JP7119273B2 - 炎症性もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための、または腸の健康を維持するための組成物 - Google Patents
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- G01N2333/335—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Lactobacillus (G)
Description
<2> 前記βグルカンが、分子量1K~10Kのβグルカンである、<1>に記載の特定乳酸菌増殖促進剤。
<3> 前記βグルカンが、β(1→3)グルカンである<1>または<2>に記載の特定乳酸菌増殖促進剤。
<4> <1>~<3>のいずれか1に記載の乳酸菌増殖促進剤を含有する、制御性T細胞増加剤。
<6> 前記βグルカンが、分子量1K~10Kのβグルカンである、<5>に記載の特定乳酸菌の増殖促進方法。
<7> 前記βグルカンが、β(1→3)グルカンである<5>または<6>に記載の特定乳酸菌の増殖促進方法。
<8> <1>~<3>のいずれか1に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を対象に投与すること、を含む制御性T細胞の増加方法。
<10> <9>に記載の特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法であって、(1)<1>~<3>のいずれか1に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与される前の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、および、(2)<1>~<3>のいずれか1に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された後の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、とを含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。
<11> <1>~<3>のいずれか1に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性T細胞数を測定すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。
<12> <11>に記載の特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法であって、(1)<1>~<3>のいずれか1に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与される前の対象から採取した試料中における制御性T細胞数を測定すること、および、(2)<1>~<3>のいずれか1に記載の特定乳酸菌増殖促進剤を投与された後の対象から採取した試料中における制御性T細胞数を測定すること、とを含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法。
<13> <4>に記載の制御性T細胞増加剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む制御性T細胞増加効果の評価方法。
<14> <13>に記載の制御性T細胞増加効果の評価方法であって、(1)<5>に記載の制御性T細胞増加剤を投与される前の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、および、(2)<5>に記載の制御性T細胞増加剤を投与された後の対象から採取した試料の微生物叢を解析し、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、とを含む制御性T細胞増加効果の評価方法。
本発明の一つの態様によれば、分子量0.2K~50Kのβグルカンが特定乳酸菌の増殖を促進する作用を有すること、特定乳酸菌の増殖が制御性T細胞を上方制御し、炎症性腸疾患を抑制する活性を有することが初めて明らかにされた。