JP7126116B2

JP7126116B2 - 濾胞性制御性ｔ細胞増加剤

Info

Publication number: JP7126116B2
Application number: JP2018089314A
Authority: JP
Inventors: 敏志八村; 翔大糸賀; 聡新井; 紀介岩淵
Original assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2018-05-07
Publication date: 2022-08-26
Anticipated expiration: 2038-05-07
Also published as: JP2018188436A

Description

NPMD

NITE BP-01633

特許法第３０条第２項適用平成２８年１１月９日日本食品免疫学会２０１６年度大会において公開

本発明は、濾胞性制御性Ｔ細胞増加剤、及びその利用に関するものである。

免疫は、生体に侵入しようとする細菌やウイルスなどの外来異物（抗原）を排除するための高度な生体防御機構である。免疫細胞の一種であるB細胞が産生する抗体は、抗原を認識して結合するタンパク質で、外来異物を効率的に排除する防御機構の一つである。一方で、自己免疫疾患は、異物を認識し排除するための免疫が、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応してしまうことで症状が起こり、自身の構成成分を抗原とする自己抗体が大量に作られることが原因の一つであると知られている。B細胞が抗原を特異的に認識する抗体を産生するためには、CD4陽性で特徴づけられるヘルパーT細胞（Th細胞）が主要な役割を担っている。B細胞からの抗体産生に関しては、B細胞の局在領域であるリンパ節濾胞の中の胚中心と呼ばれる場所で、抗原に対して親和性の高い抗体を産生するB細胞が選択されることが重要であると知られている。こうした親和性の高い抗体を産生するB細胞の選択には濾胞性ヘルパーT細胞（Tfh細胞：Follicular Helper T cell）と共に、濾胞性制御性T細胞（Tfr細胞：Follicular Regulatory Helper T Cell）の関与が示されている（非特許文献１）。

Tfr細胞は、リンパ節濾胞に存在するTh細胞の一種で、細胞表面にCXCR5、PD-1（Programmed Cell Death 1）を発現し、核内にFoxp3を発現することを特徴とするCD4陽性のTh細胞である。通常、T細胞は免疫組織の中でT細胞領域に局在しており、B細胞が局在する濾胞とは別の場所に存在している。しかし抗原が侵入すると、活性化したT細胞の一部がTfh細胞となって多くのB細胞が局在する胚中心へと移動し、B細胞を成熟化させ抗原特異的な抗体の産生を促進する。Tfr細胞は胸腺で分化した制御性Ｔ細胞（Treg細胞）から分化誘導され、B細胞やTfh細胞に対して、IL-10やTGF-βなどのサイトカインのほか、PD-1及びICOSといった共刺激分子を介した相互作用によって数的または機能的な制御を行う。Tfr細胞が欠損又は数が低下するとTfh細胞は過剰に増加し、抗原特異性の低い未成熟な抗体を産生するB細胞を増加させる（非特許文献２）。従って、B細胞からの抗原特異的な良質な抗体を産生させる胚中心反応には、Tfr細胞によるB細胞やTfh細胞の数的または機能的な制御が必須であり、抗原との親和性の高い抗体の効率的な誘導にはTfr細胞の数的または機能的な作用が重要となる。

Tfr細胞の数的または機能的な作用の低下は、Tfh細胞の過剰増加を招く結果、多くの自己免疫疾患に関わることが知られている。関節リウマチ、全身性エリテマトーテス（SLE）、シェーグレン症候群等、重症筋無力症などの自己免疫疾患の患者では、血中のTfh細胞が過剰に増加し胚中心反応が亢進していることが報告されている（非特許文献３）。SLE患者では、Tfh細胞および胚中心Ｂ細胞の過剰な産生が認められ、末梢血中のTfh細胞数はSLEの原因となる抗二本鎖DNA抗体量と強い相関が認められている（非特許文献４）。これらのTfr細胞の数的および機能が低下した人のTfr細胞の機能を向上する手段が求められるが、安全性が高く有効な手段は未だ提供されていない。

