JP7106517B2 - 偽陽性抑制機能を備えたプローブ、その設計方法及びその利用 - Google Patents
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Description
(2) 10~50merである、(1)に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(3) 15~28merである、(2)に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(4) 標識が結合している、(1)~(3)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(5) 前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも1つが、該標的配列における当該配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分の内部に位置する、(1)~(4)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(6) 前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な配列において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合であることを特徴とする、(1)~(5)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(7) 前記標的核酸が、10~50merのDNA又はRNAである、(1)~(6)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(8) 前記標的核酸が、miRNAである、(7)に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(9) DNA、RNA、LNA、GNA,BNA又はPNAである、(1)~(8)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(10) 配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分において、少なくとも1個の塩基を脱塩基化させかつ/若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び/又は、
(ii)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分が2塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列の末端を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。
(11) 前記ポリヌクレオ塩基プローブが、15~28merである、(10)に記載の方法。
(12) 前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計において、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的なポリヌクレオ塩基が2塩基以下となるように、脱塩基化、置換又は切断するように設計されることを特徴とする、(10)又は(11)に記載の方法。
(13) 被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を、高い特異度で検出する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の(1)~(9)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出することを含む方法。
(14) 被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を、高い特異度で定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の(1)~(9)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を定量することを含む方法。
また、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、50mer以下、45mer以下、40mer以下、35mer以下、30mer以下、29mer以下、28mer以下、27mer以下、26mer以下、又は25mer以下とすることができる。
例えば、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、10~40mer、13~30mer、15~28mer、又は18~25merとすることができる。
なお、上述の「ポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長」は、ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長と読み替えてもよい。
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hsa-miR-1268:CGGGCGUGGUGGUGGGGG(配列番号895)、hsa-miR-4253:AGGGCAUGUCCAGGGGGU(配列番号896)、hsa-miR-4274:CAGCAGUCCCUCCCCCUG(配列番号897)、hsa-miR-4278:CUAGGGGGUUUGCCCUUG(配列番号898)、hsa-miR-4488:AGGGGGCGGGCUCCGGCG(配列番号899)、hsa-miR-4327:GGCUUGCAUGGGGGACUGG(配列番号900)、
hsa-miR-4271:GGGGGAAGAAAAGGUGGGG(配列番号901)、hsa-miR-6085:AAGGGGCUGGGGGAGCACA(配列番号902)、hsa-miR-2392:UAGGAUGGGGGUGAGAGGUG(配列番号903)、hsa-miR-3676-3p:CCGUGUUUCCCCCACGCUUU(配列番号904)、hsa-miR-371-5p:ACUCAAACUGUGGGGGCACU(配列番号905)、hsa-miR-3960:GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG(配列番号906)、hsa-miR-4749-3p:CGCCCCUCCUGCCCCCACAG(配列番号907)、hsa-miR-6124:GGGAAAAGGAAGGGGGAGGA(配列番号908)、hsa-miR-4313:AGCCCCCUGGCCCCAAACCC(配列番号909)、hsa-miR-6716-5p:UGGGAAUGGGGGUAAGGGCC(配列番号910)、hsa-miR-1202:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG(配列番号911)、hsa-miR-1237:UCCUUCUGCUCCGUCCCCCAG(配列番号912)、hsa-miR-4687-3p:UGGCUGUUGGAGGGGGCAGGC(配列番号913)、hsa-miR-5195-3p:AUCCAGUUCUCUGAGGGGGCU(配列番号914)、hsa-miR-625:AGGGGGAAAGUUCUAUAGUCC(配列番号915)、mmu-miR-715:CUCCGUGCACACCCCCGCGUG(配列番号916)、mmu-miR-721:CAGUGCAAUUAAAAGGGGGAA(配列番号917)、hsa-miR-1228*:GUGGGCGGGGGCAGGUGUGUG(配列番号918)、hsa-miR-4433-3p:ACAGGAGUGGGGGUGGGACAU(配列番号919)、mmu-miR-680:GGGCAUCUGCUGACAUGGGGG(配列番号920)、hsa-miR-149*:AGGGAGGGACGGGGGCUGUGC(配列番号921)、hsa-miR-6069:GGGCUAGGGCCUGCUGCCCCC(配列番号922)、hsa-miR-940:AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC(配列番号923)、hsa-miR-150*:CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(配列番号924)、hsa-miR-1913:UCUGCCCCCUCCGCUGCUGCCA(配列番号925)、hsa-miR-302c*:UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG(配列番号926)、hsa-miR-3675-3p:CAUCUCUAAGGAACUCCCCCAA(配列番号927)、hsa-miR-373*:ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC(配列番号928)、hsa-miR-4689:UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC(配列番号929)、hsa-miR-4697-5p:AGGGGGCGCAGUCACUGACGUG(配列番号930)、hsa-miR-4716-3p:AAGGGGGAAGGAAACAUGGAGA(配列番号931)、hsa-miR-4716-5p:UCCAUGUUUCCUUCCCCCUUCU(配列番号932)、hsa-miR-4731-3p:CACACAAGUGGCCCCCAACACU(配列番号933)、hsa-miR-4731-5p:UGCUGGGGGCCACAUGAGUGUG(配列番号934)、hsa-miR-5010-5p:AGGGGGAUGGCAGAGCAAAAUU(配列番号935)、hsa-miR-5698:UGGGGGAGUGCAGUGAUUGUGG(配列番号936)、hsa-miR-625*:GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA(配列番号937)、mmu-miR-290-5p:ACUCAAACUAUGGGGGCACUUU(配列番号938)、mmu-miR-292-5p:ACUCAAACUGGGGGCUCUUUUG(配列番号939)、hsa-miR-1225-3p:UGAGCCCCUGUGCCGCCCCCAG(配列番号940)、hsa-miR-4640-3p:CACCCCCUGUUUCCUGGCCCAC(配列番号941)、hsa-miR-4787-5p:GCGGGGGUGGCGGCGGCAUCCC(配列番号942)、hsa-miR-615-5p:GGGGGUCCCCGGUGCUCGGAUC(配列番号943)、hsa-miR-4750-3p:CCUGACCCACCCCCUCCCGCAG(配列番号944)、hsa-miR-361-3p:UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU(配列番号945)、hsa-miR-3937:ACAGGCGGCUGUAGCAAUGGGGG(配列番号946)、hsa-miR-3943:UAGCCCCCAGGCUUCACUUGGCG(配列番号947)、hsa-miR-4665-5p:CUGGGGGACGCGUGAGCGCGAGC(配列番号948)、hsa-miR-498:UUUCAAGCCAGGGGGCGUUUUUC(配列番号949)、hsa-miR-4723-5p:UGGGGGAGCCAUGAGAUAAGAGCA(配列番号950)、hsa-miR-637:ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU(配列番号951)、hsa-miR-939:UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG(配列番号952)、hsa-miR-1975:CCCCCACAACCGCGCUUGACUAGCU(配列番号953)、hsa-miR-4665-3p:CUCGGCCGCGGCGCGUAGCCCCCGCC(配列番号954)、hsa-miR-4472:GGUGGGGGGUGUUGUUUU(配列番号955)、hsa-miR-4281:GGGUCCCGGGGAGGGGGG(配列番号956)、hsa-miR-1228:UCACACCUGCCUCGCCCCCC(配列番号957)、hsa-miR-6515-3p:UCUCUUCAUCUACCCCCCAG(配列番号958)、hsa-miR-4525:GGGGGGAUGUGCAUGCUGGUU(配列番号959)、hsa-miR-4433-5p:CGUCCCACCCCCCACUCCUGU(配列番号960)、hsa-miR-3679-3p:CUUCCCCCCAGUAAUCUUCAUC(配列番号961)、hsa-miR-1225-5p:GUGGGUACGGCCCAGUGGGGGG(配列番号962)、hsa-miR-6087:UGAGGCGGGGGGGCGAGC(配列番号963)、hsa-miR-6088:AGAGAUGAAGCGGGGGGGCG(配列番号964)、hsa-miR-296-5p:AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(配列番号965)、及びhsa-miR-1249:ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(配列番号966)(下線は標的GC連続配列を示す)。
一態様において、本発明は、配列番号1-10のいずれか1つの配列(GC連続配列)を少なくとも1つ有する標的配列を有する標的核酸と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列におけるGC連続配列と相補的な部分において、少なくとも1個の塩基を脱塩基化させかつ/若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び/又は、
