JP7222049B2 - 心血管移植片 - Google Patents

Description

本発明は、血栓形成効果を抑制するための電界紡糸コーティング、移植片または材料に関する。

管径が６ｍｍ以下の血管が関与する血管疾患は、臨床的介入が必要な疾患症例の大部分を占めている。これらの多くの場合、好ましい介入は、患者の別の場所から採取した自家血管または合成血管移植片を利用した血管再建またはバイパス手術である。このような合成移植片は、さまざまな寸法と構成を有するものとして入手でき、一般に、織布または樹枝状のアセンブリとされた、ポリ（テトラフルオロエチレン）（ＰＴＦＥ）やポリ（エーテルテレフタレート）（ＰＥＴ）などの医療用ポリマーの小セットを有する。

臨床環境で主に観察される合成血管移植片の障害の形態は、移植片の血流と減少と血栓症につながる静脈（流出）吻合部の進行性内膜過形成である。これは、循環血液と接触する移植材料の異物血栓形成性とともに、移植片と天然血管の間の接続、移植片材料と自然組織の機械的特性（追従性など）の不一致に起因する流れの摂動によって引き起こされると考えられている。しかし、血栓症の正確なメカニズムは、現在でもこの分野の研究の主要な焦点のままである。

止血には、損傷した組織または血管からの出血を止める無数の生物学的プロセスが含まれる。止血の主なメカニズムは、血小板としても知られている循環血小板の活性化と付着である。組織への損傷から数秒以内に、放出されたタンパク質は血小板を「活性化」させ、その表面に付着構造を発現させ、損傷部位に結合し、さらなる血液損失を防ぐ「プラグ」を形成し始める。さらに、活性化された血小板は、カスケード効果でさらに循環する血小板を補充および活性化するためのさらなる化学シグナルを放出し、これらの血小板は損傷部位または他の活性化血小板のいずれかに結合する。

血管内血栓は、止血プロセスの病理学的障害から生じる。多くの場合、乱流、異物と循環血小板との相互作用、損傷した血管壁からのシグナル伝達タンパク質の放出などにより、血管内で血小板の活性化、付着、凝集が起こる。これらの血小板が活性化されると、さらに成長する血栓に付着する循環血小板がさらに活性化されるため、血管の閉塞が発生し、血流が制限または完全に止められる。これらの条件は、通常６００ｍＬ／分未満の低体積流量の血管で悪化する。これが起こるのは、成長中の血栓の近くに長時間にわたって残っている循環血小板、および流動の低下による付着血小板のせん断応力の低減により、活性化血小板が除去される可能性が低下するためである。

米国特許出願公開第２０１０／０２８０５９４号明細書 国際公開第２０１４／１８５７７９号

Dobrovolskaia et al, 2012 Nanoparticle size and surface charge determine effects of PAMAM dendrimers on human platelets in vitro. Molecular pharmaceutics. 2012;9(3): 382-393. doi:10.1021/mp200463e

本発明は、血栓形成性が非常に低下した血管移植片を提供することにより、当分野の技術に進歩をもたらす。

血栓形成作用を低減するための心血管移植片が、冠動脈バイパス移植片または透析アクセス用の動静脈移植片などの用途のために提供される。心臓血管移植片は、柔らかいブロックと共有結合した硬いブロックを有する超分子化合物の繊維状ネットワークで作られた内壁を備えた管状構造を含む。前記硬いブロックは、２－ウレイド－４［１Ｈ］－ピリミジノン（ＵＰｙ）化合物を含む。前記硬いブロックは、前記ＵＰｙ化合物に対して１～５の範囲、より好ましくは１．５～３の範囲の鎖延長部を含み得る。前記柔らかいブロックは、生分解性ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（オルト）エステル、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート、またはこれらの任意の組み合わせを含む。前記柔らかいブロックの分子量の範囲は、５００～３０００Ｄａである。

前記繊維状ネットワークは、平均繊維径が１～１０μｍの繊維を有する生体吸収性の電界紡糸不織繊維ネットワークである。前記管状構造は、２～８ｍｍの内径と、２００～９００μｍの壁厚を有する。

前記実施形態の別の変形形態では、前記内壁は細孔を有し、前記内壁の平均有孔度が５０～８０％であり、前記細孔の平均細孔径は５～８μｍである。

前記実施形態のさらに別の変形携帯では、前記管状構造の内径は３～６ｍｍで、前記管状構造の壁厚は２００～８００μｍである。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記管状構造の内径は４～８ｍｍで、前記管状構造の壁厚は３００～９００μｍである。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記管状構造の内径は５ｍｍ以下である。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記繊維の平均繊維径が、４～８μｍである。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記繊維の平均繊維径が、４～６μｍである。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記内壁は疎水性であり、前記内壁の水接触角は１１０～１４０度である。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記管状構造は、前記心血管移植片の崩壊を防ぐ耐性を提供するための編組構造、ポリマーストランド、化合物、またはこれらの組み合わせによって補強された外壁を有する。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記心血管移植片は、αＩＩｂβ３阻害剤をさらに含み得る。