これに基づいて、(1)分子量0.2K~50Kのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤、(2)特定乳酸菌増殖促進剤を含有する、制御性T細胞増加剤、(3)分子量0.2K~50Kのβグルカンを対象に投与することを含む特定乳酸菌の増殖促進方法、(4)分子量0.2K~50Kのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を対象に投与することを含む制御性T細胞の増加方法、(5)分子量0.2K~50Kのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法、(6)分子量0.2K~50Kのβグルカンを含有する特定乳酸菌増殖促進剤を投与された対象から採取した試料中における制御性T細胞数を測定すること、を含む特定乳酸菌増殖促進効果の評価方法、(7)分子量0.2K~50Kのβグルカンを含有する制御性T細胞増加剤を投与された対象から採取した試料の微生物叢を解析すること、および、全細菌に対する特定乳酸菌の割合を算出すること、を含む制御性T細胞増加効果の評価方法、(8)ラクトバチルス・ムリヌス(Lactobacillus murinus)、ラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、またはラクトバチルス属に属しラクトバチルス・ムリヌス(Lactobacillus murinus)もしくはラクトバチルス・サリバリウス(Lactobacillus salivarius)との間の16S rDNAのホモロジーが90%以上である細菌の細胞を含む、制御性T細胞増加剤、が提供される。
例えば、(2)で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合が、(1)で算出した全細菌に対する特定乳酸菌の割合を引いた値が統計学的に有意に増加していれば、当該対象において分子量0.2K~50Kのβグルカンの投与による特定乳酸菌増殖促進効果があったと評価してもよい。統計学的方法としては、一般的に用いられる方法のいずれも用いることができる。例えば、ステューデントt検定等が挙げられる。
Clec7a-/-マウスはDSS誘発性大腸炎に対して抵抗性を示す
デクチン-1は、リンパ球よりもDCおよびMΦ(マクロファージ)などの骨髄細胞で発現していた(図8A)。大腸におけるこの分子の発現は、DSS投与後にTNFの発現と共に著しく上方制御されていた(図8Bおよび図8C)デクチン-1の同様の上方制御はまたIBD患者で観察されており(de Vries et al., 2009)、デクチン-1が腸の炎症性疾患に関与していることが示唆される。次に、Clec7a-/-マウスのDSS誘発性急性大腸炎に対する感受性を調べた。生理的条件下で、Clec7a-/-マウスの大腸の長さは正常であった(図8D)。Clec7a-/-の大腸固有層(cLP)において、Th1細胞ではなくTh17細胞の割合は野生型マウスより顕著に低かったが(図8E)、Th17細胞数は野生型マウスとClec7a-/-マウスで同様であった(図8F、1.5~3.5×102個のTh17細胞/大腸)。IL-23の主要産生細胞であるCD11c-内在的cLP細胞の数および割合は、無感作の野生型マウスとClec7a-/-マウスで同様であった(図8Gおよび図8H)。
イーストなどのβグルカン成分を含む通常のマウス飼料として、食品由来βグルカンがDSS誘発性大腸炎をデクチン-1の活性化を介して促進する可能性について調べた。通常の固形飼料の代わりにβグルカンを含まない合成飼料をマウスに継続的に与えた後、大腸炎を誘導した。図10A~図10Dに示すように、Clec7a-/-マウスはDSS投与後に依然として長期間生存し、体重減少および疾患活性が非常に軽度であり、TNF産生が野生型マウスと比べて減少した。これらの観察により、食品中のβグルカンは、デクチン-1により促進される腸炎症の直接的な原因ではないことが示唆される。
次に、PP調製物および糞便調製物由来のDNAの16S細菌リボソームDNA配列の分析により、マウス腸内微生物叢を野生型マウスとClec7a-/-マウスで比較した。共生細菌の主要な門は、約80%のファーミキューテス門、10%のバクテロイデス門、2~3%のプロテオバクテリア、およびその他であって、Clec7a-/-微生物叢と野生型微生物叢で同様であった(図2A)。しかし、グラム陽性細菌のグラム陰性細菌に対する比率は、Clec7a-/-マウスにおいて野生型マウスに比べて1.5倍高かった(図2B)。特に、Clec7a-/-マウスの糞便微生物叢およびPP微生物叢の両方において、ファーミキューテス門に属するラクトバチルスの割合が野生型マウスと比べて著しく増加していた(図2C)。ファーミキューテス門に属するクロストリジウムの頻度は、Clec7a-/-マウスと野生型マウスで同様であった(図2D)。16S細菌rDNAの総量は野生型マウスとClec7a-/-マウスの糞便で同様であったが、ラクトバチルスrDNAの割合はClec7a-/-マウスで野生型マウスの4~5倍高かった(図11A)。さらに、Clec7a-/-マウスの糞便微生物叢における主要な株として、ラクトバチルス・ムリヌス(L.murinus)NBRC14221株を同定し、これは、野生型微生物叢では<1%であるのに対し、ラクトバチルス・ムリヌスが>10%を構成していた(図2E)。これらの観察から、このラクトバチルス株の割合がデクチン-1シグナル伝達により制御され、この共生細菌がDSS誘導性大腸炎に対する感受性に影響し得ることが示唆された。
