JP7186656B2 - 細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法に関する。
近年、医薬品の開発において、様々なアミノ酸配列のペプチド（ポリペプチド）のライブラリの中から、特定の疾患に対する治療薬や、標的分子に親和性の高い分子などを選択（探索）することが行われるようになっている。
さらには、抗体などのポリペプチドを機能性分子で化学的に修飾してその機能を拡張した医薬品の開発にも注目が集まっている。例えば、ペプチドは、環状化することで生体内での構造の安定性が向上したり、環状化により構造が安定化することで、標的化合物への親和性や選択性が向上したり、分解酵素に対する耐性や細胞膜透過性が発現したりすることもあることが知られている。
また、医薬品の開発においては、ペプチド、タンパク質、核酸などの様々な有効成分を細胞内に効率良く取り込めるようにする技術も重要である。
有効成分を細胞内に取り込む技術としては、例えば、塩基性アミノ酸を多く含む細胞膜透過性ペプチドのアミノ酸配列を融合する方法や、中心から規則的に分枝した構造を有する樹状高分子であるデンドリマーを用いる方法などが知られている。
有効成分を細胞内に取り込む技術としては、例えば、塩基性アミノ酸を多く含む細胞膜透過性ペプチドのアミノ酸配列を融合する方法や、中心から規則的に分枝した構造を有する樹状高分子であるデンドリマーを用いる方法などが知られている。
細胞膜透過性ペプチドとしては、αヘリックス構造を取り得る天然ペプチドなどが知られている（例えば、非特許文献１参照）。
ここで、天然ペプチドの細胞膜透過性を予測するためには、ペプチドの熱運動（熱ゆらぎ）などを含めた動的な構造変化を考慮する必要があることなどから、従来の技術においては、実際に天然ペプチドを用意して、その天然ペプチドの細胞膜透過性を測定している。このため、従来の技術においては、細胞膜透過性を有する天然ペプチドの探索には、一つ一つのペプチドについて（ウエットな）実験を行う必要があり、天然ペプチドの準備などに伴って、多大な費用（コスト）及び時間が必要となるという問題があった。
ここで、天然ペプチドの細胞膜透過性を予測するためには、ペプチドの熱運動（熱ゆらぎ）などを含めた動的な構造変化を考慮する必要があることなどから、従来の技術においては、実際に天然ペプチドを用意して、その天然ペプチドの細胞膜透過性を測定している。このため、従来の技術においては、細胞膜透過性を有する天然ペプチドの探索には、一つ一つのペプチドについて（ウエットな）実験を行う必要があり、天然ペプチドの準備などに伴って、多大な費用（コスト）及び時間が必要となるという問題があった。
また、ウエットな実験を行うことなく天然ペプチドやタンパク質の動的な構造を予測・解析できる方法としては、例えば、対象とする分子における個々の原子の運動を、コンピュータを用いて計算する方法が知られている。このようなコンピュータを用いた分子シミュレーションを行うことにより、短時間で効率的に天然ペプチドやタンパク質などの分子の動的な構造を評価することができる場合がある。
分子シミュレーションの手法としては、例えば、個々の原子の運動を、ニュートンの運動方程式に基づいて算出する分子動力学法などが知られている。
しかしながら、分子動力学法などの分子シミュレーションを用いて、天然ペプチドの細胞膜透過性を十分な精度で予測（評価）できる技術は確立されていない。
しかしながら、分子動力学法などの分子シミュレーションを用いて、天然ペプチドの細胞膜透過性を十分な精度で予測（評価）できる技術は確立されていない。
Ｍａｒｔａ Ｐａｚｏ ｅｔ ａｌ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ２０１８，５４， ６９１９－６９２２
本発明は、コンピュータを用いた分子シミュレーションにより、細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドを探索可能な細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法を提供することを目的とする。
上記の課題を解決するための手段としての本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は、
細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、ことを含む。
細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、ことを含む。
本発明によれば、コンピュータを用いた分子シミュレーションにより、細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドを探索可能な細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法を提供することができる。
（細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法）
本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は、天然ペプチドの細胞膜に対する透過性が、当該天然ペプチドにおける塩基性残基の分布、より具体的には、アルギニン残基におけるグアニジノ基やリシン残基におけるアミノ基の位置関係と相関を有するという知見に基づくものである。そのため、まず、天然ペプチドの細胞膜に対する透過性と、当該天然ペプチドにおけるグアニジノ基やリシン残基におけるアミノ基の位置関係との相関について説明する。
本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は、天然ペプチドの細胞膜に対する透過性が、当該天然ペプチドにおける塩基性残基の分布、より具体的には、アルギニン残基におけるグアニジノ基やリシン残基におけるアミノ基の位置関係と相関を有するという知見に基づくものである。そのため、まず、天然ペプチドの細胞膜に対する透過性と、当該天然ペプチドにおけるグアニジノ基やリシン残基におけるアミノ基の位置関係との相関について説明する。
＜天然ペプチドの細胞膜透過性＞
細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドとしては、例えば、オクタアルギニン（Ｒ８）などが知られている。Ｒ８は、８つのアルギニン残基で形成されるペプチドである。Ｒ８のように、多数のアルギニン残基を有する天然ペプチドが、細胞膜に対する透過性を有し得ることについて、上記の非特許文献１などで報告されている。
細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドとしては、例えば、オクタアルギニン（Ｒ８）などが知られている。Ｒ８は、８つのアルギニン残基で形成されるペプチドである。Ｒ８のように、多数のアルギニン残基を有する天然ペプチドが、細胞膜に対する透過性を有し得ることについて、上記の非特許文献１などで報告されている。
非特許文献１においては、Ｒ８を細胞膜透過性の基準として、Ｐ１からＰ８と命名された８種類の天然ペプチドについて、細胞膜透過性を評価する実験を行った結果が示されている。非特許文献１には、下記に示すアミノ酸配列を有するペプチドの内、Ｐ７及びＰ８は細胞膜透過性を有し、Ｐ１及びＰ２は細胞膜透過性を有さないことが示されている。
・Ｐ１：ＡＲＡＡＡＡＡＡＲＡＡＡＡＡＡＲ
・Ｐ２：ＡＲＡＬＡＡＬＡＲＡＡＡＡＡＡＲ
・Ｐ７：ＡＲＡＬＡＡＬＡＲＡＬＡＡＡＡＲ
・Ｐ８：ＬＲＡＬＡＡＬＡＲＡＡＡＡＡＡＲ
・Ｒ８：ＲＲＲＲＲＲＲＲ
ここで、上記のアミノ酸配列は、アミノ酸の一文字表記を用いたものであり、「Ａ」はアラニン残基を示し、「Ｒ」はアルギニン残基を示し、「Ｌ」はロイシン残基を示す。
・Ｐ２：ＡＲＡＬＡＡＬＡＲＡＡＡＡＡＡＲ
・Ｐ７：ＡＲＡＬＡＡＬＡＲＡＬＡＡＡＡＲ
・Ｐ８：ＬＲＡＬＡＡＬＡＲＡＡＡＡＡＡＲ
・Ｒ８：ＲＲＲＲＲＲＲＲ
ここで、上記のアミノ酸配列は、アミノ酸の一文字表記を用いたものであり、「Ａ」はアラニン残基を示し、「Ｒ」はアルギニン残基を示し、「Ｌ」はロイシン残基を示す。
ここで、天然ペプチドについては、強い塩基性を示すアルギニン残基及びリシン残基の少なくともいずれかを多く含むものが、細胞膜透過性を有しやすいことが知られている。これは、アルギニン残基が有するグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基が、リン酸基、硫酸基、カルボキシ基などと静電相互作用を生じ得るとともに、二つの水素結合を形成可能であるため、細胞膜表面に位置する負電荷を帯びたリン酸基などと相互作用可能であるためと考えられる。
このため、天然ペプチドの細胞膜に対する透過現象が、アルギニン残基が有するグアニジノ基やリシン残基が有するアミノ基と、細胞膜表面に位置するリン酸基などとの相互作用に起因して生じているとすると、天然ペプチドにおける塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）の分布が、当該天然ペプチドの細胞膜透過性に影響すると考えられる。より具体的には、天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基の分布が、天然ペプチドの細胞膜透過性を予測する上で重要になると考えられる。
このため、天然ペプチドの細胞膜に対する透過現象が、アルギニン残基が有するグアニジノ基やリシン残基が有するアミノ基と、細胞膜表面に位置するリン酸基などとの相互作用に起因して生じているとすると、天然ペプチドにおける塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）の分布が、当該天然ペプチドの細胞膜透過性に影響すると考えられる。より具体的には、天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基の分布が、天然ペプチドの細胞膜透過性を予測する上で重要になると考えられる。
本発明者らが、天然ペプチドの細胞膜透過性と、当該天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基との関係について、鋭意研究を重ねたところ、天然ペプチドの細胞膜透過性には、当該天然ペプチドにおけるグアニジノ基の位置関係や、リシン残基が有するアミノ基の位置関係が大きく影響することがわかった。より具体的には、本発明者らは、天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基やリシン残基が有するアミノ基が、クラスター（塊）状にある程度まとまって存在すると、細胞膜透過性を有しやすいことを知見した。言い換えると、天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基やリシン残基が有するアミノ基が、ペプチドの表面の所定の領域に局在して存在することにより、細胞膜透過性を有しやすいことを知見した。これは、グアニジノ基やアミノ基がクラスター状にある程度まとまって存在している（局在している）ことにより、細胞膜表面に位置する負電荷を帯びたリン酸基などとの相互作用が強くなり、天然ペプチドの細胞膜透過性に有利に働くためであると考えられる。