近年、生体の免疫機能を調節する食品成分として、乳酸菌、麹カビ、酵母などが報告されている。これまでに一部の乳酸菌はTh1、Th2、Tfh細胞などの免疫細胞を調節することが報告されているが（非特許文献５、特許文献１）、乳酸菌を含む食品成分がTfr細胞を誘導しその細胞数を増加させることは報告されていない。

特開2016-113378号公報

Vanderleyden, I. et al., Arthritis Res Ther. (2014)16(5):471 Linterman, M.A., Nat Med. (2011) 17: 975-982 Yangyang, Z., Int Immunol. (2016)28(4):173-9 Simpson, N. et al., Arthritis Rheum. (2010) 62:234-244 Shida, K. et al. Gut. Microbes. (2011) 2:109-114

本発明は、安全性の高い、Tfr細胞を増加させる手段、例えば、血液中のTfh細胞が過剰に増加した対象に投与されるTfr細胞増加剤の提供を課題とする。

上記課題を解決するために、本発明者らはTfr細胞を誘導しうる因子を食品素材から鋭意探索し、ラクトバチルス（Lactobacillus）属に属する乳酸菌の摂取がTfr細胞を増加させることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を有効成分とする濾胞性制御性Ｔ細胞（Tfr細胞）増加剤を提供する。
前記Tfr細胞増加剤は、前記乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）であることを好ましい態様としている。
また前記Tfr細胞増加剤は、前記乳酸菌がラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）であることを好ましい態様としている。
また前記Tfr細胞増加剤は、血液中の濾胞性ヘルパーＴ細胞（Tfh細胞）が過剰に増加した対象に投与されることを好ましい態様としている。
また前記Tfr細胞増加剤は、前記乳酸菌が乳酸菌の生菌及び／又は乳酸菌の死菌であることを好ましい態様としている。
さらに、本発明は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を有効成分とする濾胞性制御性Ｔ細胞増加用飲食品組成物を提供する。

本発明により、効果的にTfr細胞を増加させる手段が提供される。本発明のTfr細胞増加剤は、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を有効成分としており、安全性が高く、医薬品、飲食品、飲食品組成物又は飼料等として有用である。

実施例２のフローサイトメトリーにおけるTfr細胞の割合（％）を示す図である。

次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。
本発明のTfr細胞増加剤は、乳酸菌を有効成分とする。乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属、メリソコッカス（Melissococcus）属、エンテロコッカス（Enterococcus）属、トリココッカス（Trichococcus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、カルノバクテリウム（Carnobacterium）属、
バゴコッカス（Vagococcus）属、テトラゲノコッカス（Tetragenococcus）属、アトポビウム（Atopobium）属、ワイセラ（Weissella）属、オエノコッカス（Oenococcus）属、アビオトロフィア（Abiotrophia）属、デスメジア（Desemzia）属、パララクトバチルス（Paralactobacillus）属、グラヌリカテラ（Granulicatella）属、アルカリバクテリウム（Alkalibacterium）属、オルセネラ（Olsenella）属、イソバキュラム（Isobaculum）属、マリニラクチバチルス（Marinilactibacillus）属、アトポスタイペス（Atopostipes）属、ラクトバム（Lactovum）属、ピリバクター（Pilibacter）属、フルクトバチルス（Fructobacillus）属、ラクチシゲミウム（Lacticigemium）属、ババリコッカス（Bavariicoccus）属、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属等に属する乳酸菌が好ましく、ラクトバチルス属がより好ましい。