(ii)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列におけるGC連続配列と相補的な部分が連続する2塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法、に関する。
本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブは、上述の設計方法により設計されたプローブを、本技術分野において周知の方法を利用して製造することができる。特に、DNA/RNA、PNA、LNA等のポリヌクレオ塩基は1塩基ずつ結合させる化学合成に方法が良く知られており、このような方法を採用することができる。例えば、PNAはFmoc固相合成法を用いて、脱塩基する箇所を塩基で伸長する代わりに5-[(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino]pentanoic acidで伸長することにより、塩基を炭素骨格で置換することができる。また、必要に応じて、合成したポリヌクレオ塩基プローブを固相や標識などの修飾物質に結合することもできる。
別の態様において本発明は、被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を高い特異度で検出する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出することを含む方法に関する。
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を定量することを含む方法に関する。
本発明のプローブは、上述のハイブリダイゼーション後に直接測定する検出及び定量方法の他、ハイブリダイゼーションを利用した後に、増幅やライゲーションを利用して検出や定量する方法において用いることもできる。特に増幅を利用する場合には、プライマーとして用いることができる。また、本発明のプローブは、アンチセンスDNAとして用いることができる。このような、アンチセンスDNAは、遺伝子発現のノックアウト/ノックダウンに用いることができる。また、このようなアンチセンスDNAを治療目的で用いることもでき、例えば、遺伝子治療用とすることもできる。
被検サンプル中の標的核酸を、配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に相補的なプローブ(プライマー)を用いた検出又は定量と比較して高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブ(プライマー)を前記被検サンプルと接触させること、
前記標的核酸と相補的な核酸を増幅させること、及び
増幅した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
被検サンプル中の標的核酸を、配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に相補的なプローブを用いた検出又は定量と比較して高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
(i)少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと、(ii)本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと重複する標的配列を有しない相補的なプローブであって、本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列と1~数塩基離れた塩基を前記標的配列の末端とするプローブを前記被検サンプルと接触させること、
前記標的核酸と相補鎖を形成した二種類のプローブをライゲーションにより結合させること、及び
二種類のプローブの結合物を検出又は定量することを含む方法。
プローブと標的とが形成する二本鎖のTm値は、温度を変化させながら各セルの260nmおよび320nmにおける吸光度を測定し、得られた吸光度対温度データから決定した。吸光度変化量の測定装置及び条件は以下の通りとした。吸光度測定は、測定ソフト設定に従って、アニーリングとTm値測定の間行われた。
----------------------------------
測定装置 吸光光度計 UV-2600(島津製作所製)
温度コントローラー TMSPC-8(島津製作所製)
8連セル 208-92097-11(島津製作所製)
測定ソフト UVProbe ver.2.52(島津製作所製)
恒温槽 CCA-1111(EYERA製)
測定ソフト設定 吸光度測定前待機時間:4min.
吸光度測定間隔 :1℃
スリット幅 :1.0nm
積算時間 :3
温度ブランク SSC(1×)
20% DMSO水溶液
測定試料 SSC(1×)
20% DMSO水溶液
プローブ 2μM
標的 2μM
----------------------------------
SSC:Saline Sodium Citrate Buffer
Aw(n、T)=A260(n、T)-A320(n、T)
n:セル番号(n=1、2、...、8)
T:測定時温度(T=20、21、...、95)
Aw(n、T):セル番号nの温度Tにおける温度補正済み吸光度
A260(n、T):セル番号nの温度Tにおける波長260nmの吸光度
A320(n、T):セル番号nの温度Tにおける波長320nmの吸光度
At(n、T)=Aw(n、T)-Aw(1、T)
At(n、T):セル番号nの温度ブランク補正済み吸光度
A(n、T)=At(n、T)/Max(At(n、T))
A(n、T):規格化済み吸光度
Max(At(n、T)):セル番号nのAt(n、T)における最大値
△abs(n)=(Max(A(n、T))-Min(A(n、T)))*100
Tm(n)=Max(dA(n、T)/dT)
本発明の一形態であるPNAを用いたプローブの一部を5-aminopentanoic acid(以下Ape)で置換することにより脱塩基を行った。以下において、「Linker」はプローブを金電極に結合させるためのチオール基を含む構造を表す。本実施例における標的GC連続配列はGGGとし、プローブGC連続配列はCCCとした。Apeによる置換部位を「*」で示す。
(標的配列及び非標的配列)
標的配列 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA(配列番号971)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号972)
(プローブ)
プローブ1 TCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号967)-Linker
プローブ2 TCGCCCTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号968)-Linker
プローブ3 TCGC*CTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号969)-Linker
