記載の方法。
(項目44)
前記解離したCTOSの共培養の少なくとも1日後に前記治療薬を投与することを含む、項目42に記載の方法。
(項目45)
前記解離したCTOSの共培養の約1、2、3、4、5、6、もしくは7日後にまたは約1、2、3、4、5、6、もしくは7日以内に前記治療薬を投与することを含む、項目44に記載の方法。
(項目46)
前記治療薬の投与の約14日以内に上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目43~45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記治療薬を投与する約14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5日以内に上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目46に記載の方法。
(項目48)
前記治療薬を投与する約7、6、または5日以内に上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、項目47に記載の方法。
(項目49)
上皮腫瘍細胞増殖を測定するステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、項目42~48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記細胞増殖マーカーが、 3 H-チミジン、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、5-エチニル-2’-デオキシウリジン(Edu)、Ki-67、および増殖細胞核抗原(PCNA)のうちの1つ以上から選択される、項目49に記載の方法。
(項目51)
上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、項目42~50のいずれか1項に記載の方法。
(項目52)
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤(FLICA)、カスパーゼ活性化、ポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)開裂、DRAQ5、DRAQ7、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイのうちの1つ以上から選択される、項目51に記載の方法。
(項目53)
-定義された無血清かつフィーダー非含有の癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)成長培地、
-組織消化培地、
-低細胞結合表面を有する組織培養プレート、
-補充血清アルブミン(SA)を場合により含む、定義された細胞培養培地であって、ノギンのような骨形成タンパク質(BMP)阻害剤およびR-スポンジン-1のようなWnt/β-カテニンシグナル伝達アゴニストを含んでいないか、または実質的に含んでいない、定義された細胞培養培地、
-凍結フィーダー細胞、
-Rho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤、場合により、
-細胞増殖マーカーおよび/または細胞アポトーシスマーカー、のいずれかの組み合わせを含む、試料調製キット。
(項目54)
前記CTOS成長培地が、ニコチンアミド、Wnt3A、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、Wnt/β-カテニンシグナル伝達アゴニスト、および/またはROCK阻害剤を含む、項目53に記載の試料調製キット。
(項目55)
前記組織消化培地が、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの1つ以上から選択されるプロテアーゼを含む、項目53または54に記載の試料調製キット。
(項目56)
前記定義された培養培地が、血清、場合によりウシ胎仔血清(FBS)を約1~5%の範囲の、または約1%、2%、3%、4%、または5%である濃度で含む、項目53または54に記載の試料調製キット。
(項目57)
前記凍結フィーダー細胞が、非増殖性線維芽細胞、場合によりヒト線維芽細胞である、項目53~56のいずれか1項に記載の試料調製キット。
(項目58)
前記ROCK阻害剤が、Y27632、HA1100ヒドロクロリド、HA1077、およびGSK429286のうちの1つ以上から選択される、項目53~57のいずれか1項に記載の試料調製キット。
(項目59)
前記細胞増殖マーカーが、 3 H-チミジン、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、5-エチニル-2’-デオキシウリジン(Edu)、Ki-67、および増殖細胞核抗原(PCNA)のうちの1つ以上から選択される、項目53~58のいずれか1項に記載の試料調製キット。
(項目60)
前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤(FLICA)、カスパーゼ活性化、ポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)開裂、DRAQ5、DRAQ7、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイのうちの1つ以上から選択される、項目53~59のいずれか1項に記載の試料調製キット。
別段の定義がない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明する技術用語および科学用語と同様のまたは等価のいかなる方法および材料も、本発明の実施または検査において使用することができるが、ある特定の好ましい方法および材料が本明細書で説明される。特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される公表物および参考文献はすべて、各個々の公表物または参考文献が参照により組み入れられるよう具体的かつここに示されたかのように、当該公表物および参考文献の全体が参照により組み入れられる。本発明の目的のために、次の用語を以下に定義する。
-定義された無血清かつフィーダー非含有の癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)成長培地、
-組織消化または解離培地、
-低細胞結合表面を有する組織培養プレート、
-定義された細胞培養培地、
-凍結フィーダー細胞、
-Rho結合型多重コイル含有タンパク質キナーゼ(ROCK)阻害剤、ならびに
-細胞増殖マーカーおよび/または細胞アポトーシスマーカー、
のいずれかの組み合わせを含む、試料調製キットに関する。