大腸炎マウスだけではなく未処理マウスにおいても、Clec7a-/-マウスのcLPにおいてCD4+Foxp3+Treg細胞集団が野生型マウスと比較して顕著に増大していることが見出された(図2F)。さらに、T-betではなくRORγtの大腸における発現が、Clec7a-/-マウスおよびRag2-/-Clec7a-/-マウスの両方で顕著に増加していた(図2G)。Foxp3およびRorcの発現誘導に重要である(Fontenot et al., 2003; Hori et al., 2003; Ivanov et al., 2006; Mangan et al., 2006)TGF-βの発現もまた、Clec7a-/-マウスおよびRag2-/-Clec7a-/-マウスの両方で顕著に高かった(図2H)。
Clec7a-/-マウスにおいて増加したラクトバチルス・ムリヌスが直接Treg細胞分化を誘導する可能性を調べるため、無菌マウスにラクトバチルス・ムリヌスを5週間生着させT細胞集団を分析した。cLP中のFoxp3+Treg細胞およびIL-10+Tr1細胞がともにラクトバチルス・ムリヌス生着後に顕著に増加したが(図3A、図3C)、アルカリゲネス・フェカリス(A.faecalis)を生着後には増加しない(図3B)ことが見いだされた。興味深いことに、INF-γ産生Th1細胞ではなく、IL-17産生Th17細胞もまたラクトバチルス・ムリヌスの生着により顕著に増大した(図3D)。ラクトバチルス・ムリヌスで感作したT細胞におけるIL-10およびIL-17の産生はまた、ex vivoで確認された(図3E)。これらの知見は、デクチン-1シグナル伝達の抑制によりラクトバチルス集団が上方制御されて大腸における制御性T細胞集団が増加し、その結果、腸炎症が抑制されることを示唆している。
腸骨髄細胞で産生されるTGF-βは、ナイーブT細胞におけるFoxp3発現の誘導によるTreg細胞分化において重要な役割を果たしている(Siddiqui and Powrie, 2008; Worthington et al., 2011)。最近の研究により、腸に常在するDCまたはMΦ(マクロファージ)の病原性微生物に対する応答は、骨髄由来DC、脾臓DC、または脾臓MΦ(マクロファージ)の応答とは異なることが示されている(Franchi et al., 2012; Ueda et al., 2010)。ラクトバチルス・ムリヌスが大腸においてTGF-βを誘導する可能性について調べるため、cLPまたは脾臓からDC+MΦ(マクロファージ)を精製し、これらを典型的なマウス腸内共生微生物叢であるラクトバチルス・ムリヌス、アルカリゲネス・フェカリス、または大腸菌(E.coli)K12と12時間共培養した。大腸抗原提示細胞(APC)におけるTgfbおよびIl10のmRNA発現がラクトバチルス・ムリヌスの刺激により著しく上方制御されていたが、アルカリゲネス・フェカリスまたは大腸菌の刺激では上方制御されなかった(図4A)。これら3種の共生細菌はいずれも大腸APCにおけるThf、Il6、またはIl1bの発現を上方制御せず(図4A)、これらの炎症性サイトカインが著しく誘導された脾臓APCとは明らかに対照的である(図13)。全cLP細胞をこれらの共生細菌と共培養すると、アルカリゲネス・フェカリスまたは大腸菌ではなくラクトバチルス・ムリヌスがFoxp3およびRorcの発現を誘導したが、Tbx21の発現は誘導せず(図4B)、in vivoでのラクトバチルス・ムリヌス生着後にTreg細胞およびTh17細胞が増大したがTh1細胞は増大しなかったことと一致している(図3)。これらの観察により、共生ラクトバチルス・ムリヌスがcLPのAPCにおいてTGF-βおよびIL-10を特異的に誘導し、続いてTreg細胞およびTh17細胞の分化が促進されることが示唆される。
抗菌ペプチド(AMP)は腸上皮細胞、パネート細胞、および自然免疫細胞から分泌される低分子量タンパク質であり、細菌およびその他の微生物に対して幅広い抗菌活性を有する(Gallo and Hooper, 2012)。S100Aファミリーのメンバー、特にS100A8-S100A9ヘテロダイマーは、ブドウ球菌の抑制に効果的であり(Corbin et al., 2008)、Reg3γまたはReg3βなどのReg3ファミリーメンバーおよびホスホリパーゼはグラム陽性菌を特異的に死滅させる(Cash et al., 2006; Lehotzky et al., 2010; Qu and Lehrer, 1998)。Clec7a-/-マウスの大腸におけるS100a8の発現が野生型と比べて特異的に低いことが見出された(図5A)。しかし、Rag2-/-Clec7a-/-マウスの大腸では、S100a8の発現に加えて、Reg3b、Reg3g、およびPla2g2a(ホスホリパーゼA2をコード)などのその他のAMPの発現レベルがRag2-/-マウスの大腸と比べて顕著に低下していた(図14Aおよび図14C)。Rag2-/-Clec7a-/-マウス大腸由来の精製上皮細胞におけるReg3bおよびReg3gの発現もまた、顕著に低下していた(図14B)。
