JP7107497B2

JP7107497B2 - Ｄｎａ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体

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Publication number: JP7107497B2
Application number: JP2018028157A
Authority: JP
Inventors: 俊雄森; 重樹杉浦; 由美 ▲高▼木
Original assignee: Public University Corp Nara Medical University
Current assignee: Public University Corp Nara Medical University
Priority date: 2018-02-20
Filing date: 2018-02-20
Publication date: 2022-07-27
Anticipated expiration: 2038-02-20
Also published as: JP2019142804A

Description

本発明は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）上の酸化的損傷部位に含まれるアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）に特異的に結合する抗体ならびにその抗原結合断片に関する。

細胞中のＤＮＡは、放射線などの外部因子や内部因子による活性酸素からの攻撃を受け、鎖切断、８－オキソデオキシグアニン構造の形成、およびサイクロプリン構造の形成など様々なＤＮＡ損傷を生じる。これらのＤＮＡ損傷は、老化、神経障害、およびがんなどの発症原因となる。例えば、色素性乾皮症Ａ群は常染色体劣性遺伝病であり、ＤＮＡ損傷修復機構の一つを欠損する。色素性乾皮症Ａ群が発症する進行性の神経障害は、ＤＮＡ鎖上のサイクロプリンの蓄積による神経細胞死と関連すると考えられている。

ＤＮＡ鎖上の酸化的損傷部位に含まれるサイクロプリンは、活性酸素が引き起こすＤＮＡ損傷の一つのグループの総称である。サイクロプリンは、ＤＮＡ鎖上のアデノシン部位に形成されるアデノシン型サイクロプリン、すなわち、８，５’－サイクロ－２’－デオキシアデノシン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）と、ＤＮＡ鎖上のグアノシン部位に形成されるグアノシン型サイクロプリン、すなわち、８，５’－サイクロ－２’－デオキシグアノシン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＧ）に大別される。それぞれに５’Ｒと５’Ｓの立体異性体が存在するため、下記の化学式に示すように、４つの異なる構造が存在する。

現在、これら４種類のサイクロプリンを最も高感度・高精度に検出・定量できるのは、液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）である。しかしながら、サイクロプリン構造の検出・定量にＬＣ－ＭＳ／ＭＳを用いるには、ＤＮＡサンプルをモノヌクレオチドまで完全に分解するという極めて困難な作業が必須となる。またＤＮＡサンプルの抽出時点で組織サンプルを破壊してしまい、組織サンプル中のＤＮＡ損傷部位を視覚化することができない。

組織サンプル中のＤＮＡ損傷部位を視覚化するためには、ＤＮＡサンプルの抽出の必要がない特異的結合分子が利用できればよい。特異的結合分子の常套手段として、抗体の作製が考えられるが、ＤＮＡ鎖上のサイクロプリンに対する抗体の作製は長らく困難であった。

ＤＮＡ鎖上のサイクロプリンに対する抗体を採ろうとする試みの初見は、非特許文献１である。非特許文献１には、サイクロプリンのモデル化合物８，５’－サイクロアデノシン－５’－モノホスフェート（８，５’－ｃｙｃｌｏ－ＡＭＰ）に対するポリクローナル抗体が作製されたことが示されている。しかしながら、ポリクローナル抗体は混合物であり、抗原特異性には問題があった。また、ＤＮＡ鎖上のサイクロプリンの検出もできていない。

非特許文献２には、５’Ｒおよび５’Ｓの両異性体を含むアデノシン型サイクロプリン、すなわち、８，５’－サイクロ－２’－デオキシアデノシン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を認識するマウスモノクローナル抗体を作製したと報告されているが、物質としての詳細が明らかでない。非特許文献２では、更に、該抗体を酵素標識免疫法（ＥＬＩＳＡ）に応用し、Ｘ線照射やフェントン反応処理したＤＮＡ鎖上にＣｙｃｌｏ－ｄＡが形成されることを見出しているが、該抗体はＬＣ－ＭＳ／ＭＳと比べても検出感度が１～２桁低く、検出・定量に用いるには難があった。

ＲａｄｉａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ１０４，２７２－２８３（１９８５）ＰｈｏｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＰｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，９０：８２９-８３６

以上のように、ＤＮＡ鎖の酸化的損傷部位に含まれるサイクロプリンの検出・定量には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳしか手段がなく、煩雑で、かつ、組織サンプルを破壊してしまうという課題があった。また、アデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を特異的に認識する公知のモノクローナル抗体は、感度が低すぎてＬＣ－ＭＳ／ＭＳの代替手段とはならなかった。本発明は、組織サンプルから破壊的にＤＮＡサンプルを抽出したり、モノヌクレオチドまで完全に分解することが必須ではなく、かつ、公知の抗体よりも感度が高く簡便に使用することができる、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）に特異的に結合するモノクローナル抗体ならびにその抗原結合断片を提供することを主な目的とする。

本発明者らは、上記の課題を解決すべく、鋭意研究した結果、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する新規なモノクローナル抗体を作製することに成功した。さらに、かかる抗体は、公知の抗体よりも感度が高いことが示された。

すなわち、本発明は、
［１］それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、
ＶＨ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ（配列番号１）であり、
ＶＨ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ（配列番号２）であり、
ＶＨ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ（配列番号３）であり、
ＶＬ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧｌｎ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－（配列番号４）であり、
ＶＬ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列がＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ（配列番号５）であり、
ＶＬ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列がＰｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ（配列番号６）である、
ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、あるいは配列番号１、３、４および６からなる群から選択される１以上のアミノ酸配列において１～３個の保存的アミノ酸置換を含む前記抗体または抗原結合断片の機能保存的変異体、
［２］配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域または配列番号７で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域または配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片、および
［３］ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または単鎖抗体のいずれかの形態である、［１］または［２］記載の抗体、機能保存的アミノ酸置換抗体、または抗原結合断片
を提供する。

本発明によれば、組織サンプルから破壊的にＤＮＡサンプルを抽出したり、モノヌクレオチドまで完全に分解することが必須ではなく、かつ、公知の抗体よりも感度が高く簡便に使うことができる、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）に特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片、ならびに前記抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体を提供する。

競合ＥＬＩＳＡ法によりサイクロプリン立体異性体と本発明抗体の結合を確認した図。ＥＬＩＳＡ法により異なるサイクロプリンと本発明抗体の結合を確認した図。ＥＬＩＳＡ法により本発明抗体の感度を測定した結果を示した図。ＥＬＩＳＡ法により本発明抗体を用いてＸＰ－Ａマウスの生体サンプル中のＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）の蓄積量を測定した結果を示した図。Ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含むオリゴヌクレオチドを導入した細胞の蛍光免疫染色結果を示した図。対照オリゴヌクレオチドを導入した細胞の蛍光免疫染色結果を示した図。本発明のｓｃＦｖの一例を示す。図７において、一重下線部は６つのＣＤＲであり、二重下線部がリンカーである。

１．用語
「抗体」とは、イムノグロブリンであり、２本の同一の重鎖および２本の同一の軽鎖という計４本のポリペプチド鎖からなるサブ構造を有するポリペプチドである。重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）には、抗体間でそのアミノ酸配列が非常に高く類似する定常領域、および抗体間でそのアミノ酸配列が大きく異なる可変領域が存在する。定常領域の内、軽鎖定常領域をＣＬ領域、および重鎖定常領域をＣＨ領域という。重鎖定常領域には第一定常（ＣＨ１）領域、第二定常（ＣＨ２）領域ならびに第三定常（ＣＨ３）領域が存在する。可変領域の内部でアミノ酸配列が特に大きく変化する部分は限られており、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）と呼ばれる。ＣＤＲは抗原に対する特異性を決定する。重鎖可変領域（ＶＨ領域）に３つのＣＤＲ（ＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３）、軽鎖可変領域（ＶＬ領域）に３つのＣＤＲ（ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、ＶＬＣＤＲ３）が存在する。ＣＤＲ以外の可変領域をフレームワークといい、アミノ酸がほとんど変化せずにＣＤＲ領域を構造的に支える役割をする。

「Ｆｃ領域」とは、抗体をパパインで切断した際に得られる２種の断片のうち、抗原結合能を有しない断片に相当する領域のことを言う。Ｆｃ領域は、典型的には、一般にヒンジ領域の一部を含み、重鎖第二定常（ＣＨ２）領域ならびに同第三定常（ＣＨ３）領域からなる、抗体の重鎖のＣ末端領域を意味する。

「モノクローナル抗体」とは、ただ一組の抗体遺伝子（軽鎖１種と重鎖１種）に由来する、タンパク質レベルで実質的に均一な抗体の集団をいう。集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在する可能性がある突然変異（例えば自然に生じる突然変異など）を除いて同一である。また、モノクローナル抗体の作製方法は限定されず、様々な常法に従い作製することができる。それらの作製方法には、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ技術、ならびに、ヒト免疫グロブリン座の一部もしくは全部またはヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子を有する動物にヒトまたはヒト様抗体を生成させる技術、などが含まれる。

「Ｆｖ」は、重鎖および軽鎖の可変領域からなる、抗原認識および抗原結合部位を保持する最小抗原結合断片である。

「Ｆａｂ」とは、抗体をパパイン処理した時に得られる２種の断片のうち、Ｎ末端側の産物であり、重鎖可変領域由来のものと軽鎖可変領域由来のものを含む。Ｆａｂは、典型的には、軽鎖および重鎖の可変領域（ＶＬおよびＶＨ領域）を含み、且つ軽鎖の定常（ＣＬ）領域と重鎖の第一定常（ＣＨ１）領域を含む。

「Ｆａｂ’」および「Ｆ（ａｂ’）２」は、抗体をペプシンおよびパパインなどのプロテアーゼで処理することによって得られる断片であり、２つの重鎖の各々において、ヒンジ領域間に存在するジスルフィド結合付近で消化されることによって生成される断片である。「Ｆ（ａｂ’）２」は、ＶＬ領域およびＣＬ領域からなる軽鎖断片、およびＶＨ領域およびＣＨ１領域からなる重鎖断片がジスルフィド結合を介してそれらのＣ末端領域で、またはヒンジ領域で連結した２つの相同性抗原結合断片からなる。２つの相同性抗原結合断片の各々が「Ｆａｂ’」である。

「単鎖抗体（ｓｃＦｖ）」には、抗体のＶＨ領域およびＶＬ領域が含まれる。これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する（Ｈｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（１９８８）８５，５８７９‐５８８３）。ｓｃＦｖは、さらに、ＶＨ領域とＶＬ領域との間にポリペプチドリンカーを含んでいてもよい。

「リンカー」とは、ある分子と別の分子とを連結させる際に用いられる連結分子を意味し、様々なものが当該技術分野で公知である。

２．本発明の抗体および抗原結合断片
本発明は、３つのＣＤＲを含むＶＨ領域および３つのＣＤＲを含むＶＬ領域を含み、
ＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ（配列番号１）であり、
ＶＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ（配列番号２）であり、
ＶＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ（配列番号３）であり、
ＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧｌｎ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ（配列番号４）であり、
ＶＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ（配列番号５）であり、
ＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＰｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ（配列番号６）である、
ＤＮＡ上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片（以下、「本発明の抗体および抗原結合断片」という）を提供する。

上記のＶＨ領域の例として、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域が挙げられる。上記のＶＬ領域の例として、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ領域が挙げられる。したがって、本発明の抗体および抗原結合断片の一態様として、配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域および配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含む、ＤＮＡ上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が提供される。本発明の抗体および抗原結合断片のさらなる態様として、配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるＶＨ領域および配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるＶＬ領域を含む、ＤＮＡ上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体およびその抗原結合断片が提供される。

本発明の抗原結合断片は、本発明の抗体の免疫学的に活性な部分または抗原結合ドメインを含有する抗原結合断片であり、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する。本発明の抗原結合断片には、例えば、上記のＶＨＣＤＲ１～３（配列番号１～３）およびＶＬＣＤＲ１～３（配列番号４～６）から選択される１以上のＣＤＲ領域が含まれ、好ましくは上記のＶＨＣＤＲ１～３（配列番号１～３）およびＶＬＣＤＲ１～３（配列番号４～６）の６つの全てのＣＤＲ領域が含まれる。

一般に、抗体の抗原に対する結合特性は、ＣＤＲによって決定される。そのため、ＣＤＲを任意のフレームワークに移植することによって、抗体の抗原に対する結合特性を再構成することができる。したがって、本発明の抗原結合断片は、本発明の抗体のＶＨ領域のＣＤＲ１、ＶＨ領域のＣＤＲ２、ＶＨ領域のＣＤＲ３、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＶＬ領域のＣＤＲ２、ＶＬ領域のＣＤＲ３の６つのＣＤＲを継承することにより、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに対する特異結合性を継承する。

本発明の抗原結合断片には、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ダイアボディー、ミニボディー等が包含される。いずれも、当該技術分野で周知の断片であり、常法により得ることができる。例えば、ペプシン、パパインなどのプロテアーゼで抗体を処理することによって製造するだけでなく、化学的ペプチド合成によって製造することもできる。また、本発明の抗原結合断片がｓｃＦｖである場合、該ｓｃＦｖはリンカーを含んでいてもよい。

ｓｃＦｖを構成するリンカーのアミノ酸配列は、Ｈ鎖とＬ鎖の可変領域を１本鎖に連結したときに、抗体としての結合特性が維持される限り限定されない。このようなリンカーとしては、限定するものではないが、例えば、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）×３、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ａｌａ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）、（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）×４などが知られている。

ｓｃＦｖにおけるＶＨ領域およびＶＬ領域の連結順序も、抗体としての結合特性が維持される限り限定されない。具体的には、Ｎ末端から順に［ＶＨ領域］－［リンカー］－［ＶＬ領域］の順に結合されたｓｃＦｖは、本発明のｓｃＦｖとして好ましいが、［ＶＬ領域］－［リンカー］－［ＶＨ領域］であってもかまわない。すなわち本発明における好ましい改変抗体は、以下の構造を有する１本鎖のポリペプチドによって構成される。
ＮＨ_２－［ＶＨ領域］－［リンカー］－［ＶＬ領域］－ＣＯＯＨ

本発明のｓｃＦｖのアミノ酸配列の一例として、配列番号９で示される単鎖抗体が挙げられる（図７）。該単鎖抗体は、リンカーとして「（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）×３」、ＶＨ領域として配列番号７で示される配列、およびＶＬ領域として配列番号８で示される配列を使用し、［ＶＨ領域］－［リンカー］－［ＶＬ領域］の順に結合することにより、常法にしたがって製造した。

本発明の抗体および抗原結合断片は、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに対する特異的結合性を維持できる範囲で、抗体および抗原結合断片を構成するアミノ酸配列の一部の、例えば、１～数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および付加等の変異を伴うことができる（本明細書において「機能保存的変異体」という）。ここで、「数個」とは、２～１０個程度をいい、全長のアミノ酸配列の長さにもよるが、好ましくは２～７個程度、例えば３個、４個、５個、または６個をいう。本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体は、限定するものではないが、典型的には、本発明の抗体および抗原結合断片を構成するアミノ酸配列の全長に対して９５％以上、例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の配列同一性を有する。

本発明において、アミノ酸残基の置換は、保存的アミノ酸置換であってもよい。保存的アミノ酸置換は、化学的性質が似通ったアミノ酸による置換であり、当業者に既知である。例えば、各アミノ酸が有する側鎖の性質に基づいてグループ分けされた、同じグループに属するアミノ酸同士の置換が挙げられる。保存的アミノ酸置換の一例として、例示的な置換残基と好ましい置換残基を表１にまとめた。抗体および抗原結合断片の全長のうち１～数個の保存的アミノ酸置換を含む変異体は、もとの抗体および抗原結合断片の結合性を保存する可能性がきわめて高い。したがって、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体は、好ましくは、保存的アミノ酸置換を含む。

本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体における変異の位置は、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに対する結合性を維持できる限り限定されず、１以上の変異がＣＤＲ領域またはＣＤＲ領域以外の領域に存在していてもよく、あるいはＣＤＲ領域とＣＤＲ領域以外の領域（例えば、フレームワーク領域、定常領域等）の両方に変異が存在していてもよい。

例えば、限定するものではないが、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体は、配列番号１～６で示される６つのＣＤＲ領域から選択される１以上のＣＤＲ領域において変異、好ましくは保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。例えば、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体は、ＶＨＣＤＲ１（配列番号１）、ＶＨＣＤＲ３（配列番号３）、ＶＬＣＤＲ１（配列番号４）およびＶＬＣＤＲ３（配列番号６）からなる群から選択される１以上のＣＤＲ領域内に１～数個、例えば１～３個のアミノ酸残基の変異、好ましくは保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。例えば、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体は、配列番号１で示されるＶＨＣＤＲ１のアミノ酸配列における９番目のセリン（Ｓｅｒ）、配列番号４で示されるＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列における１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）、配列番号４で示されるＶＬＣＤＲ１のアミノ酸配列における５番目のアスパラギン（Ａｓｎ）、配列番号６で示されるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列における８番目のアルギニン（Ａｒｇ）、および配列番号６で示されるＶＬＣＤＲ３のアミノ酸配列における９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）からなる群から選択される１以上のアミノ酸残基の位置に変異を含んでいてもよく、好ましくは、上記の群から選択される１以上のアミノ酸残基が保存的に置換されていてもよい。例えば、限定するものではないが、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体は、配列番号１の９番目のセリン（Ｓｅｒ）のトレオニン（Ｔｈｒ）への置換、配列番号４の１番目のグルタミン（Ｇｌｎ）のアスパラギン（Ａｓｎ）への置換、配列番号４の５番目のアスパラギン（Ａｓｎ）のヒスチジン（Ｈｉｓ）への置換、配列番号６の８番目のアルギニン（Ａｒｇ）のリシン（Ｌｙｓ）への置換、および配列番号６の９番目のトレオニン（Ｔｈｒ）のセリン（Ｓｅｒ）への置換からなる群から選択される１以上保存的アミノ酸置換を含んでいてもよい。なお、本明細書において、アミノ酸残基の位置はアミノ酸配列のＮ末端側から数えた位置である。

さらに、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体の例として、
（ａ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および
（ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域
を含む、アデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。またさらに、本発明の抗体および抗原結合断片の機能保存的変異体の例として、
（ａ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ領域、および
（ｂ）配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ領域
を含む、アデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片が挙げられる。上記機能保存的変異体のＶＨ領域およびＶＬ領域は、それぞれ配列番号７および配列番号８に対し、規定する配列同一性を維持する範囲内でいずれの変異を有していてもよい。かかる変異は、ＶＨ領域およびＶＬ領域中のいずれの位置にあってもよい。また、上記機能保存的変異体において、ＶＨ領域およびＶＬ領域のいずれか一方は、配列番号７または配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して１００％の配列同一性を有していてもよい。

本発明の抗体および抗原結合断片、ならびにそれらの機能保存的変異体は、好ましくは、モノクローナル抗体およびその抗原結合断片である。本発明において、モノクローナル抗体には、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト、ハムスター等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体など人為的に改変した遺伝子組み換え型抗体も含まれる。

本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのいずれの形態であってもよい。好ましくは、ＩｇＧ抗体であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４であってもよい。本発明の抗原結合断片もまた、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、またはＩｇＥのいずれの形態の抗体に由来していてもよい。好ましくは、ＩｇＧ抗体由来であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４由来であってもよい。

