JP7123921B2 - サブチラーゼサイトトキシンbサブユニット変異体 - Google Patents
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Description
つかの実施形態において、単離された材料は、濃縮形態、部分的に精製された形態、または精製された形態であり得る。
-3-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンにも結合することを意味する。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、約5~15nM、約7~12nMまたは約8~10nMの親和性で、α2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンに結合する。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、約8~20nM、10~18nMまたは約14~16nMの親和性で、α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンに結合する。
S106およびT107欠失変異体(たとえば、配列番号1)とは対照的に、T107およびE108欠失変異体は、Neu5Ac-α2-6-lacおよびNeu5Ac-α2-3-lacなどのNeu5Acグリカンを含むグリカンに広く結合することができる(たとえば表1を参照)。WT SubBはNeu5Ac-α2-6-lacに検出可能な程度に結合しないことも留意される。したがって、T107およびE108欠失変異体タンパク質は、α2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンおよびα2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンなどのNeu5GcグリカンならびにNeu5Ac-α2-6-lacおよびNeu5Ac-α2-3-lacなどのNeu5Acグリカンを結合または検出するために有用なタンパク質であり得る。
最小化する2つの完全なシーケンスのアラインメントを行う。一般に、デフォルトパラメータが使用され、ギャップ生成ペナルティ=12およびギャップ拡張ペナルティ=4である。
第15章を参照する。
の実施形態では基質は、セファロース、アガロース、プロテインA、プロテインG、磁気ビーズ、常磁性粒子、またはセンサーチップ表面(たとえば、BIACoreまたは表面プラズモン共鳴用)であってよく、または、それらを含んでよい。適切には、試料は、α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含み得るもしくは含むと疑われ得る分子の混合物またはその分子を発現する細胞を含み得る。
とによってもたらされ得る。
される。組み換え合成抗体または抗体断片の重鎖および軽鎖は、同じ宿主細胞中で異なる発現ベクターから同時発現されてもよく、または、宿主細胞中で単鎖抗体として発現されてもよい。組み換え抗体の発現および選択技術の非限定的な例が、Coliganら、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(前出)およびZuberbuhlerら、2009、Protein Engineering, Design&Selection 22 169に提供されている。
高ストリンジェントな条件の具体的および非限定的な例には、以下のものが含まれる:
(i)42℃でのハイブリダイゼーションにおいては少なくとも約31%v/vから少
なくとも約50%v/vのホルムアミドおよび少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩、ならびに、42℃での洗浄に対して少なくとも約0.01Mから少なくとも約0.15Mの塩;
(ii)65℃でのハイブリダイゼーションにおいては1%BSA、1mMのEDTA、0.5MのNaHPO4(pH7.2)、7%SDS、および、65℃を超える温度で約1時間の洗浄に対して(a)0.1×SSC、0.1%SDS;または(b)0.5%BSA、1mMのEDTA、40mMのNaHPO4(pH7.2)、1%SDS;ならびに、
(iii)68℃以上で約20分間の洗浄においては0.2×SSC、0.1%SDS。
すでに公知のがんへの関与および通常の非がん性ヒト組織における低レベルを踏まえ、血清中および組織中に多量のNeu5Gcが検出される場合は異常と考えられ、腫瘍の存在の指標となるであろう。これにより、Neu5Gcに対するSubBの特異性を利用して、一連のがんに対するハイスループット診断スクリーニング試験を開発する可能性が生
まれる。しかしながら、α2-6-結合Neu5Gcに対する親和性が乏しいことは、そのような試験の感度に影響を及ぼし得る。本研究では、両方のタイプの構造を高い親和性で認識する能力を有するSubB変異体を設計することを目的に、SubBと、α2-3-結合またはα2-6-結合の、Neu5Gcで終わるグリカンとの相互作用を検討した。