シグナルを伝達することなくデクチン-1に競合的に結合する短鎖βグルカンであるラミナリン(Huang et al., 2012; Maneu et al., 2011)のDSS誘導性大腸炎の発症に対する効果を評価した。最初に、ラミナリンが炎症性サイトカインの誘導においてTLRリガンド除去ザイモサン活性化デクチン-1シグナル伝達を阻害可能であることを確認した(図6A)。全ラミナリン混合物を異なった分子量(MW)のグルカンに分画することにより、分子量が約1000~10,000であるラミナリンがデクチン-1を介したサイトカイン産生を阻害する特に高い活性を有することを同定した(図15B)。DSS処理の3日前からラミナリンを継続的に投与すると、体重減少が防止されコントロール群と比較して大腸炎の重症度が軽減された(図6B~図6D)。LPにおける好中球および炎症性CD103-DCの浸潤ならびにTNF産生もまた、ラミナリン処理マウスで顕著に抑制された(図6Eおよび図6F)。cLP細胞によるIL-10産生は顕著に増大し(図6F)、Foxp3+Treg集団がラミナリン投与後に大幅に増大した(図6Gおよび図6H)。ラミナリン投与9日後、糞便中のラクトバチルス・ムリヌスの割合はコントロール群と比較して顕著に増加し(図6I)、Clec7a-/-マウスにおけるラクトバチルス・ムリヌス集団の増大と一致していた(図2C、図2E、図11A、図12C)。無菌マウスにラクトバチルス・ムリヌスを生着させたマウスは、アルカリゲネス・フェカリス生着マウスと比較して顕著に軽度の大腸炎を示し(図16Aおよび図16B)、熱殺菌ラクトバチルス・ムリヌスでマウスを経口的に前処理してもDSS誘導性大腸炎の症状を抑制することが可能であった(図16Cおよび図16D)。したがって、これらの知見は、デクチン-1シグナル伝達の阻害により、腸内のラクトバチルス・ムリヌスの割合の増加を介したTreg集団の増大によって大腸炎の発症を阻害可能であることを示している。
ヒト糞便におけるラクトバチルス・ムリヌス(NBRC14221)または近縁種の存在を調べた。16S rDNAの核酸配列を比較することにより、キムチの生産に使用される最も普及しているラクトバチルスの一種である(Nam et al., 2011)ラクトバチルス・アニマリス(L.animalis、KCTC3501株、NBRC15882)が、ラクトバチルス・ムリヌスと99.7%の相同性を有することを見出した。さらに、TGF-β産生またはCD25+CD4+T細胞分化を誘導する(Castellazzi et al., 2007; O'Mahony et al., 2006)ラクトバチルス・サリバリウス(L.salivarius、NBRC102160)が、ラクトバチルス・ムリヌスと94.2%の相同性を有することを見出した。各株に特異的なプライマーを使用することで、ヒト糞便中にはラクトバチルス・ムリヌス集団はほとんど存在しないが(図7A、全ラクトバチルス中、約0.00001%)、近縁種(94.2%のrDNA相同性)であるラクトバチルス・サリバリウスがマウスおよびヒト両方の糞便中で検出可能であった(図7B)。興味深いことに、ラクトバチルス・アニマリスではなくラクトバチルス・ムリヌスのみがTGF-βおよびIL-10の発現を100倍超上方制御し、Foxp3の発現を8倍上方制御することが見出された(図7C)。ラクトバチルス・サリバリウスもまたTgfbおよびIl10を10倍超誘導した(図7C)。ラクトバチルス・ムリヌスおよびラクトバチルス・アニマリスはRorcの発現を誘導したが、ラクトバチルス・サリバリウスは誘導しなかった(図7C)。Clec7a-/-マウスの糞便中で過剰発現しているラクトバチルス・ジョンソニーおよびラクトバチルス・ロイテリ(図2E)では、これらの遺伝子の発現は変化しなかった(図7C)。
今回の報告では、Clec7a-/-マウスがDSS誘導性大腸炎に対して抵抗性を有することを示した。これはTreg細胞集団がClec7a-/-マウスのcLPにおいて増大していることが原因である。Treg細胞集団の増大は腸内微生物叢中のラクトバチルス・ムリヌスにより誘導され、Clec7aシグナル伝達の欠損により、S100AなどのAMPの発現の下方制御によって腸でのラクトバチルス・ムリヌスの増殖が可能になる。さらに、ラミナリンでデクチン-1シグナル伝達を阻害することにより、腸におけるラクトバチルス・ムリヌスが同様に増殖し、Treg細胞の増大を介してDSS誘導性大腸炎の発症抑制が可能であることが示された。
すべての実験手順は、拡張実験手順に詳細に記載される。
