JP7139136B2 - Screening method for a substance that increases or suppresses autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes - Google Patents
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本発明は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質のスクリーニング方法に関する。また、本発明は、被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法に関する。更に、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法に関する。 TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method of screening for a substance that increases or suppresses autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. The present invention also relates to a method for evaluating the effect of a test substance on the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. Furthermore, the present invention relates to a method for identifying a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes.
皮膚表皮におけるシミ、そばかす、くすみ、黒ずみ、肝斑、老人性色素斑等の色素沈着は、紫外線曝露、ホルモンの異常や物理的な刺激等が原因となってメラニンが過剰に形成され、これが皮膚内に沈着することによって生じることが分かっている。また、皮膚真皮において、コラーゲン合成機能の低下は、たるみ、しわ等の皮膚老化の要因になっていることが分かっている。従来、色素沈着や皮膚老化等の皮膚症状を予防又は改善できる成分の探索は精力的に行われており、様々な美容的又は薬学的効果を有する外用製剤が開発されている。 Pigmentation such as spots, freckles, dullness, dark spots, chloasma, and senile pigmentation on the skin epidermis is caused by excessive melanin formation due to UV exposure, hormonal abnormalities, and physical stimulation. It is known to be caused by deposition within the In addition, it is known that a decrease in the function of synthesizing collagen in the dermis of the skin is a factor in skin aging such as sagging and wrinkles. BACKGROUND ART Conventionally, active efforts have been made to search for ingredients that can prevent or improve skin symptoms such as pigmentation and skin aging, and various external preparations having cosmetic or pharmaceutical effects have been developed.
一方、近年、外用製剤の性能の向上に対する消費者の要望の高まりを受けて、より優れた効能を有する成分の新たな探索が求められている。また、優れた外用製剤の開発には、効能が知られている既知成分の機能性を検証する評価系を確立することも重要になっている。 On the other hand, in recent years, in response to increasing consumer demand for improved performance of topical preparations, there is a demand for new search for ingredients with better efficacy. In addition, it is important to establish an evaluation system to verify the functionality of known ingredients with known efficacy for the development of excellent topical formulations.
従来、メラノサイト内で形成されたメラノソームがケラチノサイトに受け渡され、ケラチノサイト内にメラニン色素が留まって沈着することにより、皮膚のシミ等の暗色化（メラニン沈着）が促進されることが解明されている（例えば、非特許文献１参照）。そこで、皮膚組織に存在するメラノサイトとケラチノサイトの機能の解析を進めることは、優れた美白効果を有する成分のスクリーニング手法や、美白効果を有する既知成分の評価手法を確立する上で有効になる。 Conventionally, it has been elucidated that melanosomes formed in melanocytes are transferred to keratinocytes, and melanin pigments are retained and deposited in keratinocytes, thereby promoting darkening of skin spots (melanin deposition). (For example, see Non-Patent Document 1). Therefore, advancing the analysis of the functions of melanocytes and keratinocytes present in skin tissue will be effective in establishing a screening method for ingredients with excellent whitening effects and an evaluation method for known ingredients with whitening effects.
また、ケラチノサイトのオートファジーは、ケラチノサイトから受け渡されたメラノソームの分解や、コラーゲン合成機能の維持に寄与しており、ケラチノサイトのオートファジー活性の向上は、色素沈着や皮膚老化等の皮膚症状の予防又は改善につながることが分かっている。そこで、ケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼす要因を解明することは、外用製剤に使用される成分のスクリーニング方法や評価手法を確立する上で有効になる。 In addition, keratinocyte autophagy contributes to the degradation of melanosomes delivered from keratinocytes and maintenance of collagen synthesis function, and improvement of keratinocyte autophagy activity prevents skin symptoms such as pigmentation and skin aging. Or it is known to lead to improvement. Therefore, elucidation of the factors that affect the autophagy activity of keratinocytes will be effective in establishing screening methods and evaluation methods for components used in topical preparations.
しかしながら、従来、メラノサイトがケラチノサイトに及ぼす影響については、メラノソームの受け渡し以外は十分に解明されておらず、ケラチノサイトとメラノサイトを使用したスクリーニング系や評価系は確立できていないのが現状である。また、従来、ケラチノサイトのオートファジー活性を指標としたスクリーニング系や評価系も確立できていない。 However, until now, the effects of melanocytes on keratinocytes have not been fully elucidated except for the transfer of melanosomes, and the current situation is that no screening system or evaluation system using keratinocytes and melanocytes has been established. Moreover, conventionally, no screening system or evaluation system has been established using the autophagy activity of keratinocytes as an indicator.
ケラチノサイトのオートファジー機能は、メラノサイトから送り込まれたメラニンの分解、コラーゲン合成機能の維持等で重要な役割を果たしており、ケラチノサイトのオートファジー機能を利用したスクリーニング系や評価系を確立できれば、従来技術とは異なる指標に基づいて、外用製剤に使用される成分のスクリーニングや評価が可能になる。 The autophagy function of keratinocytes plays an important role in the degradation of melanin sent from melanocytes and the maintenance of collagen synthesis function. allows screening and evaluation of ingredients used in topical preparations based on different indicators.
そこで、本発明の目的は、ケラチノサイトのオートファジー機能を利用したスクリーニング系や評価系を確立することである。 Accordingly, an object of the present invention is to establish a screening system and an evaluation system utilizing the autophagy function of keratinocytes.
本発明者は、メラノサイトがケラチノサイトに及ぼす影響について検討を進めたところ、メラノサイトとケラチノサイトを共培養すると、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下するという新たな知見を得た。そして、メラノサイトとケラチノサイトを共培養し、共培養後のケラチノサイトのオートファジー活性を利用することによって、ケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質のスクリーニングや、被験物質がケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす効果の評価が可能になることを見出した。 The inventor of the present invention has studied the effects of melanocytes on keratinocytes, and has found new findings that co-culturing of melanocytes and keratinocytes reduces the autophagy activity of keratinocytes. Then, by co-cultivating melanocytes and keratinocytes and utilizing the autophagy activity of keratinocytes after co-culturing, screening for substances that increase or suppress the autophagy activity of keratinocytes, and the effect of the test substance on the autophagy activity of keratinocytes We found that it is possible to evaluate the effect.
更に、本発明者は、メラノサイトとケラチノサイトを共培養すると、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下するという新たな知見に基づいて、当該共培養によってメラノサイトがケラチノサイトのオートファジー活性を低下させる物質を分泌していることを突き止めた、そして、本発明者は、メラノサイトが分泌する、ケラチノサイトのオートファジー活性を低下させる物質を特定できる試験系を見出した。 Furthermore, based on the new knowledge that co-culturing melanocytes and keratinocytes reduces the autophagy activity of keratinocytes, the co-culture causes melanocytes to secrete substances that reduce the autophagy activity of keratinocytes. The present inventors have discovered a test system capable of identifying substances secreted by melanocytes that reduce the autophagic activity of keratinocytes.
本発明は、これらの知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１． メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質をスクリーニングする方法であって、
候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第１工程、
前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第２工程、及び
前記第２工程において、オートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する第３工程
を含む、スクリーニング方法。
項２． 前記第１工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、
ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、項１に記載のスクリーニング方法。
項３． 前記第１工程が、ケラチノサイトとメラノサイトが接触した状態で共培養される、項１に記載のスクリーニング方法。
項４． 前記第２工程において、オートファジー活性の測定がオートファジー小胞を選択的に染色することにより行われる、項１～３のいずれかに記載のスクリーニング方法。
項５． 被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法であって、
被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第Ｉ工程、
前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ＩＩ工程、及び
前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する第ＩＩＩ工程、
を含む、評価方法。
項６． 前記第Ｉ工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、
ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、項５に記載の評価方法。
項７． 前記第Ｉ工程が、ケラチノサイトとメラノサイトが接触した状態で共培養される、項５に記載の評価方法。
項８． 前記第ＩＩ工程において、オートファジー活性の測定がオートファジー小胞を選択的に染色することにより行われる、項５～７のいずれかに記載の評価方法。
項９． メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法であって、
ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第ｉ工程、
前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する第ｉｉ工程、
前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する第ｉｉｉ工程、
前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ｉｖ工程、及び
前記第ｉｖ工程において、オートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する第ｖ工程
を含む、同定方法。
The present invention has been completed through further studies based on these findings. That is, the present invention provides inventions in the following aspects.
