JP7219087B2 - Screening method for anti-skin aging agent - Google Patents
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Description
皮膚老化は、その要因に基づき、加齢老化、光老化などに分類されている（特許文献１）。ここで、光老化は紫外線照射を原因とする老化現象であり、一般に黄みの増加、角層水分量の減少、しわなどの表現形質を特徴とする（特許文献１ 参照）。 Skin aging is classified into age-related aging, photo-aging, etc. based on the factors involved (Patent Document 1). Here, photoaging is an aging phenomenon caused by ultraviolet irradiation, and is generally characterized by phenotypes such as increased yellowness, decreased stratum corneum moisture content, and wrinkles (see Patent Document 1).
マトリックスメタロプロテアーゼの発現の低減によって、皮膚の光老化を軽減させる技術が知られている（特許文献２）。そして、ＵＶＢへの皮膚の長期間曝露によって、真皮におけるＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、ＭＭＰ－７およびＭＭＰ－９の発現が増加することも、知られている（特許文献２）。 A technique for reducing photoaging of the skin by reducing the expression of matrix metalloproteases is known (Patent Document 2). It is also known that long-term exposure of the skin to UVB increases the expression of MMP-2, MMP-3, MMP-7 and MMP-9 in the dermis (Patent Document 2).
また、特許文献１にあるように、更年期障害や加齢によって皮膚細胞内のマトリックスメタロプロテアーゼ－１２遺伝子の発現が亢進することも知られている。
In addition, as described in
ところで、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）は皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の構成成分であることが知られている。 By the way, Mimecan, Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) is known to be a constituent of the retinacula cutis.
また、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）と呼ばれる網目状の線維構造の疎密が顔のタルミとの関連性を有することが知られている（非特許文献１）。また、額及び目尻において、深いシワ部位直下の皮下組織では皮膚支帯密度が減少していることが知られている（非特許文献２）。 In addition, it is known that the density of a mesh-like fibrous structure called retinacula cutis is associated with sagging of the face (Non-Patent Document 1). In addition, it is known that the skin retinaculum density is reduced in the subcutaneous tissue immediately below deep wrinkles on the forehead and the corners of the eyes (Non-Patent Document 2).
前述の先行技術のあるところ、本発明は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供することを課題とする。 Where there is the above-mentioned prior art, the present invention provides a screening method for an anti-skin aging agent having an effect of increasing expression and/or suppressing decrease in expression of mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4). The task is to provide
上記課題を解決する本発明は、
マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を指標とする、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法である。
The present invention for solving the above problems is
Mimecan or microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) expression-enhancing and/or expression-reducing inhibitory action, as indicated by decreased expression and/or increased-suppressed expression of matrix metalloprotease A screening method for anti-skin aging agents.
本発明の好ましい形態では、
前記マトリックスメタロプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３、ＭＭＰ３）、及び／又は、マトリクッスメタロプロテアーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９、ＭＭＰ９）であることを特徴とする。
In a preferred form of the invention,
The matrix metalloprotease is characterized by being matrix metalloproteinase-3 (MMP3) and/or matrix metalloproteinase-9 (MMP9).
また、本発明の好ましい形態では、
前記抗皮膚老化剤は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなることを抑制する作用を有するものであることを特徴とする。
ここで、『皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなること』は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）線維を束ねるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）が減少することにより、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）がほぐれて細くなる現象を指す。
Also, in a preferred form of the invention,
The anti-skin aging agent is characterized by having an effect of suppressing thinning of retinacula cutis.
Here, "thinning of the retinacula cutis" means that Mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) that bundles the retinacula cutis fibers is reduced. This refers to a phenomenon in which the retinaculum of the skin (Retinacula cutis) loosens and becomes thinner.
また、本発明の好ましい形態では、
前記抗皮膚老化剤が、光老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
The anti-skin aging agent is characterized by having an effect of improving skin conditions caused by photoaging.
また、本発明の好ましい形態では、
前記肌状態が、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下からなる群から選択される１又は２以上であることを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
The skin condition is one or more selected from the group consisting of increased wrinkles, saggy skin, decreased firmness, and decreased elasticity of the skin.
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞が、線維芽細胞及び／又は腱細胞であることを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
The cells are fibroblasts and/or tendon cells.
また、本発明の好ましい形態では、
細胞に物質を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ発現量を測定する測定工程と、
を有することを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
an applying step of applying the substance to the cells;
a measuring step of measuring the expression level of matrix metalloprotease in the cells after the applying step;
characterized by having
また、本発明の好ましい形態では、
２種以上の物質を、２以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
an application step of applying two or more substances to two or more cell groups, respectively;
a measuring step of measuring the matrix metalloprotease expression level of each of the cells after the applying step;
a measuring step of measuring a decrease in expression and/or an increase in suppression of expression of a matrix metalloprotease based on the measurement result of the measuring step;
characterized by having
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞が、線維芽細胞及び／又は腱細胞であることを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
The cells are fibroblasts and/or tendon cells.