ここで、例えば、非特許文献１において細胞膜透過性が測定されている天然ペプチドは、αヘリックス構造を取り得ることが知られている。αヘリックス構造（以下では、単に「αヘリックス」と称することがある）のようなヘリックス構造を有し得る天然ペプチドは、細胞膜透過性を有しやすいことが知られている。さらに、いわゆる両親媒性を有する天然ペプチドは、生体膜中においてもヘリックス構造をとりやすいため、細胞膜透過性を有しやすいと考えられている。
また、αヘリックスにおいては、３．６残基ごと（アミノ酸残基が３．６残基連続するごと）に一回転することが知られている。
このため、例えば、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基とが７残基離れて位置すると、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基とが、αヘリックスにおける同じ側面に位置しやすくなると考えられる。言い換えると、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基とが約７残基離れて位置すると、第一のアミノ酸残基における側鎖の向きと第二のアミノ酸残基の側鎖の向きが揃いやすくなると考えられる。
αヘリックス構造において、第一の塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）と、第二の塩基性残基とにおけるグアニジノ基、アミノ基の向きが揃っていると、グアニジノ基やアミノ基がクラスターとして存在しやすいと考えられ、細胞膜表面に位置する負電荷を帯びたリン酸基などとの相互作用が強くなり、天然ペプチドの細胞膜透過性に有利に働くと考えられる。
このため、例えば、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基とが７残基離れて位置すると、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基とが、αヘリックスにおける同じ側面に位置しやすくなると考えられる。言い換えると、第一のアミノ酸残基と第二のアミノ酸残基とが約７残基離れて位置すると、第一のアミノ酸残基における側鎖の向きと第二のアミノ酸残基の側鎖の向きが揃いやすくなると考えられる。
αヘリックス構造において、第一の塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）と、第二の塩基性残基とにおけるグアニジノ基、アミノ基の向きが揃っていると、グアニジノ基やアミノ基がクラスターとして存在しやすいと考えられ、細胞膜表面に位置する負電荷を帯びたリン酸基などとの相互作用が強くなり、天然ペプチドの細胞膜透過性に有利に働くと考えられる。
以上の知見から、本発明者らは、アミノ酸配列中に塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）を少なくとも２つ有する天然ペプチドにおいて、αヘリックス構造をとる場合に向きが揃いやすいと考えられるアルギニン残基が有するグアニジノ基の位置関係や、リシン残基が有するアミノ基の位置関係を解析することにより、当該天然ペプチドの細胞膜透過性を予測し得ることを想到した。
＜分子動力学計算の計算例＞
そこで、本発明者らは、天然ペプチドの細胞膜に対する透過性と、アルギニン残基におけるグアニジノ基の位置関係や、リシン残基が有するアミノ基の位置関係との相関を、より詳細に特定するため、上記の非特許文献１において、細胞膜透過性が既知となっている天然ペプチドであるＰ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、Ｒ８について、コンピュータを用いた分子シミュレーションを実行し解析を行った。以下では、本発明者らが実行した分子シミュレーション（分子動力学計算）の詳細について説明する。
そこで、本発明者らは、天然ペプチドの細胞膜に対する透過性と、アルギニン残基におけるグアニジノ基の位置関係や、リシン残基が有するアミノ基の位置関係との相関を、より詳細に特定するため、上記の非特許文献１において、細胞膜透過性が既知となっている天然ペプチドであるＰ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、Ｒ８について、コンピュータを用いた分子シミュレーションを実行し解析を行った。以下では、本発明者らが実行した分子シミュレーション（分子動力学計算）の詳細について説明する。
＜＜初期構造の作成＞＞
まず、本計算例で対象とする天然ペプチドは、上述したようにヘリックス様の構造をとることが報告されているため、分子動力学計算の初期構造をαヘリックス構造とした。具体的には、計算対象とする天然ペプチドの初期構造がαヘリックスとなるように、αヘリックスのらせん構造パラメータ（回転ごとの残基数３．６、残基ごとの並進１．５Å、らせん半径２．３Å、間隔幅５．４Å）に基づいて、天然ペプチドの主鎖骨格のＣＡ炭素（Ｃα炭素）を構築した。なお、１Åは、０．１ｎｍである。
次に、モデリングツールを用いて、主鎖骨格の構造及びペプチドのアミノ酸配列に応じて側鎖構造を構築した後、ペプチドのＮ末端にアセチル基（いわゆるＡＣＥ基）を、Ｃ末端にＮ－メチル基（いわゆるＮＭＥ基）をそれぞれ付加してキャップした。
続いて、ペプチドの表面から８Å離れた領域までを１つのボックス（セル）として、ペプチドの周りに水分子を配置し、Ｎａイオン、Ｃｌイオンを生理的条件（［ＮａＣｌ］＝１００ｍＭ）で配置することで計算系の中性化を行い、初期構造を作成した。
まず、本計算例で対象とする天然ペプチドは、上述したようにヘリックス様の構造をとることが報告されているため、分子動力学計算の初期構造をαヘリックス構造とした。具体的には、計算対象とする天然ペプチドの初期構造がαヘリックスとなるように、αヘリックスのらせん構造パラメータ（回転ごとの残基数３．６、残基ごとの並進１．５Å、らせん半径２．３Å、間隔幅５．４Å）に基づいて、天然ペプチドの主鎖骨格のＣＡ炭素（Ｃα炭素）を構築した。なお、１Åは、０．１ｎｍである。
次に、モデリングツールを用いて、主鎖骨格の構造及びペプチドのアミノ酸配列に応じて側鎖構造を構築した後、ペプチドのＮ末端にアセチル基（いわゆるＡＣＥ基）を、Ｃ末端にＮ－メチル基（いわゆるＮＭＥ基）をそれぞれ付加してキャップした。
続いて、ペプチドの表面から８Å離れた領域までを１つのボックス（セル）として、ペプチドの周りに水分子を配置し、Ｎａイオン、Ｃｌイオンを生理的条件（［ＮａＣｌ］＝１００ｍＭ）で配置することで計算系の中性化を行い、初期構造を作成した。
図１は、本計算例において作成した、オクタアルギニン（Ｒ８）における分子動力学計算の初期構造を示す図である。図１の中央部分にカートゥーンモデル（リボンモデル）及びラインモデルの重ね合わせで示す分子がＲ８であり、その周囲に位置している多数の分子が水分子及びイオンである。
＜＜エネルギー極小化計算＞＞
次に、作成した初期構造のおけるペプチドを構成する重原子（水素以外の原子）に位置拘束（位置束縛；Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）をかけて、分子力学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ；ＭＭ）計算によって、計算系全体のエネルギー極小化を行った。エネルギー極小化計算を行うことにより、初期構造が有する不自然な構造の歪みを取り除き、分子動力学計算の初期における時間積分の発散を避けることができる。
エネルギー極小化計算は、最急降下法を用い、最初のステップでの原子移動距離ＲＭＳＤ＝０．１［Å］、最大計算ステップ数５００００、収束判定条件ＲＭＳＦ（原子に加わる力の自乗平均）＝１００．０［ｋＪ／ｍｏｌ／ｎｍ］として行った。
なお、本計算例においては、分子力場として、Ａｍｂｅｒ ｆｆ９９ＳＢ－ＩＬＤＮを用いた。
次に、作成した初期構造のおけるペプチドを構成する重原子（水素以外の原子）に位置拘束（位置束縛；Ｐｏｓｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）をかけて、分子力学（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｃｈａｎｉｃｓ；ＭＭ）計算によって、計算系全体のエネルギー極小化を行った。エネルギー極小化計算を行うことにより、初期構造が有する不自然な構造の歪みを取り除き、分子動力学計算の初期における時間積分の発散を避けることができる。
エネルギー極小化計算は、最急降下法を用い、最初のステップでの原子移動距離ＲＭＳＤ＝０．１［Å］、最大計算ステップ数５００００、収束判定条件ＲＭＳＦ（原子に加わる力の自乗平均）＝１００．０［ｋＪ／ｍｏｌ／ｎｍ］として行った。
なお、本計算例においては、分子力場として、Ａｍｂｅｒ ｆｆ９９ＳＢ－ＩＬＤＮを用いた。
＜＜分子動力学計算＞＞
続いて、分子動力学計算のエンジンとして、ＧＲＯＭＡＣＳのパッケージ（ＧＲＯＭＡＣＳ ２０１６．１版）を用い、周期境界条件の下、溶媒の平衡化などのために、重原子に対する位置拘束ありで短時間のＮＶＴ（計算系の粒子数、体積、及び温度が一定の条件）計算を行った後、重原子に対する位置拘束ありで短時間のＮＰＴ（計算系の粒子数、圧力、及び温度が一定の条件）計算を行った。
続いて、分子動力学計算のエンジンとして、ＧＲＯＭＡＣＳのパッケージ（ＧＲＯＭＡＣＳ ２０１６．１版）を用い、周期境界条件の下、溶媒の平衡化などのために、重原子に対する位置拘束ありで短時間のＮＶＴ（計算系の粒子数、体積、及び温度が一定の条件）計算を行った後、重原子に対する位置拘束ありで短時間のＮＰＴ（計算系の粒子数、圧力、及び温度が一定の条件）計算を行った。
そして、上記の溶媒の平衡化を行った構造に対して、シミュレーション時間１００ｎｓ（時間刻み幅Δｔ＝２．０ｆｓ、計５０，０００，０００ ｓｔｅｐ）のＮＰＴ計算（Ｂｕｓｓｉの温度制御及びＰａｒｒｉｎｅｌｌｏ－Ｒａｈｍａｎの圧力制御）を実施した。エネルギーや座標等のトラジェクトリは、１ｐｓごとに出力した（合計１００，０００ ｓｎａｐｓｈｏｔｓ）。
分子動力学計算には、ＣＰＵがＸｅｏｎ Ｅ５―２６９９ ｖ４（クロック周波数２．２ＧＨｚ、計４４コア）、メモリが１２８ＧＢ、ＧＰＵカード４枚（ＧｅｆｏｒｃｅＧＴＸ１０８０）のスペックの計算機（コンピュータ）を用いた。
本計算例で計算対象としている天然ペプチドの中で１６のアミノ酸残基を有するＰ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８については、ペプチド１種のシミュレーション時間１００ｎｓの分子動力学計算にかかった計算所要時間は、８コア並列計算と１枚のＧＰＵカードを利用した場合では、約６時間で終了した。