Section 1. A method for screening a substance that increases or suppresses autophagic activity of keratinocytes in the presence of melanocytes, comprising:
A first step of co-cultivating keratinocytes and melanocytes in the presence of a candidate substance,
A second step of measuring autophagy activity in keratinocytes after the first step, and selecting a candidate substance that increases or suppresses autophagy activity in the second step as an autophagy activity promoter or an autophagy activity inhibitor A screening method, comprising a third step of
Section 2. The first step is a step of co-cultivating keratinocytes and melanocytes by separating the culture vessel using a culture insert having a porous membrane on the bottom,
Item 2. The screening method according to item 1, wherein one of keratinocytes and melanocytes is arranged on the porous membrane on the inner surface of the culture insert, and the other cell is supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert. .
Item 3. Item 2. The screening method according to Item 1, wherein in the first step, keratinocytes and melanocytes are co-cultured in contact with each other.
Section 4. Item 4. The screening method according to any one of Items 1 to 3, wherein in the second step, autophagy activity is measured by selectively staining autophagy vesicles.
Item 5. A test substance, a method for evaluating the effect on the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes,
Step I of co-cultivating keratinocytes and melanocytes in the presence of a test substance,
Step II of measuring the autophagy activity in keratinocytes after the step I, and based on the autophagy activity measured in the step II, the test substance affects the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes A third step of determining the impact,
evaluation methods, including;
Item 6. The first step is a step of co-cultivating keratinocytes and melanocytes by separating the culture vessel using a culture insert having a porous membrane on the bottom,
Item 6. The evaluation method according to item 5, wherein one of keratinocytes and melanocytes is placed on the porous membrane on the inner surface of the culture insert, and the other cell is supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert. .
Item 7. Item 6. The evaluation method according to Item 5, wherein in the first step, keratinocytes and melanocytes are co-cultured in contact with each other.
Item 8. Item 8. The evaluation method according to any one of items 5 to 7, wherein in the step II, autophagy activity is measured by selectively staining autophagy vesicles.
Item 9. A method for identifying a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes, comprising:
Step i of co-cultivating keratinocytes and melanocytes,
A step ii of identifying a secreted substance in the culture medium after the step i,
step iii of culturing the keratinocytes in the presence of the secretory substance identified in step ii;
Step iv of measuring the autophagy activity in keratinocytes after the step iii, and in the step iv, the secreted substance that inhibits the autophagy activity is used to reduce the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. identification method, comprising step v.
本発明は、メラノサイトとケラチノサイトを共培養することによってケラチノサイトのオートファジー活性が低下するという現象を利用した、外用製剤に使用される成分のスクリーニング方法や評価方法が提供される。具体的には、本発明のスクリーニング方法によれば、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質を選定することができる。また、本発明の評価方法によれば、機能が公知又は未知の被験物質について、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention provides screening methods and evaluation methods for components used in preparations for external use, utilizing the phenomenon that autophagic activity of keratinocytes is reduced by co-cultivating melanocytes and keratinocytes. Specifically, according to the screening method of the present invention, a substance that increases or suppresses the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes can be selected. In addition, according to the evaluation method of the present invention, it is possible to evaluate the influence of test substances with known or unknown functions on the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes.
更に、本発明の同定方法によれば、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定することができ、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等を進める上で福音をもたらし得る。 Furthermore, according to the identification method of the present invention, it is possible to identify a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. can bring the gospel in
１．スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、候補物質の中から、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質を選定する方法である。
具体的には、本発明のスクリーニング方法は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大又は抑制する物質をスクリーニングする方法であって、候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第１工程、前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第２工程、及び前記第２工程において、オートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する第３工程を含むことを特徴とする。以下、本発明のスクリーニング方法について工程毎に説明する。
1. Screening Method The screening method of the present invention is a method for selecting, from among candidate substances, a substance that increases or suppresses the autophagic activity of keratinocytes in the presence of melanocytes.
Specifically, the screening method of the present invention is a method of screening for a substance that increases or suppresses the autophagic activity of keratinocytes in the presence of melanocytes, wherein keratinocytes and melanocytes are co-cultured in the presence of a candidate substance. In the first step, the second step of measuring the autophagy activity in keratinocytes after the first step, and the second step, the candidate substance that increased or suppressed the autophagy activity is an autophagy activity promoter or autophagy activity It is characterized by including a third step of selecting as an inhibitor. Each step of the screening method of the present invention will be described below.
［第１工程］
第１工程では、候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する。具体的には、第１工程では、候補物質を含む培地中でケラチノサイトとメラノサイトの共培養が行われる。
[First step]
In the first step, keratinocytes and melanocytes are co-cultured in the presence of the candidate substance. Specifically, in the first step, keratinocytes and melanocytes are co-cultured in a medium containing the candidate substance.
候補物質とは、スクリーニングに供され、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤に該当するか否かの判定に供される物質である。候補物質の種類については、特に制限されず、天然物、合成物、半合成物が挙げられる。候補物質として、具体的には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、植物エキス、動物エキス、糖類（多糖、オリゴ糖、単糖等を含む）、脂質（リン脂質、糖脂質等を含む）、界面活性剤、その他の高分子有機化合物、その他の低分子有機化合物、無機化合物、その他の生体由来化合物、それらの修飾物、それらの誘導体等が挙げられる。候補物質は、１種の化合物のみからなるものであってもよく、また２種以上の化合物が含まれるものであってもよい。 A candidate substance is a substance that is subjected to screening and used to determine whether or not it corresponds to an autophagy activity promoter or an autophagy activity inhibitor. The types of candidate substances are not particularly limited, and include natural products, synthetic substances, and semi-synthetic substances. Candidate substances specifically include proteins, peptides, amino acids, plant extracts, animal extracts, saccharides (including polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, etc.), lipids (including phospholipids, glycolipids, etc.), and surfactants. , other high-molecular organic compounds, other low-molecular-weight organic compounds, inorganic compounds, other bio-derived compounds, modifications thereof, derivatives thereof, and the like. A candidate substance may consist of only one type of compound, or may contain two or more types of compounds.
ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する際の候補物質の培地中濃度については、特に制限されないが、例えば０．００００１～１０重量％程度に設定すればよい。また、候補物質の培地中濃度は、低濃度から高濃度に段階的に設定してもよい。 The concentration of the candidate substance in the medium when keratinocytes and melanocytes are co-cultivated is not particularly limited, but may be set to about 0.00001 to 10% by weight, for example. Also, the concentration of the candidate substance in the medium may be set stepwise from low concentration to high concentration.
第１工程において、候補物質の添加は、ケラチノサイト及びメラノサイトが培養器内で接着した後に行うことが望ましい。 In the first step, it is desirable to add the candidate substance after the keratinocytes and melanocytes have adhered in the incubator.
第１工程で使用するケラチノサイト及びメラノサイトの由来については、特に制限されないが、ヒトにおいてオートファジー活性を増大又は抑制する候補物質をより高精度にスクリーニングするという観点から、ヒト由来であることが好ましい。 The origin of the keratinocytes and melanocytes used in the first step is not particularly limited, but from the viewpoint of more accurately screening candidate substances that increase or suppress autophagy activity in humans, they are preferably of human origin.
共培養開始時のケラチノサイトとメラノサイトの細胞数の比率については、特に制限されないが、例えば、ケラチノサイト：メラノサイトの細胞数の比率として、５０：１～０．５：１、好ましくは２０：１～１：１、より好ましくは１０：１～１：１が挙げられる。 The cell number ratio of keratinocytes and melanocytes at the start of co-culture is not particularly limited. :1, more preferably 10:1 to 1:1.
共培養開始時のケラチノサイトとメラノサイトの細胞濃度については、特に制限されないが、培養面積あたりの細胞数として、例えば、ケラチノサイトが５×１０3～１×１０6個／ｃｍ2、好ましくは１×１０4～５×１０5個／ｃｍ2、より好ましくは２×１０4～２×１０5個／ｃｍ2；メラノサイトが５×１０3～５×１０5個／ｃｍ2、好ましくは１×１０4～１×１０5個／ｃｍ2、より好ましくは２×１０4～は４×１０4個／ｃｍ2が挙げられる。 The cell concentrations of keratinocytes and melanocytes at the start of co-culture are not particularly limited, but the number of cells per culture area is, for example, 5×10 3 to 1×10 6 cells/cm 2 of keratinocytes, preferably 1×10 cells/cm 2 . 4 to 5×10 5 /cm 2 , more preferably 2×10 4 to 2×10 5 /cm 2 ; melanocytes 5×10 3 to 5×10 5 /cm 2 , preferably 1×10 4 1×10 5 pieces/cm 2 , more preferably 2×10 4 to 4×10 4 pieces/cm 2 .
第１工程で行われる共培養は、ケラチノサイトとメラノサイトが物理的に接触していない状態で行われる非接触型共培養であってもよく、ケラチノサイトとメラノサイトが互いに接触した状態で行われる接触型共培養であってもよい。 The co-culture performed in the first step may be a non-contact co-culture performed in a state in which the keratinocytes and the melanocytes are not in physical contact, or a contact-type co-culture performed in a state in which the keratinocytes and the melanocytes are in contact with each other. It may be cultured.