また、本発明の好ましい形態では、
前記細胞は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）に存在する細胞であることを特徴とする。
Also, in a preferred form of the invention,
The cells are characterized by being cells present in the retinacula cutis.
また、本発明は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする、光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法でもある。 In addition, the present invention provides an action for improving skin conditions caused by photoaging, using as an index increased expression and/or suppression of decreased expression of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4). It is also a screening method for anti-skin aging agents having
また、本発明は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細いと判定することを特徴とする、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの推定方法でもある。 In addition, in the present invention, the smaller the expression level of Mimecan or Microfibril-associated protein 4 (MFAP4), the thinner the retinacula cutis. It is also a method of estimating the thickness of the retinacula cutis.
また、本発明は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を指標とする、皮膚における太陽光暴露量の推定方法でもある。 The present invention is also a method for estimating the amount of sunlight exposure on the skin, using the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) as an index.
本発明によれば、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法を提供することができる。 INDUSTRIAL APPLICABILITY According to the present invention, it is possible to provide a screening method for an anti-skin aging agent having an effect of increasing expression and/or suppressing decrease in expression of mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4). .
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施形態に限定されないことは言うまでもない。 Preferred embodiments of the present invention will be described below, but it goes without saying that the technical scope of the present invention is not limited to the following embodiments.
＜１＞ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法 <1> Screening method for an anti-skin aging agent having an effect of increasing expression and/or inhibiting expression decrease of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4)
本発明のミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法は、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を指標とする。 The method of screening for an anti-skin aging agent having an effect of increasing expression and/or inhibiting a decrease in expression of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) of the present invention comprises reducing the expression of matrix metalloprotease. and/or increase/suppression of expression.
ここで、指標とするマトリックスメタロプロテアーゼとしては、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３、ＭＭＰ３）、及び／又は、マトリクッスメタロプロテアーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９、ＭＭＰ９）を好ましく挙げることができる。 Matrix metalloproteinase-3 (MMP3) and/or matrix metalloproteinase-9 (MMP9) can preferably be mentioned as the matrix metalloprotease used as an indicator.
本発明のスクリーニング方法は、細胞の培養系に被験物質を添加し、細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼの発現量を測定することを含むことが好ましい。 The screening method of the present invention preferably includes adding a test substance to a cell culture system and measuring the expression level of matrix metalloprotease in the cells.
具体的には、被験物質を添加して培養した細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼの発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼの発現量と比較して統計的に有意に小さい場合に、前記被験物質はミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤の候補として判定する形態であることが好ましい。 Specifically, when the expression level of matrix metalloprotease in cells cultured with the addition of the test substance is statistically significantly lower than the expression level of matrix metalloprotease in cells cultured without the addition of the test substance. In addition, the test substance is in the form of being determined as a candidate for an anti-skin aging agent having an effect of increasing and/or suppressing the expression decrease of mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4). is preferred.
また、被験物質を添加して培養した細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼの発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞におけるマトリックスメタロプロテアーゼの発現量の１倍より小さい場合に、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤の候補として選択する形態であってもよい。 In addition, when the expression level of matrix metalloprotease in cells cultured with the addition of the test substance is less than 1 times the expression level of matrix metalloprotease in cells cultured without the addition of the test substance, Mimecan or micro It may be in a form selected as a candidate for an anti-skin aging agent having an effect of increasing the expression and/or suppressing the decrease in the expression of microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4).
ここで、マトリックスメタロプロテアーゼの発現量は、ｍＲＮＡ測定、免疫組織学化学的解析等の常法により測定することができる。
例えば、前記マトリックスメタロプロテアーゼをコードする遺伝子の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、前記マトリックスメタロプロテアーゼをコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。
Here, the expression level of matrix metalloprotease can be measured by conventional methods such as mRNA measurement and immunohistochemical analysis.
For example, the expression level of the gene encoding the matrix metalloprotease is quantitatively detected by PCR using a DNA fragment having a sequence that specifically binds to the sequence of the gene as a primer. Since the gene sequence encoding the matrix metalloprotease is open to the public, those skilled in the art can design primers as appropriate.
また、前記各マトリックスメタロプロテアーゼの抗体についても市販品が存在するので、これを用いて、細胞における発現量を測定することができる。 In addition, since there are commercially available antibodies for each matrix metalloprotease, the expression levels in cells can be measured using these.
