JP7123350B2 - 微生物回収方法、及び、微生物回収用発光性カーボンナノワイヤ - Google Patents
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Description
従来、対象物から取得した微生物を集積培養して、結果として微生物を選択的に回収する方法が知られているが、上記の方法では培養可能な状態の微生物しか回収できず、また、得られた微生物が対象物中における状態を反映しているか不明であった。
[1] 微生物、及び、回収阻害因子を含有する対象物と、発光性カーボンナノワイヤとを接触させて、上記回収阻害因子と上記発光性カーボンナノワイヤとの会合体を得る工程と、上記対象物から上記微生物、及び、上記会合体からなる群より選択される少なくとも一方を分離する工程と、を有する微生物回収方法。
[2] 上記発光性カーボンナノワイヤは、発光性ナノカーボンを固結させてなる[1]に記載の微生物回収方法。
[3] 上記発光性カーボンナノワイヤは、360~420nmの波長範囲内に発光ピークを有する励起光で励起した際に、500~650nmの波長範囲内に発光ピークを有する光を放射する、[1]又は[2]に記載の微生物回収方法。
[4] 上記対象物が酸性発酵乳である、[1]~[3]のいずれかに記載の微生物回収方法。
[5] 上記回収阻害因子がタンパク質である、[1]~[4]のいずれかに記載の微生物回収方法。
[6] 界面の少なくとも一部が互いに固着した発光性ナノカーボンからなり、360~420nmの波長範囲内に発光ピークを有する励起光で励起した際に、500~650nmの波長範囲内に発光ピークを有する光を放射する、微生物回収用発光性カーボンナノワイヤ。
以下に記載する構成要件の説明は、本発明の代表的な実施形態に基づいてなされることがあるが、本発明はそのような実施形態に制限されるものではない。
なお、本明細書において、「~」を用いて表される数値範囲は、「~」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。
本発明の実施形態に係る微生物回収方法(以下、単に「本方法」ともいう。)は、微生物、及び、回収阻害因子を含有する対象物と発光性カーボンナノワイヤとを接触させて、上記回収阻害因子と上記発光性カーボンナノワイヤとの会合体を得る工程と、上記対象物から上記微生物、及び、上記会合体からなる群より選択される少なくとも一方を分離する工程と、を有する微生物回収方法である。
なお、本明細書において、典型的には回収阻害因子とは、微生物を吸着したり、微生物とともに凝集物を形成する等して、対象物中の微生物の回収を阻害する要素であり、その具体例は後述する。
本発明者らは、回収阻害因子から微生物を遊離させることができれば、回収阻害因子と微生物との質量、粒子径、及び、密度からなる群より選択される少なくとも1種の差により、常法により分離回収可能であるという発想に基づき、微生物、又は、回収阻害因子と特異的な相互作用を有する材料を鋭意探索してきた。
本方法は、微生物、及び、回収阻害因子を含有する対象物と発光性カーボンナノワイヤとを接触させて、上記回収阻害因子と上記発光性カーボンナノワイヤとの会合体を得る工程(以下、「会合体形成工程」ともいう。)を有する。
対象物と発光性カーボンナノワイヤとを接触させる方法としては特に制限されないが、典型的には、対象物に発光性カーボンナノワイヤを加える方法、及び、発光性カーボンナノワイヤに対象物を加える方法等が挙げられる。
すでに説明したとおり、対象物と発光性カーボンナノワイヤとを接触させると、発光性カーボンナノワイヤは回収阻害因子との特異的な相互作用により、会合体を形成するものと推測される。そしてそれに合わせて回収阻害因子からは回収阻害因子と会合していた微生物が遊離するものと推測される。
更に、発光性カーボンナノワイヤは、その表面に沿って複数の相互作用性基からなる水素結合が可能な領域(部位)を有するため、同様の領域を有する粒子径が大きい生体分子(回収阻害因子)との相互作用がより強まるものと推測される。