非接触型共培養は、ケラチノサイトとメラノサイトが隔てられて、両細胞が培地を共有できる状態で培養すればよい。具体的には、非接触型共培養としては、以下に示す第１実施態様～第３実施態様が挙げられる。
第１実施態様：多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて培養する方法（トランスウェル法）。
第２実施態様：底部に仕切壁が設けられて２つの領域に区画化されている培養容器を用いて、ケラチノサイトとメラノサイトを隔てて培養する方法。
第３実施態様：ケラチノサイトを収容する第１培養容器と、メラノサイトを収容する第２培養容器とを有し、当該第１培養容器の側面と当該第２培養容器の側面が培地を共有できるように連通している培養装置を用いて、ケラチノサイトとメラノサイトを隔てて培養する方法。
In the non-contact co-culturing, keratinocytes and melanocytes are separated from each other and cultured in a state where both cells can share a medium. Specifically, non-contact co-culture includes the following first to third embodiments.
First Embodiment : A method of culturing keratinocytes and melanocytes by dividing a culture vessel using a culture insert having a porous membrane on the bottom (transwell method).
Second Embodiment : A method of culturing keratinocytes and melanocytes separately using a culture vessel having a partition wall at the bottom and compartmentalized into two regions.
Third embodiment : having a first culture vessel containing keratinocytes and a second culture vessel containing melanocytes, so that the side surface of the first culture vessel and the side surface of the second culture vessel can share the medium A method in which keratinocytes and melanocytes are separated from each other and cultured using a communicating culture apparatus.
前記第１実施態様の具体例として、ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う方法（以下、トランスウェル両面培養法）が挙げられる。 As a specific example of the first embodiment, one of keratinocytes and melanocytes is placed on the porous membrane on the inner surface of the culture insert, and the other cell is supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert. method (hereinafter referred to as transwell double-sided culture method).
図１に前記第１実施態様（トランスウェル両面培養法）、第２実施態様、及び第３実施態様の模式図を示す。 FIG. 1 shows schematic diagrams of the first embodiment (transwell double-sided culture method), the second embodiment, and the third embodiment.
これらの非接触型共培養の方法の中でも、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法は、候補物質非存在下でケラチノサイトとメラノサイトとの共培養によりケラチノサイトのオートファジー活性を低下させ易く、ケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼし易い候補物質を選定し易くなるため、好適である。 Among these non-contact co-cultivation methods, the transwell double-sided culture method according to the first embodiment is easy to reduce the autophagy activity of keratinocytes by co-cultivating keratinocytes and melanocytes in the absence of a candidate substance. This is preferable because it facilitates the selection of candidate substances that are likely to affect the autophagy activity of .
前記第１実施態様で使用されるカルチャーインサートの多孔質膜の素材については、特に制限されず、トランスウェル法で通常使用されるものであればよい。具体的には、カルチャーインサートの多孔質膜の素材として、コラーゲン、ポリカーボネート、ポリエステル（ポリエチレンテレフタレート等）、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはコラーゲンが挙げられる。 The material of the porous membrane of the culture insert used in the first embodiment is not particularly limited as long as it is commonly used in the transwell method. Specifically, materials for the porous membrane of the culture insert include collagen, polycarbonate, polyester (polyethylene terephthalate, etc.), polytetrafluoroethylene, and the like. Among these, collagen is preferred.
また、前記第１実施態様で使用されるカルチャーインサートの多孔質膜の孔径については、細胞を透過せず、且つ培地を透過可能であることを限度として、特に制限されないが、例えば、０．０１～５０μｍ、好ましくは０．０１～２０μｍ、より好ましくは０．０５～１０μｍが挙げられる。 In addition, the pore size of the porous membrane of the culture insert used in the first embodiment is not particularly limited as long as it is impermeable to cells and permeable to medium. ~50 μm, preferably 0.01 to 20 μm, more preferably 0.05 to 10 μm.
前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法では、カルチャーインサートの内側表面の多孔質膜にケラチノサイトを配し、当該カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜にメラノサイトを担持させてもよく、また、配置されるケラチノサイトとメラノサイトがその逆であってもよい。メラノサイトはケラチノサイトに比べて多孔質膜に強固に担持され易いという特性を踏まえれば、カルチャーインサートの内側表面の多孔質膜にケラチノサイトを配し、当該カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜にメラノサイトを担持させることが好ましい。 In the transwell double-sided culture method according to the first embodiment, keratinocytes may be arranged on the porous membrane on the inner surface of the culture insert, and melanocytes may be supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert. The keratinocytes and melanocytes may be treated and vice versa. Considering the characteristic that melanocytes are more likely to be firmly supported on a porous membrane than keratinocytes, keratinocytes are arranged on the porous membrane on the inner surface of the culture insert, and melanocytes are supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert. It is preferable to let
前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法において、カルチャーインサートの多孔質膜の内側表面と外側表面にそれぞれ細胞を担持又は配して共培養する方法としては、例えば、以下の手順で行うことができる。
(1)先ず、カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜を上面にして、当該多孔質膜の外側表面の外周から上に延びるリング状ホルダーを装着して容器を形成し、一方の細胞の懸濁液を入れて培養することにより、当該細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させる。
(2)次いで、培養液を除去して、前記リング状ホルダーを外し、カルチャーインサートをカルチャーインサートの受け皿となるプレート（コンパニオンプレート）に装着し、カルチャーインサート内に他方の細胞の懸濁液を入れて培養する。
In the transwell double-sided culture method according to the first embodiment, the method of co-cultivating cells by supporting or arranging them on the inner surface and the outer surface of the porous membrane of the culture insert, respectively, can be performed, for example, by the following procedure. can.
(1) First, with the porous membrane on the outer surface of the culture insert facing up, a ring-shaped holder extending upward from the outer periphery of the porous membrane is attached to form a container, and one cell is suspended. By adding the liquid and culturing, the cells are supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert.
(2) Next, the culture medium is removed, the ring-shaped holder is removed, the culture insert is attached to a plate (companion plate) serving as a receiving plate for the culture insert, and the other cell suspension is placed in the culture insert. to culture.
参考のため、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法によって共培養する手順の一例の模式図を図２に示す。なお、図２では、便宜上、カルチャーインサートの内側表面の多孔質膜にケラチノサイトが配され、当該カルチャーインサートの外側表面の多孔質膜にメラノサイトが担持されている状態になっているが、配置されるケラチノサイトとメラノサイトは、その逆であってもよい。 For reference, FIG. 2 shows a schematic diagram of an example of the procedure for co-culturing by the transwell double-sided culture method according to the first embodiment. In FIG. 2, for the sake of convenience, keratinocytes are placed on the porous membrane on the inner surface of the culture insert, and melanocytes are supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert. Keratinocytes and melanocytes may be vice versa.
なお、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法によって共培養するための装置としては、例えば、「ａｄ－ＭＥＤビドリゲル２」（関東化学株式会社製）として市販されている。当該市販品を使用して、前記第１実施態様でのトランスウェル両面培養法による共培養を簡易に行うことができる。 An apparatus for co-culturing by the transwell double-sided culture method according to the first embodiment is commercially available as, for example, "ad-MED Vidrigel 2" (manufactured by Kanto Kagaku Co., Ltd.). By using the commercially available product, co-culturing by the transwell double-sided culture method in the first embodiment can be easily performed.
接触型共培養では、同一の培養容器内で、ケラチノサイトとメラノサイトが接触するように混合した状態で培養を行えばよい。図１に接触型共培養の模式図を示す。 In the contact co-culture, keratinocytes and melanocytes may be cultured in the same culture vessel in a mixed state so that they are in contact with each other. FIG. 1 shows a schematic diagram of contact co-culture.
第1工程で行われる共培養として、好ましくは、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養、及び接触型共培養が挙げられる。このような共培養を採用することによって、メラノサイト共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性が低下し易くなり、ケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼす候補物質を高精度で選定することが可能になる。とりわけ、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養は、共培養後にメラノサイトとケラチノサイトを分離できるので、第２工程におけるオートファジー活性の測定を簡便に行うことが可能になり、特に好適である。 The co-culturing performed in the first step preferably includes non-contact co-culturing and contact co-culturing using the transwell double-sided culture method according to the first embodiment. By adopting such a co-culture, the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes is likely to decrease, and it becomes possible to select candidate substances that affect the autophagy activity of keratinocytes with high accuracy. In particular, the non-contact co-cultivation in the transwell double-sided culture method according to the first embodiment allows melanocytes and keratinocytes to be separated after co-cultivation, making it possible to easily measure autophagy activity in the second step. and is particularly suitable.
