JP7170674B2

JP7170674B2 - 付加プリンティング器具および方法

Info

Publication number: JP7170674B2
Application number: JP2019571801A
Authority: JP
Inventors: ギュイモファビアン; ヴィエルローブベルトラン; ブテールジェローム; ルブッファンエヴァルゼッグ; ヴォセルロマン; ソトダン
Original assignee: ポワティス
Priority date: 2017-03-15
Filing date: 2018-03-08
Publication date: 2022-11-14
Anticipated expiration: 2038-03-08
Also published as: CN110402125A; EP3595592A1; JP2020513850A; ES2905587T3; EP3595592B1; US20200102529A1; FR3063931A1; WO2018167402A1; KR20190126884A; CN110402125B; FR3063931B1; KR102495038B1

Description

本発明は、三次元付加レーザー支援プリンティング、およびより具体的に、しかし非排他的に、バイオプリンティングの分野に関する。

レーザー支援三次元付加印刷は、キャリア流体に含まれる転写可能な粒子または粒子の凝集体（aggregate）に運動エネルギーを提供する基材（substrate）の局所蒸発（local vaporization）により生成されたジェットによって粒子を標的に向かって発射することからなる。

転写可能粒子は、液体基材に担持される粉末状材料、または液体転写可能材料に由来し得る。

それらは、金属または無機化合物、ポリマーまたは生物材料であり得る。

それらは、また、生物学的粒子、例えば生細胞で構成され得る。

本発明は、再生医療、薬理学および細胞生物学の研究における使用のための生物工学によって作られた構造を生成するために所定の２Ｄまたは３Ｄ構造（organization）を持つ生体材料（living material）および任意選択的に非生体材料（non-living material）をモデル化しおよび組み立てるためのコンピュータ支援の転写プロセスによるレーザーバイオプリンティングの分野に関する。

組織工学（Tissue engineering）は、天然組織またはさらには器官の機能を置換、修復（restore）または維持するための生物学的に適当な代替物を設計しおよび開発することを目的とする。例は、論文（非特許文献１）に記載されている。

これらの制限を克服するために、より一般的にはバイオプリンティングと称される生物学的要素（biological element）の印刷が、非特許文献２および非特許文献３において論じられるように、創造され始めた。

技術水準
技術水準において、少なくとも１つのインクで印刷するための方法および器具を説明する特許出願（特許文献１）が知られており、前記方法は、インク膜内に空洞を生成させるようにレーザービームの焦点を合わせるステップと、インク膜の自由表面から少なくとも１つのインク滴を形成するステップと、受け入れ基材（receiving substrate）の堆積表面上に前記滴を堆積させるステップと、を含み、レーザービームは、重力と反対の方向に配向され、膜の自由表面は、インク膜の上に配置される堆積表面に向かって上方に配向されることを特徴とする。

基材なしのおよび／または局所ドナー（local donor）によるレーザー誘起前方転写（ＬＩＦＴ）のためのシステムに関する特許（特許文献２）が、同様に知られている。このシステムは、少なくとも１つの開口を持つタンクを含む。エネルギー源は、前記容器内部のドナー材料にエネルギーを送達するように構成される。このシステムは、ドナー基材の必要なしにレーザー誘起前方転写による材料の堆積を可能にする。発明は、また、基材なしのおよび局所ドナーによるレーザーによって誘起される前方転写（forward transfer）プロセスをカバーする。

国際公開第２０１６／０９７６１９号（WO2016097619）国際公開第２０１４／０６１０２４号（W02014061024）

Griffith, L. G., & Naughton, G. (2002). Tissue engineering-- current challenges and expanding opportunities. Science, 295(5557), 1009-1014. Klebe, R. (1988). Cytoscribing: A Method for Micropositioning Cells and the Construction of Two- and Three-Dimensional Synthetic Tissues. Experimental Cell Research, 179(2):362-373. Klebe, R., Thomas, C., Grant, G. Grant, A. and Gosh, P. (1994). Cytoscription: Computer controlled micropositioning of cell adhesion proteins and cells. Methods in Cell Science, 16(3):189-192.

先行技術の欠点
転写されるべき粒子を含む流体で被覆されたブレードを提供する先行技術の解決策において、各シーケンスの後でブレードを取り換えることが必要であるので、これは、転写可能要素（transferable elements）を含む膜の特性、特に、流体の容積、ブレードの表面における流体の拡散（spreading）、生体（living）粒子の乾燥、蒸発、展開（evolution）に起因する経時的な均質性（homogeneity）および発達、・・・の良好な制御を可能にしない。このようにして、先行技術の解決策の主な不利点は、印刷物の再現性（reproducibility）の欠如および頻繁な取り扱いの必要性の両方に関係し、これは生産性を低減させる。

流体を含むタンクまたは容器を必要とする解決策において、転写されるべき材料は沈殿（settle）する傾向がありおよびしたがって標的から離れる傾向があるので、問題は、気液界面におけるジェットの発生を制御することにある。これらの解決策は、したがって、再現性のある（reproducible）条件下での流体に含まれる粒子の転写を可能にしない。これは、バイオ押し出しまたはインクジェットの解決策に関して同様に知られている一般的な不利点である。

概して、先行技術の解決策は、流体に含まれる粒子を正確に標的化することの難しさおよび基材を定期的に（regularly）交換する必要性に起因して、粒子を含む液体媒体を印刷するための工業プロセスに適さない。これらは、支持体のこれらの交換は、操作（manipulations）を必要とし、観察された再現性の欠如をもたらす。

発明がその変形のいくつかによって改善することを目的とする二次的な問題は、犠牲層、例えば金被覆（gold coating）との、レーザーの相互作用の放棄（abandonment）に関する。

犠牲層を用いる先行技術の解決策のために、この層を励起するレーザーによって形成されるジェットは、転写されるべき粒子とは異なる粒子の毒性および発射の問題をもたらし得るこの層からの材料の転写を引き起こす。

それらは、また、各レーザーパルスの間の基材の局所破壊を伴い、これは、不均質性を生み出し、および基材の繰り返される交換を必要とする。

本発明によって提供される解決策
この特許出願の意味の範囲内におけるバイオインク膜の不均質性は、組成：粒子、生化学的種（成長因子、分子、イオン）、生物材料の点から、特定の局所特性を持つ膜の任意の領域を意味する。