SubBのグリカン結合部位の構造誘導変異
α2-3-結合構造に対する偏りの分子的基礎を理解するために、我々はSubBとNeu5Gcα2-3Galβ1-3GlcNAc(X線結晶解析により決定)とNeu5Gcα2-6Galβ1-3Glcとの相互作用を比較した(図1)。前に報告されたように8、前者のグリカンのサブ末端糖が溶媒中に自由に広がるのに対して、α2-6構造の3級糖はSubB表面に折り返され、SubB残基T104-E108を含むループと密接に接触する。このループは、C103とC109の間のジスルフィド結合によって安定化される。結果として生じる立体障害は、末端Neu5Gcの結合ポケットへのドッキングを歪め、最初のグリカンアレイ分析で観察されたα2-6-結合Neu5Gc構造の結合の著しい低下の理由となる。
次いで、精製したSubBおよび種々の変異誘導体をBiacoreチップ上に固定化し、そして一連のNeu5AcまたはNeu5Gc末端構造(遊離シアル酸、シアル酸-α2-3-ラクトースおよびシアル酸-α2-6-ラクトース)に対する結合親和性ならびにヒトおよびウシのα1-酸性糖タンパク質(AGP)に対する結合親和性について表面プラズモン共鳴(SPR)を用いて試験した(表1)。ヒトAGPグリカンはNeu5Acを含み22、23、ウシAGPグリカンはNeu5AcとNeu5Gcの両方を含む23。MS糖タンパク質分析(図5)を行い、SPR研究に使用されたヒトおよびウシのAGPにおけるNeu5AcおよびNeu5Gc分布を確認した。グリカンアレイの結果から予測されるように、野生型SubBは、α2-3-結合Neu5Gc-ラクトースおよび遊離Neu5Gcに対して高い親和性を有することが見出され、ナノモルレベルの結合親和性が観察された。α2-6-結合Neu5Gc-ラクトースでは結合は観察されず(最大濃度25μMまで試験)、α2-3-結合Neu5Acでは2.2μMの親和性が観察され、これは、同等のNeu5Gc構造と比較して300倍超の結合の減少である。野生型SubBはまた、ウシAGPと比較してヒトAGPに対し、結合親和性が13倍減少した。SubBT107Aにおける変異は、野生型タンパク質と比較して、試験した構造のいずれへの結合にも有意な影響を及ぼさなかった。SubBS106A/T107Aはα2-6-結合構造への結合を改善したが、この改善はNeu5AcとNeu5Gcの両方で見られた。試験した全ての結合した糖について観察されたナノモル範囲の親和性は、SubBS106A/T107Aが優れた万能のシアル酸認識レクチンであることを明
らかにしている。SubBΔS106/ΔT107/E108D変異体は、α2-6-結合型Neu5Ac構造への結合を変えることなくα2-6-結合型Neu5Gcの認識を改善した。しかしながら、α2-3-結合Neu5Acとα2-3-結合Neu5Gcとの間の親和性の差は、野生型について観察された300倍と比較すると50倍まで減少した。SubBΔS106/ΔT107変異体は、野生型タンパク質と比較してNeu5Gc対Neu5Ac識別が有意に改善され、2つの構造間で結合親和性の有意差なくα2-3-結合Neu5Gcおよびα2-6-結合Neu5Gcに結合する能力を有していた(それぞれ15.3nM対8.5nM;P=0.12)。このように、SubBΔS106/ΔT107は、Neu5Gc対Neu5Ac識別の増強ならびにα2-3-およびα2-6-結合Neu5Gc構造の両方を認識する能力という最適な組み合わせを示した。SubBΔT107/ΔE108欠失変異体は、野生型SubBタンパク質よりも実質的に高い親和性でα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンに結合し、同時にα2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンにも結合した。しかしながら、SubBΔS106/ΔT107とは対照的に、SubBΔT107/ΔE108は、野生型SubBまたはSubBΔS106/ΔT107のいずれも検出可能には結合しないNeu5Ac-α2-6-lacなどのNeu5Acグリカンに広く結合できる。
好ましいNeu5Gcに特異的なSubBΔS106/ΔT107変異が非シアル化構造に対する特異性をもたらしたかどうかを評価するため(SPR分析ではカバーされていない)、SubB野生型、SubBΔS106/ΔT107およびSubBS106A/T107A変異体についてグリカンアレイ分析を実施した(表4)。野生型SubBは、グリカンアレイ上の402個の構造のうち4個のみに有意な結合を示した;Neu5Gcα2-3Gal、Neu5Gcα2-3Galβ1-4GlcNAc、および2つのNeu5Acα2-3Galβ1-4GlcNAc末端構造。これは、以前に公表されたSubB8のグリカンアレイ分析と一致している(www.functionalglycomics.org/glycomics/HServlet?operation=view&sideMenu=no&psId=primscreen_1579#)。SubBΔS106/ΔT107のみがアレイ上の4つの構造に対して有意な結合を示した。これらはNeu5Gcα2-3GalまたはNeu5Gcα2-6Galで終わる構造に限られていた。SubBS106A/T107Aは、Neu5GcおよびNeu5Acを含む構造を有するアレイ上で合計18個のグリカンに結合した。グリコサミノグリカンを含む硫酸化構造(ヘパリンおよびコンドロイチン-6-サルフェート)および硫酸化ラクトサミン構造も認識した(表4)。SubBS106A/T107Aはまた、アレイ上の負に荷電している単糖範囲(Neu5Ac、Neu5Gc、9-NAc-Neu5Ac、3-O-Su-GlcNAc)も認識した。