共培養に使用される培地については、ケラチノサイトとメラノサイトが生育可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、ヒト正常表皮角化細胞増殖用培地（ＨｕＭｅｄｉａ－ＫＧ２）、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地(ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地等が挙げられる。共培養に使用される培地には、必要に応じて、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）等が含まれていてもよい。 The medium used for co-cultivation is not particularly limited as long as it is capable of growing keratinocytes and melanocytes. ), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), RPMI1640 medium, 199 medium and the like. The medium used for co-cultivation may contain bovine serum albumin (BSA), fetal calf serum (FCS), etc., if necessary.
候補物質存在下で共培養する際の培養時間については、採用する共培養の方法等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、４時間～１か月程度、好ましくは２４時間～２週間程度、より好ましくは３日間～１週間程度が挙げられる。なお、培養期間中、候補物質が含まれる新鮮な培地で、必要に応じて培地交換を行ってもよい。 The culture time for co-cultivating in the presence of the candidate substance may be appropriately set according to the co-cultivating method to be employed, and is, for example, about 4 hours to 1 month, preferably about 24 hours to 2 weeks. , and more preferably about 3 days to 1 week. During the culture period, the medium may be replaced with a fresh medium containing the candidate substance, if necessary.
共培養時の培養雰囲気については、ケラチノサイトとメラノサイトが生育可能な条件に設定すればよいが、例えば、約５％のＣＯ2雰囲気下で、３６～３８℃、好ましくは３７℃が挙げられる。 The culture atmosphere during co - cultivation may be set to conditions in which keratinocytes and melanocytes can grow.
［第２工程］
第２工程では、前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する。第２工程におけるオートファジー活性の測定は、定性的に行ってもよいが、候補物質についてオートファジー活性を増大又は抑制する程度をより正確に判断するために、定量的に行うことが望ましい。
[Second step]
In the second step, autophagy activity in keratinocytes after the first step is measured. The measurement of autophagy activity in the second step may be carried out qualitatively, but is preferably carried out quantitatively in order to more accurately determine the extent to which the candidate substance increases or suppresses autophagy activity.
ケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、例えば、オートファジー小胞を選択的に染色する方法によって定量的又は定性的に測定することができる。オートファジー小胞を選択的に染色できるキットは、オートファジー検出キットとして市販されており、本発明では市販のオートファジー検出キットを使用して、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定すればよい。 Autophagy activity in keratinocytes can be quantitatively or qualitatively measured, for example, by a method of selectively staining autophagy vesicles. A kit capable of selectively staining autophagy vesicles is commercially available as an autophagy detection kit. In the present invention, the commercially available autophagy detection kit may be used to measure autophagy activity in keratinocytes.
また、オートファジーには、選択的に分解される物質とオートファゴソームとを結ぶアダプタータンパク質が必要とされ、オートファジー活性が高い場合には、アダプタータンパク質の発現量が向上していることが知られている。従って、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、アダプタータンパク質量、又はアダプタータンパク質のｍＲＮＡ量を測定することによって定量的又は定性的に求めることもできる。アダプタータンパク質としては、具体的にはｐ６２等が挙げられる。また、アダプタータンパク質量は、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。また、アダプタータンパク質のｍＲＮＡ量は、例えば、ケラチノサイトから抽出された全ＲＮＡに対してＰＣＲを行うことにより測定することができる。 In addition, autophagy requires adapter proteins that connect selectively degraded substances with autophagosomes, and it is known that when autophagy activity is high, the expression level of adapter proteins increases. ing. Therefore, autophagy activity in keratinocytes can also be determined quantitatively or qualitatively by measuring the amount of adapter protein or the amount of mRNA of the adapter protein. Specific examples of adapter proteins include p62 and the like. Moreover, the amount of adapter protein can be measured by, for example, immunostaining, Western blotting, and the like. In addition, the amount of adapter protein mRNA can be measured, for example, by performing PCR on total RNA extracted from keratinocytes.
また、オートファジーにおけるオートファゴソームの形成は、ＬＣ３やＡｔｇタンパク質が担っており、オートファジー活性が高い場合には、ＬＣ３タンパク質やＡｔｇタンパク質の発現量が向上していることが知られている。従って、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性は、ＬＣ３タンパク質量若しくはＡｔｇタンパク質量、又はＬＣ３タンパク質若しくはＡｔｇタンパク質のｍＲＮＡ量を測定することによって定量的又は定性的に求めることもできる。ＬＣ３タンパク質量及びＡｔｇタンパク質量は、例えば、免疫染色、ウエスタンブロッティング等により測定することができる。また、ＬＣ３タンパク質及びＡｔｇタンパク質のｍＲＮＡ量は、例えば、ケラチノサイトから抽出された全ＲＮＡに対してＰＣＲを行うことにより測定することができる。 In addition, LC3 and Atg proteins are responsible for the formation of autophagosomes in autophagy, and it is known that when autophagy activity is high, the expression levels of LC3 protein and Atg protein are increased. Therefore, autophagy activity in keratinocytes can also be determined quantitatively or qualitatively by measuring the amount of LC3 protein or Atg protein, or the amount of mRNA of LC3 protein or Atg protein. The LC3 protein level and Atg protein level can be measured by, for example, immunostaining, Western blotting, and the like. In addition, the amounts of LC3 protein and Atg protein mRNA can be measured, for example, by performing PCR on total RNA extracted from keratinocytes.
第１工程において非接触型共培養を行った場合には、メラノサイトから隔てられているケラチノサイトに対して、そのまま又はケラチノサイトを一旦回収して、オートファジー活性を測定すればよい。 When non-contact co-cultivation is performed in the first step, autophagy activity may be measured on keratinocytes separated from melanocytes as they are or after collecting keratinocytes once.
また、第１工程において接触型共培養を行った場合には、メラノサイトが混在している状態でケラチノサイトに対して、オートファジー小胞の選択的な染色、或はアダプタータンパク質及び／又はＡｔｇタンパク質に対する免疫染色を行い、オートファジー活性を可視化して、当該可視化の程度を求めればよい。当該可視化の程度は、ケラチノサイト及びメラノサイトをそれぞれ単独で候補物質非存在下で培養した場合（コントロール）との対比によって判定できる。 Further, when contact-type co-culture is performed in the first step, selective staining of autophagy vesicles for keratinocytes in a state where melanocytes are mixed, or for adapter proteins and / or Atg proteins Immunostaining may be performed to visualize autophagy activity and the degree of visualization may be determined. The degree of visualization can be determined by comparison with the case where keratinocytes and melanocytes are cultured alone in the absence of the candidate substance (control).
ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の測定方法として、簡便性及び定量性の観点から、好ましくはオートファジー小胞を選択的に染色する方法が挙げられる。 Methods for measuring autophagy activity in keratinocytes include a method of selectively staining autophagy vesicles, from the viewpoint of simplicity and quantification.
［第３工程］
第３工程では、前記第２工程においてオートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する。具体的には、前記第２工程においてオートファジー活性を増大した候補物質は、オートファジー活性促進剤として選定される。一方、前記第２工程においてオートファジー活性を抑制した候補選定は、オートファジー活性抑制剤として選択される。
[Third step]
In the third step, a candidate substance that increases or suppresses autophagy activity in the second step is selected as an autophagy activity promoter or autophagy activity inhibitor. Specifically, a candidate substance that increases autophagy activity in the second step is selected as an autophagy activity promoter. On the other hand, candidates that have suppressed autophagy activity in the second step are selected as autophagy activity inhibitors.
第３工程において、オートファジー活性の増大又は抑制については、候補物質を添加することなく第１工程及び第２工程を実施したコントロールとの比較に基づいて判定できる。具体的には、前記コントロールに比べてオートファジー活性が高い候補物質はオートファジー活性を増大したと判定でき、前記コントロールに比べてオートファジー活性が低い候補物質はオートファジー活性を抑制したと判定できる。また、候補物質を添加することなく、且つケラチノサイトを単独で培養するように変更して第１工程及び第２工程を行った場合のオートファジー活性と同程度以上になっている候補物質は、オートファジー活性を増大させる作用が非常に高いと判定できる。 In the third step, the increase or suppression of autophagy activity can be determined based on comparison with a control in which the first and second steps were performed without addition of the candidate substance. Specifically, a candidate substance with higher autophagy activity than the control can be determined to have increased autophagy activity, and a candidate substance with lower autophagy activity than the control can be determined to have suppressed autophagy activity. . In addition, candidate substances whose autophagy activity is comparable to or higher than that obtained when the first step and the second step are performed by culturing the keratinocytes alone without adding the candidate substance are It can be determined that the effect of increasing fuzzy activity is very high.