用語「不均質帯域」、「組成の局所変動」、「特定組成の帯域」は、本特許の目的の範囲内において同一の技術的意味を有する。

本解決策は、三次元付加レーザー支援プリンティングの間、厚さおよび体積密度において均質な流体膜の不均質性をレーザー相互作用帯域内に位置決めすることにある。それは、また、流体による繰り返されおよび制御される方法での前記相互作用帯域の充填を可能にすることにある。他方、そのような解決策は、材料ジェットの発生のために犠牲層を使用しないレーザー印刷プロセスの実施を必要し、これは、流体中で直接（directly）起こるレーザー材料（laser-material）相互作用を有効に伴う。このようにして、キャビテーション気泡および次いで材料ジェットを発生させるプロセスは、一般的な先行技術とは全く異なることとなる。

この解決策の利点は、多様であり（manifold）、
－それは、任意の操作（ピペット操作、拡散（spreading）、洗浄（cleaning）・・・）を回避することによって制御されたおよび再現性のある方法で不均質な流体を相互作用帯域に向かって導くことを可能にする。それは、したがって、プロセスをより安全（secure）および確実（reliable）にする。
－それは、インクの組成がいくつかの液体（化学種、液体生物材料、・・・）およびいくつかのタイプの粒子（細胞、生物材料、・・・）を同一タイプのインク中で混合することによって調節（modulated）されることを可能にする。
－それは、連続的にまたは擬似連続的に（pseudo-continuously）相互作用帯域を再チャージする制御可能な流体系の使用を可能にし、このようにして印刷生産性を増大させる。
－それは、印刷を受け面に印刷される滴のレベルでよりいっそう再現性のあるおよび均質にすることを目的とする、相互作用帯域の表面上の厚さにおいて均質な流体の膜を得ることを可能にする。
－任意選択的に、膜は、充填モード（連続的な、不連続的な、往復の、等・・・）に対する入力／出力の幾何学の両方に適当なスロープまたは形状を有し得る。
－それは、流体系の最適化されたパラメータセット（流量（flow rate）、断面（section）、形状、・・・）のために、膜厚の調節を可能にする。したがって、材料ジェットの高さは、このやり方で調節され得、これは、非平面の表面における印刷にとって非常に興味を起こさせ得る。

加えて、本発明は、制御されたやり方で流体中の不均質性を標的化するためにレーザーパルスに相関させられた撮像手段の使用を可能にする。これを実現させるために、相互作用領域は、レーザーおよび画像取得手段の両方のために、透明材料に基づいていなければならない。

この解決策は、犠牲層（典型的には、金または銀の金属層）の使用に基づくレーザー印刷と両立可能であるが、それは、好ましくは、犠牲層の使用を伴わないレーザー印刷のために意図される。そのような解決策は、したがって、レーザーと不均質性を含む流体との間の直接的な相互作用の間、フィールド内における再現性のあるおよび繰り返し可能なジェットの生成を保証しなければならない。これを実現するために、以下にリストされる多数の印刷パラメータは、ジェット発生はこの印刷条件において犠牲層なしで実現することが非常に困難であるので、必要である：
－レーザーは、流体中におけるレーザープラズマの発生を最適化するために、ピコ秒またはフェムト秒モードにおいて、１から４０マイクロジュールおよび好ましくは５から２０マイクロジュールの間のエネルギーレベルで、短パルスを放射する。本明細書に記載されることとなる実施形態の例を読む際に、これらの性能の証明が与えられることとなる。
－レーザーは、犠牲層なしで気泡および次いでジェットの発生を可能にするために、ナノ秒モードにおいて、０．５から２０ミリジュールのエネルギーで、レーザーパルスを放射する。
－レーザーは、好ましくは、細胞に及ぼす何らかのイオン化効果を回避するために近赤外域（near IR range）のパルスを放射し、一方で、同時に、媒体（medium）によって十分に吸収される。この最後のパラメータを最適化するために、媒体による吸収速度（rate）を最大化するために、紫外（UV）または中赤外（medium IR）、またはさらには可視におけるレーザーを使用する可能性はかなり高くなり得る。
－相互作用帯域に存在する流体の特性の測定は、レーザーのパラメータを調節または最適化しおよび印刷を可能な限り均質にするために、実施される（密度、粘度、膜厚、等）。
－流体中の不均質性の画像は、特定の領域（粒子の数またはタイプ）を標的化することを可能にし、これは、再度、印刷される不均質性の数はこれらの撮像手段によってまたはより概して取得されたデータの解釈のためのコンピュータ制御された特性化によって直接的に制御され得るので、印刷を均質におよびとりわけデジタル印刷ファイルに準拠することを可能にする。

そのような状況において、印刷基材（printing substrate）に対する犠牲層からのデブリの印刷に関係する問題はもはや何もなく、このようにして、バイオプリンティングのコンテキストにおける細胞のより高い生存性を保証する。

本発明によって提供される解決策
本発明は、その最も一般的な意味において、標的に向かって配向されるジェットを引き起こすために、スライドを覆う流体との点相互作用を生み出すための方向付け可能な（directable）エネルギー励起手段を含む付加プリンティング器具に関し、前記流体は、転写可能粒子を含む液体ベクトルによってまたは転写可能な液体生物材料によって構成され、
－前記流体は、５００μｍ未満の厚さを持つ液膜を形成し、
－少なくとも１つのインレットが開口するレーザーとの相互作用を可能にする少なくとも１つの帯域を有するスライド上において、前記相互作用帯域は、少なくとも１つのアウトレット内に開口し、前記相互作用帯域は、その断面は流体中に存在する不均質性のメジアン径（median size）の少なくとも３倍大きい開口を有し、
－器具は、前記インレット（７）と前記アウトレットとの間の流体を循環させるための手段をさらに含む、
ことを特徴とする。

このスライドは、エネルギー励起ビームとの相互作用を可能にするように位置決めされた好ましくは平坦な底部を持つ領域を画定し、この領域は、過渡的に（transiently）静的で領域に配置され得および他の時は転写可能粒子の更新およびエネルギー励起軸に関する変位（displacement）を保証する流体循環によって形成され得る膜の、エネルギー励起手段を備えるこの相互作用領域における存在を保証するために、インレットおよびアウトレット開口を有する境界によって取り囲まれている。