患者由来の癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)の単離および単細胞培養物としての条件的初期化
大腸癌患者由来の正常および腫瘍外科的試料を、患者の同意書を受理した後にBeijing Tumor Hospitalから得た。
Amax(EdU)=MIcmax/MIc
DSS(曲線下面積)=∫MI(x)dx
Amax、EC50、およびDSSは、検査した薬物または薬物の組み合わせに対する患者の応答についての予測モデルを確立するために使用することができた。
Claims (27)
- インビトロ細胞培養培地中でヒト上皮腫瘍細胞を培養または増殖させ、治療薬に対するヒト患者の応答性を検査する方法であって、
(A)前記ヒト上皮腫瘍細胞を含むヒトエクスビボ由来癌組織を起源とするスフェロイド(CTOS)を実質的に単細胞の懸濁液中へと解離させることであって、前記ヒトエクスビボ由来CTOSが、ヒト癌患者から取り出された腫瘍含有試料から培養され、前記培養が、
前記腫瘍含有試料を組織消化培地中で細片化およびインキュベートすることと、
1~50mMの範囲の濃度のニコチンアミド、1~100ng/mlの範囲の濃度のWnt3A、10~500ng/mlの範囲の濃度のノギン、100~1000ng/mlの範囲の濃度のR-スポンジン-1、および1~50μMの範囲の濃度のY27632が補充された定義された完全成長培地中で、前記CTOSを形成するのに十分な時間、前記腫瘍含有試料を培養することと
を含む、解離させることと、
(B)低細胞結合表面を有する組織培養プレート中で、1~5%の範囲の濃度のウシ胎仔血清(FBS)、1~50mMの範囲の濃度のニコチンアミド、および1~50μMの範囲の濃度のY27632が補充された定義された選択的細胞培養培地中で、前記解離したCTOSとフィーダー細胞とを共培養することであって、前記定義された選択的細胞培養培地が、骨形成タンパク質(BMP)阻害剤、Wnt/β-カテニンシグナル伝達アゴニスト、およびWnt3aを含んでいないか、または実質的に含んでいない、共培養することと、を含み、
前記方法が、ステップ(A)および(B)の後14日以内に前記細胞培養培地中で前記上皮腫瘍細胞の少なくとも10%の増殖を提供し、前記方法が、さらに
前記細胞培養培地に前記治療薬を投与することと、
上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することと、を含み、
上皮腫瘍細胞増殖における低下および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスにおける誘導が、前記治療薬への前記ヒト患者の応答性を示し、上皮腫瘍細胞増殖における低下および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスの誘導の欠如が、前記治療薬への前記ヒト患者の耐性を示す、方法。 - 前記ヒトエクスビボ由来CTOSが、ヒト癌患者から取り出され、外科的試料、生検試料、胸水試料、および腹水試料から選択される腫瘍試料から培養される、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト患者が、結腸癌、肺癌、胃癌、および乳癌から選択される癌に罹患している、請求項2に記載の方法。
- 前記上皮腫瘍細胞が、ステップ(A)および(B)の後14日以内に前記ヒト患者から取り出された前記腫瘍試料の前記クローン多様性を実質的に保持している、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒト上皮腫瘍細胞が、結腸癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、および乳癌細胞から選択される、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(A)および(B)の後14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、90、または100%の増殖を提供する、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(A)および(B)の後7日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも20~30%の増殖を提供する、請求項1~6のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(A)および(B)の後7日以内に前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞の少なくとも60%の増殖を提供する、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。
- ステップ(A)および(B)の後14日以内に、前記細胞培養培地中で前記ヒト上皮腫瘍細胞とヒト間質細胞の間に少なくとも5:1、10:1、20:1、50:1、100:1、200:1、500:1、または1000:1の比を提供し、前記ヒト上皮腫瘍細胞が、上皮細胞接着分子(EpCAM)および/またはCD133の細胞表面発現を特徴とする、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記FBSの濃度が、2%、3%、または4%である、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。
- Y27632の濃度が、5~50、10~50μM、または1~40、5~40、10~40μM、または1~30、5~30、10~30μM、または1~20、5~20、10~20μM、または1~10もしくは5~10μMの範囲である、請求項1~10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記フィーダー細胞が、非増殖性ヒト線維芽細胞である、請求項1~11のいずれか1項に記載の方法。
- 前記組織消化培地が、コラゲナーゼI、コラゲナーゼII、中性非クロストリジアルプロテアーゼ、およびこれらのいずれかの組み合わせのうちの1つ以上から選択されたプロテアーゼを含む、請求項1~12のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ニコチンアミドの濃度が、5~50、10~50mM、または0.1~40、0.5~40、1~40、5~40、10~40mM、または1~30、5~30、10~30mM、または1~20、5~20、10~20mM、または1~10もしくは5~10mMの範囲である、請求項13に記載の方法。
- Wnt3Aの濃度が、1~100、10~100、または20~100に及ぶ、請求項13または14に記載の方法。