斯くしてオートファジー活性促進剤として選定された候補物質は、ケラチノサイトのオートファジー活性を増大する作用があり、美白効果、皮膚老化防止効果等が期待される成分として、化粧料等の外用製剤の分野での使用が期待される。オートファジー活性抑制剤として選定された候補物質は、ケラチノサイトのオートファジー活性を抑制する作用があり、サンタン効果が期待される成分として、化粧料等の外用製剤の分野での使用が期待される。また、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定された候補物質は、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等における実験ツールとして使用することができる。 Candidate substances thus selected as autophagy activity promoters have the effect of increasing the autophagy activity of keratinocytes, and are expected to have whitening effects and anti-aging effects on the skin. It is expected to be used in the field. Candidate substances selected as autophagy activity inhibitors have the effect of suppressing the autophagy activity of keratinocytes, and are expected to be used in the field of topical preparations such as cosmetics as ingredients that are expected to have a suntan effect. In addition, candidate substances selected as autophagy activity promoters or autophagy activity inhibitors can be used as experimental tools in elucidating the mechanism of action of autophagy activity in keratinocytes.
２．評価方法
本発明の評価方法は、機能が公知又は未知の被験物質について、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法である。
2. Evaluation Method The evaluation method of the present invention is a method for evaluating the effect of a test substance whose function is known or unknown on the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes.
具体的には、本発明の評価方法は、被験物質が、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する方法であって、被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第Ｉ工程、前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ＩＩ工程、及び前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する第ＩＩＩ工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の評価方法について工程毎に説明する。 Specifically, the evaluation method of the present invention is a method for evaluating the effect of a test substance on the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes, wherein keratinocytes and melanocytes are co-cultured in the presence of the test substance. Based on the step I, the step II of measuring the autophagy activity in the keratinocytes after the step I, and the autophagy activity measured in the step II, the test substance is keratinocytes in the presence of melanocytes It is characterized by comprising a third step of determining the effect on autophagy activity. Each step of the evaluation method of the present invention will be described below.
［第Ｉ工程］
第Ｉ工程では、被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する。
[Step I]
In step I, keratinocytes and melanocytes are co-cultured in the presence of a test substance.
被験物質とは、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価する対象となる物質である。被験物質は、美白効果や老化防止効果等の機能が知られている物質であってもよく、また、そのような機能が知られていない物質であってもよい。また、被験物質の種類については、特に制限されず、天然物、合成物、半合成物が挙げられる。被験物質として、具体的には、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、植物エキス、動物エキス、糖類（多糖、オリゴ糖、単糖等を含む）、脂質（リン脂質、糖脂質等を含む）、界面活性剤、その他の高分子有機化合物、その他の低分子有機化合物、無機化合物、その他の生体由来化合物、それらの修飾物、それらの誘導体等が挙げられる。被験物質は、１種の化合物のみからなるものであってもよく、また２種以上の化合物が含まれるものであってもよい。 A test substance is a substance whose effect on the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes is evaluated. The test substance may be a substance known to have functions such as a whitening effect and an anti-aging effect, or may be a substance that is not known to have such functions. The type of test substance is not particularly limited, and includes natural products, synthetic products, and semi-synthetic products. Specific examples of test substances include proteins, peptides, amino acids, plant extracts, animal extracts, saccharides (including polysaccharides, oligosaccharides, monosaccharides, etc.), lipids (including phospholipids, glycolipids, etc.), and surfactants. , other high-molecular organic compounds, other low-molecular-weight organic compounds, inorganic compounds, other bio-derived compounds, modifications thereof, derivatives thereof, and the like. The test substance may consist of only one compound, or may contain two or more compounds.
第Ｉ工程において、候補物質の培地中濃度については、前記スクリーニング方法における第１工程の被験物質の培地中濃度と同様である。 In step I, the concentration of the candidate substance in the medium is the same as the concentration in the medium of the test substance in the first step of the screening method.
第Ｉ工程において、使用するケラチノサイト及びメラノサイトの由来、これらの細胞の使用量、共培養方式、共培養の培養条件等は、前記スクリーニング方法における第１工程の場合と同様である。 In step I, the origin of the keratinocytes and melanocytes used, the amount of these cells used, the co-culturing method, the co-cultivating culture conditions, etc. are the same as in the first step of the screening method.
［第ＩＩ工程］
第ＩＩ工程では、前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する。
[Step II]
In step II, autophagy activity in keratinocytes after step I is measured.
第ＩＩ工程において、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の測定方法は、前記スクリーニング方法における第２工程の場合と同様である。 In step II, the method for measuring autophagy activity in keratinocytes is the same as in step 2 of the screening method.
［第ＩＩＩ工程］
第ＩＩＩ工程では、前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する。具体的には、前記第ＩＩ工程においてオートファジー活性を増大した被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大する作用があると判定される。一方、前記第ＩＩ工程においてオートファジー活性を抑制した被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を抑制する作用があると判定される。また、前記第ＩＩ工程においてオートファジー活性を増減させなかった被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に影響を与えないと判定される。
[Step III]
In step III, the influence of the test substance on the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes is determined based on the autophagy activity measured in step II. Specifically, the test substance that increased the autophagy activity in step II above is judged to have the effect of increasing the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes. On the other hand, the test substance that inhibited the autophagy activity in step II above is determined to have the effect of inhibiting the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. In addition, test substances that did not increase or decrease the autophagy activity in step II are determined not to affect the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes.
第３工程において、オートファジー活性の増大又は抑制については、被験物質を添加することなく第１工程及び第２工程を実施したコントロールとの比較に基づいて判定できる。具体的には、前記コントロールに比べてオートファジー活性が高い被験物質はメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を増大する作用があると判定できる。また、前記コントロールに比べてオートファジー活性が低い被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を抑制する作用があると判定できる。更に、前記コントロールに比べてオートファジー活性が同等である被験物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に影響を及ぼさないと判定できる。 In step 3, the increase or suppression of autophagy activity can be determined based on comparison with a control in which steps 1 and 2 were performed without addition of the test substance. Specifically, it can be determined that a test substance having a higher autophagy activity than the control has the effect of increasing the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. In addition, it can be determined that a test substance with lower autophagy activity than the control has the effect of suppressing the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes. Furthermore, it can be determined that a test substance having an autophagy activity equivalent to that of the control does not affect the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes.
更に、被験物質を添加することなく、且つケラチノサイトを単独で培養するように変更して第１工程及び第２工程を行った場合のオートファジー活性と同程度以上になっている被験物質は、オートファジー活性を増大させる作用が非常に高いと判定できる。 Furthermore, the test substance that is at least the same level of autophagy activity as when the first step and the second step are performed without adding the test substance and changing to culture keratinocytes alone It can be determined that the effect of increasing fuzzy activity is very high.
斯くしてメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を評価することにより、被験物質の香粧学的効果や薬学的効果を把握することが可能になる。 Thus, by evaluating the influence of keratinocytes on the autophagy activity in the coexistence of melanocytes, it becomes possible to understand the cosmetic effects and pharmaceutical effects of test substances.
３．メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法3. Method for identifying a factor that reduces autophagy activity of keratinocytes in coexistence with melanocytes
本発明の同定方法は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定するための方法である。 The identification method of the present invention is a method for identifying factors that reduce the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes.
具体的には、本発明の同定方法は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子を同定する方法であって、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第ｉ工程、前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する第ｉｉ工程、前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する第ｉｉｉ工程、前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ｉｖ工程、及び前記第ｉｖ工程において、オートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する第ｖ工程を含むことを特徴とする。以下、本発明の同定方法について工程毎に説明する。 Specifically, the identification method of the present invention is a method for identifying a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes, wherein the step i of co-cultivating keratinocytes and melanocytes, the Step ii of identifying the secretory substance in the culture medium after step i, Step iii of culturing keratinocytes in the presence of the secretory substance identified in step ii, Autophagy in keratinocytes after step iii Step iv of measuring the activity, and Step v of identifying the secreted substance that suppressed the autophagy activity in the step iv as a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. It is characterized by Each step of the identification method of the present invention will be described below.
［第ｉ工程］
第ｉ工程では、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養する。第ｉ工程において、使用するケラチノサイト及びメラノサイトの由来、これらの細胞の使用量、共培養方式、共培養の培養条件等は、候補物質を添加しないこと以外は前記スクリーニング方法における第１工程の場合と同様である。
[Step i]
In step i, keratinocytes and melanocytes are co-cultivated. In step i, the origin of the keratinocytes and melanocytes used, the amount of these cells used, the co-culturing method, the co-cultivating culture conditions, etc. are the same as in the first step in the screening method, except that no candidate substance is added. It is the same.
［第ｉｉ工程］
第ｉｉ工程では、前記第ｉ工程後の培養液中の分泌物質を特定する。
[Step ii]
In the ii step, a secreted substance in the culture medium after the i step is specified.
前記第ｉ工程によって培養液中に認められる分泌物質は、メラノサイト共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子の候補になる。前記第ｉ工程によって培養液中に認められる分泌物質には、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物等が含まれ得る。前記分泌物質の特定は、分泌物質の種類に応じた公知の手法で行い得る。 The secreted substance observed in the culture medium by the i-th step is a candidate factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes. The secreted substances found in the culture medium by the step i may include proteins, peptides, nucleic acids, metabolites, and the like. Identification of the secretory substance can be performed by a known method according to the type of the secretory substance.
第ｉｉ工程において、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子の候補になる分泌物質を効率的に特定するという観点から、メラノサイトの非存在下でケラチノサイトを単独培養した第１コントロール、及びケラチノサイト及びの非存在下でメラノサイトを単独培養した第２コントロールとの比較を行うことが好ましい。具体的には、前記第１コントロールの培養液及び前記第２コントロールの培養液の双方と比較して、前記第ｉ工程後の培養液中で高い濃度で存在する分泌物質を特定することが好ましい。 In step ii, keratinocytes were cultured alone in the absence of melanocytes from the viewpoint of efficiently identifying secreted substances that are candidates for factors that reduce the autophagic activity of keratinocytes in the presence of melanocytes. 1 control and a second control in which melanocytes were cultured alone in the absence of keratinocytes. Specifically, it is preferable to identify a secreted substance that is present at a high concentration in the culture medium after the step i compared to both the culture medium of the first control and the culture medium of the second control. .
［第ｉｉｉ工程］
第ｉｉｉ工程では、前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の存在下で、ケラチノサイトを培養する。
[Step iii]
In step iii, keratinocytes are cultured in the presence of the secretory substance identified in step ii above.
第ｉｉｉ工程において、前記第ｉｉ工程で特定された分泌物質の培地中濃度については、特に制限されないが、例えば、前記第ｉ工程後の培養液で認められた各分泌物質濃度と同程度に設定すればよい。 In step iii, the concentration of the secretory substance specified in step ii in the medium is not particularly limited, but for example, it is set to the same level as the concentration of each secretory substance observed in the culture medium after step i. do it.
第ｉｉｉ工程で使用されるケラチノサイトの由来、ケラチノサイトの使用量、培養時間、培養雰囲気等については、前記スクリーニング方法における第１工程の場合と同様である。 The origin of keratinocytes, amount of keratinocytes used, culture time, culture atmosphere, etc. used in step iii are the same as in step 1 of the screening method.
［第ｉｖ工程］
第ｉｖ工程では、前記第ｉｉｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する。
[Step iv]
In step iv, autophagy activity in keratinocytes after step iii is measured.
第ｉｖ工程において、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の測定方法は、前記スクリーニング方法における第２工程の場合と同様である。 In step iv, the method for measuring autophagy activity in keratinocytes is the same as in step 2 in the screening method.
［第ｖ工程］
第ｖ工程では、前記第ｉｖ工程においてオートファジー活性を抑制した分泌物質を、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定する。
[Step v]
In step v, the secreted substance that suppressed the autophagy activity in step iv is identified as a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes.
第ｖ工程において、分泌物質がオートファジー活性を抑制していることについては、分泌物質を添加することなく前記第ｉｉｉ工程及び第ｉｖ工程を実施したコントロールとの比較に基づいて判定できる。具体的には、前記コントロールに比べてオートファジー活性が低くなっている分泌物質は、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定される。 In step v, whether or not the secretory substance suppresses autophagy activity can be determined based on comparison with a control in which steps iii and iv were performed without the addition of a secretory substance. Specifically, a secreted substance with lower autophagy activity compared to the control is identified as a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes.
斯くして、メラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性を低下させている因子として同定された分泌物質は、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等における実験ツールとして使用することができる。 Thus, a secreted substance identified as a factor that reduces the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes can be used as an experimental tool in elucidating the mechanism of action of autophagy activity in keratinocytes. .
以下に実施例を示して本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to examples below, but the present invention is not limited to these.
［実施例１］
ケラチノサイトとメラノサイトを用いて、前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法で非接触型共培養を行い、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性及びメラノソームの移行について分析した。試験方法、試験結果等は、以下に示す通りである。
[Example 1]
Using keratinocytes and melanocytes, non-contact co-culture was performed by the transwell double-sided culture method according to the first embodiment, and autophagy activity and melanosome translocation in keratinocytes were analyzed. The test method, test results, etc. are as shown below.
１．試験方法
１－１．ケラチノサイトとメラノサイトの共培養
前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養は、ａｄ－ＭＥＤビドリゲル２（１２ウェルタイプ、関東化学株式会社製）を用いて行った。当該ａｄ－ＭＥＤビドリゲル２には、ビドリゲル膜（コラーゲン線維が高密度に折り重なった多孔質膜、孔径６７ｎｍ）を底部に有するカルチャーインサート、及び当該カルチャーインサートの受け皿となる１２ウェルプレートが備わっている。また、当該ａｄ－ＭＥＤビドリゲル２の付属品として供給を受けたオプションリング（リング状ホルダー）も使用した。当該オプションリングは、カルチャーインサートの外側表面のビドリゲル膜を上にした状態で、ビドリゲル膜の外側表面の外周から上に延びるように装着して、一時的にウェルを形成できるように構成されている。
1. Test method
1-1. Co-Culture of Keratinocytes and Melanocytes The non-contact co-culture by the transwell double-sided culture method according to the first embodiment was carried out using ad-MED Vidrigel 2 (12-well type, manufactured by Kanto Kagaku Co., Ltd.). The ad-MED vidrigel 2 is equipped with a culture insert having a vidrigel membrane (a porous membrane in which collagen fibers are densely folded, pore size of 67 nm) at the bottom, and a 12-well plate serving as a receptacle for the culture insert. In addition, an option ring (ring-shaped holder) supplied as an accessory of the ad-MED vidrigel 2 was also used. With the vidrigel membrane on the outer surface of the culture insert facing up, the option ring is attached so as to extend upward from the outer periphery of the vidrigel membrane to form a temporary well. .
先ず、カルチャーインサートにオプションリングを装着し、カルチャーインサートの外側表面のビドリゲル膜が底部、オプションリングが壁部を形成したウェル状にした。次いで、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ Ｍ Ｃｏｍｐ ｋｉｔ培地（クラボウ株式会社製）で懸濁したヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）を２００００個／ウェルとなるように、オプションリングで壁部を形成したウェル内に播種し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で２日間培養し、カルチャーインサートの外側表面のビドリゲル膜にメラノサイトを担持させた。 First, an option ring was attached to the culture insert, and the vidrigel membrane on the outer surface of the culture insert formed the bottom, and the option ring formed the wall. Then, normal human melanocytes (NHEM (NB), manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) suspended in DermaLife M Comp kit medium (manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) were placed in wells with wall portions formed with option rings so that 20,000 cells/well were formed. The culture insert was seeded inside and cultured for 2 days in an atmosphere of 37° C. and 5% CO 2 to support melanocytes on the vidrigel membrane on the outer surface of the culture insert.
次いで、ウェル内から培養液を除去した後にオプションリングを外し、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ Ｍ Ｃｏｍｐ ｋｉｔ培地を添加した１２ウェルプレートのウェルに、外側表面のビドリゲル膜にメラノサイトを担持させたカルチャーインサートを挿入して固定した。その後、カルチャーインサート内に、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ Ｍ Ｃｏｍｐ ｋｉｔ培地で懸濁したヒト正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）を２００００個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で１週間又は２週間培養した。ケラチノサイトを播種してから１週間後に、ケラチノサイトのオートファジー活性の測定を行った。また、ケラチノサイトを播種してから２週間後に、ケラチノサイト及びメラノサイトについてメラニン量の測定及び電子顕微鏡観察を行った。 Next, after removing the culture medium from the wells, the option ring was removed, and the culture inserts in which melanocytes were supported on the vidrigel membrane on the outer surface were inserted and fixed in the wells of a 12-well plate to which the DermaLife M Comp kit medium was added. . Thereafter, normal human keratinocytes (NHEK (NB), manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) suspended in DermaLife M Comp kit medium were seeded in the culture insert at 20,000 cells/well, and incubated at 37°C with 5% CO 2 . Cultured in atmosphere for 1 or 2 weeks. One week after keratinocyte seeding, keratinocyte autophagy activity was measured. Two weeks after seeding the keratinocytes, the amount of melanin in the keratinocytes and melanocytes was measured and observed with an electron microscope.