「静的」な解決策において、各シーケンスの後にスライドを置換することは必要である。これは、転写可能要素、特に、流体の容積、スライドの表面における流体の拡散、生体粒子の乾燥、蒸発、展開の現象に起因する経時的な均質性および発達、・・・を含む膜の特性の良好な制御を可能にしない。

先行技術のスライドは、スライドが各使用後に変更させられることを必要とするインクの静的コーティング（static coating）を含み、これは、転写可能要素の使用を最適化しない。

本発明による器具の特定の実施形態によると、
－前記膜の厚さは、５０μｍから１００μｍの間であり、
－前記膜の厚さは、前記転写可能粒子の公称サイズの５倍から１０倍の間であり、
－前記相互作用帯域の表面積は、０．０５ｍｍ²よりも大きく、
－前記インレットは、前記相互作用帯域の側部（lateral part）に繋がり、
・前記相互作用帯域は、前記アウトレット内へ側方に（laterally）開口する周辺部を有し、
・前記インレットおよび前記アウトレットは、接続帯域に接続される管状チャンネルによって構成され、前記管状チャンネルの長手方向軸は、相互作用帯域の横断面（transverse plane）と１５°から３５°の間の角度を形成し、
・前記インレットと前記アウトレットとの間の流体を循環させるための前記手段は、相互作用帯域における流体の流れ（または流体に加えられる負圧）を制御するために、注入速度（injection rate）（または流体に加えられる正圧）および吸引速度（suction rate）を制御するための手段を含み、
・前記注入速度および吸引速度制御手段は、相互作用帯域における膜厚を制御するために、膜厚を測定することによって制御され、
・器具は、各々インレットおよびアウトレットを備える複数の相互作用帯域を有し、
・前記相互作用帯域のうちの少なくとも２つは、共通のインレットおよび／またはアウトレットを有し、
・前記エネルギー励起手段は、レーザーからなり、
・相互作用帯域は、レーザーおよび撮像の波長範囲において透明であり、および犠牲層を有さず、
・前記流体は、レーザーの発振波長（emission wavelength）における吸収色素（absorbent pigment）によりチャージされ、
・器具は、粒子密度によりレーザーを制御するための相互作用帯域を撮像するための手段を含み、
・前記レーザーは、ピコ秒またはフェムト秒モードにおいて、５から２０マイクロジュールの間のエネルギーレベルで、パルスを放射し、エネルギーレベル毎パルスは、相互作用帯域に存在する流体の特性の測定の結果によりコンピュータによって制御され、前記測定は、粒子密度、および／または粘度、および／または膜厚を含み、
・前記エネルギー励起手段は、音響波発生器からなり、
・器具は、相互作用領域を撮像しおよび転写されるべき粒子のタイプを選択するための手段を含む。

本発明は、また、標的に向かって配向されるジェットを引き起こすために、スライドを覆う流体との点相互作用を生み出すための方向付け可能なエネルギー励起手段を含む器具による付加プリンティング方法に関し、前記流体は、転写可能な不均質性（粒子、または生物材料または化学種）を含む液体ベクトルによってまたは転写可能な液体生物材料によって構成され、前記流体が、レーザーとの相互作用を可能にし、およびその中に少なくとも１つのインレット（７）が開口する少なくとも１つの帯域を有するスライドのインレットダクト（７）とアウトレットダクトとの間を循環する５００μｍ未満の厚さの液膜を形成することを特徴とする。

特定の変形によると、エネルギーレベル毎パルスは、相互作用帯域に存在する流体の特性の測定の結果によりコンピュータによって制御され、前記測定は、粒子密度、および／または粘度、および／または膜厚を含む。

本発明の非制限的な例の詳細な説明
本発明は、添付図面を参照しながら、非制限的な例示的実施形態の以下の詳細な説明を読むと、最もよく理解されるであろう。

本発明による器具の断面概略図である。光学システムを備える本発明による器具の概略図である。本発明による器具のためのスライドの上方からの概略図である。実験的に実施された本発明による器具の様々な変形の３Ｄビューである。端からインク膜を撮像するための溝を備える本発明による器具の異なる変形の３Ｄビューを表す図である。本発明による器具の変形の３Ｄビューおよびこの構成において得られるインク膜の画像を示す図である。本発明による器具の多空洞の変形の３Ｄビューである。本発明による器具において実施される犠牲層が無いレーザー物質相互作用プロセス（laser-matter interaction process）の一連の説明図である。本発明による器具内部に犠牲層がないレーザー物質相互作用による物質のジェットを示す一連の写真を表す図である。本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替え（continuous refilling）なしで）、水滴で印刷されたフィールドの顕微鏡写真（micrograph）を示す図である。本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、マイクロビーズを含む滴で印刷されたフィールドの顕微鏡写真を示す図である。本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、細胞を含む滴で印刷されたフィールドの顕微鏡写真を示す図である。本発明による器具内部において、動的モードで（連続的な差し替えを伴って）、生成された水滴の印刷されたフィールドの顕微鏡写真を示す図である。本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、細胞およびメラニン（吸収剤）を含む滴の印刷されたフィールドの顕微鏡写真を示す図である。本発明によるスライドの他の実施形態のビューを示す図である。本発明によるスライドの他の実施形態のビューを示す図である。本発明によるスライドの他の実施形態のビューを示す図である。

本発明による器具の第１の変形の説明
図１は、パルス（１）を生成する合焦（focused）レーザービームによる励起を用いる、器具の第１の変形実施形態を示す。

ガラスまたは透明材料製のスライド（２）は、転写可能粒子（５）を含有するキャリア流体（４）がその中を流れる空洞（３）を画定する。

この空洞の深さは、５００μｍ未満、および好ましくは、５０からl００μｍ厚であり、このようにして、空洞（３）内における沈降現象（settling phenomena）を回避する。