ラクトバチルス属に属する乳酸菌としては、例えば、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、Lactobacillus acetotolerans、Lactobacillus acidifarinae、Lactobacillus acidipiscis、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus agilis、Lactobacillus algidus、Lactobacillus alimentarius、Lactobacillus amylolyticus、Lactobacillus amylophilus、Lactobacillus amylotrophicus、Lactobacillus amylovorus、Lactobacillus animalis、Lactobacillus antri、Lactobacillus apodemi、Lactobacillus aquaticus、Lactobacillus aviaries、Lactobacillus bifermentans、Lactobacillus bobalius、Lactobacillus brevis、Lactobacillus buchneri、Lactobacillus cacaonum、Lactobacillus camelliae、Lactobacillus capilatus、Lactobacillus casei、Lactobacillus catenaformis、Lactobacillus ceti、Lactobacillus coleohominis、Lactobacilluscollinoides、Lactobacillus composti、Lactobacillus concavus、Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus crispatus、Lactobacillus crustorum、Lactobacillus curvatus、Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus、Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii、Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus、Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis、Lactobacillus dextrinicus、Lactobacillus diolivorans、Lactobacillus equi、Lactobacillus equigenerosi、Lactobacillus fabifermentans、Lactobacillus
farciminis、Lactobacillus farraginis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus fornicalis、Lactobacillus fructivorans、Lactobacillus frumenti、Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus gallinarum、Lactobacillus gasseri、Lactobacillus gastricus、Lactobacillus ghanensis、Lactobacillus graminis、Lactobacillus hammesii、Lactobacillus hamsteri、Lactobacillus harbinensis、Lactobacillus hayakitensis、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus hilgardii、Lactobacillus homohiochii、Lactobacillus hordei、Lactobacillus iners、Lactobacillus ingluviei、Lactobacillus intestinalis、Lactobacillus jensenii、Lactobacillus johnsonii、Lactobacillus kalixensis、Lactobacillus kefiranofaciens、Lactobacillus kefiri、Lactobacillus kimchii、Lactobacillus kisonensis、Lactobacillus kitasatonis、Lactobacillus kunkeei、Lactobacillus leichmannii、Lactobacillus lindneri、Lactobacillus malefermentans、Lactobacillus mali、Lactobacillus manihotivorans、Lactobacillus mindensis、Lactobacillus mucosae、Lactobacillus murinus、Lactobacillus nagelii、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus nantensis、Lactobacillus nodensis、Lactobacillus oligofermentans、Lactobacillus oris、Lactobacillus otakiensis、Lactobacillus panis、Lactobacillus pantheris、Lactobacillus parabrevis、Lactobacillus parabuchneri、Lactobacillus paracollinoides、Lactobacillus parafarraginis、Lactobacillus parakefiri、Lactobacillus paralimentarius、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus perolens、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus pontis、Lactobacillus psittaci、Lactobacillus rapi、Lactobacillus rennini、Lactobacillus reuteri、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus rimae、Lactobacillus rossiae、Lactobacillus ruminis、Lactobacillus saerimneri、Lactobacillus sakei、Lactobacillus salivarius、Lactobacillus sanfranciscensis、Lactobacillus satsumensis、Lactobacill
us secaliphilus、Lactobacillus senmaizukei、Lactobacillus sharpeae、Lactobacillus siliginis、Lactobacillus spicheri、Lactobacillus suebicus、Lactobacillus sunkii、Lactobacillus susicola、Lactobacillus taiwanensis、Lactobacillus thailandensis、Lactobacillus tucceti、Lactobacillus ultunensis、Lactobacillus uvarum、Lactobacillus vaccinostercus、Lactobacillus vaginalis、Lactobacillus versmoldensis、Lactobacillus vini、Lactobacillus vitulinus、Lactobacillus zeae、Lactobacillus zymae等が好ましく、ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）（以下、「MCC1849」として略記することがある。）、及び、MCC1849と実質的に同等の細菌がより好ましい。以下、本明細書においては、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を、単に乳酸菌と記載することがある。
MCC1849は、ヒト糞便を分離源として分離された菌株である。同菌株の菌学的性質は、後述の実施例１に示す。同菌株は、2013年6月6日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８１２２号室）に、NITE P-01633の受託番号で寄託され、2013年12月19日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、NITE BP-01633の受託番号が付与されている。