生物学的試料中のNeu5Gcの存在を検出する操作された変異体の能力を評価するために、ELISAアッセイを実施した。SubBの段階希釈物でコーティングした皿を用いて、ヒトおよびウシ由来の標識血清タンパク質を試験した。ウシ由来のNeu5Gc含有血清タンパク質の分別認識において、SubBΔS106/ΔT107で2倍の改善が同定された(図3)。
ヒトとウシのAGPを区別する能力(ウシのAGPのみが有意なレベルのNeu5Gc末端グリカンを示す)を独立して検証するために、段階希釈糖タンパク質をニトロセルロースフィルター上に滴下し、洗浄およびブロッキング後、フィルターを精製ビオチン化SubBΔS106/ΔT107で覆った。次いで、結合レクチンをストレプトアビジン-APを用いて洗浄したフィルター上で検出した(図4)。ウシAGPへのSubBΔS106/ΔT107の結合は、約200ng/スポットまで検出可能であったが、ヒトAGPへの有意な結合は、最大試験量(12.5μg/スポット)でも検出できなかった。この区別能力は、上記のSPRデータと一致している。
Zバイオテックのグリカンアレイで分析した種々のNeu5AcおよびNeu5Gcグリカン構造を図9に示し、アレイの一例を図6に示す。表3は、図9のグリカンを図7および図8のアレイデータにリンクさせるコードを提供する。図7に要約されたアレイデータによると、Neu5Gc構造への結合は野生型SubBが偏りをより示すが、バックグラウンドを超えて5000超の蛍光単位で結合するNeu5Acグリカンは4/40であり、5000未満の結合を有するNeu5Gc構造は14/41である。全てのNeu5Ac構造が、バックグラウンドを超えて多少の結合を記録する。図8でも明らかなように、Neu5Gc構造への結合は、SubB2Mが一番強かった。バックグラウンドを超えて5000超の蛍光単位で結合するNeu5Acグリカンは観察されず、5/41のみのNeu5Gc構造が5000未満の結合を有する。7/14のみのNeu5Acグリカンがバックグラウンドを超える結合を有する。この結果は、Neu5Gcに対する特異性の面でWT SubBを用いて得られた結果よりも決定的な改善を示し、Neu5Gc含有グリカンの異なる結合の認識および提示の改善された認識を示す。
図10および11を参照しながら、すべてのアッセイは、シグマアルドリッチから入手した1%正常ヒト血清のバックグラウンドで行われた。Neu5Gc含有タンパク質を添加した場合、血清のみの対照を下回る値で存在する血清に起因する結合が観察されたため、野生型SubBを分析することはできなかった。これは、SubB WTが血清よりもNeu5Gcタンパク質への偏りを示したが、タンパク質の非存在下では高レベルで血清に結合したことを示している(図10)。図11に示すように、SubB2Mは、31.25nMから62.5nMの間の濃度で、血清バックグラウンドを超える応答を有し、はるかに良好であった。これは約2μg/mLのタンパク質濃度である。
Neu5Gcはヒト癌腫における重要な診断上および予後上のマーカーであり、Neu5Gc発現の上昇が乳がん、卵巣がん、前立腺がん、結腸がんおよび肺がんにおいて検出されている11、12。野生型SubBは、Neu5Gcで終わるグリカンに対して前例のない特異性を有していたが、α2-6-結合Neu5Gcとの結合性は低く、弱いながらもα2-3-結合Neu5Ac構造を依然として認識した8。α2-6-結合Neu5Gcに対するSubBの認識を改善し、Neu5Gcへの特異性を高めるために、我々は、T104-E108ループに特に焦点を当てて、構造補助修飾を用いてSubBを設計した。
ノ酸の欠失(ΔS106/ΔT107)により、連鎖(α2-3およびα2-6)にかかわらずNeu5Gcに対してかなり高い特異性を有するレクチンの生産につながった。SubBΔS106/ΔT107変異体は、野生型SubBと比較してNeu5Gc含有構造の認識が有意に改善された。SubBΔS106/ΔT107もまた、α2-3-結合Neu5Gcまたはα2-6-結合Neu5Gc構造に結合するその能力に差がなく、野生型タンパク質よりも有意な改善となった。S106およびT107アミノ酸以外のSubBタンパク質のさらなる修飾は、特異性において有意な改善をもたらさなかった。SubBΔS106/ΔT107タンパク質にE108D変異も加えたSubBΔS106/ΔT107/E108D変異タンパク質は、SubBΔS106/ΔT107よりもα2-3-結合Neu5Gcとα2-3-結合Neu5Acの区別能力が低く、SubBΔS106/ΔT107変異体よりもヒトα1-酸性糖タンパク質に強い結合性を示した(SubBΔS106/ΔT107よりもSubBΔS106/ΔT107/E108Dに結合されるタンパク質は24倍多かった)。対照的に、SubBΔT107/ΔE108欠失変異体は、α2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンおよびα2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸グリカンだけでなく、SubBΔS106/ΔT107が検出可能には結合しないNeu5Ac-α2-6-lacおよびNeu5Ac-α2-3-lacなどのNeu5Acグリカンにも結合した。