また、コントロール１として、メラノサイトを播種しなかったこと以外は、前記と同条件で培養（ケラチノサイトの単独培養）を行い、ケラチノサイトのオートファジー活性及びメラニン量を測定した。更に、コントロール２として、ケラチノサイトを播種しなかったこと以外は、前記と同条件で培養（メラノサイトの単独培養）を行い、メラノサイトのメラニン量を測定した。 In addition, as Control 1, culturing was performed under the same conditions (single culture of keratinocytes) except that melanocytes were not seeded, and autophagy activity and melanin content of keratinocytes were measured. Furthermore, as a control 2, culture (single culture of melanocytes) was performed under the same conditions as above, except that keratinocytes were not seeded, and the amount of melanin in melanocytes was measured.
１－２．ケラチノサイトのオートファジー活性の測定（定性的評価）
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。次いで、カルチャーインサートにオプションリングを装着し、カルチャーインサートの外側表面のメラノサイトが担持されているビドリゲル膜が底部、オプションリングが壁部を形成したウェル状にした。当該ウェル内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からメラノサイトを剥離した。次いで、オプションリングを外し、カルチャーインサートの内のケラチノサイトに対して、オートファジー検出キット（「ＣＹＴＯ－ＩＤ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」、ＥＮＺＯ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｓ製）を用いて、オートファジーを染色し、蛍光顕微鏡でＧｒｅｅｎフィルターを用いて染色の程度を観察した。
1-2. Measurement of keratinocyte autophagy activity (qualitative assessment)
After culturing, culture inserts were removed from the 12-well plates. Next, the option ring was attached to the culture insert, and the well was formed with the vidrigel membrane supporting melanocytes on the outer surface of the culture insert forming the bottom and the option ring forming the wall. A trypsin-EDTA solution (phenol red-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the wells to exfoliate the melanocytes from the vidrigel membrane. Next, the option ring was removed, and the keratinocytes in the culture insert were stained for autophagy using an autophagy detection kit ("CYTO-ID Autophagy detection kit", manufactured by ENZO life sciences), and the green cells were observed under a fluorescence microscope. A filter was used to observe the degree of staining.
１－３．ケラチノサイトのオートファジー活性の測定（定量的評価）
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。カルチャーインサート内のケラチノサイトに対して、オートファジー検出キット（「ＣＹＴＯ－ＩＤ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」、ＥＮＺＯ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｓ製）を用いて、オートファジー及び核を染色した。その後、カルチャーインサート内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からケラチノサイトを剥離して回収し、９６ウェルプレートに入れた。次いで、プレートリーダーを用いて、オートファジー活性の蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ、励起波長５３０ｎｍ）及び核の蛍光強度（蛍光波長３５５ｎｍ、励起波長４６５ｎｍ）を測定した。
1-3. Measurement of keratinocyte autophagy activity (quantitative evaluation)
After culturing, culture inserts were removed from the 12-well plates. Autophagy and nuclei of keratinocytes in the culture insert were stained using an autophagy detection kit (“CYTO-ID Autophagy detection kit”, manufactured by ENZO life sciences). Then, a trypsin-EDTA solution (phenol red-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the culture insert, and the keratinocytes were recovered by peeling from the vidrigel membrane and placed in a 96-well plate. Then, using a plate reader, fluorescence intensity of autophagy activity (fluorescence wavelength 480 nm, excitation wavelength 530 nm) and nuclear fluorescence intensity (fluorescence wavelength 355 nm, excitation wavelength 465 nm) were measured.
次いで、オートファジー活性の蛍光強度を核の蛍光強度で除することにより、ケラチノサイト１細胞当たりのオートファジー活性値を算出した Then, the autophagy activity value per keratinocyte was calculated by dividing the fluorescence intensity of the autophagy activity by the fluorescence intensity of the nucleus.
１－４．ケラチノサイト及びメラノサイトのメラニン量の測定
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。次いで、カルチャーインサートにオプションリングを装着し、カルチャーインサートの外側表面のメラノサイトが担持されているビドリゲル膜が底部、オプションリングが壁部を形成したウェル状にした。当該ウェル内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からメラノサイトを剥離して回収した。その後、オプションリングを外し、カルチャーインサート内にトリプシンＥＤＴＡ溶液（フェノールレッド不含、和光純薬工業株式会社製）を添加し、ビドリゲル膜からケラチノサイトを剥離して回収した。
1-4. Measurement of melanin content of keratinocytes and melanocytes Culture inserts were removed from the 12-well plate after culturing. Next, the option ring was attached to the culture insert, and the well was formed with the vidrigel membrane supporting melanocytes on the outer surface of the culture insert forming the bottom and the option ring forming the wall. A trypsin-EDTA solution (phenol red-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the wells, and the melanocytes were peeled off from the vidrigel membrane and recovered. After that, the option ring was removed, a trypsin-EDTA solution (phenol red-free, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to the culture insert, and the keratinocytes were peeled off from the vidrigel membrane and recovered.
回収した細胞の懸濁液を遠心分離に供して上清を除去した後に、各細胞に４Ｎの水酸化ナトリウム水溶液５０μｌを添加して細胞を溶解させ、細胞溶解液を調製した。次いで、細胞溶解液に含まれるメラニンを波長４５０ｎｍの吸光度を測定することによって求めた。 After centrifuging the recovered cell suspension and removing the supernatant, 50 μl of 4N aqueous sodium hydroxide solution was added to each cell to dissolve the cells to prepare a cell lysate. Next, melanin contained in the cell lysate was determined by measuring absorbance at a wavelength of 450 nm.
１－５．電子顕微鏡観察
培養後にカルチャーインサートを１２ウェルプレートから取り出した。次いで、一方面にケラチノサイトが担持され、他方面にメラノサイトが担持されているビドリゲル膜を取り出した。この状態のビドリゲル膜をパラホルムアルデヒドで固定化した後に、ビドリゲル膜を切断し、その横断面を電子顕微鏡（株式会社東海電子顕微鏡解析製）にて観察した。
1-5. Culture inserts were removed from the 12-well plate after electron microscopy incubation. Then, the vidrigel membrane with keratinocytes supported on one side and melanocytes supported on the other side was taken out. After the vidrigel membrane in this state was fixed with paraformaldehyde, the vidrigel membrane was cut and its cross section was observed with an electron microscope (manufactured by Tokai Electron Microscopy Analysis Co., Ltd.).
２．試験結果
ケラチノサイトのオートファジーを染色した結果の像を図３に示し、ケラチノサイト１細胞当たりのオートファジー活性値の結果を表１に示す。この結果、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合には、コントロール１（ケラチノサイトの単独培養）の場合に比べて、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性が低下していることが明らかとなった。
2. Test Results FIG. 3 shows the results of autophagy staining of keratinocytes, and Table 1 shows the autophagy activity values per keratinocyte cell. As a result, it was clarified that when keratinocytes and melanocytes were co-cultured, the autophagy activity in keratinocytes was lower than in Control 1 (single culture of keratinocytes).
ケラチノサイト及びメラノサイトのメラニン量を測定した結果を表２に示し、培養後にケラチノサイト及びメラノサイトが担持されているビドリゲル膜の横断面を電子顕微鏡で観察した像を図４に示す。表２から分かるように、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合には、ケラチノサイトのメラニン量がコントロール１（ケラチノサイトの単独培養）に比べて増大し、且つメラノサイトのメラニン量がコントロール２（メラノサイトの単独培養）に比べて減少していた。また、図４からも分かるように、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養した場合には、ケラチノサイトが担持されている側でメラノソームの存在が多数認められた。即ち、本結果から、本試験で採用した共培養では、メラノソームがメラノサイトからケラチノサイトに受け渡されており、実際の皮膚組織内と同じ挙動を示すことが確認された。 Table 2 shows the results of measuring the amount of melanin in keratinocytes and melanocytes, and FIG. 4 shows an electron microscope image of a cross section of the vidrigel membrane supporting keratinocytes and melanocytes after culture. As can be seen from Table 2, when keratinocytes and melanocytes were co-cultured, the amount of melanin in keratinocytes increased compared to control 1 (single culture of keratinocytes), and the amount of melanin in melanocytes increased to control 2 (single culture of melanocytes). ) was decreased compared to Moreover, as can be seen from FIG. 4, when keratinocytes and melanocytes were co-cultured, a large number of melanosomes were observed on the side carrying keratinocytes. That is, from this result, it was confirmed that in the co-culture employed in this test, melanosomes were transferred from melanocytes to keratinocytes, exhibiting the same behavior as in actual skin tissue.
［実施例２］
ケラチノサイトとメラノサイトを用いて、接触型共培養を行い、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性について分析した。試験方法、試験結果等は、以下に示す通りである。
[Example 2]
Keratinocytes and melanocytes were used in contact co-cultures and assayed for autophagy activity in keratinocytes. The test method, test results, etc. are as shown below.