前記実施形態のさらに別の変形形態では、前記心血管移植片の移植は、αＩＩｂβ３阻害剤の投与と組み合わせて行われ得る。

図１Ａ～図１Ｃは、ＰＴＦＥ不織布と比較した、本発明の例示的実施形態による超分子ポリマー（ＳＰ）ミクロン（μｍ）およびサブミクロン電界紡糸繊維上の血小板付着および活性化のＳＥＭ画像（倍率１０，０００倍）を示す。図１Ａは、平均直径４～６μｍのＳＰ電界紡糸繊維での血小板の付着と広がりの様子を高倍率画像を示す。図１Ｂは、平均直径が１μｍ未満のＳＰ電界紡糸繊維の血小板の付着と広がりの様子を高倍率画像で示す。図１Ｃは、平均直径が１μｍ未満の不織布ＰＴＦＥ繊維での血小板の付着と広がりの様子を高倍率画像で示す。 図２Ａ～図２Ｃは、ＰＴＦＥ不織布と比較した、本発明の例示的実施形態による、ＳＰミクロン繊維およびサブミクロン繊維上に広がる血小板を示す。図２Ａは、平均直径が４～６μｍのＳＰ電界紡糸繊維での血小板拡散挙動の低倍率画像を示す。図２Ｂは、平均直径が１μｍ未満のＳＰ電界紡糸繊維での血小板拡散挙動の低倍率画像を示す。図２Ｃは、平均直径が１μｍ未満の不織布ＰＴＦＥ繊維の血小板拡散挙動の低倍率画像を示す。 図３Ａ～図３Ｃは、本発明の例示的実施形態による、血液灌流後の試験材料の表面多孔度の分析方法を示す。各画像は、（図３Ａ）：元のＳＥＭ画像、（図３Ｂ）：図３Ａから切り抜きされ強調されたコントラスト画像、（図３Ｃ）：図３Ｂから生成されたバイナリ画像であり、ＩｍａｇｅＪ（商標）ソフトウェアで自動閾値処理を行って、図３Ｃから絶対黒／白ピクセルとして２７．３５％の全体有孔度を得た。 図４は、本発明の例示的実施形態による、血小板凝集／拡散による血液灌流後の試験材料についてＳＥＭ下で観察される有孔度の低下を、初期有孔度のパーセンテージとして示した図である。 図５は、本発明の例示的な実施形態による、試験表面からの灌流血液中の活性化αＩＩｂβ３の検出を示す。 図６は、本発明の例示的な実施形態による、電界紡糸されたＳＰ材料およびＰＴＦＥ不織布材料への血小板付着を、アブシキシマブの添加ありの場合と添加なしの場合で、複数の倍率でのＳＥＭ画像を示す。 図７Ａ～図７Ｃは、本発明の例示的実施形態による、ヘパリンを投与した動物（図７Ａ）、ヘパリンおよびアスピリン（商標）を投与した動物（図７Ｂ）、およびヘパリン、アスピリン（商標）およびプラビックス（商標）を投与した動物（図７Ｃ）に移植して得たサンプルのＳＥＭ画像拡大図（２５０倍）を示す。 図８Ａは、本発明の例示的な実施形態に従って、６ヶ月間移植した後の６ｍｍの頸動脈介在移植片の血管造影を示し、矢印は遠位部（上）および近位部（下）吻合を示す。 図８Ｂは、発明の例示的な実施形態に従って、６ヶ月間移植した後の６ｍｍの頸動脈介在移植片の血管造影を示し、矢印は遠位部（上）および近位部（下）吻合を示す。 図８Ｃは、発明の例示的な実施形態に従って、６ヶ月間移植した後の７ｍｍの頸動脈介在移植片の血管造影を示し、矢印は遠位部（上）および近位部（下）吻合を示す。 図９は、本発明の例示的実施形態による、３６週間移植した６ｍｍおよび７ｍｍの頸動脈介在移植片について、遠位吻合の直前に測定された移植片の内径を示す。 図１０は、本発明の例示的実施形態による小径移植片における細孔径に対する漸増注入量のデータを示し、細孔の大部分の細孔径が５～１０μｍの範囲にあることを示している。本発明による心臓血管移植片の平均細孔径は、肺動脈弁で観察される、すなわち望ましい大きさとは異なる。 図１１は、例示的実施形態による繊維の整列によって耐疲労性を増加できることを示す図であり、耐疲労性は、ＩＳＯ ５８４０にそった大動脈条件下での超分子ポリマーバルブの加速摩耗テスター（ＡＷＴ）における故障までのサイクル数として表される。