SubBの構造モデリング
SubB変異体の3次元構造は、Phyre2を用いてモデル化した24。Neu5GCα2-6Galβ1-3Glcは、PDB ID:4EN8から得25、Cootを用いて手動でSubBおよびSubB変異体構造にモデル化した26。
表2に記載されているフォワードプライマーpETSubBFとそれぞれの変異体特異的リバースプライマーを使用したハイフィデリティーPCRを直接行うことにより、subBコード配列に変異を導入した(3’末端近く)。PCR産物をpET-23(+)(ノバジェン(Novagen))のBamHIおよびXhoI部位にクローニングし、そして大腸菌BL21(DE3)に形質転換した。SubB誘導体は、以前に記載されているように4、Ni-NTAアフィニティークロマトグラフィーにより、His6でタグ付けした融合タンパク質として発現および精製した。タンパク質は、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色によって評価したところ純度>95%であった。
表面プラズモン共鳴(SPR)は、Biacore T100システム(GE)を用いて以前記載されたように行った27。簡単に説明すると、SubB、SubB変異体および抗Neu5Gc IgY(シアマブ(SiaMab)、旧シアリックス/GC-フリー(Sialix/GC-Free Inc.);USA、カリフォルニア州サンディエゴ)を、NHSキャプチャーキットを用いてシリーズSセンサーチップCM5(GE)のフローセル2-4上に固定し、フローセル1をブランクの固定として実行した。ヒトおよびウシ由来の単糖、二糖、オリゴ糖およびα1-酸性糖タンパク質(シグマアルドリッチ;表1参照)を最初の範囲測定実験で0.01~100μMで流した。濃度を調整し、全てのデータを、Biacore T100評価ソフトウェアを用いた単一サイクル動態を用いて分析した。
ヒト血漿(シグマアルドリッチ、G9885)およびウシ血漿(シグマアルドリッチ、G3643)由来のAGP(6M塩化グアニジニウム、pH8の50mMのTris-HCl中に1mg)を還元し、それぞれ10mMジチオトレイトールおよび25mMアクリルアミドでアルキル化した。次いで、タンパク質を1:1のメタノール:アセトンを4体積分添加することにより沈殿させ、-20℃で16時間インキュベートし、次いで遠心分離後(18,000rcf、10分)、ペレットを回収した。沈殿したタンパク質をpH8の50mM Tris-HCl50μLに再懸濁し、1μgのトリプシン(Trypsin Gold、プロメガ(Promega))で消化した(37℃、16時間)。次いで消化したペプチドをC18ZipTips(ミリポア(Millipore))で脱塩した。
黒色96ウェルNUNCマキシソーププレートのウェルを、100mM重炭酸塩/炭酸塩コーティング緩衝液(pH9.6)で、1.25μgから始めて2倍に段階希釈したSubBまたはSubBΔS106/ΔT107タンパク質で、4℃で一晩かけてコーティングした。ウェルをリン酸緩衝食塩水、0.05%Tween-20(PBS-T)で3回洗浄し、ブロッキング溶液(3%BSA)を室温で1時間添加した。正常ヒト血清およびウシ血清中のタンパク質を、生の血清を100μMのFITC色素(Peirce)と混合することによって、氷上で1時間インキュベートすることによって蛍光標識した。1kDaサイズ排除スピンカラムを用いて過剰の色素を除去した。100μlのFITC標識正常ヒト血清またはウシ血清を、SubBまたはSubBΔS106/ΔT107でコーティングしたウェルに添加し、そしてウェルを室温で1時間インキュベートした。ウェルをPBS-Tで3回洗浄した。100μlのPBSを各ウェルに添加し、蛍光を485/535nmで測定した。蛍光単位値は、二重反復試験の平均±SDとして示され、SubBタンパク質を除く全ての試薬を含有するウェルについて得られた平均蛍光単位が差し引かれている。負の値は0と見なした。