Clec7a-/-マウスの予備的特性評価はすでに述べた(Saijo et al., 2007)。マウスはC57BL/6Jマウスに9世代戻し交配した後に実験に用いた。年齢および性別を一致させたC57BL/6Jマウス(日本クレア株式会社、川崎)を同じマウス室で3~4週間飼育した後にコントロールとして使用した。Rag2-/-Clec7a-/-マウスを作製するため、BALB/cAマウスに10世代戻し交配したClec7a-/-マウスを、BALB/cAバックグラウンドのRag2-/-マウス(京都大学 眞貝洋一博士より提供)と交配した。すべてのマウスは、東京大学医科学研究所システム疾患モデル研究センターおよび東京理科大学生命科学研究所において、特定病原体未感染条件下で環境制御された無菌室で維持した。実験は施設の動物実験倫理指針および遺伝子操作実験安全指針に従って実施し、施設の委員会により承認された。
マウスから糞便を回収し、QIAamp DNA stool Mini Kit(キアゲン社、ドイツ、ヒルデン)を用いて取扱説明書に従って糞便微生物叢の全DNAを単離した。糞便中の細菌rDNAおよび真菌rDNAの定量には、20ngの全糞便DNAをリアルタイムRT-PCR解析のテンプレートとして用いた。表1に示す細菌または真菌に対するプライマーを使用した。相対量はΔCt法により計算し、全DNA量またはマウスβ-アクチン量で標準化した。
生存率の差はログランク検定(マンテル・コックス検定)で評価した。疾患活性指数および組織学的スコアは、マンホイットニーのU検定を用いて統計的に解析した。パラメトリックデータの差は、スチューデントt検定により評価した。p<0.05の差を統計的に有意であるとみなした。
補足データには、拡張実験手順、8つの図、1つの表、および1つの参考文献が含まれ、本論文とともにオンラインで検索可能である。
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DSS誘導性大腸炎
DSSによる急性大腸炎の誘導のため、2%または4%(重量/体積)のDSS(分子量36~50kDa、MPバイオメディカルズ、フランス、イルキルシュ)をマウスに飲料水投与した。大腸炎の程度を評価するために、体重、糞便の硬さ、および血便をCooperらの方法(Cooper et al., 1993)の改変法を用いて毎日モニターした。下痢は以下のようにスコア化した。0:正常、2:軟便、4:水様下痢。血便は以下のようにスコア化した。0:正常、2:わずかな出血、4:肉眼的な出血。体重減少は以下のようにスコア化した。0:なし。1:1~5%、2:5~10%、3:10~15%、4:>15%。疾患活性指数はこれらのスコアの平均、すなわち、(体重減少、糞便の硬さ、および出血を合わせたスコア)/3である。マウスは、11日目または12日目に屠殺した。盲腸および大腸を取り出し、細胞培養、フローサイトメトリー(FCM)、および組織学的検査のために切片を調製した。
ラクトバチルス・ムリヌス(NBRC14221)、ラクトバチルス・アニマリス(NBRC15882)、ラクトバチルス・サリバリウス(NBRC102160)、ラクトバチルス・ジョンソニー(NBRC13952)、ラクトバチルス・ロイテリ(NBRC15892)、アルカリゲネス・フェカリス(NBRC13111)、大腸菌(NBRC102203)、およびカンジダ・トロピカリス(NBRC1400)は、製品評価技術基盤機構生物遺伝資源センター(日本、292-0818、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)から直接入手した。括弧内のNRBC番号は、寄託番号を表す。ラクトバチルスは、嫌気性条件下、ラクトバチルスMRS培地で培養し、MRC寒天上でコロニーを形成させた。アルカリゲネスおよび大腸菌は、好気性条件下、液体または固形のLB基本培地で培養した。カンジダ・トロピカリスまたはカンジダ・トロピカリス+糞便溶解物混合物は、好気性条件下、クロムアガー(登録商標)カンジダプレートまたはサブローデキストロース培地で培養した。すべての微生物は37℃で培養した。すべての培養液はBD社(米国、メリーランド州)から購入した。
CLP細胞は前述の方法をわずかに改変して用いて単離した(Arstila et al., 2000)。すなわち、腸片を2mm片に切り分けた後、3mM EDTAを含むリン酸緩衝食塩水中で各15分間、37℃で2回撹拌し、1%ウシ胎児血清(FBS)、1mM EGTA、および1.5mM MgCl2を含むRPMI(シグマケミカル社、米国、ミズーリ州、セントルイス)中で各20分間、2回撹拌した。その後、腸片を回収し、20%FBS、200U/mlコラゲナーゼ(C2139、シグマアルドリッチ社)、および5U/ml DNase1(シグマアルドリッチ社)を含むRPMI中、37℃で120分撹拌した。培養後、試料を1分間ボルテックスし、滅菌ガーゼ濾過後に単一細胞懸濁液を回収した。いくつかの実験では、45%/66.6%不連続パーコール(ファルマシア社、スウェーデン、ウプサラ)勾配上、2200rpm、20分間で、LP細胞をLPリンパ球にさらに精製した。