この空洞（３）は、モールディング、機械加工（machining）、ブローイング（ガラス）または３Ｄ印刷（ＦＤＭ、ＳＬＳ、ＳＬＡ、ＤＬＰ、ＤＭＬＳ、ＥＢＭ、ＣＬＩＰ、ＭｕｌｔｉＪｅｔ、・・・）によって形成され、および円形、または長方形、または楕円形、断面（section）、または他の幾何学的形状を有する。その横表面（transverse surface）（６）は、レーザービーム（１）によって走査され得、および光学的再帰性ビーム（optical retrobeam）を介してセンサにおいて視覚化され得る作業領域を画定する。

ポンピングシステム（１５）によって押されたキャリア流体（４）は、供給タンク（１４）にそれ自体が接続される供給ダクト（８）に接続されるインレット開口（７）を通って空洞（３）に入り、およびアウトレット開口（９）を経て、排出および／または吸引ダクトダクト（１０）に排出される。

排出および／または吸引ダクトパイプ（１０）は、転写可能粒子（５）が投入（loaded with）されたキャリア流体（４）を含む回収タンク（１３）に繋がる。ポンプ（１５）は、転写可能粒子（５）が投入されたキャリア流体（４）を循環させる。供給タンク（１４）および回収タンク（１３）は、分離され得、または同一の流体がシステム内において数回再循環させられるべき場合は、単一のタンクを形成し得る。この構成において、関心事は、循環流体内における印刷された粒子の数を最大限にすることである。

任意選択的に、システムは、異なるタイプの不均質性が投入されたキャリア流体を各々含む数セットのタンク（１４および１３）を含む。弁は、標的（１１）上における異なる種類の粒子の堆積および分化された（differentiated)層の形成を可能にするために、タンクのうちの１つを選択するために使用される。

キャリア流体流量（４）は、転写可能粒子（５）の作業領域が適当な手段（撮像、分光法、・・・）による選択を可能にする速度で移動されることを保証するように調節され、およびそれらの選択されたものをレーザーパルスによって活性化する。

標的（１１）は、転写された粒子（１２）の堆積点を決定するために、および任意選択的に垂直方向において、転写されるべき粒子（５）によって移動される距離を調節するために、空洞（３）の底（６）に平行な平面Ｘ、Ｙにおいて可動である。この場合において、印刷基材に堆積される滴のサイズを調節することが可能である。

図２は、光学システムと結び付けられるデバイスの断面図である。

この光学システムは、２つの角度的に揺動可能な（angularly oscillating）ミラー（ガルバノメータタイプ）（２０）からなり、レーザー発射（laser shooting）領域を走査することを可能にし、および第１の光学ユニット（２１）は、ｆθ（F-Theta）タイプの走査レンズからなり、作業平面上におけるその直径が可能な限り最も小さくおよび最も一定であるレーザースポットを形成することを可能にする。この第１の光学ユニット（２１）は、いくつかのレンズの系による知られている方法で作られている。

走査ミラー（２０）の上流において、光学システムは、そのビームがダイクロイックミラー（２３）によって走査ミラー（２０）に反射し戻されるレーザー源（２２）を含む。

第２の光学ユニット（２４）は、ダイクロイックミラー（２３）を通過するレトロビームを用いて、センサ（２６）上に、作業領域（２５）の画像を形成する。

本発明による器具の第２の変形の説明
図３は、本発明によるスライド（２）の変形の上面図である。

それは、３つの平行な空洞（３０、３１、３２）からなり、各々、供給ダクト（それぞれ３３から３５）と排気（exhaust）ダクト（それぞれ３６から３８）との間に延びる。

各回路は、潜在的に異なる性質の転写可能な不均質性（３９から４１）を含むキャリア流体の循環を保証する。実際に、either それらは、サイズにおいてより大きいフィールドが印刷されまたは印刷プロセスが加速される（生産性を増す）ことを可能にし得る同一の性質のものであるか、またはそれらは、複雑なおよびカスタマイズされたアイテムを製造する（製造可能なアイテムの範囲を増す）ことを可能にし得る異なる性質のものであるか、のいずれかであり、それは、このタイプのアーキテクチャによって提供される「マルチカラー」態様である。

空洞のうちの１つを選択するために、スライド（２）は、３つの空洞の主軸に垂直の方向に機械的に移動させられ得、またはレーザービームの走査は、スライド（２）全体をカバーするようにさせられ得る。

本発明による異なる器具の実施形態の説明
図４は、器具の３つの可能なアーキテクチャの図を示す。図４のａは、供給（８）および排気（１０）ダクトがスライド（２）に平行である図を表し、一方、図４のｂは、ダクトが０°から９０°の間であり得る角度でスライドに達する状態を示す。１つまたは他の解決策の興味は、流体（４）の流れにおける閉塞（clogging）または連続性（continuity）の任意の問題を回避しおよび開口空洞（３）（レーザーパルスが合焦される図の円形部分）内における流体の均質膜の取得を同時に保証するために、流れ、デッドボリュームまたは角度を管理する能力にある。図４のｃは、空洞（３）内におけるその流れを均質膜として方向付け／案内するために、ガラスラメラが流体（４）のインレット（７）およびアウトレット（９）に配置されている、前の解決策の変形である。本明細書に例示されるアーキテクチャは、包括的（exhaustive）ではない。実際に、ダクトの形状、位置決めおよび角度、空洞およびスライドのサイズおよび形状、使用される材料、インレット（７）およびアウトレット開口の形状および位置決めは、本明細書に示される例とは異なっていてもよい。

図５は、図４に示されるものに類似している３つの可能な器具アーキテクチャの図を示す。それらは全て、共通して、この新しい構成において、それらが、その高さが空洞（３）の高さに対応しおよびその位置（positioning）が空洞（３）の開口領域と交差する上部の溝を有することを有する。そのような開口の利点は、器具に対して垂直に配置された視覚化手段（撮像）による膜の観察を可能にすることである。このようにして、膜の展開を経時的に追うことが可能であり、これは、印刷の間、レーザーパルスのエネルギーを膜の実厚さに適合させること、または逆に、膜の厚さをレーザーパルスのエネルギーに適合させることを可能にする。再び、本明細書に例示されるアーキテクチャは、包括的ではない。再び、ダクトの形状、位置決めおよび角度、空洞およびスライドのサイズおよび形状, 使用される材料、インレット（７）およびアウトレット開口の形状および位置決め、溝の形状、サイズおよび位置決めは、本明細書に示される例とは異なっていてもよい。