プローブ4 TCGC*CTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号970)-Linker
上述の実施例2に示した通り、配列中の塩基を欠失させた脱塩基プローブを用いた実験により、GC連続配列の脱塩基が効果的に偽陽性率の低い検出を可能とすることが示された。このことから、GC連続配列が末端付近に存在している配列において、GC連続配列の途中で切断して配列長を短くしたプローブでも同じく偽陽性率の低い検出が可能か否かを調べた。
具体的には、本発明の一形態であるPNAを用いたプローブにおけるGC連続配列を切断して、以下の配列を有する鎖長の異なるプローブを3種類作製した。標的配列(プローブと相補的な配列)および非標的配列(プローブと相補的でない配列)との塩基対形成について、上述の方法によりTm値を測定した。非標的配列はプローブと相補的ではない配列を有するが、標的配列と同じGC連続配列(GGG)を含む。このため、非標的配列はプローブと塩基対を形成しやすく、プローブと塩基対を形成することは偽陽性となることを意味する。本実施例において標的GC連続配列はGGGとし、相補的なプローブGC連続配列はCCCとした。
標的配列 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(配列番号973)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号974)
(プローブ)
プローブ23mer GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT(配列番号975)-Linker
プローブ18mer CCAGCAGACAATGTAGCT(配列番号976)-Linker
プローブ17mer CAGCAGACAATGTAGCT(配列番号977)-Linker
本実施例において「修飾」とは、対応する溶液をピペットにより作用電極上に滴下した後に指定時間だけ指定温度中で静置する工程を指す。また、本実施例において「洗浄」とは、指定温度の指定洗浄液により金電極表面を洗浄する工程を指す。
(1)測定液の調整
リン酸二水素ナトリウム水溶液に対し、pH7.0となるよう水酸化ナトリウムで調整した後、過塩素酸ナトリウムとヘキサシアノ鉄(II)酸カリウムを加えた。測定液の最終濃度は、リン酸二水素ナトリウム 2.5 mM、過塩素酸ナトリウム 5 mM、及びヘキサシアノ鉄(II)酸カリウム 1 mMとした。
本実施例における電気化学測定は、以下の工程により行った。以下の表において、RT:室温(約25℃)、TFA:トリフルオロ酢酸、DMSO:ジメチルスルホキシド、Milli-Q:超純水を表す。
作用電極表面をプローブおよび6-Hydroxy-1-hexanethiol(HHT)で修飾した(図4)。この状態では作用電極表面は帯電していない。そのため、測定液中では設定電位に応じてヘキサシアノ鉄(II)酸イオン(以下、マーカーと称す)は作用電極表面まで到達することができる(図5)。この状態のときのCVによる測定波形(図6)を基本値とする。また、測定1において最大電流値i1を記録した電圧値をV1とする。
非標的核酸を含む試料で電極を修飾した(以下、非相補電極)。非標的核酸はプローブとほとんどハイブリダイゼーションしないため、初期状態(図5)と同様にマーカーが電極表面に到達した。そのため、測定2においても測定1と同様のCV波形(図7)が得られ、測定1において最大電流値i1を記録した電圧値V1における電流値i2は、測定誤差を除けば理論的には測定1における最大電流値i1と同じ値となった。
次に、標的核酸を含む試料で電極を修飾した(以下、相補電極)。プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションしたため、核酸の負電荷によりマーカーが斥力を受けて電極表面に到達しづらくなった(図8)。そのため、得られるCV波形も測定1において最大電流値i1を記録した電圧値V1における電流値i2が低下した(図9)。
以上の結果から、測定した電極が相補電極であったか非相補電極であったかは、測定1において最大電流値i1を記録した電圧値V1における電流値により判定することとした。測定1,2で得られた電流値比i2/i1は、理想的には非相補電極であれば1となり、相補電極であれば1よりも小さくなる。実際的には、測定誤差を考慮して
電流値比i2/i1≧0.9のときは非相補電極であり
電流値比i2/i1<0.9のときは相補電極である
と判定することとした。
上述のCV測定法を用いて、以下の標的配列及び非標的配列に対するプローブ1~4のハイブリダイゼーションの測定を行った。
標的配列 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA(配列番号971)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号972)
(プローブ)
プローブ1 TCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号967)-Linker
プローブ2 TCGCCCTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号968)-Linker
プローブ3 TCGC*CTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号969)-Linker
プローブ4 TCGC*CTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号970)-Linker
標的配列-プローブ1~4:測定1に対する測定2の電流値比がいずれも0.1以下まで低下しているため、標的配列と正しくハイブリダイゼーションした。
非標的配列-プローブ1:電流値比が0.3であり、非標的配列とミスハイブリダイゼーションを起こした。
非標的配列-プローブ2,3:電流値比は0.4、0.7であり、プローブ1の電流値比0.3よりも値が高くなっている為、GC連続配列を一箇所脱塩基したことによるミスハイブリダイゼーションの低減効果が認められた。
非標的配列-プローブ4:電流値比が0.9であり、ミスハイブリダイゼーションを起こさなかった。GC連続配列を二箇所とも脱塩基した効果が認められた。
上述のCV測定法を用いて、以下の標的配列及び非標的配列に対するプローブ1~4のハイブリダイゼーションの測定を行った。
標的配列 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(配列番号973)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号974)
(プローブ)
プローブ23mer GAAACCCAGCGACAATGTAGCT(配列番号975)-Linker
プローブ18mer CCAGCAGACAATGTAGCT(配列番号976)-Linker
プローブ17mer CAGCAGACAATGTAGCT(配列番号977)-Linker