本発明の抗体および抗原結合断片、ならびにそれらの機能保存的変異体において、フレームワーク領域は、マウス由来に限らず、例えば、ヒトや他の動物由来であってもよい。また、本発明の抗体および抗原結合断片ならびにそれらの機能保存的変異体における定常領域も、マウス由来に限らず、例えば、ヒトや他の動物由来であってもよい。本発明の抗体および抗原結合断片ならびにそれらの機能保存的変異体において、Ｆｃ領域は、マウス由来のＦｃに限定されない。例えば、ヒト由来のＦｃに置換することができる。また、Ｆｃは、ＣＨ３を構成するアミノ酸配列を含むＦｃの断片とすることもできる。

また、特に本発明の抗原結合断片またはその機能保存的変異体がＦｃ領域を含む場合、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ結合した分岐オリゴ糖修飾を含みうる（例えば、Wright et al., (1997) Trends Biotechnol. 15: 26-32を参照のこと）。オリゴ糖は様々な炭水化物、例えばマンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、およびシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム部」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含みうる。

本発明の抗体および抗原結合断片、ならびにそれらの機能保存的変異体により特異的に認識され、結合されるＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンには、５’Ｒと５’Ｓの両方の立体異性体が包含される。

３．本発明の抗体および抗原結合断片の製造
本発明の抗体および抗原結合断片は、当該分野で既知のいずれかの方法によって製造することができる。例えば、本発明の抗体および抗原結合断片は、ハイブリドーマ細胞、または抗体あるいは抗原結合断片を発現するように遺伝子を組換えた細胞（例えば、動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、および植物細胞）および微生物（ファージ、細菌、酵母などを含む）などから産生され得る。本発明の抗体および抗原結合断片は、また、無細胞タンパク質合成系を使用して製造することもできる。

また、本発明に基づけば、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、これらポリヌクレオチドを発現可能に保持したベクター、および本発明のポリペプチドを産生する細胞（例えば、動物細胞、魚類細胞、昆虫細胞、および植物細胞）および微生物（ファージ、細菌、酵母などを含む）を作製できることは、当業者にとって自明である。よって、本発明はこれらの態様も包含する。

また、本発明の機能保存的変異体を作成することは、当業者にとっては技術的にそう困難なことではない。例えば、分子生物学的手法で行うのが当該分野での常法である。具体的には、当該抗体遺伝子中の配列をＰＣＲにより改変するか、化学合成した変異配列で置き換えること等が一般に行われる。ＰＣＲの場合は、抗体発現ベクターに本発明の抗体の軽鎖および重鎖を組み込んだＤＮＡを鋳型に、変異部分を含むｐｒｉｍｅｒをｔａｉｌｔｏｔａｉｌになるよう設計し、ｉｎｖｅｒｓｅＰＣＲした後、ｓｅｌｆｌｉｇａｔｉｏｎすることで作製が可能である。また合成配列の場合は、変異部分を含む配列を化学人工合成し、制限酵素部位等を使って組み込むことが可能である。こうして作製した変異抗体を組み込んだ発現ベクターを、哺乳動物細胞など発現させる細胞にトランスフェクションし、変異抗体を得ることができる（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ. １７（１６) ６５４５－６５５１（１９８９））。

かくして、本発明の抗体および抗原結合断片、ならびにそれらの機能保存的変異体は、細胞等の生体から単離、または合成されたものである。

４．本発明の抗体および抗原結合断片の利用
本発明は、さらに、本発明の抗体またはその抗原結合断片、またはそれらの機能保存的変異体を含む、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンを測定または検出するための試薬を提供する。かかる試薬は、当業者の知る常法により製造できる。該試薬は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、化学発光免疫測定法（ＣＩＡ）、免疫比濁法、免疫比ろう法、ラテックス凝集法、ラテックス比濁法、赤血球凝集反応、粒子凝集反応、ウェスタンブロット法、免疫染色、免疫沈降法、イムノクロマト法、酵素標識免疫法（ＥＬＩＳＡ）などに利用できる。

また、こうした試薬と組み合わせるデバイスとしては、特に限定されないが、例えば、マイクロウェルプレート、アレイ、チップ、フローサイトメーター、表面プラズモン共鳴装置、イムノクロマトグラフィーストリップなどが利用できる。

またさらに、本発明は、本発明の抗体またはその抗原結合断片、またはそれらの機能保存的変異体を使用して、試料においてＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンを測定または検出する方法を提供する。試料としては、微生物から高等ほ乳類までの様々なＤＮＡサンプルが挙げられる。また、例えば、対象が癌、心臓病、脳卒中、肝障害、神経障害（色素性乾皮症Ａ群等）等の疾患に罹患しているかの診断においても使用できる。