図６は、図５のｅに最初に示される、本発明による器具の変形のうちの１つに関して得られる結果を示す。図６のｈにおいて、透視図は、本構成における器具の内部アーキテクチャを浮き彫りにする。供給ダクトおよび排気ダクトは、空洞（３）およびスライド（２）に関して傾斜する。ダクトと空洞領域との間の接続は、５００μｍ未満の必要とされる膜厚と両立可能な小径のパイプによってなされる。しかしながら、これらのダクトの断面は、容易に閉塞しおよび著しい機械的応力を細胞にもたらしこのようにしてそれらの生存性に経時的に影響を及ぼすノズルシステム（オリフィス）内において観察されるものと比較可能な任意の現象を回避するために、小さすぎてはならない。この理由のために、ダクトは、好ましくは、２００μｍを超える直径を有することとなり、これは、この器具によって印刷され得る細胞または粒子の平均サイズの少なくとも１０倍である。器具は、その中心において穴が穿設され（シリンダー）、レーザーがその波長において透明なスライド（２）を通過することによって空洞内において合焦させられることを可能にすることがわかる。図６のｉにおいて、流体（４）が送られるスライド（２）の上側の空洞（３）の拡大図は、インレット（７）およびアウトレット（７および９）開口それぞれが、インレットおよびアウトレットダクト（８および１０）それぞれによっておよび器具の最上部に配置されるガラスラメラによって部分的に形成されることを示す。

ダクトおよびラメラの組み合わせは、流体（４）がスライド（２）上に適切に方向付けられることを保証する。薄膜が可能であることを証明する画像は、器具を横切る撮像（カメラおよび画像回復レンズ）によって得られた写真６のｊ、写真６のｋおよび写真６のｌに示される。インレット（７）における流体圧パラメータ（４）およびアウトレットにおける流体吸引（４）に応じて、膜の中心厚さを調節することが可能である。例えば、１３６μｍ、１００μｍおよび５６μｍの厚さが実験によって得られ、および図６のｊ、図６のｋおよび図６のｌに示される。

レーザー励起パラメータの適合（エネルギー、合焦、等）に相関するこれらの厚さの監視は、レーザー吸収によって生成されるジェットの微調節を可能にする。膜の上部形状は、写真に見られるように必ずしも平坦でなくてもよい。これは、流体（４）のパラメータ（粘度、密度、流量・・・）および前記流体の圧力／吸引パラメータに応じる。レーザー発射領域は、空間的に、厚さが一定である膜の部分に適合される。この帯域は、また、空洞全体に相当し得るが、この場合において、レーザーパラメータは、標的フィールドにおける膜厚の変動に適合されることとなる。

膜の特性化は、また、分光分析、距離測定、ラインシャドウグラフ、等のような本明細書において言及される撮像とは別の手段により実施され得る。

図７は、図３に示される解決策の３Ｄビューである。図７のｍにおける３Ｄに示されるこの実施形態は、専用の（dedicated）供給ダクトおよび排気ダクトによって各々供給（fed）される、３つの空洞を有する。インク膜、少なくとも器具の両端（ends）に配置されるもの、の観察を可能にするために、溝が最上部に存在する。加えて、透視図は、図７のｎに提供される。それは、３つの穴が見られることを可能にし、レーザーが該部分（the part）を通ってスライド（２）を備える各空洞（３）に移動することを可能にする。この例は、この器具にとって可能である広いデザイン可能性を純粋に例示するものであることは明らかである。実際に：
－２つの空洞または３つより多い空洞、
－すべての空洞に共通する単一の供給および／または排気ダクト、
－異なる空洞形状（正方形（square）、導管（canal）、楕円形、ひし形（diamond）、等）、
－スライドの表面に平行にまたは垂直に到着するダクト、
を備えるものを想像し得る。

本明細書に挙げられた例は、したがって、本発明による器具が有し得るアーキテクチャを限定するものではない。

本発明による、犠牲層の無い印刷方法の詳細な説明
図８は、均質なまたは不均質性を含む液体の印刷におけるレーザーと物質との間の相互作用の主要ステップを説明する。

－第１のステップは、レーザーを材料、この場合において、空洞（３）内に膜（４）の形で配置されるインク、に合焦させることにある。レーザーが合焦させられる方法は、蓄積されるエネルギーを吸収するであろう体積に直接的に影響を与える。これは、レーザーフルエンス（面または体積に関するエネルギー）と呼ばれている。方法は犠牲層を使用しないので、レーザーエネルギーを吸収するのはインクおよびその液体媒体の大部分である。事実上、レーザー波長およびエネルギーの選択は、膜（４）の吸収能力に及ぼす直接的な影響を有する。

スペクトルレベルでよく知られた吸収ピークを有する水から本質的になる、バイオプリンティングの場合において。したがって、これらの最大値に対応するレーザー源を選択することによって、この吸収を最大化しようと試みることが可能となる（例えば、赤外線水吸収線）。また、インク（分子、染料、粒子）中に配置される吸収剤による吸収を最大化しようと試みることも可能である。本発明において例示される実施例において、レーザーは、１０ピコ秒から４００フェムト秒までをカバーするするパルス持続時間（pulse duration）および１から４０μジュールの間のエネルギーに関して１０３０ｎｍの波長（イッテルビウム）でのワークを用いた。好ましくは、１０から１４μジュールのパルスあたりエネルギーに関して１０ピコ秒のパルス持続時間を用いるレーザーが使用された。

－第２のステップは、膜流体（４）によるレーザービームの吸収に続く材料の解離の結果であるプラズマ（８１）の生成（creation）に相当する。このプラズマは、原子、イオン、電子、分子の残基（residues）・・・の混合物で構成されている。