本計算例で計算対象としている天然ペプチドの中で１６のアミノ酸残基を有するＰ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８については、ペプチド１種のシミュレーション時間１００ｎｓの分子動力学計算にかかった計算所要時間は、８コア並列計算と１枚のＧＰＵカードを利用した場合では、約６時間で終了した。
図２は、本計算例での分子動力学計算により求められたオクタアルギニン（Ｒ８）の立体構造の一例のスナップショットを示す図である。図２においては、カートゥーンモデル及びラインモデルの重ね合わせた表示形式でＲ８の立体構造を示す。
図３は、本計算例での分子動力学計算により求められたＰ１の立体構造の一例のスナップショットを示す図である。図３においては、カートゥーンモデル及びラインモデルの重ね合わせた表示形式でＰ１の立体構造を示す。
図３は、本計算例での分子動力学計算により求められたＰ１の立体構造の一例のスナップショットを示す図である。図３においては、カートゥーンモデル及びラインモデルの重ね合わせた表示形式でＰ１の立体構造を示す。
＜＜アルギニン残基のグアニジノ基の角度と距離のヒストグラム分布の算出＞＞
そして、アルギニン残基におけるグアニジノ基同士の位置関係を解析するため、上記の分子動力学計算により取得したトラジェクトリを利用して、天然ペプチドが有するアルギニン残基のグアニジノ基の角度と距離のヒストグラム分布（ヒストグラムの等高線マップ）を算出した。以下では、グアニジノ基の角度と距離のヒストグラム分布の算出方法について説明する。
そして、アルギニン残基におけるグアニジノ基同士の位置関係を解析するため、上記の分子動力学計算により取得したトラジェクトリを利用して、天然ペプチドが有するアルギニン残基のグアニジノ基の角度と距離のヒストグラム分布（ヒストグラムの等高線マップ）を算出した。以下では、グアニジノ基の角度と距離のヒストグラム分布の算出方法について説明する。
まず、計算対象の天然ペプチドのアルギニン残基が有するグアニジノ基における、当該天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素（Ｃα炭素）からグアニジノ基が有するＣＺ炭素（グアニジノ基が有する炭素）に向かうベクトルを算出した。解析対象とするアルギニン残基におけるベクトルは、グアニジノ基が有するＣＺ炭素の座標値から、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素の座標値を引く（差をとる）ことにより算出した。
そして、解析対象とする２つのアルギニン残基が有するグアニジノ基のベクトルペア（以下では、対照ベクトルペアと称することがある）のなす角度を、それぞれのアルギニン残基におけるベクトルの内積から算出した。
さらに、グアニジノ基間の距離（グアニジノ基の先端同士の距離）は、解析対象とする２つのアルギニン残基におけるそれぞれのベクトルのノルムと、その対照ベクトルペアの内積から算出した。より具体的には、対照ベクトルペアにおける一のベクトルを「ａ」とし、他のベクトルを「ｂ」とすると、余弦定理を用いて下記の式に基づき、グアニジノ基の先端同士の距離を算出した。なお、下記の式における｜ａ｜と｜ｂ｜は、それぞれベクトルａとベクトルｂのノルムを意味し、ａ・ｂは、ベクトルａとベクトルｂの内積を意味する。
そして、解析対象とする２つのアルギニン残基が有するグアニジノ基のベクトルペア（以下では、対照ベクトルペアと称することがある）のなす角度を、それぞれのアルギニン残基におけるベクトルの内積から算出した。
さらに、グアニジノ基間の距離（グアニジノ基の先端同士の距離）は、解析対象とする２つのアルギニン残基におけるそれぞれのベクトルのノルムと、その対照ベクトルペアの内積から算出した。より具体的には、対照ベクトルペアにおける一のベクトルを「ａ」とし、他のベクトルを「ｂ」とすると、余弦定理を用いて下記の式に基づき、グアニジノ基の先端同士の距離を算出した。なお、下記の式における｜ａ｜と｜ｂ｜は、それぞれベクトルａとベクトルｂのノルムを意味し、ａ・ｂは、ベクトルａとベクトルｂの内積を意味する。
図４は、本計算例において算出した、オクタアルギニン（Ｒ８）のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、当該天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルの一例を示す図である。
図４においては、Ｒ８における１番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルｖ１と、Ｒ８における８番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルｖ８とを示している。
図４においては、Ｒ８における１番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルｖ１と、Ｒ８における８番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルｖ８とを示している。
次に、算出したグアニジノ基同士の角度及び距離について、角度は、０°以上１８０°以下の範囲を１０°ごとに区切り、距離は、０Å以上５５Å以下の範囲を５Åごとに区切って、ビン（ｂｉｎ）を作成した。そして、各ビンにおいて、そのビンの範囲に入る対照ベクトルペアの数をカウントすることで、ヒストグラム分布を算出した。なお、「ビン」とは、統計学の分野で用いられる用語であり、数値に従って対象をグループ分けして、一般化や比較を行うための範囲を意味する。
より具体的には、オクタアルギニン（Ｒ８）においては、上述した方法により、１番目と８番目、７残基離れたアルギニン残基におけるグアニジノ基のペアに対して角度と距離のヒストグラム分布を算出した。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８においては、７残基ごとにアルギニン残基が３つ存在するので、２番目のアルギニン残基と９番目のアルギニン残基のペア、２番目と１６番目のアルギニン残基のペア、９番目と１６番目のアルギニン残基のペア、３つすべてのペアを１つにまとめてヒストグラム分布を算出した。
より具体的には、オクタアルギニン（Ｒ８）においては、上述した方法により、１番目と８番目、７残基離れたアルギニン残基におけるグアニジノ基のペアに対して角度と距離のヒストグラム分布を算出した。Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８においては、７残基ごとにアルギニン残基が３つ存在するので、２番目のアルギニン残基と９番目のアルギニン残基のペア、２番目と１６番目のアルギニン残基のペア、９番目と１６番目のアルギニン残基のペア、３つすべてのペアを１つにまとめてヒストグラム分布を算出した。
図５から９は、本発明の計算例における、天然ペプチドに対するヒストグラムの等高線マップである。図５は、Ｐ１におけるヒストグラムの等高線マップであり、図６は、Ｐ２におけるヒストグラムの等高線マップであり、図７は、Ｐ７におけるヒストグラムの等高線マップであり、図８は、Ｐ８におけるヒストグラムの等高線マップであり、図９は、Ｒ８におけるヒストグラムの等高線マップである。
図５から９に示すヒストグラムの等高線マップにおいては、縦軸がグアニジノ基同士の角度を示し、横軸がグアニジノ基同士の距離を示す。なお、図５から９においては、最も外側の等高線の内側が、存在確率が１％以上の領域、それより１つ内側の等高線が２％以上、もう１つ内側の等高線が３％以上の領域を示す。
なお、図５から９に示したヒストグラムの等高線マップは、マイクロソフト社のエクセルの等高線マップ機能により作成した。
図５から９に示すヒストグラムの等高線マップにおいては、縦軸がグアニジノ基同士の角度を示し、横軸がグアニジノ基同士の距離を示す。なお、図５から９においては、最も外側の等高線の内側が、存在確率が１％以上の領域、それより１つ内側の等高線が２％以上、もう１つ内側の等高線が３％以上の領域を示す。
なお、図５から９に示したヒストグラムの等高線マップは、マイクロソフト社のエクセルの等高線マップ機能により作成した。
ここで、上述したように、天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基が、クラスター状にある程度まとまって存在すると、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
グアニジノ基がクラスター状にある程度まとまって存在しているとすると、図５から９に示すヒストグラムの等高線マップにおいては、グアニジノ基同士の角度が小さい領域（例えば、３０°以下の領域）に分布しやすい（グアニジノ基同士の向きが揃いやすい）と考えられる。
さらに、グアニジノ基がクラスター状にある程度まとまって存在しているとすると、図５から９に示すヒストグラムの等高線マップにおいては、グアニジノ基同士の距離が所定の範囲にまとまって分布しやすいと考えられる。本計算例に用いたＰ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、及びＲ８においては、ヘリックス構造を有し得ることに加え、アルギニン残基同士が７残基離れて位置しているため、αヘリックスの残基ごとの並進距離が１．５Åであることを考慮すると、グアニジノ基がクラスター状にある程度まとまって存在している場合には、例えば、グアニジノ基同士の距離が１０Å（１．０ｎｍ）以上２５Å（２．５ｎｍ）以下の領域に分布しやすいと考えられる。
グアニジノ基がクラスター状にある程度まとまって存在しているとすると、図５から９に示すヒストグラムの等高線マップにおいては、グアニジノ基同士の角度が小さい領域（例えば、３０°以下の領域）に分布しやすい（グアニジノ基同士の向きが揃いやすい）と考えられる。
さらに、グアニジノ基がクラスター状にある程度まとまって存在しているとすると、図５から９に示すヒストグラムの等高線マップにおいては、グアニジノ基同士の距離が所定の範囲にまとまって分布しやすいと考えられる。本計算例に用いたＰ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８、及びＲ８においては、ヘリックス構造を有し得ることに加え、アルギニン残基同士が７残基離れて位置しているため、αヘリックスの残基ごとの並進距離が１．５Åであることを考慮すると、グアニジノ基がクラスター状にある程度まとまって存在している場合には、例えば、グアニジノ基同士の距離が１０Å（１．０ｎｍ）以上２５Å（２．５ｎｍ）以下の領域に分布しやすいと考えられる。