- 前記ノギンの濃度が、20~500、30~500、40~500、50~500、60~500、70~500、80~500、90~500、100~500、200~500、300~500、400~500ng/ml、または10~400、20~400、30~400、50~400、40~400、60~400、70~400、80~400、90~400、100~400、200~400、300~400ng/ml、または10~300、20~300、30~300、40~300、50~300、60~300、70~300、80~300、90~300、100~300、200~300ng/ml、または10~200、20~200、30~200、40~200、50~200、60~200、70~200、80~200、90~200、100~200ng/ml、または10~150、20~150、30~150、40~150、50~150、60~150、70~150、80~150、90~150、100~150ng/ml、または10~120、20~120、30~120、40~120、50~120、60~120、70~120、80~120、90~120、100~120ng/ml、または10~100、20~100、30~100、40~100、50~100、60~100、70~100、80~100、90~100ng/mlの範囲である、請求項13~15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記R-スポンジン-1の濃度が、200~1000、300~1000、400~1000、500~1000、600~1000、700~1000、800~1000、900~1000ng/ml、または100~800、200~800、300~800、400~800、500~800、600~800、700~800ng/ml、または100~700、200~700、300~700、400~700、500~700、600~700ng/ml、または100~600、200~600、300~600、400~600、500~600ng/ml、または100~500、200~500、300~500、400~500ng/mlの範囲である、請求項13~16のいずれか1項に記載の方法。
- 前記解離したCTOSを共培養するのと同じ日に前記治療薬を投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記解離したCTOSの共培養の少なくとも1日後に前記治療薬を投与することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記解離したCTOSの共培養の1、2、3、4、5、6、もしくは7日後にまたは1、2、3、4、5、6、もしくは7日以内に前記治療薬を投与することを含む、請求項19に記載の方法。
- 前記治療薬の投与の14日以内に上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項18~20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記治療薬を投与する14、13、12、11、10、9、8、7、6、または5日以内に上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項21に記載の方法。
- 前記治療薬を投与する7、6、または5日以内に上皮腫瘍細胞増殖および/または上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定することを含む、請求項22に記載の方法。
- 上皮腫瘍細胞増殖を測定するステップが、細胞増殖マーカーを測定することを含む、請求項1または18~23のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞増殖マーカーが、3H-チミジン、ブロモデオキシウリジン(BrdU)、5-エチニル-2’-デオキシウリジン(Edu)、Ki-67、および増殖細胞核抗原(PCNA)のうちの1つ以上から選択される、請求項24に記載の方法。
- 上皮腫瘍細胞アポトーシスを測定するステップが、細胞アポトーシスマーカーを測定することを含む、請求項1または18~25のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞アポトーシスマーカーが、カスパーゼの蛍光色素で標識された阻害剤(FLICA)、カスパーゼ活性化、ポリADPリボースポリメラーゼ(PARP)開裂、DRAQ5、DRAQ7、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)dUTPニック末端標識(TUNEL)アッセイのうちの1つ以上から選択される、請求項26に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2022157853A JP2022173488A (ja) | 2016-11-21 | 2022-09-30 | 上皮腫瘍細胞培養 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
PCT/CN2016/106619 WO2018090375A1 (en) | 2016-11-21 | 2016-11-21 | Epithelial tumor cell cultures |
CNPCT/CN2016/106619 | 2016-11-21 | ||
CNPCT/CN2017/086556 | 2017-05-31 | ||
PCT/CN2017/086556 WO2018218485A1 (en) | 2017-05-31 | 2017-05-31 | Epithelial tumor cell cultures |
PCT/US2017/062863 WO2018094410A1 (en) | 2016-11-21 | 2017-11-21 | Epithelial tumor cell cultures |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022157853A Division JP2022173488A (ja) | 2016-11-21 | 2022-09-30 | 上皮腫瘍細胞培養 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019535280A JP2019535280A (ja) | 2019-12-12 |
JP7225095B2 true JP7225095B2 (ja) | 2023-02-20 |
Family
ID=62145889
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019527184A Active JP7225095B2 (ja) | 2016-11-21 | 2017-11-21 | 上皮腫瘍細胞培養 |