さらに具体的には、本発明は、
細胞に物質の投与を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ発現量を測定する測定工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
More specifically, the present invention provides
an applying step of applying an administration of the substance to the cells;
a measuring step of measuring the expression level of matrix metalloprotease in the cells after the applying step;
Preferably, an embodiment having
また、本発明は、
２種以上の物質を、２以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
In addition, the present invention
an application step of applying two or more substances to two or more cell groups, respectively;
a measuring step of measuring the matrix metalloprotease expression level of each of the cells after the applying step;
a measuring step of measuring a decrease in expression and/or an increase in suppression of expression of a matrix metalloprotease based on the measurement result of the measuring step;
Preferably, an embodiment having
本発明のスクリーニング方法において、スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤は特に限定されず、たとえば、市販の化合物（ペプチドを含む）、公知化合物（ペプチドを含む）、コンビナトリアル・ケミストリー技術によって得られた化合物群、植物や海洋生物由来の天然成分、動物組織抽出物などの物質を挙げることができる。 In the screening method of the present invention, the anti-skin aging agent to be screened is not particularly limited. Examples include commercially available compounds (including peptides), known compounds (including peptides), and compounds obtained by combinatorial chemistry techniques. Groups, natural ingredients from plants and marine organisms, and substances such as animal tissue extracts can be mentioned.
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味する。
また、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等を挙げることができる。
Animal and plant-derived extracts refer not only to animal- or plant-derived extracts per se, but also to general terms including fractions of extracts, purified fractions, extracts or fractions, and solvent-removed purified products.
Plant-derived extracts include wild or grown plants, extracts using those sold as raw materials for herbal medicines, commercially available extracts, and the like.
スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなることを抑制する作用を有するものであることが好ましい。
ここで、『皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなること』は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）線維を束ねるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）が減少することにより、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）がほぐれて細くなる現象を指す。
The anti-skin aging agent to be screened preferably has an effect of suppressing thinning of the retinacula cutis.
Here, "thinning of the retinacula cutis" means that Mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) that bundles the retinacula cutis fibers is reduced. This refers to a phenomenon in which the retinaculum of the skin (Retinacula cutis) loosens and becomes thinner.
また、スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤は、光老化に基づく肌状態の改善作用を有するものであることが好ましい。
光老化に基づく肌状態としては、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下を好ましく挙げることができる。ここで、肌のタルミとは、皮膚および皮下組織の弾力性の低下によって生ずる肌の変形をさす。
In addition, the anti-skin aging agent to be screened preferably has an effect of improving skin conditions caused by photoaging.
Preferred examples of skin conditions due to photoaging include increased wrinkles, saggy skin, decreased firmness, and decreased skin elasticity. Here, sagging of the skin refers to deformation of the skin caused by a decrease in elasticity of the skin and subcutaneous tissue.
ここで、本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を指標とする、光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法とすることもできる。 Here, the present invention can also be used as a method of screening for anti-skin aging agents that have an effect of improving skin condition due to photoaging, using a reduction in the expression of matrix metalloproteases and/or a suppression of an increase in the expression as an index.
また、本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を指標とする、肌状態の推定方法とすることもできる。 In addition, the present invention can also be used as a method for estimating a skin condition, using a decrease in matrix metalloprotease expression and/or a suppression of an increase in expression as an index.
＜２＞光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法 <2> Screening method for anti-skin aging agents that improve skin conditions due to photoaging
本発明の光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を指標とする。 The method of screening for an anti-skin aging agent having an effect of improving skin conditions due to photoaging of the present invention comprises increasing and/or expressing Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) expression. Suppressing the decrease of
本発明のスクリーニング方法は、細胞の培養系に被験物質を添加し、細胞におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を測定することを含むことが好ましい。 The screening method of the present invention may include adding a test substance to a cell culture system and measuring the expression level of mimecan or microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) in the cells. preferable.
具体的には、被験物質を添加して培養した細胞におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量と比較して統計的に有意に大きい場合に、前記被験物質は光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤の候補として判定する形態であることが好ましい。 Specifically, the expression level of mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) in cells cultured with the addition of the test substance is higher than that of mimecan in cells cultured without the addition of the test substance. (Mimecan) or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) when statistically significantly larger than the expression level, the test substance is an anti-aging agent having an effect of improving skin condition due to photoaging It is preferably in a form judged as a candidate skin aging agent.
また、前記ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の抗体についても市販品が存在するので、これを用いて、細胞における発現量を測定することができる。 In addition, since there are commercially available antibodies against Mimecan or Microfibril-associated protein 4 (MFAP4), their expression levels in cells can be measured using them.