抗CD3抗体(145-2C11)、抗CD4抗体(RM4-5)、および抗IL-17A抗体(TC11-18H10)は、BDバイオサイエンス社(米国、フランクリンレイクス)から入手し、抗IFN-γ抗体(XMG1.2)、抗IL-10抗体(JES5-16E3)、抗Foxp3抗体(150D/E4)、抗Gr-1抗体(RB6-8C5)、抗CD11b抗体(M1/70)、抗CD11c抗体(N418)、抗CD103抗体(2E7)、抗F4/80抗体(BM8)、抗CD25抗体(PC61.5)、および抗MHC class II抗体(M5/114.15.2)は、eバイオサイエンス社(米国、サンディエゴ)から入手した。2.4G2(抗FCγRII/III特異的マウス抗体、ラットIgG1、産生ハイブリドーマ)は、アメリカ培養細胞系統保存機関(バージニア州、マナッサス)から入手した。すべての抗体は、1:100希釈で使用した。CantoIIフローサイトメーターまたはFACSCaliburフローサイトメーター(BDバイオサイエンス社)、およびCellQuestソフトウエア(BDバイオサイエンス社)またはFlowJo FACSソフトウエアを解析に用い、FACS AriaII(BDバイオサイエンス社)を細胞選別に用いた。
CLP細胞(2×105)を抗CD3(17A2)抗体(バイオレジェンド社、米国、サンディエゴ)を加えずに、または該抗体とともに、48時間、37℃、5%CO2で、96ウエル平底プレート(ファルコン、ベクトン・ディッキンソン社、英国、オックスフォード)中、0.2mlの10%FBS含有RPMI中で培養した。48時間培養後、培養上清を回収し、サイトカイン濃度をマウスTNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p40(OptiEIAキット、BD PharMingen社、米国、フランクリンレイクス)、ならびにIL-17、IL-17F、IFN-γ、およびIL-10(R&Dシステムズ社、米国、ミネアポリス)に対する酵素結合免疫吸着測定(ELISA)発色キットで測定した。
全RNAは、Mammalian Total RNA Miniprep kit(シグマアルドリッチ社、米国、セントルイス)を用いて取扱説明書に従って抽出した。RNAをオリゴdTプライマーの存在下で変性した後、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(アプライドバイオシステムズ社、米国、サンフランシスコ)で逆転写した。定量的リアルタイムRT-PCRはSYBR Green qPCR kit(米国、カールスバッド)およびiCycler system(バイオラッド社、米国、ハーキュリーズ)で、表1に記載のプライマーセットを用いて行い、サイトカインをコードする各mRNAの発現をgapdh発現レベルで標準化した。
16S rDNAは、抽出DNAから細菌ユニバーサルPCRプライマーであるBact-27F(5’-AGRGTTTGATYMTGGCTCAG-3’)およびBact-1492R(5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’)を用いて増幅した。以下の反応条件を用いた。全量50μl中に、2.5μlの10×PCR buffer(タカラバイオ株式会社、日本、大津)、2.5μlのdNTP(25 mM、タカラバイオ株式会社)、0.5μlのプライマー(各10pmol/μl)、0.1μlのExTaq DNA polymerase(5U/μl、タカラバイオ株式会社)、0.5μlのテンプレートDNA、および18.4μlのDNaseフリー水。PCRは、T1 Thermal cycler(バイオメトラ社)を用いて行った。以下のサイクルパラメーターを用いた。96℃で30秒間の初期変性後、20サイクルの変性(96℃で30秒間)、アニーリング(56℃で20秒間)、および伸長(68℃で90秒間)、ならびに72℃で10分間の最終伸長。全10試料からの増幅産物は、1μlのPCR反応混合液を用いたゲル電気泳動により1.0%アガロースゲルで確認した。PCR産物はpCR-4-TOPOベクター(インビトロジェン)にクローニングし、シークエンス用TOPO-TAクローニングキット(インビトロジェン)を用いてDH12Sコンピテント大腸菌を形質転換した。各細菌PCR産物から96コロニーをランダムに単離した。配列決定テンプレートはプライマーとしてM13F(5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’)およびM13R(5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’)を用いてコロニーPCRにより調製した。