EZ-Link(登録商標)Sulfo-NHS-ビオチン化キット(サーモサイエンティフィック(Thermo Scientific))を製造元の指示に従って使用して、精製したSubBΔS106/ΔT107をビオチンで標識した。精製されたヒトおよびウシα-1酸性糖タンパク質(シグマ、カタログ番号G9885およびG3643)を5mg/mlで水に溶解し、5μl容量の段階2倍希釈液をニトロセルロースフィルター上に滴下し、37℃で一晩風乾した。次いで、フィルターを、0.05%Tween20を含むトリス緩衝食塩水(TTBS)中の5%スキムミルクで2時間ブロックした。TTBSで3回洗浄した後、フィルターをTTBS中1μg/mlのビオチン-SubBΔS106/ΔT107で覆い、4℃で一晩インキュベートした。フィルターをTTBSで3回洗浄し、ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲート(ロシュ(Roche))を用いて結合ビオチン-SubBΔS106/ΔT107を検出した。発色性ニトロブルーテトラゾリウム/X-ホスフェート基質システム(ロシュ)を用いてフィルターを開発した。
表3に示されるデータについて、グリカンアレイスライドを、以前に記載されているように28、Arrayit Spotbot Extremeコンタクトプリンターを使用してSuperEpoxy3(アレイット(Arrayit))活性化基質上に印刷した。各サブアレイについて、2μgのSubBタンパク質を、抗Hisタグ抗体(セルシグナリング(Cell signaling))ならびにAlexa 555の2次抗体および3次抗体(ウサギ抗マウス;ヤギ抗ウサギ)と2:1:0.5:0.25の比かつ500μLの最終容量で予め複合体化させた。この500μLの抗体-タンパク質複合体
を、カバーガラスなしで65μLの遺伝子フレーム(サーモサイエンティフィック)に添加した。洗浄および分析は、以前に記載されているように実施した27。
図6~9に示すデータについては、Neu5Ac/Neu5Gcグリカンアレイは、Z-バイオテク(http://www.zbiotech.com/neu5gc-enoantigen-microarray.html)から入手した。製造業者の説明書に従って、各サブアレイ領域に合計2μgのタンパク質を適用してアレイを作製した。検出は、マウス抗His IgG(タンパク質と1:1のモル比)、ウサギ抗マウスAlexa 555 IgG(0.5モル量のマウスIgG)およびヤギ抗ウサギAlexa 555 IgG(0.5モル量のウサギIgG)を用いて行われた。タンパク質を1時間インキュベートし、1×PBS中で3回洗浄した。スライドを488、532および647レーザーを用いてInnoscan 1100ALでスキャンした。アレイをMapixソフトウェアで分析した。全てのデータは532レーザーチャンネルから得られ、バックグラウンドを差し引いた蛍光を分析に使用した。
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Claims (29)
- アミノ酸配列TTSTE(配列番号3)を含む配列番号2のアミノ酸配列を含む、単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアントであって、前記単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアントのアミノ酸配列TTSTE(配列番号3)の1つ以上のアミノ酸残基が欠失しており、前記単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアントはα2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸およびα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸に結合することができ、ならびに前記バリアントは配列番号2で表されるアミノ酸配列と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含むものである、前記単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント。
- 配列番号2の断片である請求項1に記載の単離されたタンパク質であって、配列番号1のアミノ酸配列を含むものである、前記タンパク質。
- 請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、ならびに
α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含むグリカン
を含む単離された分子複合体。 - 前記α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含むグリカンが、腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞で発現される、請求項10に記載の単離された分子複合体。
- 請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、を含む組成物。
- 前記組成物が担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物である、請求項12に記載の組成物。
- 前記組成物が1つ以上の検出試薬を含む診断用組成物である、請求項12に記載の組成物。