さらに具体的には、本発明は、
細胞に物質を適用する適用工程と、
適用工程後に前記細胞のミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の結果に基づき、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
More specifically, the present invention provides
an applying step of applying the substance to the cells;
a measurement step of measuring the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) in the cells after the application step;
a measuring step of measuring the expression level of Mimecan or microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) based on the results of the measuring step;
Preferably, an embodiment having
また、本発明は、２種以上の物質を、２以上の細胞群に対し各々適用する適用工程と、
適用工程後に各々の前記細胞のミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現の増大及び／又は発現の減少抑制を計測する計測工程と、
を有する実施の形態とすることが好ましい。
In addition, the present invention provides an application step of applying two or more substances to two or more cell groups, respectively;
A measurement step of measuring the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) in each of the cells after the application step;
a measuring step of measuring an increase in expression and/or suppression of decrease in expression of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) based on the measurement results of the measuring step;
Preferably, an embodiment having
ここで、光老化に基づく肌状態は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなることに基づくものであることが望ましい。具体的には、シワの増加、肌のタルミ、ハリの低下、肌の弾力性の低下を好ましく挙げることができる。 Here, the skin condition due to photoaging is desirably based on thinning of the retinacula cutis. Specifically, increased wrinkles, saggy skin, decreased firmness, and decreased skin elasticity are preferred.
ここで、スクリーニングの対象となる抗皮膚老化剤の種類については、＜１＞に記載の技術的事項を援用することができる。
また、＜１＞に記載の技術的事項のうち、＜２＞光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤のスクリーニング方法に妥当する技術的事項については、前述した説明を準用することができる。
Here, the technical matters described in <1> can be used for the types of anti-skin aging agents to be screened.
In addition, among the technical matters described in <1>, the technical matters applicable to the <2> screening method for anti-skin aging agents having an effect of improving skin condition due to photoaging are applied mutatis mutandis to the above description. be able to.
＜３＞皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの推定方法 <3> Method for estimating thickness of retinacula cutis
本発明は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細いと判定することを特徴とする、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの推定方法にも関する。 The present invention is characterized in that the lower the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4), the thinner the retinal cutis (Retinacula cutis) is determined. It also relates to a method for estimating the thickness of the band (Retinacula cutis).
本発明の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの推定方法は、細胞におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を指標とする。 The method for estimating the thickness of the retinacula cutis of the present invention uses the expression level of mimecan or microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) in cells as an index.
ここで、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が少ないほど、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細いと判定するための方法は特に限定されない。 Here, the method for determining that the smaller the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4), the thinner the retinacula cutis, is not particularly limited.
たとえば、統計学的に有意な人数に対して、従来の手法によるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量の測定と、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さについての試験を行うことで、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量と皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの相関についてのデータベースを予め作成しておき、被験者の皮膚におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を当該データベースと照合することにより被験者の皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さを推定する実施の形態を好ましく挙げることができる。 For example, for a statistically significant number of people, measurement of the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) by conventional methods, and retinacula cutis By conducting a test on the thickness of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) expression level and the thickness of the retinal cord (Retinacula cutis) A database on the correlation By comparing the expression level of mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) in the skin of the subject with the database prepared in advance, the retinal cord of the subject (Retinacula cutis) An embodiment for estimating the thickness can be mentioned preferably.
複数の被験者の皮膚におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量に基づき、被験者間での皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの優劣を推定する実施の形態としてもよい。 Based on the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) in the skin of multiple subjects, the superiority or inferiority of the thickness of the retinacula cutis between subjects is estimated. It is good also as embodiment.
また、同一被験者から取得した複数のミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量に基づき、相対的に皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さを推定する実施の形態としてもよい。 In addition, based on the expression levels of multiple mimecans or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) obtained from the same subject, the thickness of the retinacula cutis is relatively estimated. It is good also as embodiment.
また、被験者から取得したミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量に関する情報を、既に用意された指標と照らし合わせることにより、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さを推定する実施の形態としてもよい。 In addition, by comparing information on the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) obtained from a subject with an index already prepared, retinacula cutis It is good also as an embodiment which estimates the thickness of.
ここで、＜１＞に記載の技術的事項のうち、＜３＞皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）の太さの推定方法に妥当する技術的事項については、前述した説明を準用することができる。 Here, among the technical matters described in <1>, the above description can be applied mutatis mutandis to the technical matters applicable to <3> Method for estimating thickness of retinacula cutis.
＜４＞皮膚における太陽光暴露量の推定方法 <4> Method for estimating the amount of sunlight exposure on the skin
本発明は、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を指標とする、皮膚における太陽光暴露量の推定方法にも関する。 The present invention also relates to a method for estimating the amount of sunlight exposure on the skin, using the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) as an index.
本発明の皮膚における太陽光暴露量の推定方法は、細胞におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を指標とする。 The method for estimating the amount of sunlight exposure in the skin of the present invention uses the expression level of mimecan or microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) in cells as an index.
ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が少ないほど、皮膚における太陽光暴露量が多いと判定する形態であることが好ましい。
ここで、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が少ないほど、皮膚における太陽光暴露量が多いと判定するための方法は特に限定されない。
It is preferable that the amount of sunlight exposure in the skin is determined to be high as the expression level of Mimecan or Microfibril-associated protein 4 (MFAP4) is low.