そこで、本発明者らは、非特許文献１において細胞膜透過性の基準として用いられているＲ８におけるグアニジノ基同士の角度及び距離について鋭意検討を重ねたところ、Ｒ８においては、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å（１．０ｎｍ）以上２５Å（２．５ｎｍ）以下となる確率（存在確率）が５．０％以上となっていることを見出した。
さらに、非特許文献１において細胞膜透過性を有すると報告されているＰ７及びＰ８においても、Ｒ８と同様に、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５．０％以上となっていることを見出した。
加えて、非特許文献１において細胞膜透過性を有さないと報告されているＰ１及びＰ２においては、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５．０％以下となっていることを見出した。
さらに、非特許文献１において細胞膜透過性を有すると報告されているＰ７及びＰ８においても、Ｒ８と同様に、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５．０％以上となっていることを見出した。
加えて、非特許文献１において細胞膜透過性を有さないと報告されているＰ１及びＰ２においては、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５．０％以下となっていることを見出した。
ここで、図１０は、本発明の計算例における、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率（存在比率）を示すヒストグラムである。また、表１に、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率（存在比率）と、非特許文献で報告されている各ペプチドにおける細胞膜透過性とを示す。
図１０及び表１に示すように、非特許文献１において、細胞膜透過性を有さないことが報告されているＰ１及びＰ２では、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５％以下となっている。
また、図１０及び表１に示すように、非特許文献１において、細胞膜透過性を有することが報告されているＰ７、Ｐ８、及びＲ８では、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５％以上となっている。
また、図１０及び表１に示すように、非特許文献１において、細胞膜透過性を有することが報告されているＰ７、Ｐ８、及びＲ８では、グアニジノ基同士の角度が３０°以下であり、かつグアニジノ基同士の距離が１０Å以上２５Å以下となる確率が５％以上となっている。
本発明者らは、上記の知見に基づいて、塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士（グアニジノ基、アミノ基）の角度が３０°以下であり、かつ塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士の距離が１０Å（１．０ｎｍ）以上２５Å（２．５ｎｍ）以下となる確率（存在確率）が５．０％以上となる天然ペプチドは、細胞膜透過性を有すると考えることができることを想到し、本発明を完成させるに至ったものである。
すなわち、本発明者が完成させた本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は、
細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、こと（工程）を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、こと（工程）を含み、更に必要に応じてその他の工程を含む。
以下、本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法について、更に詳細に説明する。
＜探索対象としての天然ペプチド＞
探索対象としては、アミノ酸配列中に塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）を少なくとも２つ有する天然ペプチドであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ここで、本発明における天然ペプチドは、厳密な意味で天然由来のものである必要は無く、例えば、立体構造を形成可能又は機能を発揮可能なものであれば、糖鎖やその他のペプチド部分を欠失させたものであってもよい。
探索対象としては、アミノ酸配列中に塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）を少なくとも２つ有する天然ペプチドであれば特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
ここで、本発明における天然ペプチドは、厳密な意味で天然由来のものである必要は無く、例えば、立体構造を形成可能又は機能を発揮可能なものであれば、糖鎖やその他のペプチド部分を欠失させたものであってもよい。
探索対象としての天然ペプチドの残基数としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、５残基以上５０残基以下が好ましく、７残基以上３０残基以下がより好ましく、８残基以上２０残基以下が特に好ましい。
ここで、上述したように、探索対象としての天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基やリシン残基が有するアミノ基が、クラスター（塊）状にある程度まとまって存在すると、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。言い換えると、天然ペプチドにおけるアルギニン残基が有するグアニジノ基やリシン残基が有するアミノ基が、ペプチドの表面の所定の領域に局在して存在することにより、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
これは、グアニジノ基やアミノ基がクラスター状にある程度まとまって存在している（局在している）ことにより、細胞膜表面に位置する負電荷を帯びたリン酸基などとの相互作用が強くなり、天然ペプチドの細胞膜透過性に有利に働くためであると考えられる。
これは、グアニジノ基やアミノ基がクラスター状にある程度まとまって存在している（局在している）ことにより、細胞膜表面に位置する負電荷を帯びたリン酸基などとの相互作用が強くなり、天然ペプチドの細胞膜透過性に有利に働くためであると考えられる。
探索対象としての天然ペプチドとしては、αヘリックス構造を有し得るものが好ましい。αヘリックス構造を有し得る天然ペプチドは、細胞膜透過性を有しやすいことが知られている。
αヘリックスは、３．６残基ごとに一回転するため、例えば、２つの塩基性残基が７残基程度（又は１４残基程度）離れて位置すると、これらの塩基性残基におけるグアニジノ基、アミノ基が同方向に配向しやすいと考えられる。言い換えると、αヘリックス構造を有し得る天然ペプチドは、所定の間隔で位置する塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士（グアニジノ基、アミノ基）の角度が小さくなりやすいため、グアニジノ基、アミノ基がクラスター状態で存在しやすく、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
αヘリックスは、３．６残基ごとに一回転するため、例えば、２つの塩基性残基が７残基程度（又は１４残基程度）離れて位置すると、これらの塩基性残基におけるグアニジノ基、アミノ基が同方向に配向しやすいと考えられる。言い換えると、αヘリックス構造を有し得る天然ペプチドは、所定の間隔で位置する塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士（グアニジノ基、アミノ基）の角度が小さくなりやすいため、グアニジノ基、アミノ基がクラスター状態で存在しやすく、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
ここで、探索対象としての天然ペプチドが、第一の塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）と第二の塩基性残基を有する場合、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置することが好ましい。この場合、上述したように、天然ペプチドがαヘリックス構造を有するときに、アルギニン残基におけるグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基が同方向に配向しやすいことにより、塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士の角度が小さくなりやすいため、グアニジノ基、アミノ基がクラスター状態で存在しやすく、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
また、探索対象としての天然ペプチドが、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基を有する場合、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基とが、１３残基以上１４残基以下の間隔を開けて位置することが好ましい。この場合、上述したように、天然ペプチドがαヘリックス構造を有するときに、アルギニン残基におけるグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基が同方向に配向しやすいことにより、塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士の角度が小さくなりやすいため、グアニジノ基、アミノ基がクラスター状態で存在しやすく、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
加えて、探索対象としての天然ペプチドが、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基と第三の塩基性残基を有する場合、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置し、第一の塩基性残基と、第三の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置することが好ましい。この場合、上述したように、天然ペプチドがαヘリックス構造を有するときに、アルギニン残基におけるグアニジノ基、リシン残基が有するアミノ基が同方向に配向しやすいことにより、塩基性残基が有する側鎖末端の官能基同士の角度が小さくなりやすいため、グアニジノ基、アミノ基がクラスター状態で存在しやすく、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