MCC1849と実質的に同等の細菌とは、ラクトバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌であって、MCC1849と同程度のTfr細胞増加作用を有する細菌をいう。また、実質的に同等の細菌は、さらに、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、MCC1849の16S rRNA遺伝子の塩基配列と９８％以上、好ましくは９９％以上、より好ましくは１００％の相同性を有し、且つ、好ましくはMCC1849と同一の菌学的性質を有する。さらに、MCC1849又はそれと実質的に同等の細菌は、本発明の効果が損なわれない限り、それらの細菌から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株であってもよい。

MCC1849等の乳酸菌は、それらを培養することにより容易に増殖させることができる。培養する方法は、乳酸菌が増殖できる限り特に限定されず、乳酸菌の培養に通常用いられる方法を必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培養温度は２５～５０℃でよく、３５～４２℃であることが好ましい。また培養は好気条件下、及び嫌気条件下のいずれで行ってもよいが、嫌気条件下で行うことが好ましく、例えば、炭酸ガス等の嫌気ガスを通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養してもよい。

乳酸菌を培養する培地としては、特に限定されず、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を必要により適宜修正して用いることができる。すなわち、炭素源としては、例えば、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デンプン、デンプン加水分解物、廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。また、調製済みの培地としては、例えばＭＲＳ培地を好適に用いることができる。

乳酸菌は、培養後、得られた培養物をそのまま用いてもよく、希釈又は濃縮して用いてもよく、培養物から回収した菌体を用いてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、培養後に加熱、及び凍結乾燥等の種々の追加操作を行うことができる。追加の操作は、生菌の生残性が高いものであることが好ましい。尚、実施例に示すように、乳酸菌の加熱殺菌菌体はTfr細胞増加作用を有する。したがって、生菌であっても同様に、Tfr細胞増加作用を示すと考えられる。すなわち、本発明のTfr細胞増加剤においては、乳酸菌の菌体
は、生菌であっても死菌であってもよく、生菌及び死菌の両方であってもよい。死菌は、死菌体の破砕物であってもよい。

上記のような乳酸菌は、Tfr細胞増加剤の有効成分として用いることができる。本発明において、「Tfr細胞増加」とは、Tfr細胞の細胞数の増加、又はリンパ球画分中のTfr細胞の割合の増加を意味する。Tfr細胞増加剤を摂取した対象が、摂取していない場合に比べてTfr細胞の細胞数が増加するか、又はリンパ球画分中のTfr細胞の割合が増加すれば、Tfr細胞は増加したといえる。
MCC1849等の乳酸菌、又はこれを有効成分として含有する本発明のTfr細胞増加剤を含む組成物は、医薬、飲食品、飲食品組成物又は飼料として広く用いることができる。たとえば、ラクトバチルス属に属する乳酸菌を有効成分とするTfr細胞増加用医薬、Tfr細胞増加用飲食品組成物、又はTfr細胞増加用飼料を提供することができる。

本発明のTfr細胞増加剤は、乳酸菌を含有する限り特に制限されない。本発明のTfr細胞増加剤は、乳酸菌をそのまま使用してもよく、生理的に許容される液体又は固体の製剤担体を配合し製剤化して使用してもよい。

本発明のTfr細胞増加剤の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤、及び点鼻剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、又は注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。

本発明のTfr細胞増加剤における乳酸菌の含有量は、剤形、用法、対象の年齢、性別、疾患の種類、疾患の程度、及びその他の条件等により適宜設定されるが、通常、１×１０⁶～１×１０¹²ｃｆｕ／ｇまたは１×１０⁶～１×１０¹²ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０⁷～１×１０¹¹ｃｆｕ／ｇまたは１×１０⁷～１×１０¹¹ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。乳酸菌が死菌の場合、ｃｆｕ／ｇまたはｃｆｕ／ｍｌは、個細胞（cells）／ｇまたは個細胞（cells）／ｍｌと置き換えることができる。