Here, the method for determining that the lower the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4), the higher the amount of sunlight exposure in the skin, is not particularly limited.
たとえば、統計学的に有意な人数に対して、従来の手法によるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量の測定と、皮膚における太陽光暴露量についての試験を行うことで、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量と皮膚における太陽光暴露量の相関についてのデータベースを予め作成しておき、被験者の皮膚におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を当該データベースと照合することにより被験者の皮膚における太陽光暴露量を推定する実施の形態が好ましく挙げられる。 For example, for a statistically significant number of people, measurement of the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) by conventional methods, and the amount of sunlight exposure in the skin By conducting the test, a database for the correlation between the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) and the amount of sunlight exposure in the skin was created in advance, and the subject's Preferred is an embodiment in which the amount of sunlight exposure on the subject's skin is estimated by collating the expression level of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) in the skin with the database. .
複数の被験者の皮膚におけるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量に基づき、皮膚における太陽光暴露量の多寡を推定する実施の形態としてもよい。 An embodiment may be used in which the amount of sunlight exposure on the skin is estimated based on the expression levels of Mimecan or Microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) in the skin of a plurality of subjects.
また、同一被験者から取得した複数のミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量に基づき、相対的に、皮膚における太陽光暴露量の多寡を推定する実施の形態としてもよい。 In addition, based on the expression levels of multiple mimecans or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) obtained from the same subject, the relative amount of sunlight exposure in the skin is estimated. may be in the form of
また、被験者から取得したミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量を、既に用意された指標と照らし合わせることにより、皮膚における太陽光暴露量を推定する実施の形態としてもよい。 In addition, the amount of sunlight exposure in the skin is estimated by comparing the expression level of Mimecan or microfibril-associated protein 4 (MFAP4) obtained from the subject with the index already prepared. It is good also as embodiment.
ここで、＜１＞及び＜３＞に記載の技術的事項のうち、＜４＞皮膚における太陽光暴露量の推定方法に妥当する技術的事項については、前述した説明を準用することができる。 Here, among the technical matters described in <1> and <3>, the above description can be applied mutatis mutandis to the technical matters applicable to the <4> method for estimating the amount of sunlight exposure on the skin.
以下、本発明の基礎となる知見を裏付ける各種試験結果を示す。 Various test results supporting the findings underlying the present invention are shown below.
＜試験１＞光老化と、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）との関連
試験１では、光老化と、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）との関連を調べた。
<
（１）実験操作
まず、若齢者（20-30代)及び老齢者（60-90代)のヒト正常皮下組織（非露光部）・皮下組織（露光部）を、凍結組織包理剤（ＯＣＴコンパウンド）で凍結処理し、組織切片を用意した。
(1) Experimental procedure First, normal human subcutaneous tissue (non-exposed area) and subcutaneous tissue (exposed area) of young people (20s-30s) and old people (60s-90s) were treated with a frozen tissue embedding agent ( OCT compound) was frozen, and a tissue section was prepared.
用意した組織切片を１０％中性緩衝ホルマリンにて固定し、その後ＰＢＳで洗浄し、Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅを用い、ブロッキング処理した。 The prepared tissue sections were fixed with 10% neutral buffered formalin, washed with PBS, and blocked with Block Ace.
ブロッキング処理した組織切片に一次抗体を添加し、４℃条件下で一晩静置した。
静置後ＰＢＳで洗浄し、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＡＢＣ－ＡＰ Ｋｉｔ （ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社製）及び、Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ＫｉｔI ＜ＶＥＣＴＯＲ Ｒｅｄ＞ （ＶＥＣＴＯＲ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ 社製）を用い、処理した。
A primary antibody was added to the blocked tissue section and allowed to stand overnight at 4°C.
After standing, the plate was washed with PBS and treated using VECTASTAIN Universal ABC-AP Kit (manufactured by VECTOR Laboratories) and Alkaline Phosphatase Substrate Kit I <VECTOR Red> (manufactured by VECTOR Laboratories).
上記の増感剤による処理後、ＰＢＳで洗浄しマイヤーヘマトキシリン染色溶液で核を染色した。染色後に流水洗水し、１００％エタノールで脱水処理をした。
脱水処理後、キシレンを用い透徹処理をし、非水溶性封入剤を用い封入した。以上の工程により調製した組織切片について、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）の染色度合いの観察を行った。
After treatment with the above sensitizer, the cells were washed with PBS and the nuclei were stained with Mayer's hematoxylin staining solution. After dyeing, it was washed with running water and dehydrated with 100% ethanol.
After dehydration, they were cleared using xylene and mounted using a water-insoluble mounting medium. The degree of staining of mimecan and microfibril-associated protein 4 (MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4) was observed for the tissue sections prepared by the above steps.