JP2022157853A Pending JP2022173488A (ja) | 2016-11-21 | 2022-09-30 | 上皮腫瘍細胞培養 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2022157853A Pending JP2022173488A (ja) | 2016-11-21 | 2022-09-30 | 上皮腫瘍細胞培養 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20190284536A1 (ja) |
EP (1) | EP3541933A4 (ja) |
JP (2) | JP7225095B2 (ja) |
CN (1) | CN110462028A (ja) |
WO (1) | WO2018094410A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11753626B2 (en) | 2016-03-09 | 2023-09-12 | Beijing Percans Oncology Co., Ltd. | Tumor cell suspension cultures and related methods |
CN113403278B (zh) * | 2020-03-16 | 2023-02-17 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 胃癌原代细胞的培养基及培养方法 |
CN113528444B (zh) * | 2020-04-15 | 2023-05-23 | 合肥中科普瑞昇生物医药科技有限公司 | 一种用于食管鳞癌上皮细胞的培养基、培养方法及其应用 |
US20230167414A1 (en) * | 2020-04-26 | 2023-06-01 | Georgetown University | Methods for isolating and culturing tumor cells |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016081554A1 (en) | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Neostem Oncology, Llc | Immunogenic compositions prepared from tumor cells derived from peripheral blood and originating from a solid tumor and their use |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7993918B2 (en) * | 2006-08-04 | 2011-08-09 | Anthrogenesis Corporation | Tumor suppression using placental stem cells |
HUE028647T2 (en) * | 2009-02-03 | 2016-12-28 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium for epithelial stem cells and organoids containing these stem cells |
JP2011115106A (ja) * | 2009-12-04 | 2011-06-16 | Rei Medical Co Ltd | 癌細胞凝集塊およびその調製法 |
GB201100180D0 (en) * | 2011-01-06 | 2011-02-23 | Capsant Neurotechnologies Ltd | Tumour cell and tissue culture |
JP2015062400A (ja) * | 2013-08-30 | 2015-04-09 | 独立行政法人放射線医学総合研究所 | 癌組織由来細胞凝集塊を調製するための方法及び癌組織由来細胞凝集塊を用いる抗癌剤スクリーニング方法、抗癌剤の定量分析又は癌組織の放射線感受性試験 |
CN105647870A (zh) * | 2016-02-22 | 2016-06-08 | 深圳市优圣康医学检验所有限公司 | 肿瘤原代细胞的培养方法 |
-
2017
- 2017-11-21 CN CN201780083564.8A patent/CN110462028A/zh active Pending
- 2017-11-21 WO PCT/US2017/062863 patent/WO2018094410A1/en unknown
- 2017-11-21 EP EP17872054.6A patent/EP3541933A4/en active Pending
- 2017-11-21 US US16/348,705 patent/US20190284536A1/en active Pending
- 2017-11-21 JP JP2019527184A patent/JP7225095B2/ja active Active
-
2022
- 2022-09-30 JP JP2022157853A patent/JP2022173488A/ja active Pending
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016081554A1 (en) | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Neostem Oncology, Llc | Immunogenic compositions prepared from tumor cells derived from peripheral blood and originating from a solid tumor and their use |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2019535280A (ja) | 2019-12-12 |
EP3541933A4 (en) | 2020-09-16 |
US20190284536A1 (en) | 2019-09-19 |
EP3541933A1 (en) | 2019-09-25 |
WO2018094410A1 (en) | 2018-05-24 |
JP2022173488A (ja) | 2022-11-18 |
CN110462028A (zh) | 2019-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7112957B2 (ja) | 腫瘍細胞懸濁培養及び関連方法 | |
JP2022173488A (ja) | 上皮腫瘍細胞培養 | |
WO2018090375A1 (en) | Epithelial tumor cell cultures | |