以下、本発明を実施した好ましい形態の一例について説明する。但し、下記の実施形態は、単なる例示である。本発明は、下記の実施形態に何ら限定されない。

〔ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体の樹立〕
〔操作１〕抗原の作製
分子中に１個の５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含む２０－ｍｅｒオリゴヌクレオチドにビオチンを標識した合成品（日本遺伝子研究所製）を購入した。配列は５’－ｂｉｏｔｉｎ－ＴｓＣｓＴｓＣｓＣｓＣＮＸＮＧｓＣｓＧｓＴｓＧｓＣｓＧｓＣｓＣｓＴｓＴ－３’であり、Ｘは、５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡであり、Ｎは、Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔの４塩基のいずれかである。ｓは、ホスホロチオエート（phosphorothioate）結合を示す。購入したビオチン標識オリゴヌクレオチドとアビジンを１：１の比率で混合し、抗原として用いた。

〔操作２〕マウスへの免疫
操作１により得られた抗原と完全フロイントアジュバント（Ｄｉｆｃｏ製）を１：１の比率で混合して乳化し、７週齢ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌）の腹腔内へ注射し免疫付けを行った。注射は初回、初回から２週間後、４週間後、６週間後および８週間後の合計５回実施した。

〔操作３〕スクリーニング
最終免疫１週間後にマウスから外科的な方法で脾臓を摘出し、単個細胞にした後、等量のミエローマ細胞（Ｐ３Ｘ３Ａｇ８．６５３）と５０％ポリエチレングリコール１５００を用いて融合した。９６穴培養プレートに１０^５個ずつ融合細胞を入れ、ＨＡＴを含む培地を交換しながら選択培養した。

アデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を含むオリゴヌクレオチドに結合する抗体を産生するハイブリドーマの選択は、その培養上清を用いて酵素標識免疫法（ＥＬＩＳＡ）により行った。アデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を含むオリゴヌクレオチドに反応し、且つ、Ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含まないオリゴヌクレオチドには反応しないウェルのハイブリドーマを選択した。

〔操作４〕クローニング
スクリーニングにより選択した陽性ウェルのハイブリドーマを、限界希釈法により１細胞／穴になるように９６穴細胞培養用プレートに播種した。２週間程度培養し、その培養上清を用いてＥＬＩＳＡ法によりアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を含むオリゴヌクレオチドに反応し、且つ、Ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含まないオリゴヌクレオチドには反応しないウェルのハイブリドーマを選択した。この作業を２回繰り返し、最終的に１種類のハイブリドーマ株を樹立した。

〔操作５〕抗体の作製
当該ハイブリドーマ細胞を培養し、抗体を含む培養上清と飽和硫安溶液を１：１の比率で混合し、沈殿物のみを回収した。沈殿物を超純水で再溶解後、ＰＢＳで透析し、粗精製された抗体溶液を得た。

〔操作６〕競合ＥＬＩＳＡ法によるサイクロプリン立体異性体への結合確認
硫酸プロタミンをコートした９６穴プレートに、５ｎｇ／穴の５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含むオリゴヌクレオチド５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡ－ｏｌｉｇｏ２０（５’－ＴＣＴＣＣＣＮＸＮＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴＴ－３’、ただし、Ｘは５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡであり、ＮはＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのいずれかの塩基である）を一晩３７℃で吸着させた。ブロッキング処理後、プレートに固定したＣｙｃｌｏ－ｄＡを含むオリゴヌクレオチドの約半数と結合する濃度の本発明抗体（操作５で得られた粗精製抗体をＰＢＳにより５０，０００倍希釈）と、０、５、５０、または５００ｎｇ／穴の競合阻害剤５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡ－ｏｌｉｇｏ１４（５’－ＡＣＴＧＴＧＸＣＴＧＡＴＣＴ－３’、ただし、Ｘは５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）、５’Ｒ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡ－ｏｌｉｇｏ１４（５’－ＡＣＴＧＴＧＹＣＴＧＡＴＣＴ－３’、ただし、Ｙは５’Ｒ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）、またはｃｏｎｔｒｏｌ－ｏｌｉｇｏ１４（５’－ＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＡＴＣＴ－３’を混合し、３７℃で３０分間反応させた。続いて、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ製）を反応させた。さらに、ポリペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＳＤＴ製）を反応させシグナルを増幅した。最後にＯＰＤ（ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩）基質液を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。

競合阻害率は、［１－（Ａ２－Ａ３）/（Ａ１－Ａ３）］×１００の式から求めた。ただし、Ａ１は競合阻害剤がないときの吸光度、Ａ２は競合阻害剤があるときの吸光度、Ａ３は抗体がないときの吸光度である。

結果を図１に示した。この結果から、本発明抗体はＤＮＡ中の５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡおよび５’Ｒ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡにほぼ同等に結合することがわかった。

〔操作７〕ＥＬＩＳＡ法による他のサイクロプリンへの結合確認
硫酸プロタミンをコートした９６穴プレートに５０ｎｇ／穴の５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＡ－ｏｌｉｇｏ２０、５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＧ－ｏｌｉｇｏ２０（５’－ＴＣＴＣＣＣＮＺＮＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴＴ－３’、ただし、Ｚは５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＧであり、ＮはＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのいずれかの塩基である）、およびｃｏｎｔｒｏｌ－ｏｌｉｇｏ２０（５’－ＴＣＴＣＣＣＮＡＮＧＣＧＴＧＣＧＣＣＴＴ－３’、ただし、ＮはＧ、Ｃ、Ａ、Ｔのいずれかの塩基）を一晩３７℃で吸着させた。ブロッキング処理後、本発明の抗体（操作５で得られた粗精製抗体をＰＢＳにより１０，０００倍希釈）を加え３７℃で３０分間反応させた。続いて、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体を反応させた後、ＯＰＤ基質液を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。