このように、本発明の一実施形態においては、所定の間隔を開けて塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）が位置することが好ましいが、その他の位置に塩基性残基を有していてもよい。例えば、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置する場合、第一の塩基性残基と第二の塩基性残基の間に、他の塩基性残基を有していてもよい。
この場合、当該他の塩基性残基については、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１０Å（１．０ｎｍ）以上２５Å（２．５ｎｍ）以下であるものの存在確率を算出する際の計算対象から除外することが好ましい。当該他の塩基性残基は、天然ペプチドがαヘリックス構造を有する場合に、塩基性残基におけるグアニジノ基、アミノ基が同方向に配向しにくいと考えられるため、実際には細胞膜透過性を有し得る天然ペプチドにもかかわらず、当該他の塩基性残基の影響により、上記の存在確率が低く算出されることを防止することができる。
この場合、当該他の塩基性残基については、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１０Å（１．０ｎｍ）以上２５Å（２．５ｎｍ）以下であるものの存在確率を算出する際の計算対象から除外することが好ましい。当該他の塩基性残基は、天然ペプチドがαヘリックス構造を有する場合に、塩基性残基におけるグアニジノ基、アミノ基が同方向に配向しにくいと考えられるため、実際には細胞膜透過性を有し得る天然ペプチドにもかかわらず、当該他の塩基性残基の影響により、上記の存在確率が低く算出されることを防止することができる。
また、探索対象としての天然ペプチドとしては、ロイシン残基を有するものが好ましい。探索対象としての天然ペプチドがロイシン残基を有すると、当該天然ペプチドが両親媒性を示しやすくなる。両親媒性の天然ペプチドは、リポソーム内でαヘリックス構造をとりやすいことが知られており、グアニジノ基やアミノ基が同方向に配向しやすく、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
探索対象としての天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対するロイシン残基の割合としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５％以上であることが好ましい。探索対象としての天然ペプチドが、当該天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対しロイシン残基を１５％以上有することにより、当該天然ペプチドが両親媒性を有しやすくなるためαヘリックス構造をとりやすくなり、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
探索対象としての天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対するロイシン残基の割合としては特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができるが、１５％以上であることが好ましい。探索対象としての天然ペプチドが、当該天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対しロイシン残基を１５％以上有することにより、当該天然ペプチドが両親媒性を有しやすくなるためαヘリックス構造をとりやすくなり、細胞膜透過性を有しやすいと考えられる。
＜分子動力学計算＞
本発明においては、探索対象としての天然ペプチドについての分子動力学計算に基づいて、後述する存在確率を算出する。本発明においては、例えば、水中、３００Ｋの条件下で、シミュレーション時間を１００ｎｓとして実行した分子動力学計算に基づいて、存在確率を算出することが好ましい。
分子動力学計算の手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
以下では、分子動力学計算の詳細について説明する
本発明においては、探索対象としての天然ペプチドについての分子動力学計算に基づいて、後述する存在確率を算出する。本発明においては、例えば、水中、３００Ｋの条件下で、シミュレーション時間を１００ｎｓとして実行した分子動力学計算に基づいて、存在確率を算出することが好ましい。
分子動力学計算の手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
以下では、分子動力学計算の詳細について説明する
ペプチドを構成する原子は、例えば溶液中で静止しているわけではなく、少しずつ位置を変えている。このような原子の動きを計算機（コンピュータ）の中で再現するために使用されるのが分子動力学法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ；ＭＤ）である。
分子動力学法では、まず、計算対象とする分子の初期構造を作成する。本発明においては、例えば、αヘリックス構造を有し得る天然ペプチドを計算対象とする場合には、αヘリックスのらせん構造パラメータ（回転ごとの残基数３．６、残基ごとの並進１．５Å、らせん半径２．３Å、間隔幅５．４Å）に基づいて、天然ペプチドの主鎖骨格のＣＡ炭素（Ｃα炭素）を構築することができる。そして、モデリングツールを用いて、主鎖骨格の構造及びペプチドのアミノ酸配列に応じて側鎖構造を構築した後、ペプチドのＮ末端にアセチル基（いわゆるＡＣＥ基）を、Ｃ末端にＮ－メチル基（いわゆるＮＭＥ基）をそれぞれ付加してキャップすることにより、天然ペプチドの初期構造を作成することができる。
天然ペプチドの初期構造を作成した後、安定な分子シミュレーションを実施するために、十分大きなボックス（セル）サイズを設定し、周りに溶媒分子（例えば、水分子）を配置し、セル内の環境が生理的な溶液状態で中性になるようにＮａ＋イオン、Ｃｌ－イオンを挿入し、周期的境界条件下で、それぞれの原子に働く力を計算する。それぞれの原子に働く力（エネルギー）としては、結合の伸縮エネルギー、結合角の変角エネルギー、ねじれ（トーション）エネルギー、ファンデルワールス相互作用エネルギー、静電相互作用エネルギー、水素結合エネルギーなどが挙げられる。なお、分子を構成する全ての原子に働く力の総和が「ポテンシャルエネルギー」となる。
次に、分子動力学法では、その力を受けた原子がどのように運動するかを、ニュートンの運動方程式に基づいて計算する。これにより、最初の配置から短い刻み時間の後における、原子の位置の変化を計算することができる。
続いて、分子動力学法では、変化後の原子の位置を新たな起点として、同様の計算を再び行う。非常に短い時間の刻みでこれを繰り返すと、原子が徐々に動く様子が再現できる。このように、分子動力学法においては、（ｉ）原子の位置の決定、（ｉｉ）原子に働く力の計算、（ｉｉｉ）原子の動きの計算、という（ｉ）～（ｉｉｉ）を計算機で繰り返し、時間の経過に伴って変化する物理量や立体構造を任意に抽出し、抽出したデータに基づいて統計処理や、立体構造の画像を表示するなどして、生体分子や化合物の構造、物性を解析する。
続いて、分子動力学法では、変化後の原子の位置を新たな起点として、同様の計算を再び行う。非常に短い時間の刻みでこれを繰り返すと、原子が徐々に動く様子が再現できる。このように、分子動力学法においては、（ｉ）原子の位置の決定、（ｉｉ）原子に働く力の計算、（ｉｉｉ）原子の動きの計算、という（ｉ）～（ｉｉｉ）を計算機で繰り返し、時間の経過に伴って変化する物理量や立体構造を任意に抽出し、抽出したデータに基づいて統計処理や、立体構造の画像を表示するなどして、生体分子や化合物の構造、物性を解析する。
ここで、安定な分子シミュレーションを実施するためには、溶媒分子の構造緩和と計算系のセルサイズの調整が必要である。このため、セルサイズを固定したまま、ペプチドの主鎖原子に位置拘束をかけた粒子数、体積、温度一定の分子動力学計算（以下では、ＮＶＴ計算と称することがある）を行って溶媒分子の構造緩和を行った後、粒子数、圧力、温度一定の分子動力学計算（以下では、ＮＰＴ計算と称することがある）を行って計算系全体の平衡化を行うことで計算系のセルサイズを決定することが好ましい。
その後、平衡化の計算で得られた最終構造のセルサイズを用いてＮＰＴ計算を実施することにより、安定な分子シミュレーションを継続して行うことができる。
その後、平衡化の計算で得られた最終構造のセルサイズを用いてＮＰＴ計算を実施することにより、安定な分子シミュレーションを継続して行うことができる。
本発明における分子動力学法の「シミュレーション時間」とは、ニュートンの運動方程式に基づいて短い刻みの時間での原子の位置の変化を繰り返し計算することにより、分子の構造変化を再現した時間を意味する。
また、上記の短い刻みの時間は、０．１ｆｓ（フェムト秒）以上１０ｆｓ以下であることが好ましく、０．５ｆｓ以上２．０ｆｓ以下であることがより好ましい。なお、短い刻みの時間を「ステップ時間」又は「時間刻み幅」と称することがある。本発明では、特段の断りが無い限り、ステップ時間は２．０ｆｓとする。
ここで、ステップ時間での原子の位置の変化を繰り返し計算する際における繰り返し回数を「ループ回数」とすると、シミュレーション時間は、ステップ時間とループ回数の積で表される。本発明においては、例えば、シミュレーション時間を１００ｎｓ以上とすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
また、上記の短い刻みの時間は、０．１ｆｓ（フェムト秒）以上１０ｆｓ以下であることが好ましく、０．５ｆｓ以上２．０ｆｓ以下であることがより好ましい。なお、短い刻みの時間を「ステップ時間」又は「時間刻み幅」と称することがある。本発明では、特段の断りが無い限り、ステップ時間は２．０ｆｓとする。
ここで、ステップ時間での原子の位置の変化を繰り返し計算する際における繰り返し回数を「ループ回数」とすると、シミュレーション時間は、ステップ時間とループ回数の積で表される。本発明においては、例えば、シミュレーション時間を１００ｎｓ以上とすることが好ましいが、これに限定されるものではない。
ペプチドなどの分子中に存在する各原子が、どのような力を受けているのかを関数として数式化したものが分子力場である。分子力場に基づく分子力学計算や分子動力学計算では、原子間に働く力を、原子間の結合を表すパラメータ（結合距離や結合角など）を変数とし、原子の種類や結合様式によって決まるポテンシャル関数で数値として表す。