例えば、典型的な回収阻害因子である球状のカゼインミセルにおいては、表面にκカゼインが局在し、そのC末端側に結合している糖鎖がミセル表面に露出していると言われている。従って、上記カゼインミセル表面に存在する糖鎖に対して、発光性カーボンナノワイヤが優先的に結合しやすいものと推測される。
これにより、発光性カーボンナノワイヤと回収阻害因子(例えばカゼインミセル、具体的には後述する。)とが巨大な凝集体ネットワークを形成すると共に、回収阻害因子に接着した微生物を遊離させ、結果として、生死に関わらず微生物の回収が容易になるものと推測される。
本方法の対象物としては、後述する微生物、及び、回収阻害因子を含有していれば特に制限されない。対象物としては、例えば、飲食品;家畜の飼料;ペットフード;土壌;水(地下水、及び、表流水等);ヒト又は動物の臓器、血液、皮膚、及び、糞便等;化粧品;医薬品;等が挙げられる。
飲食品としては特に制限されず、微生物を含有することが明らかな食品(例えば発酵食品)であってもよいし、微生物を含有することが不明である食品であってもよいが、発酵食品が好ましい。
発酵食品としては、例えば、納豆、醤油、味噌、テンペ、及び、パン等の穀物加工品;鰹節、塩辛、くさや、鮒ずし、及び、漁醤等の魚介類加工品;漬物、ピクルス、キムチ、ザーサイ、メンマ、及び、ザワークラウト等の野菜類加工品;ヨーグルト、及び、チーズ等の発酵乳;清酒、ワイン、及び、ビール等の酒類;酢;等が挙げられる。
本方法において回収の対象となる微生物は特に制限されないが、菌類、及び、細菌類等が挙げられる。微生物としては特に制限されないが、具体的には、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・コリニフォルミス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ.デルブルッキィ、及び、ラクトバチルス・デルブルッキィ サブスピーシーズ.ブルガリカス等のラクトバチルス属細菌;ストレプトコッカス・サーモフィルス等のストレプトコッカス属細菌;ラクトコッカス・ラクチス、ラクトコッカス・プランタラム、及び、ラクトコッカス・ラフィノラクチス等のラクトコッカス属細菌;ロイコノストック・メセンテロイデス、ロイコノストック・メセンテロイデス サブスピーシーズ.クレモリス、及び、ロイコノストック・ラクチス等のロイコノストック属細菌;エンテロコッカス・フェーカリス、及び、エンテロコッカス・フェシウム等のエンテロコッカス属細菌;等の乳酸菌が挙げられる。
また、微生物としては、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アニマリス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・アンギュラータム、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム、及び、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム等のビフィドバクテリウム属細菌;等も挙げられる。
また、微生物としては、サッカロマイセス・セルビシエ等のサッカロマイセス属;シゾサッカロマイセス属;等の酵母も挙げられる。
なお、対象物は、微生物の1種を単独で含有してもよく、2種以上を併せて含有していてもよい。
本明細書において、「回収阻害因子」とは、典型的には、対象物に含有される夾雑物の一種であり、対象物から微生物を回収しようとする際、微生物と、その他の夾雑物との分離を妨げる物質を意味する。なお、回収阻害因子が微生物の回収を妨げる機序としては、回収阻害因子が回収対象となる微生物に直接作用してその分離、回収を妨げる場合;回収阻害因子の存在により夾雑物が対象微生物の画分に残存し、精製度が低下する場合;等が挙げられる。なかでも、より優れた本発明の効果が得られやすい点で、回収対象の微生物を吸着し、及び/又は、回収対象の微生物と会合する回収阻害因子が好ましい。
より具体的には、回収阻害因子としては、タンパク質、糖質、及び、脂質からなる群から選択される少なくとも一種が好ましく、タンパク質がより好ましい。