Becher et al. | Chromosome changes in soft tissue sarcomas | |
US11667894B2 (en) | Methods of primary tissue culture and drug screening using autologous serum and fluids | |
CN107849535A (zh) | 源自间充质干细胞的外来体 | |
JP4980211B2 (ja) | 細胞単離方法 | |
WO2014082096A1 (en) | Method for culture of human and mouse prostate organoids and uses thereof | |
Dalley et al. | Organotypic culture of normal, dysplastic and squamous cell carcinoma‐derived oral cell lines reveals loss of spatial regulation of CD44 and p75NTR in malignancy | |
Miserocchi et al. | Three-dimensional collagen-based scaffold model to study the microenvironment and drug-resistance mechanisms of oropharyngeal squamous cell carcinomas | |
JP2016512423A (ja) | 能動的自家免疫療法のための高純度卵巣癌幹細胞 | |
WO2022072847A1 (en) | Methods for identifying modulators of natural killer cell interactions | |
CN114787381A (zh) | 获得用于测序的核酸的方法 | |
US20240182866A1 (en) | Tumor cell suspension cultures and related methods | |
WO2018218485A1 (en) | Epithelial tumor cell cultures | |
JP2011147434A (ja) | 癌組織由来細胞塊または癌細胞凝集塊の薬剤または放射線感受性評価方法 | |
JP2008534022A (ja) | 腫瘍組織、とりわけ乳癌から初代培養腫瘍細胞を得るための方法、初代培養腫瘍細胞およびそれらの使用 | |
CN112972491A (zh) | 癌症治疗或预防用细胞组合物、及其制造方法 | |
WO2023230297A1 (en) | Compositions and methods for improving squamous epithelial organoids and their production | |
Cui et al. | High-mannose glycosylation of ITGAM regulates the development and differentiation of trophoblast in the placenta | |
Perry | Understanding the biology of metastatic cutaneous squamous cell carcinoma | |
Lester | Intracranial ependymomas: Establishing preclinical models for the investigation of novel treatments | |
WO2024054518A1 (en) | Systems and methods of enhancing tumor-reactive immune populations with organoids | |
Cavazzoni et al. | Synergic activity of FGFR2 and MEK inhibitors in the treatment of FGFR2-amplified cancers of unknown primary | |
Liu et al. | In vitro flow cytometry assay to assess primary human and mouse macrophage phagocytosis of live cells |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200910 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20211018 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20211224 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220415 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20220531 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220930 |
|
C60 | Trial request (containing other claim documents, opposition documents) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C60 Effective date: 20220930 |
|
C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C11 Effective date: 20221011 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20221118 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20221208 |
|
C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: C21 Effective date: 20221209 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20230110 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20230208 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7225095 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |