JP7187240B2

JP7187240B2 - 液滴生成装置、液滴生成方法及びプログラム

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Publication number: JP7187240B2
Application number: JP2018189457A
Authority: JP
Inventors: 久子元木; 二郎立山; 尚史海老澤; 浩城井
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2018-10-04
Filing date: 2018-10-04
Publication date: 2022-12-12
Anticipated expiration: 2038-10-04
Also published as: JP2020058956A

Description

本明細書の開示は、エマルジョン生成に用いられる液滴生成装置、液滴生成方法及びプログラムに関する。

多孔質膜を介して分散相を一定の圧力で押し出すことにより、連続相中にエマルジョンを生成する直接膜乳化法が知られている。

特許第３２４２７７６号

しかしながら、分散相が分裂していると圧力を加えてエマルジョンを生成する時に、多孔質膜、すなわち液滴を生成する生成手段を透過せずに残存する分散相ができてしまうという課題があった。

本明細書の開示は、多孔質膜、すなわち液滴を生成する生成手段を透過せずに残存する分散相を低減することが可能な装置を提供することを目的の一つとする。

なお、前記目的に限らず、後述する発明を実施するための形態に示す各構成により導かれる作用効果であって、従来の技術によっては得られない作用効果を奏することも本明細書の開示の他の目的の一つとして位置付けることができる。

本明細書に開示の液滴生成装置は、液滴を生成する液滴生成装置であって、前記液滴生成装置内部の１つの空間を、液体を注入可能な開口を有する第１の空間と生成された液滴を保持する第２の空間との２つの空間に隔てるように設けられた、前記液体から前記液滴を生成する生成手段と、前記第１の空間を形成する側壁に設けられた導電部と、を備えることを特徴とする。

本明細書の開示によれば、多孔質膜、すなわち液滴を生成する生成手段を透過せずに残存する分散相を低減することが可能となる。

第１の実施形態に係る液滴生成装置の外観の一例を示す図。第１の実施形態における全体の処理手順の一例を示す図。第１の実施形態に係る液滴生成装置の外観の一例を示す図。第２の実施形態に係る液滴生成装置の外観の一例を示す図。第２の実施形態における全体の処理手順の一例を示す図。第３の実施形態における全体の処理手順の一例を示す図。液滴生成工程において水相が残存してしまう状態の一例を示す図。

以下に、本発明の好ましい実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、発明の範囲は図示例に限定されるものではない。

＜実施形態１＞
本実施形態に係る液滴生成装置は、エマルジョンの生成に用いられる液滴生成装置である。具体的には、例えば、油中水型エマルジョンを反応場としてサンプル中に含まれる化合物や粒子といった分析対象物を分析する核酸試料デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ：ｄｉｇｉｔａｌＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｉｏｎ）法で用いることができる。デジタルＰＣＲ法では、分析の対象とする核酸を含む試料を、核酸を増幅するための増幅試薬、核酸を検出するための蛍光試薬などと混合して希釈し、物理的に独立した多数の反応場に分割する。エマルジョンに含まれるそれぞれの液滴はデジタルＰＣＲ法において反応場として用いられることがある。そして、多数の反応場（液滴）のそれぞれにおいて独立にＰＣＲが行われ、核酸が増幅される。増幅後に蛍光試薬により核酸を検出し、当該蛍光試薬のシグナルが検出された反応場の数（陽性反応場数）と、増幅後にシグナルが検出されなかった反応場の数（陰性反応場数）とに基づいて、試料中の核酸の濃度を推定することができる。

以下に示す実施形態は、いずれも液滴生成装置を用いたエマルジョンの生成方法を説明するための一例にすぎず、本明細書の開示は実施形態に限定されるものではない。

図１は、本実施形態に係る液滴生成装置１００の外観の一例を示す図である。

図１（ａ）は、液滴生成装置１００の平面図である。図１（ｂ）は、液滴生成装置１００のＡ－Ａ断面を示す断面図である。

以下、図１（ｂ）を用いて液滴生成装置１００の構成を説明する。

第１の空間１０１は、液滴生成装置１００内において生成部１０４を隔てて分かれる２つの空間のうち、液滴を生成するための液体を注入する開口部側の空間である。すなわち、第１の空間１０１は液体を注入可能な開口を有する。

第２の空間１０２は、液滴生成装置１００内において生成部１０４を隔てて分かれる２つの空間のうち、生成部１０４を介して生成された液滴を保持する側の空間である。すなわち、第２の空間１０２は生成された液滴を保持する。

導電部１０３は、電極であり、金属、半導体、導電性プラスチック等の導電性部材を用いる。注入された水相が生成部１０４上に留まることを考慮すると、導電部１０３は水相が注入される開口部側かつ生成部１０４の近くに備えられていることが望ましい。すなわち、導電部１０３は液体を注入可能な開口を有する第１の空間１０１を形成する側壁に設けられていることが望ましい。特に、生成部１０４の直上付近に備えられていることが望ましい。なお、導電部１０３は、側壁の一部を一周するように設けられていてもよいし、側壁の一部に対になるように設けられていてもよい。より具体的には、対向する１組の部材であってもよい。また、導電部１０３は、側壁に埋め込まれるように設けられていてもよいし、側壁を貫通するように設けられていてもよい。すなわち、注入された水相に対して電圧を印加できるような構成であればいかなる構成でもよい。生成部１０４は、複数の孔を有しており、注入された液体が複数の孔を透過することでエマルジョン、すなわち液滴が生成される。以下、エマルジョンを液滴と記載する。生成部１０４は、膜状の部材に孔が複数２次元的に配置された部材であり、連続気泡の多孔質体や、繊維を縦横に配置したメッシュ、単一部材に貫通孔を配置したマイクロチャンネルなどが使用される。なお、本実施形態における生成部１０４は、乳化膜であることが望ましい。また、生成部１０４として使用される物質の孔の直径は、およそ２０［μｍ］であると望ましいが上記に限定されない。生成部１０４は、液滴生成装置内部の１つの空間を、液体を注入可能な開口を有する第１の空間１０１と生成された液滴を保持する第２の空間１０２との２つの空間に隔てるように設けられた液体から液滴を生成する生成手段の一例に相当する。

さらに、液滴生成装置１００の形状は図１に図示されているものに限定されず、例えば図３のようなカートリッジでもよい。

次に図２を用いて本実施形態における液滴生成システムの全体の処理を説明する。

（ａ）（油相を注入する）
図２（ａ）の工程では、油相注入手段２０１を用いて液滴生成装置１００に連続相となる油相を充填する。油相は、油と界面活性剤とを含む。油相は水相と相溶せず分離する溶剤から成り、典型的には脂肪族炭化水素やシリコーンオイル等のオイルから成る。

また、油相注入手段２０１には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、油相注入手段２０１は、液滴生成装置１００内に油を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。

なお、この工程において、油相は少なくとも生成部１０４が油相に浸かる程度の量が注入されることが望ましい。しかし、油相が注入される量は上記に限定されない。

（ｂ）（水相を注入する）
図２（ｂ）の工程では、水相注入手段２０２を用いて液滴生成装置１００に分散相となる水相を充填する。本実施形態の工程で生成される液滴が、例えば液滴内に含まれる対象物の濃度分析に用いられる場合、水相は例えば反応液で構成される。反応液は水と試料と増幅試薬と蛍光試薬とを含有する。ここでいう試料とは、検体そのものであってもよいし、検体に対して精製や濃縮、分析対象物の化学修飾や断片化など、分析のための前処理や調整を施したものであってもよい。分析対象物は、例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素などが挙げられ、これらが共存していてもよい。分析対象物は、核酸、ペプチド、タンパク質、酵素の少なくともいずれかが共有結合等で結合または付着した分子、マイクロ粒子、ナノ粒子、さらにはウイルス、細菌、細胞などであってもよい。なお、反応液の構成は上記に限定されず、水相は反応液でなくてもよい。水相注入手段２０２には、シリンジ等の所定の容量の液体を吐出する手段や、流路内の空気を加圧または減圧するポンプやポンプとバルブの組み合わせなどを用いることができる。すなわち、水相注入手段２０２は、液滴生成装置１００内に水相を注入できる機能を有する任意の手段により実現される。

また、本工程において注入される水相は極力分裂していないことが望ましいため、水相注入手段２０２により液滴生成装置１００に近い位置から水相を注入することが望ましい。

（ｃ）（水相を合一させる）
図２（ｃ）の工程では、分裂した水相を合一させるために電圧を印加する。ここで、分裂した水相を合一させる理由について図７を用いて説明する。

図７（ａ）は、注入した水相が２つに分裂しており、大きい水相の上に小さな水相が乗っている様子の一例を示している。この状態で図２（ｄ）の加圧工程を行うと大きい水相が多孔質膜を透過した後に残る小さい水相には圧力が十分にかからないため、多孔質膜を透過せずに残存してしまう。なお、水相が分裂している数は一例であり、３つ以上に分裂している場合でも同様である。

図７（ｂ）は、注入した水相が３つに分裂しており、分裂した水相同士が重なり合っている様子を示している。この状態で図２（ｄ）の加圧工程を行うと図２（ａ）で注入した水相同士の重なりの間にできる隙間に油相のパスができ圧力が逃げてしまうため、水相が多孔質膜を透過せずに残存してしまう。

上記のように水相が分裂していると液滴を効率よく生成することができないため、この工程で水相を合一させる。

具体的には、電源２０３に接続された導線部２０４を導電部１０３につなぎ電極間で電位差を発生させることにより前工程で注入された水相に対して電圧を印加する。

上記によると、電圧を印加して水相の表面に帯電している電荷を移動させることにより、水相が分裂した状態であってもそれぞれの界面状態が不安定になるため水相を合一させることができる。

なお、印加する電圧の強さは１ｋＶ以上であることが望ましい。また、電圧印加時間は１ｎｓ以下であることが望ましい。さらに、電圧印加の波形はパルス波形であることが望ましい。

また、本実施形態においては水相を合一させる手段として静電気を用いたが、例えば、超音波、磁気、振動または温度変化等の手段でもよい。すなわち、水相を合一させることができる手段であれば上記に限定されない。また、静電気で合一させる場合には電気絶縁性が高い材質が好ましいため、液滴生成装置１００の材質はガラス、ポリカーボネート樹脂（ＰＣ）、シクロオレフィンポリマー樹脂（ＣＯＰ）、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）、ポリ塩化ビニル樹脂（ＰＶＣ）、ポリエチレンテレフタレート樹脂（ＰＥＴ）、ポリジメチルシロキサン樹脂（ＰＤＭＡ）などを用いることが望ましい。電気絶縁性部材を用いることで、水相以外に電気が流れてしまい水相に電圧がかからないことを防ぐことができる。

（ｄ）（液滴を生成する）
図２（ｄ）の工程では、駆動手段２０５が開口部から液滴生成装置１００内を加圧することにより、液滴生成装置１００内に充填された水相を駆動させる。すると、生成部１０４上面に充填された水相が生成部１０４を透過し液滴が生成される。

なお、駆動手段２０５は油相注入手段２０１もしくは水相注入手段２０２を用いてもよいし、これらとは異なる手段を新たに用いてもよい。すなわち、駆動手段は圧力を加えることで液体の駆動が可能な手段であれば種々の手段を用いることができる。

また、駆動手段２０５には耐圧栓をつけることで圧力の抜け漏れを防ぐことができるが、耐圧栓は必ずしも必要ではない。

上記によれば、多孔質膜を用いて液滴を生成する場合であっても、水相を合一させることで液滴生成時に油相が通過するパスができにくくなる。すなわち、加圧した圧力が逃げづらくなるため多孔質膜を透過せずに残存する分散相を低減することができる。すなわち、水相を合一させることにより液滴を効率よく生成することができる。

また、注入された水相から生成されうる液滴の数が増えるため、液滴を反応場として用いた定量分析の分析精度を向上させることができる。

さらに、分析に用いられる水相から無駄なく液滴を生成することができるため試料ロスによるコスト上昇を防ぐことができる。

＜実施形態２＞
本実施形態に係る液滴生成装置は、実施形態１と同様にエマルジョンの生成に用いられる液滴生成装置である。本実施形態に係る液滴生成装置４００は図４に示すように筒状になっており、生成された液体を保持する容器５０１が別体となっていることを特徴とする。

図４に示す液滴生成装置４００は、図１（ｂ）と比較して生成した液滴を保持する第２の空間１０２を有さない以外は図１（ｂ）と略同様であるため詳細な説明は省略する。例えば、導電部１０３は導電部４０３に相当し、生成部１０４は生成部４０４に相当する。また、本実施形態において導電部４０３と生成部４０４については図４（ｂ）、（ｃ）に示すようにどの部分に備えられていてもよい。すなわち、液体を注入可能な第１の開口および第２の開口の間に備えられていればよい。なお、上述の第１の開口および第２の開口の間とは第１の開口もしくは第２の開口に備えられている場合も含む。なお、注入された水相が生成部４０４上に留まることを考慮すると導電部４０３は水相が注入される開口部側かつ生成部４０４の近くに備えられていることが望ましい。すなわち、生成部４０４を隔てて第１の開口側の側壁に設けられていることが望ましい。さらに、生成部４０４から第１の空間を形成する側壁の鉛直方向の高さの半分以下の高さに設けられていることが望ましく、特に、生成部４０４の直上付近に備えられていることが望ましい。また、上記は、しかし、導電部４０３と生成部４０４の位置関係は上記に限定されず、水相を合一させることができるのであれば、例えば図４（ｄ）に示すように導電部４０３は生成部４０４を隔てるように配置されていてもよい。すなわち、導電部４０３は、２つの部材を含み、一方の部材と前記一方とは異なる他方の部材とが生成部４０４を隔てて側壁に設けられていてもよい。すなわち、液滴を生成する前に水相を合一させることができるような構成であればよい。

図５は実施形態２における液滴生成の処理の手順の一例を示している。本実施形態では図２（ａ）の工程を省略して図示してある。

上記理由は、実施形態１の液滴生成装置１００は、液滴を生成する際に第２の空間１０２に油相が注入されている必要があったが、本実施形態の液滴生成装置４００は、油相を注入する容器５０１が別体となっているため工程の順序が限定されないためである。具体的には、油相を注入してある容器５０１に液滴生成装置４００を浸してから水相を注入してもよい。また、水相を注入した液滴生成装置４００を容器５０１にいれ、その後に油相を容器５０１に油相を注入してもよい。

上記以外の他の処理は図２と略同様であるため詳細な説明は省略する。

また、図５に示す液滴生成システムは、図２に示す液滴生成システムと構成は略同様である。例えば、水相注入手段２０２は水相注入手段５０２に相当し、電源２０３は電源５０３に相当し導線部２０４は導線部５０４に相当し、駆動手段２０５は駆動手段５０５に相当する。

本実施形態によれば、生成された液滴を保持する容器の形状によらず液滴生成が可能となる。また、容器の交換が容易であるため効率的に液滴を生成することができる。

＜実施形態３＞
本実施形態に係る液滴生成装置は、実施形態１，２と同様にエマルジョンの生成に用いられる液滴生成装置である。実施形態１，２では水相を合一させるために導電部を液滴生成装置に設けている、電源に接続された導線部を導電部につなぎ電極間で電位差を発生させることにより水相に対して電圧を印加した。しかし、本実施形態においては液滴生成装置に電極を設けない形態を示す。

図６は実施形態３における液滴生成システムを用いた液滴生成の処理の手順の一例を示す図である。図６（ｃ）に示すように実施形態３では水相に直接導線を接触させることで直接電圧を印加する構成となっている。図６（ｃ）に示す導線は不図示のＣＰＵもしくはプロセッサと接触位置を観察する観察装置により、液滴生成装置内の水相に接触するように位置が制御される。なお、図６（ｃ）以外の処理は図２（ａ）、（ｂ）、（ｄ）と略同様であるため詳細な説明は省略する。また、本実施形態に係る液滴生成システムは、図２に示す液滴生成システムと構成は略同様である。

例えば、油相注入手段２０１は油相注入手段６０１に相当し、水相注入手段２０２は水相注入手段６０２に相当し、電源２０３は電源６０３に相当し、導線部２０４は導線部６０４に相当し、駆動手段２０５は駆動手段６０５に相当する。

本実施形態によれば、水相に直接電圧を印加するため確実に水相を合一させることが可能となる。導線部６０４を操作して分裂した水相同士が接する部分に直接電圧を印加することができるため、確実に水相を合一させることが可能となる。

＜その他の実施形態＞
本明細書の開示は、上述の実施形態の１以上の機能を実現するプログラムを、ネットワーク又は記憶媒体を介してシステム又は装置に供給し、そのシステム又は装置のコンピュータにおける１つ以上のプロセッサがプログラムを読出し実行する処理でも実現可能である。また、１以上の機能を実現する回路（例えば、ＡＳＩＣ）によっても実現可能である。

上述の各実施形態における情報処理装置は、単体の装置として実現してもよいし、複数の装置を互いに通信可能に組合せて上述の処理を実行する形態としてもよく、いずれも本発明の実施形態に含まれる。共通のサーバ装置あるいはサーバ群で、上述の処理を実行することとしてもよい。液滴生成装置および液滴生成システムを構成する複数の装置は所定の通信レートで通信可能であればよく、また同一の施設内あるいは同一の国に存在することを要しない。

本明細書に開示の実施形態には、前述した実施形態の機能を実現するソフトウェアのプログラムを、システムあるいは装置に供給し、そのシステムあるいは装置のコンピュータが該供給されたプログラムのコードを読みだして実行するという形態を含む。

したがって、実施形態に係る処理をコンピュータで実現するために、該コンピュータにインストールされるプログラムコード自体も本発明の実施形態の一つである。また、コンピュータが読みだしたプログラムに含まれる指示に基づき、コンピュータで稼働しているＯＳなどが、実際の処理の一部又は全部を行い、その処理によっても前述した実施形態の機能が実現され得る。

また、本明細書の開示は上記実施形態に限定されるものではなく、本明細書の開示の趣旨に基づき種々の変形（各実施例の有機的な組合せを含む）が可能であり、それらを本明細書の開示の範囲から除外するものではない。即ち、上述した各実施例及びその変形例を組み合わせた構成も全て本明細書に開示の実施形態に含まれるものである。

Claims

連続相と複数の分散相とを含む液体から、前記連続相中に液滴を生成する液滴生成装置であって、
前記液滴生成装置の内部の１つの空間を、前記複数の分散相を注入可能な開口を有し前記液体を保持する第１の空間と、前記連続相中に前記液滴を保持する第２の空間との２つの空間に隔てるように設けられ、孔を有する生成手段と、
前記第１の空間を形成する側壁に設けられた導電部と、
を備え、
前記導電部を用いて前記複数の分散相に電圧を印加することにより、前記第１の空間に保持された前記複数の分散相を合一させ、合一した前記複数の分散相を前記孔に通すことで、前記連続相中に前記液滴を生成させることを特徴とする液滴生成装置。
前記生成手段は、合一した前記複数の分散相から、合一した前記複数の分散相よりも小さい液滴を生成することを特徴とする請求項１に記載の液滴生成装置。
前記導電部を用いて、１ｋＶ以上の電圧を前記複数の分散相に印加することを特徴とする請求項１または２に記載の液滴生成装置。
前記導電部を用いて、パルス波形の電圧を前記複数の分散相に印加することを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の液滴生成装置。
前記導電部は、対向して設けられた少なくとも１組の部材であって、電源に接続された前記導電部を用いて、前記複数の分散相に電圧を印加することによって前記複数の分散相を合一させることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の液滴生成装置。
前記導電部は、前記生成手段の直上付近に備えられていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか１項に記載の液滴生成装置。
前記導電部は、前記第１の空間を形成する側壁を貫通するように設けられていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか１項に記載の液滴生成装置。
前記生成手段は、多孔質膜を含むことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の液滴生成装置。
前記液滴生成装置は、前記液滴に含まれる対象物の分析に用いられることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の液滴生成装置。
前記導電部は、２つの部材を含み、一方の部材と前記一方の部材とは異なる他方の部材とが前記生成手段を隔てて前記側壁に設けられていることを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の液滴生成装置。