JP7106517B2 - 偽陽性抑制機能を備えたプローブ、その設計方法及びその利用 - Google Patents

偽陽性抑制機能を備えたプローブ、その設計方法及びその利用 Download PDF

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Description

本発明は、特異度の高い核酸検出に利用可能なプローブ、その設計方法及び当該プローブを利用した核酸検出方法に関する。
近年、20塩基程度のマイクロRNA(miRNA)を含む低分子ノンコーディングRNA(ncRNA)が様々な機能を有することから注目されている。特に、これらのncRNAレベルが疾患と相関する場合には、マーカーとしての利用が可能である。
ハイブリダイゼーションにより標的DNA又はRNAとプローブとを結合させる場合、標的DNA又はRNAの結合部分の配列(以下、「結合配列」という)に結合力の強いグアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列が存在する場合がある。このような場合、標的以外のDNA又はRNAであって、この配列と同じ連続配列を有するDNA又はRNAにもプローブが結合することで、偽陽性が出やすいという事象があった。従来、このような偽陽性を誘発しやすい配列を有する長鎖の標的DNA又はRNAにプローブを結合させる場合には、グアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列を全く含まない部位に対するプローブを設計して利用していた。一般的にハイブリダイゼーションによる特異的配列の検出には18mer程度のプローブ長が必要と考えられている。しかし、miRNAのような20mer程度の短い鎖長で構成される標的配列を検出する場合には、グアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列を全く含まないプローブ設計はできず、偽陽性の発生を回避できない。
このため、miRNAを含むncRNAの検出方法としては、ハイブリダイゼーションによる特異的配列の検出によらない方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を利用した方法や、オリゴヌクレオチドライゲイションアッセイ(OLA)又はリガーゼ連鎖反応(LCR)(特許文献1)などが用いられてきた。
その他、miRNAの測定の特異度を高める方法として、アフィニティの高いLNA(特許文献2)を用いる方法が知られている。しかし、この方法はハイブリダイゼーションにおける結合力を高めるが、グアニン又はシトシンのどちらか一方が多数連続した配列がもたらす偽陽性を回避できなかった。
特許文献3は、光応答性有機基に結合したプローブを用いて、二本鎖を形成したオリゴヌクレオチドに光を照射し、光の吸収の違いを利用してSNPを検出する方法を開示している。本文献におけるプローブとして、SNP部位が変異していない配列及び変異している配列のいずれをも用いることができることが記載されている。その他、特許文献3は、SNP用のプローブとして、SNP部分が変異型に置換されているプローブを開示している。しかし、これらのプローブの配列はいずれも結合させようとする標的配列そのものにおいてSNP部分に変異が挿入されていることから、標的配列とは相補的な配列として設計されるものである。
ペプチド核酸(PNA)は、DNAやRNAにおける糖鎖の代わりに、N-(2-アミノエチル)グリシンがアミド結合で結合した疑似ペプチド骨格を有する、DNA/RNAミメティックである。PNAはDNA/RNAと二本鎖を形成することができることから、新しいプローブとして利用されている(非特許文献1及び非特許文献2)。
特許文献4は、一部の塩基が欠落したPNAと核酸とで二本鎖を形成させるステップと、二本鎖を形成したPNAの塩基が欠落した部分(核酸との間でペアを形成していない部分)に対してタグ化塩基を接触させることにより可逆的に結合させるステップと、当該タグ化塩基を検出することにより、標的核酸を検出するステップと、を含む方法を開示している。この方法において、標識はPNAではなくタグ化塩基に付されており、タグ化塩基のPNAへの結合により、標的核酸を検出している。
非特許文献3は、一塩基置換、脱塩基又はフェニル置換された15merのDNAプローブは、完全に相補的なプローブと比較してTm値が低下し、二本鎖の安定性が低下することを開示している。特に、脱塩基又はフェニル置換されたDNAプローブを用いたDNA・DNAダブルへリックスの場合、Tm値が約40%も減少し、ダブルへリックスの安定性が下がることが報告されている。非特許文献4は、同様に脱塩基又はフェニル置換された15merのPNAプローブを用いてPNA・DNAダブルへリックスを形成させてTm値を測定したところ、脱塩基で4℃、フェニル置換で6.5℃のTm値の低下が見られ、DNAプローブと同様に安定性が下がることが示されている。非特許文献5は、二重らせん構造の内部を修飾する目的で、19merのPNAプローブの1塩基を330nmの吸光度を有するアントラキノン(AQ)で置換している。AQが比較的高いTm値を維持しながら二本鎖内に収まることが示されている一方、脱塩基は二本鎖形成の安定性を下げることが示されている。
国際公開WO2005/098029号 国際公開WO2006/069584号 特開2001-346579号 国際公開WO2009/037473号
Nielsen,P.E.ら、Science;254:1497-1500(1991) Michael Egholmら、Nature;365:566-568(1993) Millicanら、Nucleic Acids Research;12:7435-7453(1984) Hemavathi Challaら、Tetrahedron Letters;40:8333-8336(1999) Bruce Armitageら、Nucleic Acids Research;26:715-720(1998)
本発明は、グアニン又はシトシンのどちらか一方が連続した配列を有する短鎖の標的核酸の検出において、従来技術が採用していたライゲーションや増幅などの煩雑な操作を必要とすることなく、プローブと標的核酸とのハイブリダイゼーションによる二本鎖形成によって偽陽性率低く(特異度高く)検出可能な手段又は定量可能な手段を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、プローブとグアニン又はシトシンのどちらか一方が連続した配列を有する標的核酸とのハイブリダイゼーションによる相補鎖形成における偽陽性率を低下させ、特異度を向上させることを目的とする。特に、本発明は、従来は高い特異度で実施することが困難であった、グアニン又はシトシンのどちらか一方が連続した配列を有する10~50merの標的配列を有する核酸との二本鎖形成において、非標的核酸との非特異的結合を低減させ、それにより高い特異度での検出又は定量を可能とするプローブを提供することを目的とする。一例として、該標的核酸はグアニン又はシトシンが連続した配列を有するmiRNAである。
一般的に、プローブの塩基を置換したり脱塩基化したりして標的配列と一部において相補的でない配列とすることは、標的核酸への結合力を低下させる。例外的に、標識化のためにPNAプローブの1塩基を3,6-ジアザ(N-Boc-アミノエチル)-4,7-ジオキソ-7-(2-アントラキノイル)-へプタン酸等の特定のアントラキノン(AQ)と置換した例において結合力が比較的維持されていることが報告されている。しかし、一般的な核酸検出や核酸解析の分野では、二本鎖形成による核酸検出用プローブにおいて塩基を置換したり脱塩基化したり切断したりして、あえて標的配列と一部において相補的でない配列を採用することは行われてこなかった。また、完全に相補的なプローブの塩基を置換したり脱塩基化したり切断したりすることで、非標的配列との結合を抑制させるという考え方はこれまで存在していなかった。また、PNAはDNAと比べて二本鎖を安定的に形成する一方、ミスマッチに対する感受性もDNAより高いことが知られていた(Michaelら、前掲)。