それは、レーザー吸収後に、極めて短い時間、典型的には数ピコ秒にわたって生成され、および１マイクロ秒のオーダーの非常に短い「ライフ」タイムを有する。プラズマ（８１）のサイズ、その時空間動力学（spatio-temporal dynamics）、その「温度」、その成分は、使用されるレーザーパルスの持続時間に非常に強く関連する。後者がマイクロ秒からナノ秒までのいわゆる「短」レジームである場合、プラズマの発生（origin）における主な効果は、１度から数度のオーダーの局所的な温度上昇を伴う線形吸収効果である。それは、サーマルと呼ばれるプロセスである。それは、よく制御された（well-controlled）および小さい空間内におけるプラズマ閉込（containment）の質に関して、より「粗い（coarse）」とみなされる。他方、パルス持続時間がいわゆる「超短」レジーム内である、すなわち数十ピコ秒から１フェムト秒のパルス持続時間に相当する場合、そうして、プラズマの発生における効果は、線形効果および非線形効果の組み合わせになる。

さらに、パルス持続時間が短ければ短いほど、非線形効果がより優先されることとなる。これらのレジームを用いることの利点は、温度上昇なしに、非常によく閉ざされた（bounded）および非常に小さい空間内におけるプラズマ閉込を保証するための、いわゆる「サーマル」プロセスへのアクセスにある。このレジームは、したがって、先験的に（a priori）細胞生存性に、および高解像度に、より好ましい。本発明の場合において、主な結果は、５から１０ピコ秒の間、線形および非線形効果の両方を混ぜ合わせるレジーム、に得られる。それらは、犠牲層なしで均質な媒体およびコロイド状の媒体の両方を印刷する能力を示す。

－第３のステップは、媒体中にキャビテーション気泡（８２）を生成することである。この気泡は、加圧ガス内へのプラズマ成分の再結合の結果である。再結合は、フィールド効果、放射性（radiative）および非放射性（non-radiative）再結合、トンネル効果、等・・・のような多くの複雑な物理的プロセスに基づく。キャビテーションは、初期プラズマ（８１）のサイズおよび質に非常に強く依存する。キャビテーション（８２）は、レーザーによる吸収およびプラズマの生成に続いて、約１マイクロ秒後に現れる。それは、球形状を有し得るが、また、細長いまたは環状の形状を有し得る。それは、全て、初期プラズマおよびその形状に依存する。レーザーの偏光（polarization）および焦平面におけるそのエネルギーの幾何学的分布は、プラズマの形状、およびしたがってキャビテーション気泡の形状に及ぼす直接的な影響を有する。このようにして、より再現性のある結果を得るために、円形レーザー偏光のような等方性形状が好ましいこととなる。

－最後に、第４のステップは、キャビテーション気泡（８２）が、成長し、変形し、液体移動を引き起こす、等・・・となるいわゆる流体力学段階に相当する。これらの流体力学現象の異なる段階は、ＰｅａｒｓｏｎまたはＷｏｒｔｉｎｇｔｏｎ・・・のもののような特定の理論を通して、既に部分的に知られている。最終結果は、液体の自由表面における材料ジェット（８３）の生成である。液体の表面張力、気泡から自由表面までの距離、液体の粘度は、このジェット（８３）の形状および動力学にもっとも影響力が大きいパラメータの１つである。

このようにして、犠牲層なしでの印刷は、使用されるレーザーおよびインクの両方と関連する非常に多数のパラメータに依存することとなる。本発明による記載された器具によるインク膜の制御は、印刷の間における可能性のある差異（沈降（sedimentation）、乾燥、可変のおよび制御されていない厚さ、・・・）のいくつかを規制する手段である。加えて、圧力および吸引により前記膜の流量および厚さを調節する可能性は、ジェットのサイズ、形状および動力学を調節することを可能にし得る。このようにして、そのような発明により、ジェットを調節するために必要とされるレーザーパラメータの範囲を縮小させることが可能となる。そのような選択の直接的な影響は、その定義においてはるかに単純で、より安定した、および何よりも、それはあまり多目的ではないのではるかに安価であるレーザーを使用することであり得る。

図９は、任意の犠牲層なしにレーザーによって発生させられる材料の実際のジェットを示す。この図における４つの写真は、各々、レーザーパルスがインク膜（４）内に合焦させられた後の特定の時間に対応する。第１の写真は、発射５μｓ後、第２が５０μｓ後などに撮影された。このシャドウグラフ撮像技術は、一般に、時間分解撮像（time-resolved imaging）と称される。それは、とても短い照明時間による写真撮影（photo shots）により、非常に高速の（hyper-fast）イベントを分解することを可能にする。この一連の写真は、上記図８において説明されたようなレーザージェットの発生の原理を示す。短時間に、微細な第１のジェットによって乗り越えられる（surmounted）ピラミッド型のドームの生成が見られ、次いで、より長い時間を掛けて、１つまたは複数の滴がそれから突出するはるかに壮大な（imposing）ジェットの立ち上がり（rise）が見られる。膜（４）の自由表面と上に印刷する受け入れ基材との間の距離に応じて、これらの滴のうちの１つまたは複数が、堆積されることとなる。ときには、インクと印刷基材との間の距離が、ジェットが受け入れ基材の表面を直接的に迎撃（intercept）するのに十分に小さく、大抵５００μｍ未満であることが起こり得る。これは、転写レジーム（transfer regeme）と称される。全ての場合において、機構が滴の堆積であろうと転写であろうと、それは、前方レーザー印刷と呼ばれることとなる。

以下の図１０、図１１、図１２、図１３および図１４は、任意の犠牲層なしに印刷したときに得られる結果を示す。これらの結果は、本発明において使用されたパラメータセット：
－レーザー（ピコ秒レジーム、１０マイクロジュール、近赤外波長、偏光・・・）、
－インク（粘度、表面張力、密度、厚さ・・・）、
－システム（操作速度、使用されたパターン、焦点・・・）、
が、均質なおよび不均質なアイテムを印刷することを可能にすることを証明し、これは、以前示されたことがなかった。

このようにして、図１０は、主に水からなる均質なインクの、任意の犠牲層なしでの、再現性の高いレーザー印刷の結果を示す。各印刷された滴は、画像上の小さい円として現れる。大きい円（灰色領域を黒色領域から分離する）は、単純に、この写真を撮るために使用された顕微鏡によって撮像されたフィールドに相当する。印刷された滴は、典型的には、直径において１００μｍでありおよび５００μｍ離れている。この結果は、本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、得られた。