本明細書において、発光性カーボンナノワイヤとは、グラフェン、及び、炭素繊維等とは異なり、自身が発光性を有し、主成分として炭素原子を含有するものである。なお、主成分とは、X線光電子分光法を用いて検出される全原子に対するその原子の含有量の含有原子数比が70atm%以上であることを意味し、80atm%以上が好ましく、90atm%以上がより好ましい。
なお、上記「長さ」は、発光性カーボンナノワイヤを走査型電子顕微鏡で観察したとき、50本の発光性カーボンナノワイヤの長径の算術平均を意味する。また、「幅」は、同様の方法で観察したとき50本の発光性カーボンナノワイヤの短径の算術平均を意味する。
なお、発光性カーボンナノワイヤは他の原子の1種を単独で含有してもよく、2種以上を併せて含有していてもよい。発光性カーボンナノワイヤ中に含有される他の原子の含有量は、すでに説明した主成分の測定方法と同様の方法により測定できる。
また、他の形態としては、発光性カーボンナノワイヤは、励起光の波長によらず略同様の波長の光を放射してもよい。
発光性カーボンナノワイヤとしては、公知の製造方法で製造したものを使用することができる。発光性カーボンナノワイヤの製造方法としては特に制限されず、例えば、特開2015-67509号公報、及び、RSC Adv.,2018,8,12907等に記載の方法を用いることができ、上記方法は本明細書に組み込まれる。
なかでも、より優れた本発明の効果が得られる点で、発光性カーボンナノワイヤの製造方法としては、以下の工程をこの順に有することが好ましい。
ワイヤ状の開孔を有する部材の上記開孔内に、上記組成物を配置する工程(以下、「工程2」ともいう。)。
上記開孔内に配置された上記組成物に含有される上記溶媒の少なくとも一部を除去して、発光性ナノカーボンを固結させ、発光性カーボンナノワイヤを合成する工程(以下、「工程3」ともいう。)。
上記部材と上記発光性カーボンナノワイヤとを分離する工程(以下「工程4」ともいう。)。
以下では、上記各工程について詳述する。
工程1は、炭素源化合物、窒素源化合物、及び、水を含有する原料溶液を加熱して、発光性ナノカーボンを得る工程である。
炭素源化合物としては特に制限されないが、例えば、有機酸、糖類、及び、アルコール類等が使用できる。有機酸としては、ヒドロキシ酸が好ましく、ヒドロキシ酸としては、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、ガラクタル酸、キナ酸、グリセリン酸、グルコン酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、及び、没食子酸等が挙げられる。
原料溶液は、炭素源化合物の1種を単独で含有していてもよく、2種以上を併せて含有していてもよい。
より優れた本発明の効果が得られる点で、炭素源化合物としては、有機酸が好ましく、ヒドロキシ酸がより好ましく、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、ガラクタル酸、キナ酸、グリセリン酸、グルコン酸、グルクロン酸、アスコルビン酸、及び、没食子酸からなる群より選択される少なくとも1種が好ましい。
脂肪族アミンとしては、ヘキシルアミン、及び、N,N-ジメチルエチレンジアミン等のモノアミン;エチレンジアミン等のジアミン;等が挙げられる。
芳香族アミンとしては、アニリン、及び、フェニレンジアミン等が挙げられる。
なかでも、より優れた本発明の効果が得られる点で、窒素源化合物としては脂肪族アミンが好ましく、エチレンジアミンがより好ましい。
加熱は、密閉容器中で行ってもよく、この場合、加圧、及び、無加圧のいずれでもよく、反応容器中に原料溶液が均一に存在する条件において、すなわち、気液平衡よりも高い圧力とした均一状態の反応溶液(原料溶液)中において、炭素源化合物と窒素源化合物とを反応させることが好ましい。
工程2は、ワイヤ状の開孔を有する部材の上記開孔内に、発光性ナノカーボンと、溶媒とを含有する組成物を配置する工程である。
溶媒としては特に制限されず、発光性ナノカーボンを分散可能な溶媒であればよく、例えば、水、有機溶媒、及び、これらの混合物が挙げられる。