本発明に用いることができる分子力場としては、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｍｂｅｒ系の分子力場、ＣＨＡＲＭｍ系の分子力場、ＯＰＬＳ系の分子力場などが挙げられる。Ａｍｂｅｒ系の分子力場としては、例えば、Ａｍｂｅｒ ｆｆ９９ＳＢ－ＩＬＤＮ、Ａｍｂｅｒ １２ＳＢなどが挙げられる。ＣＨＡＲＭｍ系の分子力場としては、例えば、ＣＨＡＲＭｍ３６などが挙げられる。
本発明に用いることができる分子力場としては、特に制限なく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、Ａｍｂｅｒ系の分子力場、ＣＨＡＲＭｍ系の分子力場、ＯＰＬＳ系の分子力場などが挙げられる。Ａｍｂｅｒ系の分子力場としては、例えば、Ａｍｂｅｒ ｆｆ９９ＳＢ－ＩＬＤＮ、Ａｍｂｅｒ １２ＳＢなどが挙げられる。ＣＨＡＲＭｍ系の分子力場としては、例えば、ＣＨＡＲＭｍ３６などが挙げられる。
また、どのエネルギー項を計算に取り入れるかの選択も、特に限定はされない。また、計算の効率を考慮して、原子間の距離が一定以上であれば静電相互作用などを計算しない方法であるカットオフ法と呼ばれる手法を導入してもよい。
分子動力学計算を行うことができるプログラムとしては、ＡＭＢＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ａｍｂｅｒｍｄ．ｏｒｇ／）、ＣＨＡＲＭＭ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｈａｒｍｍ．ｏｒｇ／ｃｈａｒｍｍ／）、ＮＡＭＤ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｎａｍｄ／）、ＧＲＯＭＡＣＳ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒｏｍａｃｓ．ｏｒｇ／）、ＭｙＰｒｅｓｔｏ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｅｓｔｏ．ｐｒｏｔｅｉｎ．ｏｓａｋａ－ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｍｙＰｒｅｓｔｏ４／）などが挙げられる。
分子動力学計算は、２８０Ｋ（ケルビン）以上３２０Ｋ以下程度の設定温度下で行うことが一般的であり、本発明においては、例えば、３００Ｋとすることが好ましい。
また、分子動力学計算においては、溶媒効果を考慮することが好ましく、溶媒分子（例えば、水分子）をペプチドなどと同じ様に、１個１個の分子として取り扱う系で計算することが好ましい。本発明においては、天然ペプチドの周りに、水分子を十分な数配置した。水分子のモデルとしては、例えば、ＴＩＰ３Ｐモデルなどを用いることができる。
＜細胞膜透過性天然ペプチドの特定＞
本発明においては、上記の分子動力学計算の結果に基づいて、探索対象の天然ペプチドが、細胞膜透過性を有するか否かを特定する。
より具体的には、本発明においては、天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出する。さらに、本発明においては、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する。
本発明においては、上記の分子動力学計算の結果に基づいて、探索対象の天然ペプチドが、細胞膜透過性を有するか否かを特定する。
より具体的には、本発明においては、天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出する。さらに、本発明においては、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する。
＜第一のベクトル及び第二のベクトルの算出＞
第一のベクトルは、天然ペプチドの第一の塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かうベクトルである。
第二のベクトルは、天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かうベクトルである。
第一のベクトルは、天然ペプチドの第一の塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かうベクトルである。
第二のベクトルは、天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かうベクトルである。
塩基性残基がアルギニン残基である場合においては、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素としては、アルギニン残基におけるグアニジノ基が有するＣＺ炭素とすることができる。
そのため、塩基性残基がアルギニン残基である場合、第一のベクトルは、天然ペプチドの第一のアルギニン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルとすることができる。
同様に、塩基性残基がアルギニン残基である場合、第二のベクトルは、天然ペプチドの第二のアルギニン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルとすることができる。
そのため、塩基性残基がアルギニン残基である場合、第一のベクトルは、天然ペプチドの第一のアルギニン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルとすることができる。
同様に、塩基性残基がアルギニン残基である場合、第二のベクトルは、天然ペプチドの第二のアルギニン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトルとすることができる。
ここで、グアニジノ基が有するＣＺ炭素とは、グアニジノ基において、３つの窒素原子と結合している炭素原子を意味する。なお、「ＣＺ」とは、ＲＣＳＢ ＰＤＢ（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ）に登録されているタンパク質の立体構造データや、上記の分子力場において、グアニジノ基における３つの窒素原子と結合している炭素原子を意味する原子種（原子タイプ）である。
また、塩基性残基がリシン残基である場合においては、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素としては、リシン残基におけるアミノ基が結合するＣＥ炭素とすることができる。
そのため、塩基性残基がリシン残基である場合、第一のベクトルは、天然ペプチドの第一のアルギニン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からアミノ基と結合するＣＥ炭素に向かうベクトルとすることができる。
同様に、塩基性残基がリシン残基である場合、第二のベクトルは、天然ペプチドの第二のリシン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からアミノ基と結合するＣＥ炭素に向かうベクトルとすることができる。
そのため、塩基性残基がリシン残基である場合、第一のベクトルは、天然ペプチドの第一のアルギニン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からアミノ基と結合するＣＥ炭素に向かうベクトルとすることができる。
同様に、塩基性残基がリシン残基である場合、第二のベクトルは、天然ペプチドの第二のリシン残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素からアミノ基と結合するＣＥ炭素に向かうベクトルとすることができる。
ここで、アミノ基と結合するＣＥ炭素とは、リシン残基において、アミノ基の窒素原子と結合している炭素原子を意味する。なお、「ＣＥ」とは、ＲＣＳＢ ＰＤＢに登録されているタンパク質の立体構造データや、上記の分子力場において、アミノ基の窒素原子と結合している炭素原子を意味する原子種である。
第一のベクトル及び第二のベクトルの長さ（大きさ）は、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素までの距離と等しい。つまり、第一のベクトル及び第二のベクトルは、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素が始点となり、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素が終点となるベクトルである。
第一のベクトルは、例えば、第一の塩基性残基おいて、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標値から、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素の座標値を引く（差をとる）ことにより算出することができる。第二のベクトルについても同様に、例えば、第二の塩基性残基おいて、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標値から、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素の座標値を引くことにより算出することができる。
第一のベクトルは、例えば、第一の塩基性残基おいて、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標値から、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素の座標値を引く（差をとる）ことにより算出することができる。第二のベクトルについても同様に、例えば、第二の塩基性残基おいて、側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標値から、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素の座標値を引くことにより算出することができる。
本発明においては、例えば、分子動力学計算により得られたトラジェクトリの各スナップショットについて、第一のベクトル及び第二のベクトルを算出することが好ましい。こうすることにより、後述する存在確率の算出をより正確に行うことができる。
＜＜第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度の算出＞＞
本発明においては、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度を算出し、当該なす角が３０°以下であるものを特定する。
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度を算出する手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
本発明においては、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度を算出し、当該なす角が３０°以下であるものを特定する。
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度を算出する手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度は、例えば、第一のベクトルと第二のベクトルのベクトルペア（以下では、対照ベクトルペアと称することがある）について、第一のベクトルと第二のベクトルの内積を算出し、算出した内積に基づいて求めることができる。
第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度は、例えば、分子動力学計算により得られたトラジェクトリの各スナップショットについて算出することが好ましい。こうすることにより、後述する存在確率の算出をより正確に行うことができる。
＜＜第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離の算出＞＞
本発明においては、第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離を算出し、当該距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものを特定する。
第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離を算出する手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
本発明においては、第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離を算出し、当該距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものを特定する。
第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離を算出する手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
ここで、第一のベクトルの先端とは、第一の塩基性残基（アルギニン残基、リシン残基）における側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の位置（座標）を意味する。同様に、第二のベクトルの先端とは、第二の塩基性残基における側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の位置（座標）を意味する。
第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離は、例えば、第一のベクトルと第二のベクトルのノルム及び内積から求めることができる。
また、第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離は、第一の塩基性残基の側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標と、第二の塩基性残基の側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標を用いて、いわゆる「２点間の距離の公式」から求めることもできる。
第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離は、例えば、第一のベクトルと第二のベクトルのノルム及び内積から求めることができる。
また、第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離は、第一の塩基性残基の側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標と、第二の塩基性残基の側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素の座標を用いて、いわゆる「２点間の距離の公式」から求めることもできる。
第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離は、例えば、分子動力学計算により得られたトラジェクトリの各スナップショットについて算出することが好ましい。こうすることにより、後述する存在確率の算出をより正確に行うことができる。
＜＜存在確率の算出＞＞
本発明においては、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率（以下では、この存在確率を単に「存在確率」と称することがある）を算出し、当該存在確率が５．０％以上であるものを、細胞膜透過性を有する天然ペプチドとして特定する
存在確率を算出する手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
本発明においては、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率（以下では、この存在確率を単に「存在確率」と称することがある）を算出し、当該存在確率が５．０％以上であるものを、細胞膜透過性を有する天然ペプチドとして特定する
存在確率を算出する手法については、上記の＜分子動力学計算の計算例＞で説明した手法を、適宜目的に応じて用いることができるが、これに限られるものではない。
存在確率は、例えば、分子動力学計算により得られたトラジェクトリに基づいて算出した、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度及び第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離から求めることができる。より具体的には、例えば、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度及び第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離について、角度は、０°以上１８０°以下の範囲を１０°ごとに区切り、距離は、０Å以上５５Å以下の範囲を５Åごとに区切って、ビンを作成した。そして、各ビンにおいて、そのビンの範囲に入る対照ベクトルペアの数をカウントすることで、ヒストグラム分布を算出することができる。算出したヒストグラム分布を可視化することにより、図５から９に示したようなヒストグラムの等高線マップを作成することができる。
ここで、所定のビンの範囲に入る対照ベクトルペアの数については、例えば、分子動力学計算により得られたトラジェクトリの各スナップショットについてカウントすることが好ましい。こうすることにより、存在確率の算出をより正確に行うことができる。
また、例えば、オクタアルギニン（Ｒ８）のような残基数が８の天然ペプチドについては、上述した方法により、１番目と８番目、７残基離れた塩基性残基におけるグアニジノ基、アミノ基のペアに対して角度と距離のヒストグラム分布を算出することが好ましい。また、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ７、Ｐ８のような残基数が１６の天然ペプチドについては、７残基ごとに塩基性残基が３つ存在するので、２番目の塩基性残基と９番目の塩基性残基のペア、２番目と１６番目の塩基性残基のペア、９番目と１６番目の塩基性残基のペア、３つすべてのペアを１つにまとめてヒストグラム分布を算出することが好ましい。
そして、算出したヒストグラム分布に基づいて、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率を算出する。
存在確率の算出は、例えば、分子動力学計算により得られた全スナップショットに対する、そのビンの範囲に入るスナップショットの数の割合を算出することなどにより行うことができる。
存在確率の算出は、例えば、分子動力学計算により得られた全スナップショットに対する、そのビンの範囲に入るスナップショットの数の割合を算出することなどにより行うことができる。
本発明においては、算出した存在確率が５．０％以上である天然ペプチドを、細胞膜透過性を有する天然ペプチドとして特定する。
本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法では、天然ペプチドの細胞膜透過性をウエットな実験で評価する（ペプチドを合成して膜透過実験を実施する）必要がなく、時間的コストを大幅に削減できることができ、細胞膜透過性を有する天然ペプチドを探索する際において、実用面で非常に有益である。
本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法では、天然ペプチドの細胞膜透過性をウエットな実験で評価する（ペプチドを合成して膜透過実験を実施する）必要がなく、時間的コストを大幅に削減できることができ、細胞膜透過性を有する天然ペプチドを探索する際において、実用面で非常に有益である。
以上、説明したように、本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、探索対象としての天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、天然ペプチドの第一の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、天然ペプチドの第二の塩基性残基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、第一のベクトルと第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ第一のベクトルの先端と第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する。
これにより、本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は、コンピュータを用いた分子シミュレーションにより、細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドを探索できる。
これにより、本発明の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法は、コンピュータを用いた分子シミュレーションにより、細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドを探索できる。
本発明の態様としては、例えば、以下のとおりである。