（２）結果及び考察
観察の結果、光の影響が蓄積している老齢者において露光部皮下組織の方が、非露光部皮下組織に比して、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）の量が少ないことがわかった（図１ 参照）。
(2) Results and discussion As a result of observation, in the elderly who have accumulated the effects of light, the exposed subcutaneous tissue has more Mimecan, microfibril binding protein 4 ( MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4) was found to be low (see Figure 1).
以上より、光の照射による影響（光老化）によって、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）及び、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）の発現量が減少することがわかった。 From the above, it was found that the expression levels of mimecan and microfibril-associated protein 4 (MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4) decreased due to the effects of light irradiation (photoaging).
また、図２に示すように、光の影響が蓄積している老齢者では、露光部皮下組織の方が、非露光部皮下組織に比して、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなっていることがわかった。 In addition, as shown in FIG. 2, in the elderly who have accumulated the effects of light, the skin retinaculum (Retinacula cutis) is thinner in the exposed subcutis than in the non-exposed subcutis. It turns out that there is
すなわち、図１、図２及び観察の結果、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）の減少によって、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉ）が細くなることがわかった。 1 and 2 and the results of observation, it was found that the reduction of mimecan and microfibril-associated protein 4 (MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4) thinned the retinacula cuti.
＜試験２＞マトリックスメタロプロテアーゼと、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）との関連
<
試験２では、マトリックスメタロプロテアーゼと、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）の関連を調べた。
In
（１）実験操作
まず、キモトリプシンを用い活性化させたマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ３またはＭＭＰ９）と、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）またはミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）を混合し、各酵素・基質反応溶液（図３ 参照）を調製した。
(1) Experimental procedure First, matrix metalloprotease (MMP3 or MMP9) activated using chymotrypsin was mixed with Mimecan or microfibril binding protein 4 (MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4), and each enzyme/ A substrate reaction solution (see FIG. 3) was prepared.
ここで、酵素活性阻害による基質分解の状態変化の確認のため、ＭＭＰ阻害剤（８０ｍＭ ＮＮＧＨ（N-Hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]acetamide）（溶媒：ＤＭＳＯ））を添加した系を用意した。なお、ＭＭＰ阻害剤を含むサンプルは、上記の酵素・基質反応溶液に対し、ＮＮＧＨを添加することにより、調製した。 Here, in order to confirm the state change of substrate decomposition due to enzyme activity inhibition, MMP inhibitor (80 mM NNGH (N-Hydroxy-2-[[(4-methoxyphenyl)sulfonyl](2-methylpropyl)amino]acetamide) (solvent : DMSO)) was prepared. A sample containing an MMP inhibitor was prepared by adding NNGH to the above enzyme/substrate reaction solution.
調製した酵素・基質反応溶液を、３７℃の条件で、２４時間、振とう混和（インキュベート）した。 The prepared enzyme/substrate reaction solution was shaken and mixed (incubated) at 37° C. for 24 hours.
Ｌａｎｅ Ｍａｒｋｅｒ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ ＳＤＳ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 社製）をマーカーとし、図３に示す各系のサンプルをＳＤＳ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌに充填（アプライ）し、電気泳動を行った。 Using Lane Marker Sample Buffer SDS (manufactured by Thermo Fisher Scientific) as a marker, each system sample shown in FIG. 3 was filled (applied) in SDS-polyacrylamide gel and electrophoresed.
電気泳動の後、２Ｄ－Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｔａｉｎ Ｒｅａｇｅｎｔ ＩＩ（Ｃｏｓｍｏ Ｂｉｏ 社製）を用い銀染色をし、タンパクバンドの定量を行った。結果を図３に示す。 After electrophoresis, silver staining was performed using 2D-Silver Stain Reagent II (manufactured by Cosmo Bio) to quantify protein bands. The results are shown in FIG.
（２）結果及び考察
図３に示した通り、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３、ＭＭＰ３）、マトリックスメタロプロテアーゼ９（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９、ＭＭＰ９）の存在によって、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）が分解されることがわかった。
(2) Results and Discussion As shown in FIG. 4 (MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4) was found to be degraded.
＜試験３＞光老化と、マトリックスメタロプロテアーゼとの関連
試験３では、光老化と、マトリックスメタロプロテアーゼとの関連を調べた。
<
（１）実験操作
まず、ヒト正常組織（非露光部）(表皮、真皮、皮下組織)を一晩ｅｘ ｖｉｖｏ培養し、ＵＶＡ、ＵＶＢ、可視光、ＩＲを図４に示す条件で照射した。
(1) Experimental procedure First, normal human tissues (unexposed areas) (epidermis, dermis, subcutaneous tissue) were cultured overnight ex vivo and irradiated with UVA, UVB, visible light, and IR under the conditions shown in FIG.