また、本発明の効果を損なわない限り、本発明のTfr細胞増加剤と、乳酸菌以外の成分を有効成分とするTfr細胞増加剤、免疫賦活剤等を併用してもよい。

本発明のTfr細胞増加剤の投与時期は特に限定されず、対象となる疾患の治療方法に従って、適宜投与時期を選択することが可能である。また、予防的に投与してもよく、維持療法に用いてもよい。また、投与形態は製剤形態、患者の年齢、性別、その他の条件、患者の症状の程度等に応じて決定されることが好ましい。なお、本発明のTfr細胞増加剤は、いずれの場合も１日１回又は複数回に分けて投与することができ、また、数日又は数週間に１回の投与としてもよい。

本発明のTfr細胞増加剤は、Tfh細胞の過剰増加を抑制することが有効な対象、例えば、自己抗体や未成熟な抗体を減少させることが有効な対象に投与される。対象は、例えばヒトである。これらの対象は、濾胞性制御性Ｔ細胞を増加させることによって、濾胞性ヘルパーＴ細胞、又は抗体産生細胞を制御し、過剰な抗体産生機能の亢進を調節することが期待される。また、本発明のTfr細胞増加剤は、Tfh細胞の過剰増加による自己抗体の増加によって引き起こされる疾患又は症状、例えば、全身性エリテマトーテス、関節リウマチ、バセドウ病、橋本病、及びシェーグレン症候群等を予防、治療又は改善すること、又は、Tfr細胞を増加させることによって、予防、治療又は改善され得る疾患又は症状の予防、治療又は改善に使用することができる。
ここで「Tfh細胞が過剰に増加している」状態とは、健常者を基準にして血液中のTfh細
胞数が過剰に増加していることが好ましく、具体的には、健常者の血液中のTfh細胞数に対して２倍以上増加していることがより好ましい。血液としては、例として末梢血が挙げられるが、これに限定されない。
尚、ラクトバチルス・パラカゼイは、IL-12産生誘導能を有することが知られているが（国際公開2012/133827号）、本発明のTfr細胞増加剤は、IL-12産生促進を目的とする用途を除くことが好ましい。また、ラクトバチルス・パラカゼイは、Tfh細胞増加作用を有することが知られているが（特許文献１）、本発明のTfr細胞増加剤は、Tfh細胞増加を目的とする用途を除くことが好ましい。

本発明の他の形態は、Tfr細胞増加剤の製造における、乳酸菌の使用である。また、本発明の他の形態は、乳酸菌又は本発明のTfr細胞増加剤を適用対象に投与する工程を含む、Tfr細胞増加によって予防、治療又は改善され得る疾患の予防方法、治療方法又は改善方法である。

本発明のMCC1849等の乳酸菌は、飲食品又は飲食品組成物（以下、「飲食品等」と記載することがある。）として利用できる。また、Tfr細胞増加剤を含む飲食品又は飲食品組成物は、乳酸菌を含有する限り特に制限されず、飲食品等としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、及び乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、及び焼き菓子等の菓子類；加工乳、乳飲料、発酵乳、ドリンクヨーグルト、及びバター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。また、飲食品等は、サプリメントであってもよく、例えばタブレット状のサプリメントであってもよい。サプリメントである場合には、一日当りの食事量及び摂取カロリーについて他の食品に影響されることなく、乳酸菌を摂取できる。

上記のような飲食品等は、飲食品等の原料に乳酸菌を添加することにより製造することができ、乳酸菌を添加すること以外は、通常の飲食品等と同様にして製造することができる。乳酸菌の添加は、飲食品等の製造工程のいずれの段階で行ってもよい。また、添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飲食品等が製造されてもよい。そのような飲食品等としては、乳酸菌飲料、及び発酵乳等が挙げられる。
食品又は飲料の原料としては、通常の飲料や食品に用いられている原料を使用することができる。製造された飲食品等は、経口的に摂取することが可能である。

本発明の飲食品等には、飲食品等製造のための原料、及び食品添加物等、飲食品等の製造工程又は製造後に飲食品等に添加されるものも含まれる。例えば、本発明の乳酸菌は、発酵乳製造用スターターとして使用することができる。また、本発明の乳酸菌を、製造された発酵乳に後から添加することもできる。

飲食品等における乳酸菌の生菌又は死菌の含有量は、飲食品等の態様によって適宜設定されるが、通常、飲食品等中に、１×１０⁶～１×１０¹²ｃｆｕ／ｇ（ｃｅｌｌｓ／ｇ）または１×１０⁶～１×１０¹²ｃｆｕ／ｍｌ（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の範囲内であることが好ましく、１×１０⁷～１×１０¹¹ｃｆｕ／ｇ（ｃｅｌｌｓ／ｇ）または１×１０⁷～１×１０¹¹ｃｆｕ／ｍｌ（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の範囲内であることがより好ましい。

本発明のMCC1849等の乳酸菌又はTfr細胞増加剤を含む飲食品もしくは飲食品組成物は、Tfr細胞増加、免疫機能改善等の効果を利用する種々の用途に用いることができる。すなわち、飲食品又は飲食品組成物の形態である、Tfr細胞増加剤、免疫機能改善剤を提供することができる。

本発明のMCC1849等の乳酸菌又はTfr細胞増加剤を含む飲食品もしくは飲食品組成物は、Tfr細胞増加用、免疫機能改善用との用途が表示された飲食品又は飲食品組成物として販売することができる。また、そのような飲食品又は飲食品組成物には、「Tfr細胞増加用」、「免疫機能改善用」等の表示をすることができる。また、これ以外でも、Tfr細胞増加によって二次的に生じる効果を表す文言であれば、使用できることはいうまでもない。

前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物及び媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。具体的には、本発明の飲食品等に係る商品又は商品の包装に上記用途を記載する行為、商品又は商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が例示でき、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。

また、表示としては、行政等によって許可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましい。例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省や消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、機能性表示食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができる。さらに詳細には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、及びこれに類する表示等を例示することができる。

本発明のMCC1849等の乳酸菌又はTfr細胞増加剤を含む飼料としては、ペットフード、家畜飼料、及び養魚飼料等が例示される。そのような飼料は、一般的な飼料、例えば、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、又は酵母類等に乳酸菌を混合することにより製造することができる。また、例えばサイレージの様に、添加した乳酸菌による発酵工程を経て、飼料が製造されてもよい。製造された飼料は、一般的な哺乳動物、家畜類、養魚類、及び愛玩動物等に経口的に投与することが可能である。

飼料における乳酸菌の生菌又は死菌の含有量は、飼料の態様や投与対象によって適宜設定されるが、１×１０⁶～１×１０¹²ｃｆｕ／ｇ（ｃｅｌｌｓ／ｇ）または１×１０⁶～１×１０¹²ｃｆｕ／ｍｌ（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の範囲内であることが好ましく、１×１０⁷～１×１０¹¹ｃｆｕ／ｇ（ｃｅｌｌｓ／ｇ）または１×１０⁷～１×１０¹¹ｃｆｕ／ｍｌ（ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）の範囲内であることがより好ましい。

以下に、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕MCC1849の菌学的性質
MCC1849は、ヒト糞便サンプルから分離した。同細菌の菌学的性質として、細胞の形態、運動性、胞子形成、グラム染色性、カタラーゼ、グルコースからのガスの産生、及び、糖の発酵性を表１に示す。糖の発酵性は、細菌同定キットAPI 50CH（シスメックス・ビオ
メリュー社）を用いて調べた。キットに付属のマニュアル記載の方法にしたがって一晩培養後の菌液を各基質を含む培地に接種し、これを３７℃のインキュベーターで培養し、培養１日目および２日目に各基質の糖発酵性状を評価した。
これらの菌学的性質を表１に示す。この結果から、MCC1849はラクトバチルス・パラカゼイと判定された。