図１１は、水、界面活性剤および５μｍ径のマイクロビーズで各々作られたコロイド状のインクの、犠牲層なしでの、レーザー印刷の均質な結果を示す。印刷結果は、平均して２から３個の少数のマイクロビーズを滴ごとに含む滴を堆積させるこの発明の能力を示す。これは、任意の犠牲層なしでの印刷がコロイド状の媒体に関して非常に高解像度の性能を実現し得るという証拠である（これは、以前示されたことが一度もない）。この結果は、本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、得られた。

図１２は、細胞インクの、任意の犠牲層なしでの、レーザー印刷の相対的に均質な結果を示す。この印刷は、マイクロビーズに関して一番（a first）である。それは、非常に説得力があり（convincing）および本発明のために非常に広い分野の使用に開かれる。画像上で見える印刷差異は、本質的に、沈降しおよびクラスターに凝集した、使用されおよびスライド（３）上に堆積されるインクの差異に関連する。実際に、この結果は、静的モードで、すなわち、動的な連続的な差し替えモードで本発明による器具を操作することなしに、得られた。この結果の主な目的は、生細胞を印刷するための金不使用の印刷の能力を証明することであった。再び、この結果は、本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、得らえた。

図１３は、動的モードで作動する本発明による器具、すなわち、連続的な差し替えにおいて作動する流体系により得られた、均質なインクによる、犠牲層なしでの、レーザー印刷の相対的に均質な印刷結果を示す。

最後に、図１４は、ニーズにより最適化されるべき、犠牲層のない印刷テクノロジーの能力の別の例示である。実際に、この画像において、今までに記載されたものと同一の条件下で印刷された滴のフィールドが、たった１つの違い：インクに組み込まれた吸収剤の存在、を有して見られる。この例において、それは、これらの実験のために使用されたレーザーの波長、すなわち１０３０ｎｍにおいて非常に高い吸収を持つ天然の生物学的化合物、メラニンであった。このようにして、この化合物の追加は、レーザー吸収、次いで、プラズマ生成および最終的にキャビテーション気泡の流体力学を可能にするために、より低いレーザーエネルギーにおいて作業することを可能にする。この結果は、本発明による器具内部において、静的モードで（連続的な差し替えなしで）、得られた。

別の実施形態の説明
図１５から図１７は、任意選択的な第１の隆起部（elevation）（１０５）、およびメサ形状のプレート（１００）を備え、平坦な上面を備える、スライド（２）の別の例の、部分断面図、斜視図および上面図をそれぞれ表す。この平坦な上面は、流体と励起および／または観察ビーム、例えばレーザービームとの間の相互作用の領域（１００）を画定する。

スライドは、このプレート（１００）のいずれの側にも、横溝（transverse groove）（１１０，１２０）を有する。

溝（１１０、１２０）の各々は、穴（１１１、１２１）を介して、スライド（２）を垂直に通過しおよび対応する溝それぞれに（１１０、１２０）開口するそれぞれのダクト（１１２、１２２）と連通する。

流体の流れは、第１の横溝（１１０）と第２の横溝（１２０）との間の長手方向に対応する矢印（１０５）によって表される方向に生じる。

第１の溝（１１０）は、通常、流体供給のために使用され、これは、流体が次いで吸い上げられるところの第２の溝（１２０）内に流れる前に、プレート（１００）を通過する。しかしながら、プレートの表面（１００）における交互の流れを保証するように、流れ方向を一時的に変更することも可能である。

チューブ（１１３、１２３）は、転写可能粒子を運ぶ流体の供給および／または吸引のためのダクト（１１１、１２１）にそれぞれ接続される。ダクトのうちの１つは、多方弁（multi-way valve）によって、異なる種類の流体のいくつかのインレット（１１４から１１６）に接続され得る。これらのチャンネルの各々は、流量（シリンジポンプのような）または圧力のいずれかにおいて、作動し得る。

溝（１１０、１２０）に隣接しない、プレート（１００）の他の２つの縁部は、are 任意選択的に、区切られた流体流領域を形成するように、フランジ（１３０、１４０）によって境される。同様に、スライドの外側縁部は、縁部（１５０、１６０）によって区切られる。

供給および／または吸引流量の制御は、プリントヘッドの開口部分にわたって液体の均質分布（homogeneous distribution）を保証するように、流れを制御することを可能にする。

第１の解決策は、インレットポートおよび長方形アウトレットを提供することであり、インレットポートおよびアウトレットポートは、図１５から図１７に示されるように、横溝（１１０、１２０）の上面によって画定される。

側縁部（１３０、１４０）は、軸（１０５）を含む平面内の液体メニスカスの形状が制御され得ることを保証する。それらは、物理的または化学的であり得る。

本発明の特定の実施形態によると、液膜は、流れが端部においてより高い流体力学的抵抗を有するように、縁部において完全に平坦なまたはより薄い厚さを有する。

この解決策は、また：
－液体の厚さを制御することのできる異なる要素、
－接触線のインキングがその上で容易にされる、上流および下流の壁（１５０、１６０）、
－相互作用領域における膜の厚さを低減させるために膜を高くするための中央プラットフォーム（１００）、
を含んでいてもよい。

流体の性質を代替させるための別の解決策は、転写可能粒子を含む流体と不活性液体との間で代替させることである。

別の解決策は、少なくとも２つのチャンネルを持つ液体排出パイプからなる。

走査は、そして、以下の通りである：
初期化のステップ１：注入点および排出点を接続するプリントヘッド上に液体ブリッジを生成するために、制御プロセスが設定される。

第１の解決策は、カートリッジからヘッドに、注入および排出点から、液体を注入することである。

別の解決策は、カートリッジからヘッドに、注入点のみから、液体を注入することである。

別の解決策は、プリントヘッドの開口部分が完全に湿潤されることを可能にするテクスチャを使用することである。

自動化ステップ２：液体ブリッジが作り出されると、膜厚は、注入点または排出点のいずれかから液体を除去することによって制御される。

実施形態の第１の例は、注入点と排出点との間の流量を制約すること（imposing）により、連続的な流れを確立しおよび膜の厚さを制御する

実施形態の別の例は、注入点と排出点との間の圧力差を制約することにより、連続的な流れを確立しおよび膜の厚さを制御する。

実施形態の別の例は、バッチモード：
－注入点からの制約された体積の注入、
－次いで、注入または排出点からの液体の除去による所望される厚さの調節、
で操作される。

この操作は周期的に繰り返される。

プリントヘッド上の液膜をよりよく制御するために、センサが統合され得る。

実施形態の例は、膜の厚さを測定するために共焦点（confocal）システムを使用する。実施形態の別の例は、注入および排出ダクトにおいて光学検出システムを使用する。有利な発達は、気泡の通路（passage）を、特には脱出路に関して、検出することを可能にする。有利な発達は、濃度を、特には注入路に関して、検出することを可能にする。