有機溶媒としては特に制限されず、公知の有機溶媒が使用でき、中でも、水溶性有機溶媒が好ましい。水溶性有機溶媒としては特に制限されないが、アルコール系溶媒等が挙げられる。
組成物中における発光性ナノカーボンの含有量としては特に制限されないが、開孔内に組成物をより配置しやすい点で、90質量%以下が好ましく、50質量%以下がより好ましい。また、下限値としては特に制限されないが、一般に1質量%以上が好ましく、10質量%以上がより好ましい。
部材としてはワイヤ状の開孔を有していれば特に制限されないが、陽極酸化アルミナ膜等を使用可能である。
なお、開孔の形状としては特に制限されず、所望の発光性カーボンナノワイヤの形状に応じて任意に選択されればよく、細孔径としては、例えば、5~450nmであってもよい。
また、部材の厚みとしては特に制限されないが、開孔内に組成物を配置するのがより容易な点で、10~100μmが好ましい。
工程3は、開孔内に配置された組成物に含有される溶媒の少なくとも一部を除去して、発光性ナノカーボンを固結させ、発光性カーボンナノワイヤを合成する工程である。
組成物から溶媒を除去する方法としては特に制限されず、減圧、及び/又は、加熱する方法等が挙げられる。
本工程により、発光性ナノカーボン同士が固着し、開孔の形状に応じた形状を有する発光性カーボンナノワイヤが合成される。
なお、発光性カーボンナノワイヤの安定性は、後述する実施例に記載した方法により測定される発光性カーボンナノワイヤの物性である。
また、加熱温度が350℃以下であると、発光性ナノカーボンの分解がより抑制され、発光性カーボンナノワイヤの収率がより向上する。
工程4は、上記部材と上記発光性カーボンナノワイヤとを分離する工程である。
部材から発光性カーボンナノワイヤを分離する方法としては特に制限されないが、典型的には、部材を分解して、発光性カーボンナノワイヤを取り出す方法が好ましい。部材を分解する方法としては特に制限されないが、部材に熱、及び/又は、光によりをエネルギ付与して分解する方法、及び、部材を溶媒に浸漬させて、溶解させる方法等が挙げられる
なかでも、より容易に発光性カーボンナノワイヤを分離できる点で、部材を溶媒に浸漬させて、溶解させる方法が好ましい。
本発明の実施形態に係る微生物回収方法は、対象物から微生物、及び、会合体からなる群より選択される少なくとも一方を分離する工程と、を有する。
すでに説明したとおり、対象物中においては、回収阻害因子と、発光性カーボンナノワイヤとが会合体を形成しており、遊離した微生物との間で、質量、粒子径、及び、密度からなる群より選択される少なくとも1種に差が生じている。そのため、本工程においてはそれらを利用して両者を分離し、結果的に微生物を回収すればよい。
分離する方法としては特に制限されず、公知の方法が使用できる。例えば、自然に会合体を対象物中において沈降させて、上清を回収する方法、及び、遠心分離して、上清を回収する方法等が挙げられる。上記の場合、上清には、対象物中の微生物が濃縮されている。
1.0gのクエン酸、384μLの1,2-エチレンジアミンを混合し、1mLの超純水に溶解させ原料溶液を調製した。次に、原料溶液をガラスチューブオーブン内に密閉し、240℃で30分間加熱したところ、赤褐色で泡状の固体(発光性ナノカーボン、収量0.9~1g)が得られた。
上記で得られた発光性ナノカーボンを超純水に分散させ、発光性ナノカーボンの含有量が20質量%となるように調整し、組成物を得た。上記組成物を、商品名「アノポア(陽極酸化アルミナ膜、連続孔を有し、細孔径200nm、膜厚は65μmである、部材に該当する)」に含浸させ、60分間維持した。
次に、上記部材を空気雰囲気で、300℃、2時間加熱し、その後、上記部材を3Mの水酸化ナトリウム水溶液に溶解させて、溶解液を得た。次に、上記溶解液を超純水中で3000rpmで3回遠心分離して発光性カーボンナノワイヤを得た。