本発明は、超分子ポリマー（ＳＰ）から製造された電界紡糸メッシュを有することによって血栓形成性が非常に低下した心臓血管移植片に関する。好ましくは、血管移植片は、不織メッシュおよび／または大径繊維である。本発明はまた、電界紡糸を介してそのような移植片を製造する方法に関する。本発明はさらに、血管バイパス／再構築、または透析処置、および小径血管の他の障害の処置のための静脈アクセスの反復を可能にする人体への血管移植片の移植に関する。

心臓血管移植片の設計について、以下に定義するように、本発明者らは、ＳＰから製造された血管移植片での予期しない血小板の挙動を本明細書で実証および説明した。ＰＴＦＥなどの広く利用可能な「生体適合性」材料とは全く異なり、血小板の活性化と付着は、顕著な広がり、凝集、または糸状仮足の形成なしに観察された。このような結果は、血栓および／または狭窄が重要な問題となる小径移植片に理想的な材料であることを証明している。さらに、採用されたＳＰ材料は生体吸収性であり、組織の浸潤と再成長が可能となる。これにより、長期の再構築、新生内膜形成、血管の狭窄を引き起こす継続的な炎症反応のリスクが大幅に軽減される。

［血栓形成作用を抑制するための心血管移植片の定義］
血栓形成作用を低減するための心臓血管移植片は、柔らかいブロックと共有結合した硬いブロックを有する超分子化合物の繊維状ネットワークで作られた内壁を備える管状構造によって定義される。硬いブロックは、２－ウレイド－４［１Ｈ］－ピリミジノン（ＵＰｙ）化合物を含む。繊維状ネットワークは、平均繊維径が１～１０μｍの繊維を有する生体吸収性の電界紡糸不織繊維ネットワークである。管状構造は、２～８ｍｍの内径と、２００～９００μｍの壁厚を有する。

心臓血管移植片のバリエーションは、個別の、または該当する場合は任意の組み合わせでの、以下の構造的側面によって定められる。
・厚さが少なくとも２０μｍで、平均細孔径が５～１０μｍの内壁。
・平均細孔径が５～８μｍで、平均有孔度が５０～８０％の細孔を有する内壁。
・内径が３～６ｍｍで壁厚が２００～８００μｍの管状構造。
・内径が３～８ｍｍで壁厚が３００～９００μｍの管状構造。
・内径が５ｍｍ以下の管状構造。
・４～８μｍの、または４～６μｍの平均繊維径の繊維。
・生分解性ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（オルト）エステル、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート、またはそこれらの任意の組み合わせを含む柔らかいブロック。
・５００～３０００Ｄａの分子量の柔らかいブロック。
・ＵＰｙ化合物に対して１～５の範囲、より好ましくは１．５～３の範囲の鎖延長部を含む硬いブロック。
・移植片の内壁が疎水性であり、内壁の水接触角は１１０～１４０度であること。
・心血管移植片が、冠動脈バイパス移植片であること。
・管状構造が、心血管移植片の崩壊を防ぐ耐性を提供するための編組構造、ポリマーストランド、化合物、またはこれらの組み合わせによって補強された外壁を有すること。
・心血管移植片が、血栓形成作用をさらに低減させる、αＩＩｂβ３阻害剤をさらに含むこと。
・心血管移植片が、血栓形成作用をさらに低減させる、αＩＩｂβ３阻害剤の投与と組み合わせとして提供されること。

本明細書で言及される超分子ポリマー（ＳＰ）としては、ウレイド－ピリミジノン（ＵＰｙ）四重水素結合モチーフおよびポリマー骨格、例えば生分解性ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（オルトエステル）、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、およびポリプロピレンフマレートからなる群から選択されるポリマー骨格を含み得る。ポリエステルの例としては、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ－ラクチド）、ポリ（ＤＬ－ラクチド）、ポリ（バレロラクトン）、ポリグリコリド、ポリジオキサノン、およびそれらのコポリエステルが挙げられる。ポリカーボネートの例としては、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ジメチルトリメチレンカーボネート）、ポリ（ヘキサメチレンカーボネート）が挙げられる。

同じ血小板の付着の低下が、特性を慎重に選択し、必要な表面特性を確保するために材料を処理した場合に代替の非超分子ポリマーとともに発生し得る。これらのポリマーとしては、生分解性または非生分解性のポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（オルトエステル）、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート等が挙げられる。ポリエステルの例としては、ポリカプロラクトン、ポリ（Ｌ－ラクチド）、ポリ（ＤＬ－ラクチド）、ポリ（バレロラクトン）、ポリグリコリド、ポリジオキサノン、およびこれらのコポリエステル等が挙げられる。ポリカーボネートの例としては、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ジメチルトリメチレンカーボネート）、ポリ（ヘキサメチレンカーボネート）等が挙げられる。

さらに、移植片の管腔表面の形態は、血栓形成特性に重要な役割を果たす。ヒトの血液を用いて試験管内で行われた実験により、不織布メッシュの繊維径が重要であり、４～６μｍの大径繊維が小径繊維よりも好ましいことが明らかになった。

［超分子ポリマーで作られた足場上の血小板凝集］
さまざまな表面形態の電界紡糸ＳＰ材料のサンプルを、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）でコーティングされたＰＥＴシートにコーティングした。これらのサンプルは、一定せん断率のフローセルを介して、トロンビンの活性化を阻害するために３．２％クエン酸塩を含むヒト血液に灌流にさらし、血小板の挙動を具体的に調査できるようにした。灌流の３０分後、フローセルを取り外し、エタノール脱水を用いて材料の表面を固定し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で特性評価した。ネガティブコントロールは、サンプル被覆なしのＰＥＴ－ＩＴＯシート上で実施され、有意な血小板付着を示さなかった。ポジティブコントロールは、コラーゲンでコーティングしたＰＥＴ－ＩＴＯ上で実施され、有意な血小板クラスター形成を示した。すべての実験は、複数の健康な献血者を対象に３回反復して行われた。

電界紡糸ＳＰメッシュは、市販のＰＴＦＥ不織布材料と比較して、血小板活性の大幅な低下を示した。この効果は、直径の大きい繊維で最も明確であったが、ＰＴＦＥ不織布と同様の形態で、サブミクロン繊維でも広がりの減少は明らかであった。ＳＰ繊維および不織布ＰＴＦＥへの血小板付着のＳＥＭ画像を高倍率（１０，０００倍）で示す。繊維への血小板の付着と活性化が明確に観察されるが、ＰＴＦＥ不織布と比較して、血小板の凝集と拡散は著しく低下している。すべての基体の低倍率（１，０００倍）ＳＥＭ画像も示されており、より広い領域での血小板の拡散と凝集の減少を示している。

ＵＰｙベースの電界紡糸繊維は、同様の形態の市販の生体適合性材料と比較して、ヒトの血液中の血小板の拡散と凝集の減少を示す。観察された血小板の挙動は通常とは異なり、組織の再構築を達成するための生体吸収性デバイスに非常に適合している。活性化された血小板コーティングの存在により、その後の再構築段階と再上皮化が誘発される。しかし、活性血小板層が存在すると、しばしば重篤な血栓形成反応をもたらし、合成材料で構成される小径導管の急速な閉塞をもたらす。従って、この実証された血小板反応は、生体吸収性基材上での新生組織の形成にとって理想的な状況を表しており、これは完全な非血栓形成性の生体表面をもたらすものと理論化されている。さらに、超分子ケミストリの性質により合成ポリマーの機械的特性にある程度の柔軟性がもたらされ、これにより、デバイスの特性の調整可能性が向上し、血液反応がさらに改善される。

試験材料上の血液製剤の表面被覆率の定量化は、ＳＥＭで観察された表面の総有孔度の減少の分析に基づくものとした。ＩｍａｇｅＪ（商標）ソフトウェアを使用して分析を実施し、その段階の概要は図３Ａ～図３Ｃに記載されている。簡単に述べると、ＳＥＭ画像は、切り抜きとコントラスト強調、およびバイナリ画像（黒または白のピクセルのみを含む画像）への変換によって作成される。このバイナリ画像を、ＩｍａｇｅＪ（商標）の「閾値」機能、イメージ内の黒ピクセルの総数をカウントする機能を用いて分析する。このプロセスは、血液灌流前のサンプル表面の３つの特徴的なＳＥＭ画像に対して行われ、血液灌流後の表面のＳＥＭ画像と有孔度の変化が報告される。図４は、表面上への灌流後のすべての材料サンプルにおける血液製剤による表面コーティングによる有孔度の減少を示している。

トロンビン不活性化ヒト血液を使用した血流実験に加えて、全血を使用して静的実験を実施した。これらの実験では、健康なドナーからの血液を、試験材料のサンプルとともに９６ウェルプレートに入れた。サンプルチャンバを振盪インキュベータで３７℃で２０分間インキュベートした後、ピペットで血液を取り出し、フローサイトメトリーで特性評価した。

これらの実験では、電界紡糸ＳＰ材料とともにインキュベートした血液中の糖タンパク質αＩＩｂβ３の場合の細胞接着は、不織布ＰＴＦＥからの流出血液サンプルの場合と比較して予想外の５０％の減少が示され、また他の接着糖タンパク質、Ｐ－セレクチンの接着低下は観察されなかった（図５）。

［インテグリンαＩＩｂβ３の不活性化による超分子ポリマーの繊維への血小板付着の非常に効果的な阻害］
さまざまなサンプルでの全血実験のサイトメトリーから生じる結果に基づいて、電界紡糸ＳＰ繊維による血小板活性化および接着は、インテグリンαＩＩｂβ３に強力にかつ特異的に依存するという仮定が得られた。

付着のメカニズムを確認するために、αＩＩｂβ３の阻害剤であるアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（商標））を、臨床的に適切な用量である１０μｇ／ｍｌのクエン酸入りの健康な血液に加えた。続けて、制御されたせん断速度フローセルを３０分間使用して、繊維径４～６μｍの電界紡糸不織布ＳＰ材料のサンプル材料および不織布ＰＴＦＥのサンプルに血液を灌流した。フロー後、走査型電子顕微鏡を使用してサンプルを固定し、かつ画像化し、血小板付着を直接的な可視化できるようにした。アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ（商標））の添加により、対照と比較して血小板接着が大幅に減少した（図６）。さらに、その効果は、ＰＴＦＥ不織布繊維材料の場合と比較して大幅に誇張された。生理学的に適切な用量での臨床的に利用可能な単一の薬剤（ＲｅｏＰｒｏ（商標））を用いて合成ポリマー材料（ＸＰ）への血小板の付着をほぼ完全な阻害する能力が得られることは、さまざまな血液接触用途に適用できる新発見であると考えられる。

上記のＳＥＭ画像からカウントした試験材料への吸収された血小板の数は、ＰＴＦＥ不織布の場合の７８％（２３６から５１）と比較して、アブシキシマブの追加後のＳＰ電界紡糸材料で９７％の減少（２２６から６）を示した。灌流後の糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａレベルに関する試験管内での血栓形成試験の上記データとともに、電界紡糸ＳＰ材料の血小板吸収阻害剤としてのアブシキシマブの明らかな特定の有効性に基づいて、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａの阻害を標的とする作用メカニズムを有するあらゆる抗血小板化学療法薬が、ＳＰ電界紡糸材料に対して同様に誇張された効果を発揮することが提示されている。この拡張される効果のメカニズムは明確でないが、見かけの表面電荷密度の違いおよび／またはＳＰ電界紡糸材料の関連する疎水性によってもたらされると仮定されている。表面電荷密度、または材料表面の単位面積あたりの電荷は、タンパク質の結合に影響することが知られている。この効果は、これらのタンパク質内の電荷分布が、異なった表面／同様に帯電した表面からの誘引効果／反発効果をそれぞれもたらすために発生する。さらに、かなりの程度の表面粗さを示す材料は、平坦な表面からのマイクロスケールの突起や、これらの表面のナノスケールの粗さや突起などの曲率領域で総電荷密度が増加するため、この効果をさらに誇張または悪化させる可能性がある。血小板活性化に対する表面電荷のこのような効果は、樹状突起の合成ポリマーに関する文献、Ｄｏｂｒｏｖｏｌｓｋａｉａら，２０１０（非特許文献１）で確立されている。

さらに、電界紡糸繊維およびポリマーコーティングにアブシキシマブなどの化学療法剤を含めることが知られている（特許文献１）。ＳＰ電界紡糸材料と糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤、特にアブシキシマブとの間に明らかな特異的相互作用があるので、この方法により非常に効果的な抗血栓効果が実現され得る。生体吸収性の電界紡糸超分子構築物と、アブシキシマブまたは糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害を標的とする他の化合物との組み合わせは、この組み合わせにより、冠動脈バイパス移植などの用途で、従来は不可能であった身体自身の組織の再生が可能となり得るので特に効果的であると予想される。そのような化学療法剤を含める他の方法も同様に可能であると考えられ、そのような方法としては、限定しないが、共有結合か、または繊維表面での吸収、不織布表面にコーティングされたキャリア材料に含められることで電界紡糸繊維材料への取り込みも含まれる。さらに別の可能な方法は、経口投与、静脈内投与またはその他の方法で化学療法剤を投与することである。この投与は、心臓血管移植片の移植前、移植中、または移植後に行うことができる。

［大型動物モデルにおける電界紡糸超分子ポリマー（ＳＰ）材料の小径移植片の血栓閉塞における血小板の役割］
電界紡糸ＳＰ材料の小径移植片の生体内の血栓閉塞における血小板の役割を実証するため、血小板の抑制を目的としたさまざまな投薬戦略をもって、ヒツジモデルに冠動脈バイパス移植片として４ｍｍ移植片を移植した。比較的低い流量（一般に＜１２０ｍＬ／分）と、湾曲した移植片経路と、小さい直径との組み合わせが、合成移植片の最悪のシナリオを示すと予想され、これにより生体内での抗血小板治療の有効性を否定的に評価することが可能となる。

手術の前に、ヘパリン、アスピリン（商標）およびプラビックス（商標）の組み合わせを動物に投薬した。ヘパリンはトロンビンの発生による凝固経路の確立された阻害剤であるため、観察されたすべての凝固反応は血小板の発生によるものとみなすことができる。アスピリンとプラビックスは両方とも二次血小板活性化に作用するが、これは活性化血小板がさらに循環する血小板を活性化する能力である。プラビックスはより強力な薬剤である。移植片は、外植、固定、および組織学およびＳＥＭを介した特性化の前に４時間移植された。図７に見られるように、血小板抑制処置の増加により、移植片の不織布表面での血栓形成が大幅に減少した。これらの結果は、血小板の活性化と凝集が生体内の血栓形成の主要なメカニズムであることを示している。

［大型動物モデルにおけるＳＰ電界紡糸材料の小径移植片の長期の血栓応答］
ＳＰ電界紡糸材料の６および７ｍｍ移植片を含む小径移植片をヒツジモデルの頸動脈介在物として（それぞれｎ＝４およびｎ＝２）移植し、小径移植片の長期血栓形成反応を実証する。移植直後に血管造影と超音波検査により、そしてその後０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、およびその後は１か月に１回の超音波検査により移植片の開通性を評価した。移植片の近位部、遠位部、および中間部を、この期間の内腔直径の変化について評価した。試験動物の半分を６ヶ月時点で屠殺し、肉眼的組織学的特性化のために移植片を外植し、残りの動物は１２ヶ月で屠殺し外植する計画とした。

動物は、手術時に開始して、１日２回９０日間にわたって０．４ｍＬの「Ｌｏｖｅｎｏｘ（登録商標）」エノキサパリン（商標）（低分子量ヘパリン）を投薬し、かつ屠殺まで１日１回、１２５ｍｇのアスピリン（商標）を投薬した。

図８に見られるように、血管造影は、６ヶ月の時点で外植前に移植片の良好な開通性を示した。図９は、試験過程にデータをとった遠位吻合（血栓性閉塞が最も起こりやすい）の直径を示す。

［超分子ポリマーの製造方法］
例示的な一実施形態では、超分子ポリマーは、２０１７年１２月２８日出願の米国特許米国仮出願第６２／６１１４３１号に記載されているレシピの１つを使用して作成することができ、当該米国特許出願は、本願が出願する優先権の基礎出願であり、その全内容は、参照により本明細書の一部とする。

これらのレシピによれば、超分子化合物は、柔らかいブロックと共有結合した硬いブロックとして定義される。硬いブロックはＵＰｙ部分をベースとしている。柔らかいブロックは、超分子化合物の骨格である。特にポリカプロラクトンと比較して、本発明の意図および目的に対して驚くほどの有利な効果を示したため、ポリカーボネート（ＰＣ）を使用した。

柔らかいブロックと硬いブロックの比率は、材料特性に影響する。ここでは、硬いブロックセクション内の構成成分の比率が耐久性などの特性に大きな影響を与えることを説明する。ここでは、硬いブロック内の当該比率と、機械的特性（耐久性）を向上させる柔らかいブロックの形成に使用されるポリマーの長さの特定の組み合わせを説明する。硬いブロック内の２－ウレイド－４［１Ｈ］－ピリミジノン化合物（ＵＰｙ化合物）と鎖延長部との比率（Ｒ）は、ＵＰｙ化合物に対して鎖延長部が１．５～３の範囲である。

［ＰＣＬポリマー－ＸＰ１］
分子量８００ｇ／ｍｏｌ（３０．０ｇ、３７．５ｍｍｏｌ、真空下で乾燥）のテレケリックヒドロキシ末端ポリカプロラクトン、１，６－ヘキサンジオール（４．４ｇ、３７ｍｍｏｌ）、およびＵＰｙ－モノマー（６．３ｇ、３７ｍｍｏｌ）は８０℃で乾燥ＤＭＳＯ（１０５ｍＬ）に溶解した。この反応混合物に、ヘキサメチレンジイソシアネート（１８．８ｇ、１１１．５ｍｍｏｌ）を攪拌しながら添加し、続いて１滴のスズオクトエート（tin dioctoate）を添加した。この反応混合物を８０℃で一晩撹拌した。翌日、反応混合物を２５℃に冷却し、水に混合物を沈殿させるために追加のＤＭＳＯを加えることにより粘度を下げた。ポリマーを白色の弾性固体として収集し、クロロホルム／メタノール（７／３ｖ／ｖ）に再溶解し、過剰のメタノールで再沈殿させた。これにより、５０℃の真空下で乾燥した後、透明な弾性固体が得られた。ＳＥＣ（ＴＨＦ、ＰＳ－標準）：Ｍｎ＝１３ｋｇ／ｍｏｌ、Ｄ＝１．６。国際公開第２０１４／１８５７７９号（特許文献２）も参照。

［ＰＣポリマー］
分子量が５００～３０００ｇ／ｍｌのポリカーボネートで作られたポリマーは、ＸＰ１と同様の方法で合成された。ポリカーボネートの長さと構成成分間の望ましい比率に応じて変更がなされた。モル比は次のように表現できる。Ａ（ポリカーボネート）は１に固定される。Ｂ（鎖延長部）は０～３の間で変えられ、Ｄ（Ｕｐｙ）は０．３～２の間で変えられ、Ｃは、ＡとＢとＤの合計モル量の０．８～１．２倍に常に等しくなる。モル比Ｂ／ＤはＲと表記されている。表１は、前述の指示に従って得られた超分子ポリマーの例（全てを網羅していない）のリストを提示している。

表１ 材料のリスト

例えば、耐久性に影響を与える可能性がある機能は、足場内の繊維の整列である。好ましい繊維の整列は、管状インプラントの場合、軸が血流の方向であるインプラントの仮想的な軸の周りの円周方向である。図１１から、整列により耐疲労性を増加させられることが明確にわかる。好ましい繊維方向と好ましい繊維方向に垂直な線との間の線形弾性剛性比として定義される整列は、最大８：１まで変化した。図１１は、電界紡糸超分子ポリマー心臓弁における整列の比較に基づいているが、同じ原理が心臓血管移植片に適用されると考えられる。

［補足情報］
［１．範囲（耐久性を中心に）］
・モル比Ｒは、０～３の範囲で変化した。１．５を超えるモル比で増強された／最適な耐疲労性が得られた。
・ＰＣの長さは５００～３０００ｇ／ｍｏｌで変化した。ＰＣの長さが１０００の場合、増強された／最良の耐疲労性が得られた。
・鎖延長部の質量比は０～１５で変化した。高ＨＤ比（９ｗ％以上）で増強された／最良の耐疲労性が得られた。

［２．足場構造］
・［厚さ］は、数μｍからｍｍの間で変えることができるが、好ましい厚さは２００～８００μｍ、さらに好ましくは２５０～５５０μｍである（平均３００～５００μｍが良い結果をもたらす）。
・［繊維径］は、１μｍ～２０μｍの広い範囲で得られる。好ましくは、３～１５μｍの範囲で、さらに好ましくは４～１０μｍの範囲で実施する。
・［繊維の整列］は、特に電界紡糸がガイドされていない場合に耐久性を高める別のパラメーターであり、ランダム分布から１：２（円周方向：軸方向）の組織化（軸方向の剛性は周方向の剛性の２倍を意味する）をもたらす。繊維は、無限大：１～１：２の比率で整列できる。耐久性が大幅に向上するため、２：１～８：１の比率で実施することが望ましい。
・［細孔径］：マトリックス材料は、直径が１～３００μｍ、好ましくは５～１００μｍの細孔を含む。
・［有孔度］：マトリックス材料は繊維ネットワークを構成し、有孔度は５０％～８０％である。

［心血管移植片の作製方法］
心臓血管移植片を作製するための例示的な一実施形態では、例えば以下のレシピの１つで得られる超分子ポリマー（ＳＰ）材料を、クロロホルムとヘキサフルオロイソプロパノールの溶媒混合物に１１．５重量％の濃度に溶解する。この溶液は、シリンジポンプを介して、５～１０ｋＶの電圧に維持された平滑末端のステンレス鋼ニードルに供給され、静電駆動のホイップジェットが生成される。このジェットは、１～４ｋＶの負の電圧に帯電した円筒形のコレクターに引き付けられ、非常に多孔性の高い繊維性不織布コーティングが形成される。厚さ０．５ｍｍの電界紡糸ポリマー材料を堆積させた後、先端が柔らかいスパチュラで分離することによりコレクターデバイスからの除去がなされ、壁厚が０．５ｍｍの電界紡糸チューブ状移植片が得られる。