結果を図２に示した。この結果から、本発明抗体はＤＮＡ鎖上の５’Ｓ－ｃｙｃｌｏ－ｄＧに対しては結合しないことがわかった。

〔相補性決定領域のアミノ酸配列の決定〕
本発明のモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマより、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＲＮＡＩＩ（ＴＡＫＡＲＡ製）を用いてＴｏｔａｌＲＮＡを抽出し、逆転写酵素ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ（ＴＯＹＯＢＯ製）でｃＤＮＡを合成した。当該ハイブリドーマのサブクラスが、重鎖はＩｇＧ２ａ、軽鎖がκであることから、ｃＤＮＡ合成の際のプライマーに、重鎖の場合はＭｕＩｇＧＶＨ３’－２（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＧＧＧＲＣＣＡＲＫＧＧＡＴＡＲＡＣＩＧＲＴＧＧ、Ｉ＝ｉｎｏｓｉｎｅ，Ｋ＝ＧまたはＴ，Ｒ＝ＡまたはＧ）、軽鎖の場合はＭｕＩｇκＶＬ３’－１（ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡを使用した。

得られたｃＤＮＡを鋳型にＰＣＲを行い、重鎖および軽鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを増幅した。この際のプライマーには、ＭｏｕｓｅＩｇ－ＰｒｉｍｅｒｓＳｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ製）を、また耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ製）およびＫＯＤ－ＦＸ－Ｎｅｏ（ＴＯＹＯＢＯ製）を使用した。増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲルより回収し、ｐＵＣ１９ベクターにクローニング後、遺伝子配列を決定した。シーケンス反応には、ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｓｖ１．１ｃｙｃｌｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｋｉｔ（アプライドバイオシステムズ社製）を使用し、同社のプロトコールに従って３１３０ジェネティックアナライザー（アプライドバイオシステムズ社製）により行った。得られた重鎖および軽鎖可変領域の塩基配列から、重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を決定した（配列番号７および８）。

得られた重鎖可変領域および軽鎖可変領域の塩基配列をＩＭＧＴ/Ｖ－ＱＵＥＳＴ［Ｂｒｏｃｈｅｔ, Ｘ. ｅｔａｌ., Ｎｕｃｌ. ＡｃｉｄｓＲｅｓ. ３６，Ｗ５０３－５０８（２００８），Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｂｒｏｃｈｅｔ，Ｘ．，Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂＰｒｏｔｏｃ．２０１１Ｊｕｎ１；２０１１（６）．］で解析し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を決定した。得られた結果を表２に示す。

〔ＥＬＩＳＡ法による感度の確認〕
硫酸プロタミンをコートした９６穴プレートに１００，０００塩基当たり０、０．１、０．２、０．５、１あるいは２個のアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を含む２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドを１μｇ／穴の濃度で加え、一晩３７℃で吸着させた。ブロッキング処理後、本発明抗体（実施例１の操作５で得られた粗精製抗体をＰＢＳにより３０，０００倍希釈）を加え３７℃で３０分間反応させた。続いて、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ製）を反応させた。さらに、ポリペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＳＤＴ製）を反応させシグナルを増幅した。最後にＯＰＤ基質液を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定し当該吸光度により、感度の確認を行った。

結果を図３に示した。その結果、本発明抗体はアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）を含むオリゴヌクレオチドの吸着量に正比例して結合量を増加させた。また、その測定感度は１００，０００塩基当たり０．１個となった。非特許文献２の抗体の感度は１００，０００塩基当たり１個と書かれていることから、本発明抗体はＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合し、非特許文献２の抗体の１０倍高い感度を持つことがわかった。

〔ＸＰ－Ａマウスの生体サンプルのＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリン（Ｃｙｃｌｏ－ｄＡ）の蓄積量の測定〕
５ヶ月齢の色素性乾皮症Ａ群のモデルマウス（ＸＰ－Ａマウス）から臓器を取り出した。臓器をすりつぶした後、ＤＮＡＥＸＴＲＡＣＴＯＲＴＩＳｋｉｔ（和光純薬）を用いてＤＮＡを抽出した。硫酸プロタミンをコートした９６穴プレートに臓器ＤＮＡを１μｇ／穴の濃度で加え、一晩３７℃で吸着させた。同時に、検量線用のＣｙｃｌｏ－ｄＡオリゴヌクレオチド（１００，０００塩基中に０、１、２、５あるいは１０のＣｙｃｌｏ－ｄＡを含む）やＤＮＡ非特異結合測定用の仔牛胸腺ＤＮＡも１μｇ／穴の濃度で吸着させた。ブロッキング処理後、本発明抗体（ＰＢＳにより３０，０００倍希釈）を加え、３７℃で３０分間反応させた。続いて、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ製）を反応させた。さらに、ポリペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＳＤＴ製）を反応させシグナルを増幅した。最後にＯＰＤ基質液を用いて４９２ｎｍの吸光度を測定した。臓器ＤＮＡ中のＣｙｃｌｏ－ｄＡの蓄積量は、サンプルの吸光度から仔牛胸腺ＤＮＡ吸光度を差し引いた値を検量線と比較することにより求めた。