同様に、450~490nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際には、570nmに発光ピークを有する光を放射し、510~560nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際には、600nmに発光ピークを有する光を放射し、590~660nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際には、675nmに発光ピークを有する光を放射した。
また、360~420nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際の蛍光スペクトルの半値全幅は、100nmであった。
同様に、450~490nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際には、595nmに発光ピークを有する光を放射し、510~560nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際には、600nmに発光ピークを有する光を放射し、590~660nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際には、670nmに発光ピークを有する光を放射した。
また、360~420nmの波長範囲に発光ピークを有する励起光で励起した際の蛍光スペクトルの半値全幅は、160nmであった。
図7からわかるように、発光性カーボンナノワイヤは、発光ピークが長波長側にシフトし、よりブロードであることがわかった。その結果、発光性ナノカーボンの蛍光の色調は青色であるのに対し、発光性カーボンナノワイヤの蛍光の色調は橙色であった。
比較として、RSC Adv.,2018,8,12907のScheme1に記載された方法によってカーボンナノワイヤを合成した。
発光性カーボンナノワイヤと、上記比較カーボンナノワイヤを一晩超純水に浸漬したところ、上記比較カーボンナノワイヤは溶解し始めた一方、発光性カーボンナノワイヤは溶解せず、より優れた安定性を有していることがわかった。
また、工程3における加熱温度を240℃(12時間)とにしたものと比較して、加熱温度を270℃(2時間)とした場合、得られる発光性カーボンナノワイヤはより優れた安定性を有していた。
試料としてヨーグルト(酸性発酵乳に該当する)を準備し、超純水により10倍に希釈して希釈液を得た。次に、上記希釈液の1mLを2000rpm、3分間遠心分離し、上清を除去し、沈殿物に超純水の1mLを加え、再分散させて分散液を得た。
次に、上記分散液の100μLに、発光性カーボンナノワイヤの水分散液(発光性カーボンナノワイヤの含有量:0.0047質量%)の10μLを加えて、撹拌して混合液を得た。次に、上記混合液を遠心分離し、上清を得た。
図8は、市販ヨーグルト試料の光学顕微鏡(ニコンインステック社製「FN-1」)像である。図8によれば、遊離した乳酸菌(a)は少なく、多くはカゼインミセルの集合体に結合している(b)。
Claims (6)
- 微生物、及び、回収阻害因子を含有する対象物と、発光性カーボンナノワイヤとを接触させて、前記回収阻害因子と前記発光性カーボンナノワイヤとの会合体を得る工程と、
前記対象物から前記微生物、及び、前記会合体からなる群より選択される少なくとも一方を分離する工程と、を有する微生物回収方法。 - 前記発光性カーボンナノワイヤは、発光性ナノカーボンを固結させてなる請求項1に記載の微生物回収方法。
- 前記発光性カーボンナノワイヤは、360~420nmの波長範囲内に発光ピークを有する励起光で励起した際に、500~650nmの波長範囲内に発光ピークを有する光を放射する、請求項1又は2に記載の微生物回収方法。
- 前記対象物が酸性発酵乳である、請求項1~3のいずれか1項に記載の微生物回収方法。
- 前記回収阻害因子がタンパク質である、請求項1~4のいずれか1項に記載の微生物回収方法。
- 界面の少なくとも一部が互いに固着した発光性ナノカーボンからなり、360~420nmの波長範囲内に発光ピークを有する励起光で励起した際に、500~650nmの波長範囲内に発光ピークを有する光を放射する、微生物回収用発光性カーボンナノワイヤ。
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