＜１＞ 細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての前記天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
前記天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
前記天然ペプチドの第一の塩基性残基における、前記天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
前記天然ペプチドの第二の塩基性残基における、前記天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
前記第一のベクトルと前記第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ前記第一のベクトルの先端と前記第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、
ことを含むことを特徴とする細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜２＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが、前記天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対しロイシン残基を１５％以上有する、前記＜１＞に記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜３＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが両親媒性である、前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜４＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが５以上５０以下のアミノ酸残基を有する、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜５＞ 前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置する、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜６＞ 前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置する、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜７＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが、第三の塩基性残基を更に有し、
前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置し、
前記第一の塩基性残基と、第三の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置する、
前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜１＞ 細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての前記天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
前記天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
前記天然ペプチドの第一の塩基性残基における、前記天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
前記天然ペプチドの第二の塩基性残基における、前記天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
前記第一のベクトルと前記第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ前記第一のベクトルの先端と前記第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、
ことを含むことを特徴とする細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜２＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが、前記天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対しロイシン残基を１５％以上有する、前記＜１＞に記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜３＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが両親媒性である、前記＜１＞から＜２＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜４＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが５以上５０以下のアミノ酸残基を有する、前記＜１＞から＜３＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜５＞ 前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置する、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜６＞ 前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置する、前記＜１＞から＜４＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
＜７＞ 前記探索対象としての前記天然ペプチドが、第三の塩基性残基を更に有し、
前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置し、
前記第一の塩基性残基と、第三の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置する、
前記＜１＞から＜５＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法である。
前記＜１＞から＜７＞のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法によれば、従来における諸問題を解決し、本発明の目的を達成することができる。
ｖ１ Ｒ８における１番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトル（第一のベクトルの一例）
ｖ２ Ｒ８における８番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトル（第二のベクトルの一例）
ｖ２ Ｒ８における８番目のアルギニン残基が有するグアニジノ基における、天然ペプチドの主鎖を形成するＣＡ炭素からグアニジノ基が有するＣＺ炭素に向かうベクトル（第二のベクトルの一例）
Claims (7)
- 細胞膜に対する透過性を有する天然ペプチドの探索方法であって、
探索対象としての前記天然ペプチドが、アミノ酸配列中に塩基性残基を少なくとも２つ有し、
前記天然ペプチドについての分子動力学計算に基づき、
前記天然ペプチドの第一の塩基性残基における、前記天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第一のベクトルと、
前記天然ペプチドの第二の塩基性残基における、前記天然ペプチドの主鎖を形成するＣα炭素から側鎖末端の官能基が有する又は結合する炭素に向かう第二のベクトルと、を算出し、
前記第一のベクトルと前記第二のベクトルとのなす角度が３０°以下であり、かつ前記第一のベクトルの先端と前記第二のベクトルの先端との距離が１．０ｎｍ以上２．５ｎｍ以下であるものの存在確率が５．０％以上であるものを特定する、
ことを含むことを特徴とする細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。 - 前記探索対象としての前記天然ペプチドが、前記天然ペプチドを構成する全アミノ酸残基に対しロイシン残基を１５％以上有する、請求項１に記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。
- 前記探索対象としての前記天然ペプチドが両親媒性である、請求項１から２のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。
- 前記探索対象としての前記天然ペプチドが５以上５０以下のアミノ酸残基を有する、請求項１から３のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。
- 前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置する、請求項１から４のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。
- 前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置する、請求項１から４のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。
- 前記探索対象としての前記天然ペプチドが、第三の塩基性残基を更に有し、
前記第一の塩基性残基と前記第二の塩基性残基とが、６残基以上８残基以下の間隔を開けて位置し、
前記第一の塩基性残基と、第三の塩基性残基とが、１３残基以上１５残基以下の間隔を開けて位置する、請求項１から５のいずれかに記載の細胞膜透過性天然ペプチドの探索方法。
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| Richard M. Venable, et al.，Molecular Dynamics Simulations of Membrane Permeability，Chemical Reviews，2019年02月12日，Vol.119, No.9，Pages 5954-5997，[検索日：2022年10月25日], <URL:htttps:pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acs.chemrev.8b00486> |
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