結果を図４に示した。その結果、本発明抗体は色素性乾皮症Ａ群のモデルマウス（ＸＰ－Ａマウス）の生体サンプル中のＤＮＡ鎖上のＣｙｃｌｏ－ｄＡの蓄積量を検出できることがわかった。

〔蛍光免疫染色によるＣｙｃｌｏ－ｄＡの視覚化〕
ヒト骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）細胞２×１０^５個を３５ｍｍガラス底ディッシュ（ＭａｔＴｅｋ）に植え、２４時間培養後、Ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含むオリゴヌクレオチド、あるいは対照オリゴヌクレオチド１０μｇをｊｅｔＰＲＩＭＥ細胞導入試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ－Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）と共に４時間処理した。正常培地に交換し、２４時間培養後、細胞を４％ホルマリンで１０分間室温処理により固定し、さらに氷冷０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘで５分間処理により浸透化した。２０％牛胎児血清でブロッキング後、本発明抗体（ＰＢＳにて３０，０００倍希釈）、続いてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ－Ｆ（ａｂ’）２抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，２００倍希釈）をそれぞれ３７℃で３０分間反応させ、Ｃｙｃｌｏ－ｄＡを染色した。さらに、細胞骨格（Ｆ－ａｃｔｉｎ）の染色のため、Ａｌｅｘａ５９４－ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を４℃で２０分間反応させ、細胞核ＤＮＡ染色のために０．０５μｇ／ｍｌのＤＡＰＩを室温で５分間反応させた。カバーグラスで包埋後、蛍光顕微鏡を用いて３波長の蛍光画像を撮影し、ＡｄｏｂｅＰｈｏｔｏｓｈｏｐにより画像を重合した。

Ｃｙｃｌｏ－ｄＡを含むオリゴヌクレオチドを導入した細胞の蛍光免疫染色画像を図５に、対照オリゴヌクレオチドを導入した細胞の蛍光免疫染色画像を図６に示した。図５および図６において、白い繊維状の部分は細胞骨格（Ｆ－ａｃｔｉｎ）を示し、大きな楕円部分はＤＡＰＩで染色された細胞核ＤＮＡを示す。図５において、細胞内に導入されたＣｙｃｌｏ－ｄＡを含むオリゴヌクレオチドは、本発明抗体および蛍光染色二次抗体により染色され、ハイライト部分（例として矢印で示した箇所）に点在していることがわかった。一方、図６において、細胞内に導入された対照オリゴヌクレオチドの蛍光染色は観察されなかった。それ故、本発明抗体を用いれば、細胞サンプルを破壊することなく、細胞内のＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンを特異的に視覚化できることがわかった。

SEQ ID NO.9: ScFv
SEQ ID NO.10: Control－oligo14
SEQ ID NO.11: Control－oligo20, wherein n is a, c, g, or t.
SEQ ID NO.12: Primer MuIgGVH3’-2, wherein n is inosine.
SEQ ID NO.13: Primer MuIgκVL3’-1

Claims

それぞれ３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、
ＶＨ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ（配列番号１）であり、
ＶＨ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩｌｅ－Ｈｉｓ－Ｔｙｒ－Ｓｅｒ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ（配列番号２）であり、
ＶＨ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡｌａ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ｔｙｒ－Ｖａｌ－Ｍｅｔ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ（配列番号３）であり、
ＶＬ領域のＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧｌｎ－Ｓｅｒ－Ｉｌｅ－Ｖａｌ－Ａｓｎ－Ｓｅｒ－Ａｓｎ－Ｇｌｙ－Ａｓｎ－Ｔｈｒ－Ｔｙｒ（配列番号４）であり、
ＶＬ領域のＣＤＲ２のアミノ酸配列がＬｙｓ－Ｖａｌ－Ｓｅｒ（配列番号５）であり、
ＶＬ領域のＣＤＲ３のアミノ酸配列がＰｈｅ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ－Ｔｈｒ（配列番号６）である、
ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片。
配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むＶＨ領域または配列番号７で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＨ領域、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むＶＬ領域または配列番号８で示されるアミノ酸配列に対し少なくとも９７％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＶＬ領域を含み、ＤＮＡ鎖上のアデノシン型サイクロプリンに特異的に結合する、請求項１記載の抗体またはその抗原結合断片。
ＩｇＧ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または単鎖抗体のいずれかの形態である、請求項１または２記載の抗体またはその抗原結合断片。