次に、光線照射後のヒト正常組織に対し、ＲＮＡｌａｔｅｒ（ＱＩＡＧＥＮ 社製）で処理することにより、固定した。固定した組織から皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）のみを単離した。 Next, the normal human tissue after irradiation was treated with RNAlater (manufactured by QIAGEN) and fixed. Only the skin retinaculum (Retinacula cutis) was isolated from the fixed tissue.
単離した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）を破砕し、ＲＮｅａｓｙ Ｆｉｂｒｏｕｓ Ｔｉｓｓｕｅ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ 社製）を用いてＲＮＡを回収した。回収したＲＮＡについて、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社製）を用い、ｃＤＮＡを合成した。 The isolated dermal ligament (Retinacula cutis) was crushed, and RNA was recovered using RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (manufactured by QIAGEN). cDNA was synthesized from the recovered RNA using SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (manufactured by Invitrogen).
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ （ＱＩＡＧＥＮ 社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（ＭＡＴＲＩＸＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ－３、ＭＭＰ３）、マトリクッスメタロプロテアーゼ－９（ＭＡＴＲＩＸＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ－９、ＭＭＰ９）の遺伝子発現量を測定した。
ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較ＣＴ法を用いて算出した。
Quantitative RT-PCR was performed using QuantiTect Primer Assay (manufactured by QIAGEN) to determine the gene expression levels of matrix metalloprotease-3 (MATRIXMETALLOPROTEINASE-3, MMP3) and matrix metalloprotease-9 (MATRIXMETALLOPROTEINASE-9, MMP9). It was measured.
Here, the gene expression level was calculated using the comparative CT method using β-actin as an endogenous control.
（２）結果及び考察
図４に示した通り、光の照射によって、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（ＭＡＴＲＩＸＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ－３、ＭＭＰ３）、マトリクッスメタロプロテアーゼ－９（ＭＡＴＲＩＸＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ－９、ＭＭＰ９）の遺伝子発現量が増大することがわかった。
(2) Results and Discussion As shown in FIG. 4, light irradiation increases gene expression levels of matrix metalloprotease-3 (MATRIXMETALLOPROTEINASE-3, MMP3) and matrix metalloprotease-9 (MATRIXMETALLOPROTEINASE-9, MMP9). found to do.
＜試験４＞ スクリーニング手法の検討
試験４では、上記知見を基にした、スクリーニング手法の検討を行った。
<Test 4> Examination of Screening Method In Test 4, a screening method was examined based on the above findings.
（１）操作
（１－１）準備工程
ヒト正常皮下組織から取得した細胞をＯＧ（アウトグロース）法により培養した。培養した細胞から、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞のみをＣｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ ＳＨ８００（ＳＯＮＹ 社製）を用い、単離した。
(1) Operation (1-1) Preparation Step Cells obtained from normal human subcutaneous tissue were cultured by the OG (outgrowth) method. From the cultured cells, only skin retinaculum (Retinacula cutis) cells were isolated using Cell Sorter SH800 (manufactured by SONY).
単離した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を２４穴プレートに１．７×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、３７℃、５％ＣＯ２環境下で２４時間培養した。 The isolated retinacula cutis cells were seeded in a 24-well plate at 1.7×10 4 cells/well and cultured at 37° C. under 5% CO 2 environment for 24 hours.
（１－２）適用工程
別途、ヒト正常皮膚の皮下組織を除去した。処理した皮膚に１５ｍｍ径の穴あけを行い、ポピドンヨード（ｐｏｖｉｄｏｎｅ ｉｏｄｉｎｅ）で洗浄後、ＰＢＳで洗浄した。
(1-2) Application Step Separately, the subcutaneous tissue of normal human skin was removed. A 15 mm diameter hole was made in the treated skin and washed with povidone iodine followed by PBS.
洗浄後のヒト正常皮膚をセルカルチャーインサート(スタンディングタイプ： サーモフィッシャーサイエンティフィック 社製)に載せた。そして、１０ｍｍ径にカットした濾紙にスクリーニング対象となる物質を染み込ませ、ヒト正常皮膚中心部に配置した。
ヒト正常皮膚中心部に配置したセルカルチャーインサート(スタンディングタイプ： サーモフィッシャーサイエンティフィック 社製)を、（１－１）で用意した皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）細胞を播種した２４穴プレートに設置し、２４時間培養した。
The washed normal human skin was placed on a cell culture insert (standing type: manufactured by Thermo Fisher Scientific). A filter paper cut to a diameter of 10 mm was impregnated with a substance to be screened, and placed in the center of normal human skin.
A cell culture insert (standing type: manufactured by Thermo Fisher Scientific) placed in the center of human normal skin was placed in a 24-well plate seeded with the dermal retinacula (Retinacula cutis) cells prepared in (1-1). , cultured for 24 hours.