標的配列-プローブ23mer:電流値比が0.0まで低下しており、標的配列と正しくハイブリダイゼーションした。
標的配列-プローブ18,17mer:鎖長が短くなるにつれ電流値比が高くなるが、0.2までで抑えられた。これは、完全長に比べれば標的配列とのハイブリダイゼーションが減少していることを意味するが、それでも相補判定には十分な電流値比低下を保っていた。
非標的配列-プローブ23mer:電流値比が0.7であり、非標的配列とミスハイブリダイゼーションを起こした。
非標的配列-プローブ18,17mer:電流値比が1.0であり、ミスハイブリダイゼーションを完全に抑制した。GC連続配列を3連続塩基未満となるように切断した効果が認められる。
Claims (14)
- 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ標的配列と高い特異度で検出又は定量するための組成物であって、
前記組成物はポリヌクレオ塩基プローブを含み、
前記標的配列は配列番号1-6のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有し、
前記ポリヌクレオ塩基プローブは、前記配列番号1-6のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分における少なくとも1個の塩基が脱塩基化された配列を有し、
前記標的配列における配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合である、組成物。 - 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ標的配列と高い特異度で検出又は定量するための組成物であって、
前記組成物はポリヌクレオ塩基プローブを含み、
前記標的配列は配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有し、
前記ポリヌクレオ塩基プローブは、前記配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分それぞれにおける少なくとも1個の塩基が脱塩基化された配列を有し、
前記標的配列における配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分それぞれにおいて、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合である、組成物。 - 前記ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長が10~50merである、請求項1又は2に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長が15~28merである、請求項3に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオ塩基プローブに標識が結合している、請求項1~請求項4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列における配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、該標的配列における当該配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分の内部に位置する、請求項1及び請求項1を引用する請求項3~請求項5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記ポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列における配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、該標的配列における当該配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分の内部に位置する、請求項2及び請求項2を引用する請求項3~請求項5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的核酸が、10~50merのDNA又はRNAである、請求項1~請求項7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記標的核酸が、miRNAである、請求項8に記載の組成物。
- DNA、RNA、LNA、GNA,BNA又はPNAである、請求項1~請求項9のいずれか1項に記載の組成物。
- 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ配列番号1-6のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分において、少なくとも1個の塩基を脱塩基化させ、前記標的配列における配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合となるように、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。 - 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-10の2つの配列と相補的な部分において、それぞれ少なくとも1個の塩基を脱塩基化させ、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分それぞれにおいて、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合となるように、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。 - 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ被検サンプル中の配列番号1-6のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を、高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の請求項1及び請求項1を引用する請求項3~請求項10のいずれか1項に記載の組成物を前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。 - 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有する標的核酸を、高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の請求項2及び請求項2を引用する請求項3~請求項10のいずれか1項に記載の組成物を前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
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