また、MCC1849の16S rRNA遺伝子塩基配列の解析からは、MCC1849はラクトバチルス・パ
ラカゼイまたはラクトバチルス・カゼイであると判断された。ラクトバチルス・パラカゼイとラクトバチルス・カゼイは近縁種であり、標準株間の16S rRNA遺伝子塩基配列の相同性は９９％以上であることが示されている（Huang CH, and Lee FL., Antonie Van Leeuwenhoek, 2011, 99(2):319-27）。MCC1849のゲノム配列を決定し、リードをラクトバチルス・パラカゼイ標準株（ATCC25302）またはラクトバチルス・カゼイ標準株（ATCC393）をリファレンスゲノムとしてマッピングすることで相同性を確認した。

その結果、MCC1849はラクトバチルス・パラカゼイ標準株との相同性が８５％であったのに対し、ラクトバチルス・カゼイ標準株との相同性は４５％であった。
したがって、MCC1849はラクトバチルス・パラカゼイであることが確認された。

〔実施例２〕MCC1849によるTfr細胞増加作用
（１）MCC1849加熱殺菌体の調製
MCC1849をMRS（de Man Rogasa Sharpe）培地（Difco）で16時間培養した菌体を、PBSで2回洗浄し、さらに蒸留水で1回洗浄した後に蒸留水に懸濁し、100℃30分間の加熱処理を行った。加熱処理後、菌体を蒸留水で2回洗浄した後に蒸留水に懸濁し、凍結乾燥を行い、MCC1849加熱殺菌体とした。

（２）樹状細胞（DC）の調製
BALB/cA Jcl マウス（日本クレアより入手）由来パイエル板（PP）細胞に1×10⁸ cellsあたり475 μLのMACSバッファーおよび25 μLのCD11c MicroBeads, mouse（ミルテニーバイオテク）を加えて懸濁した後、氷上で15 min静置し、MACSバッファーを加えて遠心（4℃、400 G、5 min）して上清ごとCD11c Beadsを除去した。そのあと細胞をMACSバッファーで再度懸濁し、付属のプロトコルに従いMACS LS分離カラム（ミルテニーバイオテク）に細胞懸濁液を通して一度目の精製を行った。この粗精製細胞をMACS MS分離カラム（ミルテニーバイオテク）に通して二度目の精製を行うことでCD11c⁺細胞を精製した。これをPP DCとして用いた。

（３）CD4⁺T細胞の調製
DO11.10マウス由来脾臓（SPL）細胞に1×10⁷ cellsあたり45 μLのMACSバッファーおよび5 μLのCD4 MicroBeads, mouse（ミルテニーバイオテク）を加えて懸濁した後、氷上で15 min静置し、MACSバッファーを加えて遠心（4℃、400 G、5 min）して上清ごとCD4 MicroBeadsを除去した。そのあと細胞をMACS LS分離カラム（ミルテニーバイオテク）に細胞懸濁液を通してCD4⁺細胞を精製した。これをCD4⁺ T細胞として用いた。

（４）B細胞の調製
BALB/cマウス由来SPL細胞に1×10⁸ cellsあたり2500 μLのMACSバッファーおよび5 μLのビオチン化ラット抗マウスIgM抗体を加えて懸濁した後、氷上で15 min静置し、MACSバッファーを加えて遠心（4℃、400 G、5 min）して上清ごとビオチン化ラット抗マウスIgM抗体を除去した。その後1×10⁸ cellsあたり980 μLのMACSバッファーおよび20 μLのStreptavidin MicroBeads, mouse（ミルテニーバイオテク）を加えて懸濁した後、氷上で15 min静置し、MACSバッファーを加えて遠心（4℃、400 G、5 min）して上清ごとStreptavidin MicroBeadsを除去した。そのあと細胞をMACS LS分離カラム（ミルテニーバイオテク）に細胞懸濁液を通してIgM⁺細胞を精製した。これをSPL B細胞として用いた。