Claims

標的（１１）に向かって配向されるジェットを引き起こすための、スライド（２）を覆う流体との点相互作用を生み出すために配向可能なエネルギー励起手段を含む付加プリンティング器具であって、前記流体は、転写可能な特定の局所特性を持つ部分を含む液体ベクトルによって構成され、
－前記流体は、５００μｍ未満の厚さを持つ液膜（４）を形成し、
－スライド（２）上に、レーザーとの相互作用を可能にする少なくとも１つの相互作用帯域（３）を有し、
－前記膜（４）内に開口する少なくとも１つのインレット（７）と、前記膜（４）内に開口する少なくとも１つのアウトレット（９）と、を有し、
－前記器具は、前記インレット（７）と前記アウトレット（９）との間の流体を循環させるための手段をさらに含むことを特徴とする、付加プリンティング器具。
前記膜（４）の厚さは２０μｍから１００μｍの間であることを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記膜（４）の厚さは、前記転写可能な特定の局所特性を持つ部分に含まれる粒子の公称サイズの３倍から１０倍の間であることを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記相互作用帯域（３）の表面は、０．０５ｍｍ²よりも大きいことを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記インレット（７）は、前記相互作用帯域（３）の側部内へ開口することを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記相互作用帯域（３）は、前記アウトレット（９）内へ側方に開口する周辺部を有することを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記インレット（７）および前記アウトレット（９）は、前記相互作用帯域（３）に接続される管状チャンネルによって構成されることを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記インレット（７）と前記アウトレット（９）との間の流体を循環させるための前記手段は、前記相互作用帯域における流体の流れを制御するために、注入速度および吸引速度を制御するための手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記注入速度および前記吸引速度を制御するための前記手段は、前記相互作用帯域（３）における前記膜（４）の厚さを制御するために、前記膜（４）の厚さを測定することによって制御されることを特徴とする請求項８に記載の付加プリンティング器具。
各々インレット（７）およびアウトレット（９）を含む複数の相互作用帯域を含むことを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
少なくとも２つの前記相互作用帯域は、共通のインレット（７）および／またはアウトレット（９）を有することを特徴とする請求項１０に記載の付加プリンティング器具。
前記エネルギー励起手段は、レーザーであることを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記相互作用帯域は、前記レーザーおよび撮像の波長帯において透明であり、および任意の犠牲層を有さないことを特徴とする請求項１２に記載の付加プリンティング器具。
前記流体は、前記レーザーの発振波長における吸収色素を含むことを特徴とする請求項１３に記載の付加プリンティング器具。
前記相互作用帯域を撮像するための手段を含むことを特徴とする請求項１２に記載の付加プリンティング器具。
前記レーザーは、ピコ秒またはフェムト秒モードにおいて、２０から４０マイクロジュールの間のエネルギーレベルで、パルスを放射し、パルス毎のエネルギーレベルは、前記相互作用帯域に存在する流体の特性の測定の結果に応じて印刷を可能な限り均質にするようにコンピュータによって制御され、前記測定は、前記特定の局所特性を持つ部分の粒子密度、および／または粘度、および／または膜厚（４）の測定を含むことを特徴とする請求項１２に記載の付加プリンティング器具。
前記レーザーは、ナノ秒レジームにおいて、０．５から２０ミリジュールのエネルギーで、パルスを放射し、パルス毎のエネルギーレベルは、前記相互作用帯域に存在する流体の特性の測定の結果に応じて印刷を可能な限り均質にするようにコンピュータによって制御され、前記測定は、特定の局所特性を持つ部分の粒子密度、および／または粘度、および／または膜厚（４）を含むことを特徴とする請求項１２に記載の付加プリンティング器具。
前記エネルギー励起手段は、音響波発生器であることを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記エネルギー励起手段は、振動による表面波発生器からなることを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記相互作用帯域を撮像しおよび転写されるべき粒子のタイプを選択するための手段を含むことを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
前記スライド（２）は、メサ形状のプレート（１００）を有し、その上面は、前記流体と励起および／または観察ビームとの間の前記相互作用帯域（１００）を画定し、前記スライド（２）は、前記プレート（１００）のいずれかの側に横溝（１１０、１２０）を有し、前記溝（１１０、１２０）の各々は、前記スライド（２）を垂直に横断しおよび対応する前記溝（１１０、１２０）それぞれに開口する穴（１１１、１２１）を介してダクト（１１２、１２２）とそれぞれ連通することを特徴とする請求項１に記載の付加プリンティング器具。
標的（１１）に向かって配向されるジェットを引き起こすための、スライド（２）を覆う流体との点相互作用を生み出すために配向可能なエネルギー励起手段を含む器具による付加プリンティングプロセスであって、前記流体は、転写可能な特定の局所特性を持つ部分を含む液体ベクトルによって構成され、前記流体は、レーザーとの相互作用を可能にする少なくとも１つの相互作用帯域を有するスライド（２）のインレットダクト（７）とアウトレットダクト（９）との間を循環する５００μｍ未満の厚さの液膜（４）を形成し、および前記インレットダクト（７）および前記アウトレットダクト（９）は前記膜（４）内に開口することを特徴とする、付加プリンティングプロセス。
パルス毎のエネルギーレベルは、前記相互作用帯域に存在する前記流体の特性の測定の結果に応じて印刷を可能な限り均質にするようにコンピュータによって制御され、前記測定は、粒子密度、および／または粘度、および／または膜厚（４）の測定を含むことを特徴とする請求項２２に記載の付加プリンティングプロセス。