１．試験方法
１－１．ケラチノサイトとメラノサイトの共培養
表３に示す条件で、ヒト正常ケラチノサイト（ＮＨＥＫ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）及びヒト正常メラノサイト（ＮＨＥＭ（ＮＢ）、クラボウ株式会社製）をシャーレに播種し、３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で３日間共培養を行った。なお、培地は、ＤｅｒｍａＬｉｆｅ Ｍ Ｃｏｍｐ ｋｉｔ培地（クラボウ株式会社製）を使用した。
1. Test method
1-1. Co-culture of keratinocytes and melanocytes Under the conditions shown in Table 3, normal human keratinocytes (NHEK (NB), manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) and normal human melanocytes (NHEM (NB), manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) were seeded in a petri dish and incubated at 37°C. , and co-cultured for 3 days in an atmosphere of 5% CO 2 . DermaLife M Comp kit medium (manufactured by Kurabo Industries, Ltd.) was used as the medium.
１－２．ケラチノサイトのオートファジー活性の測定（定量的評価）
培養後のシャーレから培地を除去した後、「ＣＹＴＯ－ＩＤ Ａｕｔｏｐｈａｇｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ」、ＥＮＺＯ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｓ製）を用いて、オートファジー及び核を染色し、プレートリーダーを用いて、オートファジー活性の蛍光強度（蛍光波長４８０ｎｍ、励起波長５３０ｎｍ）及び核の蛍光強度（蛍光波長３５５ｎｍ、励起波長４６５ｎｍ）を測定した。次いで、オートファジー活性の蛍光強度を核の蛍光強度で除することにより、ケラチノサイト１細胞当たりのオートファジー活性値を算出した。
1-2. Measurement of keratinocyte autophagy activity (quantitative evaluation)
After removing the medium from the petri dish after culture, autophagy and nuclei were stained using "CYTO-ID Autophagy detection kit", manufactured by ENZO life sciences), and the fluorescence intensity of autophagy activity was measured using a plate reader ( Fluorescence wavelength 480 nm, excitation wavelength 530 nm) and nuclear fluorescence intensity (fluorescence wavelength 355 nm, excitation wavelength 465 nm) were measured. Then, the autophagy activity value per keratinocyte was calculated by dividing the fluorescence intensity of the autophagy activity by the fluorescence intensity of the nucleus.
２．試験結果
結果を表４に示す。ケラチノサイトとメラノサイトを接触状態で共培養した場合には、ケラチノサイトを単独培養した場合（コントロールＡ１及びＡ２）に比べて、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性が低下していることが確認された。なお、メラノサイト（コントロールＢ）では、オートファジー活性は殆ど認められなかった。
2. Table 4 shows the test results . It was confirmed that when keratinocytes and melanocytes were co-cultured in contact with each other, the autophagy activity in keratinocytes was lower than when keratinocytes were cultured alone (controls A1 and A2). In melanocytes (control B), almost no autophagy activity was observed.
［総合考察］
実施例１及び２によって、ケラチノサイトとメラノサイトを共培養すると、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下することが確認された。ケラチノサイトは、オートファジーによって、メラノサイトから送り込まれたメラニンの分解、コラーゲン合成機能の維持等の重要な役割を果たしているので、実施例１及び２から、メラノサイトの共存下のケラチノサイトのオートファジー活性を指標とすることにより、外用製剤に使用される成分のスクリーニングや評価が可能になることが明らかとなった。
[Comprehensive consideration]
Examples 1 and 2 confirmed that co-culturing of keratinocytes and melanocytes reduces the autophagic activity of keratinocytes. Keratinocytes play important roles such as degradation of melanin sent from melanocytes and maintenance of collagen synthesis function by autophagy. Therefore, from Examples 1 and 2, the autophagy activity of keratinocytes in the coexistence of melanocytes can be used as an index. By doing so, it became clear that screening and evaluation of the ingredients used in external preparations became possible.
また、実施例１で採用した前記第１実施態様によるトランスウェル両面培養法での非接触型共培養では、実際の皮膚組織内の場合と同様に、メラノソームがメラノサイトからケラチノサイトに受け渡されており、当該非接触型共培養は、外用製剤に使用される成分のスクリーニングや評価において適した試験系であることも確認された。 Further, in the non-contact co-culture in the transwell double-sided culture method according to the first embodiment adopted in Example 1, melanosomes are transferred from melanocytes to keratinocytes, as in the actual skin tissue. It was also confirmed that the non-contact co-culture is a suitable test system for screening and evaluation of ingredients used in external preparations.
メラノサイトは、紫外線等のダメージに対しての防御機能としてメラノソームを生成してケラチノサイトへ送り込むことが知られている。一方、ケラチノサイトにとっては、メラノソームが異物であるため、送り込まれたメラノソームに対する排除機能が働き、オートファジーによりケラチノサイトが利用できる物質に変換することも知られている。このようなメラノサイトとケラチノサイトの機能を踏まえると、実施例１及び２において、ケラチノサイトとメラノサイトとの共培養により、ケラチノサイトのオートファジー活性が低下した結果は、メラノサイトは防御機能を高めるためにケラチノサイトのオートファジーを抑制する物質を分泌していることを強く示唆している。このようなケラチノサイトのオートファジー活性を低下させる物質を特定することは、ケラチノサイトにおけるオートファジー活性の作用機序の解明等において有用である。 It is known that melanocytes produce melanosomes and deliver them to keratinocytes as a protective function against damage such as ultraviolet rays. On the other hand, for keratinocytes, since melanosomes are foreign substances, it is also known that the melanosomes that have been sent in are expelled, and autophagy converts them into substances that can be used by keratinocytes. Based on such functions of melanocytes and keratinocytes, co-culture of keratinocytes and melanocytes in Examples 1 and 2 reduced the autophagy activity of keratinocytes. This strongly suggests that they secrete a substance that suppresses fuzzy. Identification of such a substance that reduces the autophagy activity of keratinocytes is useful in elucidating the mechanism of action of autophagy activity in keratinocytes.
Claims (4)
候補物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第１工程、
前記第１工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第２工程、及び
前記第２工程において、オートファジー活性を増大又は抑制した候補物質を、オートファジー活性促進剤又はオートファジー活性抑制剤として選定する第３工程、を含み、
前記第１工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、スクリーニング方法。 A method for screening a substance that increases or suppresses autophagic activity of keratinocytes in the presence of melanocytes, comprising:
A first step of co-cultivating keratinocytes and melanocytes in the presence of a candidate substance,
A second step of measuring autophagy activity in keratinocytes after the first step, and selecting a candidate substance that increases or suppresses autophagy activity in the second step as an autophagy activity promoter or an autophagy activity inhibitor a third step of
The first step is a step of co-cultivating keratinocytes and melanocytes by separating the culture vessel using a culture insert having a porous membrane on the bottom, and keratinocytes and melanocytes, one of the cells is placed inside the culture insert. A screening method in which cells are arranged on the porous membrane of the surface of the culture insert and the other cell is supported on the porous membrane of the outer surface of the culture insert .
被験物質の存在下でケラチノサイトとメラノサイトを共培養する第Ｉ工程、
前記第Ｉ工程後のケラチノサイトにおけるオートファジー活性を測定する第ＩＩ工程、及び
前記第ＩＩ工程において測定されたオートファジー活性に基づいて、被験物質がメラノサイトの共存下でのケラチノサイトのオートファジー活性に及ぼす影響を判定する第ＩＩＩ工程、を含み、
前記第Ｉ工程が、多孔質膜を底部に有するカルチャーインサートを用いて培養容器を区切ってケラチノサイトとメラノサイトを隔てて共培養する工程であり、ケラチノサイトとメラノサイトの内、一方の細胞をカルチャーインサートの内側表面の多孔質膜上に配し、他方の細胞をカルチャーインサートの外側表面の多孔質膜に担持させて行う、評価方法。 A test substance, a method for evaluating the effect on the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes,
Step I of co-cultivating keratinocytes and melanocytes in the presence of a test substance,
Step II of measuring the autophagy activity in keratinocytes after the step I, and based on the autophagy activity measured in the step II, the test substance affects the autophagy activity of keratinocytes in the presence of melanocytes A third step of determining the impact ,
The first step is a step of co-cultivating keratinocytes and melanocytes by separating the culture vessel using a culture insert having a porous membrane on the bottom, and keratinocytes and melanocytes, one of the cells is placed inside the culture insert. An evaluation method in which cells are placed on the porous membrane on the surface of the culture insert and the other cell is supported on the porous membrane on the outer surface of the culture insert .
4. The evaluation method according to claim 3 , wherein the measurement of autophagy activity in step II is performed by selectively staining autophagy vesicles.
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