（５）MCC1849加熱死菌体、抗原ペプチド、CpGオリゴヌクレオチド、DC、T細胞およびB細胞の共培養
96 well 平底プレート（BD Falcon^TM）を用いて、5% FCS-RPMI 200 μL中にDC、T細胞、B細胞を、それぞれ1×10⁴cells、2×10⁵ cells、2.5×10⁵cellsとなるように細胞溶液を加えた。OVA 323-339に相当する抗原ペプチド（OVAp; 終濃度10 nM）を 5% FCS-RPMIに
懸濁し添加した。加熱死菌体はPBSに懸濁して終濃度100 μg/mLにて、またアジュバントであるCpGオリゴDNA（CpG ODN 1668; CpG）は10 nMにて添加した。37℃、5% CO₂の環境下で培養した。

（６）フローサイトメトリー
細胞懸濁液を1×10⁵-2×10⁶cells程度ポリスチレンラウンドチューブに添加しFACSバッファーを加えて遠心（4℃、400 G、5分）し、上清を除去することで洗浄した。以下、洗浄及び希釈には全てFACSバッファーを使用した。抗マウスCD16/32抗体（2.4G2, BioLegend）を2.5 μg/mLの濃度で懸濁し、氷上で15分、Fcレセプターのブロックを行った。洗浄を行い、蛍光標識抗体、およびbiotin化抗体を希釈して懸濁し、氷上で20分反応させた。洗浄を行った後、蛍光標識ストレプトアビジンを希釈して懸濁し、氷上で20分反応させた。細胞内分子の染色を行わない場合は洗浄を行った後、ヨウ化プロピジウムを加えて懸濁した直後に洗浄し、これらのサンプルにFACSバッファーを加えてフローサイトメトリーに使用した。Foxp3の染色は、Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience) を用い、付属のプロトコルに従った。測定にはFACS Verse (BD Biosciences) を使用し、データの解析はFlowJo (Tree Star, Inc.) にて行った。
なお、抗体、蛍光試薬は以下のものを使用した。
FITC標識抗マウスCD4抗体（H129.19, BD Pharmingen）
allophycocyanin (APC) 標識抗マウスCD4抗体（GK1.5, BioLegend）
PerCP-efluor710標識抗マウスCD279/PD-1抗体（J43, ebioscience）
biotin化抗マウスCD185/CXCR5抗体（SPRCL5, ebioscience）
biotin化抗マウスCD11c抗体（N418, Cytotechnology(2011),vol.63,p.307-317に記載された抗体であり、市販されているものと同等のものである。）
biotin化抗マウスCD279/PD-1抗体（J43, ebioscience）
PE-cy7標識streptavidin (BioLegend)
APC標識streptavidin (BioLegend)
PE標識抗マウスFoxp3抗体（FJK-16s, ebioscience）
*印は両群間の統計学的危険率が5％以下であることを示す。また、統計的有意差の検定にはTukey HSDを用い、p<0.05を統計的有意差とみなした。

（７）結果
図１に示すように、CpG存在下においてMCC1849加熱殺菌体を添加することによって、CD4^＋CXCR5^＋PD-1^highFoxp3^＋細胞 (Tfr細胞)の割合は有意に増加した。また本実験では、CpG非存在下においても、Tfr細胞の割合は有意に増加した。尚、図中のバーは平均値を示す。
この結果から、乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849はTfr細胞を増加させる効果を有することが示された。

Claims

乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）を有効成分とする濾胞性制御性Ｔ細胞増加剤。
血液中の濾胞性ヘルパーＴ細胞が過剰に増加した対象に投与される、請求項１に記載の濾胞性制御性Ｔ細胞増加剤。
前記乳酸菌が乳酸菌の生菌及び／又は乳酸菌の死菌である、請求項１又は２に記載の濾胞性制御性Ｔ細胞増加剤。
乳酸菌ラクトバチルス・パラカゼイMCC1849（NITE BP-01633）を有効成分とする濾胞性制御性Ｔ細胞増加用飲食品組成物。