- α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を検出するインビトロの方法であって、
請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12もしくは14に記載の組成物を試料と結合させて、前記請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12もしくは14に記載の組成物、ならびに前記α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含む検出可能な複合体を形成する工程を含む、前記方法。 - 前記α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸が、腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞で発現される、請求項15に記載のインビトロの方法。
- 前記α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸が、ヒト投与用の組み換えグリコシル化薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む試料または調製物中の混入物である、請求項15に記載のインビトロの方法。
- α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含むグリカンまたは前記グリカンを発現する細胞を検出するインビトロの方法であって、
前記方法は、
請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12もしくは14に記載の組成物を試料と結合させて、前記請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12もしくは14に記載の組成物、ならびに前記α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含むグリカンを含む複合体を形成する工程;ならびに
前記複合体を単離する工程を含む、前記方法。 - 前記細胞が腫瘍細胞またはネコ科動物の血液細胞である、請求項18に記載のインビトロの方法。
- 前記α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を含むグリカンが、ヒト投与用の組み換え薬物、抗体および他の治療用生体分子を含む調製物または製剤中の混入物である、請求項19に記載のインビトロの方法。
- 対象のがんを治療するための、請求項12または13に記載の組成物であって、前記がんが、α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を発現するがんである、前記組成物。
- 前記請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12~14のいずれか一項に記載の組成物が細胞傷害剤と結び付いている、請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12~14のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記治療が、α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞を殺傷することを含む、請求項21に記載の組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項21または23に記載の組成物。
- α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞を検出するための、請求項12~14のいずれか一項に記載の組成物。
- がんを治療することを必要とする対象のがんを治療するための医薬品の製造における、請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、または請求項12または13に記載の組成物の使用であって、前記医薬品が、α2-3-結合N-グリコリルノイラミン酸および/またはα2-6-結合N-グリコリルノイラミン酸を発現するがん細胞を選択的に標的化するものである、前記使用。
- 請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離されたタンパク質またはその断片もしくはそのバリアント、または請求項7に記載の断片、をコードする単離された核酸。
- 請求項27に記載の単離された核酸を含む遺伝子構築物。
- 請求項1~6及び8~9のいずれか一項に記載の単離タンパク質またはその断片もしく
はそのバリアント、または請求項7に記載の断片、請求項12~14のいずれか一項に記載の組成物、請求項27に記載の単離された核酸、および/または請求項28に記載の遺伝子構築物を含むキット。
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