（１－３）測定工程
２４時間培養後、培地を除いた後、ＰＢＳで洗浄した。その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ 社製）を用いてＲＮＡを回収し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。
(1-3) Measurement Step After culturing for 24 hours, the medium was removed and the cells were washed with PBS. After that, RNA was recovered using RNeasy Mini Kit (manufactured by QIAGEN), and cDNA was synthesized using SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (manufactured by Invitrogen).
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ 社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）における、以下の（ｉ）、（ｉｉ）の遺伝子発現量を測定した。ここで、遺伝子発現量は、内在性コントロールをβ-actinとし、比較ＣＴ法を用い、算出した。 Quantitative RT-PCR was performed using QuantiTect Primer Assay (manufactured by QIAGEN) to measure the expression levels of the following genes (i) and (ii) in the skin retinacula (Retinacula cutis). Here, the gene expression level was calculated using the comparative CT method using β-actin as an endogenous control.
（ｉ）マトリックスメタロプロテアーゼ－３（ＭＡＴＲＩＸＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ－３、ＭＭＰ３）、マトリクッスメタロプロテアーゼ－９（ＭＡＴＲＩＸＭＥＴＡＬＬＯＰＲＯＴＥＩＮＡＳＥ－９、ＭＭＰ９）
（ｉｉ）ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（ＭＩＣＲＯＦＩＢＲＩＬＬＡＲ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ ＰＲＯＴＥＩＮ ４、ＭＦＡＰ４）
(i) Matrix Metalloprotease-3 (MATRIXMETALLOPROTEINASE-3, MMP3), Matrix Metalloprotease-9 (MATRIXMETALLOPROTEINASE-9, MMP9)
(ii) Mimecan, Microfibril Associated Protein 4 (MICROFIBRILLAR-ASSOCIATED PROTEIN 4, MFAP4)
（ｉ）の測定値を基に、スクリーニング対象となる物質についての、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）若しくはミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ４、ＭＦＡＰ４）の発現増大及び／又は発現減少抑制作用を有する抗皮膚老化剤としての有用性についての評価をすることができる。 Based on the measured value of (i), for the substance to be screened, Mimecan or microfibril-associated protein 4 (Microfibrillar-associated protein 4, MFAP4) expression increase and / or anti-expression suppression effect It is possible to evaluate usefulness as a skin aging agent.
また、（ｉｉ）の測定値を基に、スクリーニング対象となる物質についての、光老化に基づく肌状態の改善作用を有する抗皮膚老化剤としての有用性についての評価をすることができる。 In addition, based on the measured value of (ii), it is possible to evaluate the usefulness of the substance to be screened as an anti-skin aging agent that has an effect of improving skin condition due to photoaging.
本発明は、抗皮膚老化剤のスクリーニング方法に応用することができる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention can be applied to screening methods for anti-skin aging agents.
Claims (7)
前記マトリックスメタロプロテアーゼが、マトリックスメタロプロテアーゼ－３（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－３、ＭＭＰ３）、及び／又は、マトリクッスメタロプロテアーゼ－９（Ｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ－９、ＭＭＰ９）であり、
前記抗皮膚老化剤は、皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａ ｃｕｔｉｓ）が細くなることを抑制する作用を有するものである、抗皮膚老化剤のスクリーニング方法。 Mimecan or microfibrillar-associated protein 4 (MFAP4) expression-enhancing and/or expression-reducing inhibitory action, as indicated by decreased expression and/or increased-suppressed expression of matrix metalloprotease A screening method for an anti-skin aging agent,
the matrix metalloprotease is matrix metalloproteinase-3 (MMP3) and/or matrix metalloproteinase-9 (MMP9),
A screening method for an anti-skin aging agent, wherein the anti-skin aging agent has an effect of suppressing thinning of retinacula cutis.
適用工程後に前記細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ発現量を測定する測定工程と、
を有することを特徴とする、請求項１～３の何れか１項に記載のスクリーニング方法。 an applying step of applying the substance to the cells;
a measuring step of measuring the expression level of matrix metalloprotease in the cells after the applying step;
The screening method according to any one of claims 1 to 3 , characterized by having
適用工程後に各々の前記細胞のマトリックスメタロプロテアーゼ発現量を測定する測定工程と、
前記測定工程の測定結果に基づき、マトリックスメタロプロテアーゼの発現の減少及び／又は発現の増大抑制を計測する計測工程と、
を有することを特徴とする、請求項１～４の何れか１項に記載のスクリーニング方法。 an application step of applying two or more substances to two or more cell groups, respectively;
a measuring step of measuring the matrix metalloprotease expression level of each of the cells after the applying step;
a measuring step of measuring a decrease in expression and/or an increase in suppression of expression of a matrix metalloprotease based on the measurement result of the measuring step;
The screening method according to any one of claims 1 to 4 , characterized by having
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