［結論］
本願に記載のデータは、血小板の活性化、付着および拡散に対する本発明の心臓血管移植片の予期しない効果を実証している。既知の生体適合性合成ポリマーと比較した場合の、心臓血管移植片での血小板の発生による血栓形成について定量化可能な減少が実証されている（例：図４：、電界紡糸ＳＰ材料で２７％の有孔度減少、ＰＴＦＥで５９％の有孔度減少）。さらに、特異な細胞接着タンパク質糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａへのこれまで未知で予期せぬ依存性が示されている。この予期しない相互作用は、ＳＰの電界紡糸繊維の表面電荷の結果に基づくものと仮定される。特定の糖タンパク質に対する血小板接着のこの依存性により、細胞接着分子に対してより広範な阻害を必要とするＰＴＦＥなどの既知の生体適合性合成ポリマーとは対照的に、単一の化学療法剤によって血小板の発生による血栓症に強い影響を与えること可能となる。部位特異的かつ非常に効果的な血小板阻害を提供するためのＳＰ材料の電界紡糸繊維によるそのような化学療法剤の組み込みまたは表面吸収について、さらなる調査を行うことが提案されている。

Claims (17)

1. 血栓形成作用を低減するための心血管移植片であって、
   柔らかいブロックと共有結合した硬いブロックを有する超分子化合物の繊維状ネットワークで作られた内壁を備える管状構造を含み、
   前記硬いブロックは、２－ウレイド－４［１Ｈ］－ピリミジノン（ＵＰｙ）化合物を含み、
   前記繊維状ネットワークは、平均繊維径が１～１０μｍの繊維を有する生体吸収性の電界紡糸不織繊維ネットワークであり、
   前記管状構造は、２～８ｍｍの内径と、２００～９００μｍの壁厚を有し、
   前記繊維は、前記管状構造において長手方向の軸を中心とした周方向に、前記周方向の線形弾性剛性の前記周方向に垂直な方向の線形弾性剛性に対する比が１／２以上（但し、２～８の範囲を除く。）となるように整列していることを特徴とする心血管移植片。
2. 請求項１に記載の心血管移植片であって、
   前記心血管移植片は、αＩＩｂβ３阻害剤、ヘパリンおよびアスピリン（商標）の投与と組み合わせて移植されるように適合されることを特徴とする心血管移植片。
3. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記内壁は少なくとも２０μｍの厚さを有し、
   前記内壁は細孔を有し、前記細孔の平均細孔径は５～１０μｍであることを特徴とする心血管移植片。
4. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記内壁は細孔を有し、前記内壁の平均有孔度が５０～８０％であり、前記細孔の平均細孔径は５～８μｍであることを特徴とする心血管移植片。
5. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記管状構造の内径は３～６ｍｍで、前記管状構造の壁厚は２００～８００μｍであることを特徴とする心血管移植片。
6. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記管状構造の内径は４～８ｍｍで、前記管状構造の壁厚は３００～９００μｍであることを特徴とする心血管移植片。
7. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記管状構造の内径は５ｍｍ以下であることを特徴とする心血管移植片。
8. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記繊維の平均繊維径が、４～８μｍであることを特徴とする心血管移植片。
9. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
   前記繊維の平均繊維径が、４～６μｍであることを特徴とする心血管移植片。
10. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    前記柔らかいブロックは、生分解性ポリエステル、ポリウレタン、ポリカーボネート、ポリ（オルト）エステル、ポリホスホエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート、ポリビニルアルコール、ポリプロピレンフマレート、またはそこれらの任意の組み合わせを含むことを特徴とする心血管移植片。
11. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    前記柔らかいブロックの分子量の範囲は、５００～３０００Ｄａであることを特徴とする心血管移植片。
12. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    前記硬いブロックは、前記ＵＰｙ化合物に対して１～５の範囲の鎖延長部を含むことを特徴とする心血管移植片。
13. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    前記内壁は疎水性であり、前記内壁の水接触角は１１０～１４０度であることを特徴とする心血管移植片。
14. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    冠動脈バイパス移植片であることを特徴とする心血管移植片。
15. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    透析アクセスのための動静脈移植片であることを特徴とする心血管移植片。
16. 請求項１または２に記載の心血管移植片であって、
    前記管状構造は、前記心血管移植片の崩壊を防ぐ耐性を提供するための編組構造、ポリマーストランド、化合物、またはこれらの組み合わせによって補強された外壁を有することを特徴とする心血管移植片。
17. 請求項１に記載の心血管移植片であって、
    前記心血管移植片の移植が、αＩＩｂβ３阻害剤の投与と組み合わせて行われるようにαＩＩｂβ３阻害剤をさらに含むことを特徴とする心血管移植片。

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