その後、PCR産物をエクソヌクレアーゼIおよびエビアルカリフォスファターゼ(GEヘルスケア社)で処理した。挿入断片の16S配列は、サイクルシークエンス法により、BigDye Terminator(アプライドバイオシステムズ社)、ならびに3.2pmolのTシークエンスプライマー7(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)、T3シークエンスプライマー(5’-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3’)、およびBact-357Fシークエンスプライマー(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)を用いて決定した。DNAをエタノール沈殿により洗浄し、自動ABI3730キャピラリーシクエンサー(アプライドバイオシステムズ社)で泳動した。各クローンのデータは、Phred-Phrapプログラムでアセンブルした。Phrapでアセンブルした配列は、Clustalw解析でアライメントし、マルチプルアライメント配列を全配列の距離行列に対して計算した。DOTURを用いて操作上の分類単位(OTU)計算を行い、全典型的OTU配列をNCBI BLASTのリボソームデータベースプロジェクトII(RDP)データベースの16S rRNA配列とアライメントした。
ラクトバチルス・ムリヌスまたはアルカリゲネス・フェカリスは、組み換えS100A8+S100A9(1:1混合物、各ペプチド5mg/ml)の存在下、嫌気性環境下、37℃で9時間培養し、NanoDrop2000c分光計(サーモフィッシャーサイエンティフィック社、日本、横浜)で細菌増殖を測定した。
脾臓またはリンパ節からの細胞をビオチン結合抗CD-25、抗CD8α、抗B220、抗CD11c、抗CD11b、抗DX5、γδTCR、および抗MHC class IIマウス抗体で標識し、続いて抗ビオチンマイクロビーズで標識した。autoMACSを用いてCD4+T細胞を陰性精製した後、FITC 抗CD25マウス抗体、PE 抗CD45RBマウス抗体、およびAPC 抗CD4マウス抗体で染色した。CD25-CD45RBhighCD4+ナイーブT細胞をFACS AriaII(BDバイオサイエンス社)で選別し、レシピエントマウスにマウス1匹当たり4×105個の細胞で静脈内(i.v.)養子移植を行った。
PPは、SPF条件の野生型マウスまたはClec7a-/-マウスの小腸から単離した。70%エタノールで2分間処理後、5個のPPをPBSで2回洗浄し、スライドグラスを用いてPBS中で破砕し、レシピエント無菌マウスの胃腸管に移植した。3日後、1%DSSを飲料水投与した。大腸管腔由来の微生物叢の場合、SPF条件マウスの糞便5粒をPBS中で滅菌ガラス棒を用いて粉砕し、2分間激しくボルテックスして100mmメッシュのナイロンフィルターで濾過した。次に回収した上清を4℃で、5000×g、10分間遠心分離し、沈査をさらにPBSで2回洗浄した。単一の細菌細胞懸濁液を無菌マウスに移植し、3日後に2%DSSを飲料水投与した。
ラミナリン混合物(東京化成工業株式会社、日本、東京)を蒸留水(100mg/ml)中に溶解し、各透析膜(分子量カットオフ:1000、3500、10000、50000、スペクトラムラボラトリーズ社)で、4℃、2日間、蒸留水に対して透析した。透析後、異なった分子量を有する透析された内部液を回収して凍結乾燥した。
チオグリコール酸培地は日水製薬株式会社(日本、東京)から購入した。アラメ由来のラミナリンは東京化成工業株式会社(日本、東京)から購入した。カードラン(β-1,3-グルカン)は和光純薬工業株式会社(日本、大阪)から購入した。TLRリガンド除去ザイモサン(D-ザイモサン、熱アルカリ処理済み出芽酵母細胞壁)はインビトロジェン社(米国、カリフォルニア、サンディエゴ)から入手した。
以下のリアルタイムRT-PCRプライマーを用いた。
GATGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAACTTCTTTATCACCGAGTGCTTGCACTCACCGATAAAGAGTTGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCAAAAGAGGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCATAACCATAGTTACCGCATGGTAACTATGTAAAAGGTGGCTATGCTACCGCTTTTGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCTTACCAAGGCAATGATGCGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGGGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACCCTGTTGTTAGAGAAGAAAGTGCGTGAGAGTAACTGTTCACGTTTCGACGGTATCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGACAATCCTAGAGATAGGACTTTCCCTTCGGGGACAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGCAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCAAGACCGCGAGGTTTAGCAAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAG
GACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAACGAAACTTTCTTACACCGAATGCTTGCATTCANCGTAAGAAGTTGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTAAAAGAAGGGGATAACACTTGGAAACAGGTGCTAATACCGTATATCTCTAAGGATCGCATGATCCTTAGATGAAAGATGGTTCTGCTATCGCTTTTAGATGGACCCGCGGCGTATTAACTAGTTGGTGGGGTAACGGCCTACCAAGGTGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGAGAAGAACACGAGTGAGAGTAACTGTTCATTCGATGACGGTATCTAACCAGCAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGGGAACGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGTAGTGCATTGGAAACTGGAAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGTTCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCAATAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTTTGACCACCTAAGAGATTAGGCTTTCCCTTCGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTGTCAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTGGCGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTTAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGAATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGTCTAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAG
Claims (6)
- 活性成分として、分子量1.0K以下のβ-1,3結合を有するβグルカンを含む、炎症性腸疾患もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための組成物であって、前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎もしくはクローン病であり、前記アレルギー性の疾患もしくは症状が食品アレルギー又は花粉症である、組成物。
- 前記βグルカンが水溶性である、請求項1に記載の組成物。
- 分子量1.0K以下のβ- 1,3結合を有するβグルカン混合物を含む、炎症性腸疾患もしくはアレルギー性の疾患もしくは症状を予防、治療もしくは改善するための組成物であって、前記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎もしくはクローン病であり、前記アレルギー性の疾患もしくは症状が食品アレルギー又は花粉症である、組成物。
- 医薬組成物である、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記医薬組成物が経口医薬組成物である、請求項4に記載の組成物。
- 食品組成物である、請求項1~3のいずれか一項に記載の組成物。
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