本発明者らは、このような遺伝子工学の分野における常識的な考え方に拘泥せず、様々なアプローチによりプローブの設計を試みた。その結果、本発明者らは、短鎖のプローブであっても結合力の強い塩基が連続する場合、その一部を切断、脱塩基化又は置換することで、標的核酸への結合力を比較的維持しながら、非標的核酸への結合力を劇的に減少させることができることを見出した。また、本発明者らは、特にこのようなプローブは、結合力の強い塩基(グアニン及びシトシン)が連続する標的核酸の検出において、偽陽性と陽性とを区別可能な程度に、非標的核酸と標的核酸とで異なる結合力を有することを見出した。その結果、結合力の強い塩基(グアニン及びシトシン)が連続する標的核酸の検出において有用なプローブの取得及びその設計を達成するに至った。本発明はかかる知見に基づきなされたものであり、具体的には以下の発明に関する。
(1) 配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分における少なくとも1個の塩基が、脱塩基化されかつ/又は置換され、かつ/あるいは、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列における2塩基以下の配列と相補的な配列を末端に少なくとも1つ有するように切断された配列を有するポリヌクレオ塩基プローブ。
(2) 10~50merである、(1)に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(3) 15~28merである、(2)に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(4) 標識が結合している、(1)~(3)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(5) 前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも1つが、該標的配列における当該配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分の内部に位置する、(1)~(4)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(6) 前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な配列において、前記脱塩基化され又は置換されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合であることを特徴とする、(1)~(5)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(7) 前記標的核酸が、10~50merのDNA又はRNAである、(1)~(6)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(8) 前記標的核酸が、miRNAである、(7)に記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(9) DNA、RNA、LNA、GNA,BNA又はPNAである、(1)~(8)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブ。
(10) 配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分において、少なくとも1個の塩基を脱塩基化させかつ/若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び/又は、
(ii)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な部分が2塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列の末端を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。
(11) 前記ポリヌクレオ塩基プローブが、15~28merである、(10)に記載の方法。
(12) 前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計において、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的なポリヌクレオ塩基が2塩基以下となるように、脱塩基化、置換又は切断するように設計されることを特徴とする、(10)又は(11)に記載の方法。
(13) 被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を、高い特異度で検出する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の(1)~(9)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出することを含む方法。
(14) 被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を、高い特異度で定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の(1)~(9)のいずれかに記載のポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を定量することを含む方法。
本明細書において「グアニン又はシトシンのどちらか一方が3塩基以上連続した配列」又は「GC連続配列」とは同意義であり、GGGGGGG(配列番号1)、CCCCCCC(配列番号2)、GGGGGG(配列番号3)、CCCCCC(配列番号4)、GGGGG(配列番号5)、CCCCC(配列番号6)、GGGG(配列番号7)、CCCC(配列番号8)、GGG(配列番号9)、及びCCC(配列番号10)を意味する。ただし、「置換/脱塩基プローブGC連続配列」又は「置換/脱塩基後のプローブGC連続配列」の語における、「GC連続配列」は、置換/脱塩基前の配列がグアニン又はシトシンのどちらか一方が3塩基以上連続した配列であったことを意味する。
グアニンとシトシンは相補的であることから、標的核酸がGC連続配列を有する場合、それに相補的なプローブもGC連続配列を有する。本明細書においては、GC連続配列の用語は、標的核酸に存在する場合とプローブに存在する場合の両方において用いられる。特に、標的核酸/配列に存在するGC連続配列を「標的核酸/配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列」又は「標的GC連続配列」という。また、プローブに存在する標的GC連続配列と相補的なGC連続配列、特には、切断前、脱塩基化前又は置換前の標的配列と完全に相補的なプローブに存在する、標的GC連続配列と相補的なGC連続配列を「プローブGC連続配列」又は「標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列と相補的な配列部分」という。このような、切断前、脱塩基化前又は置換前の標的配列と完全に相補的なプローブ配列を「完全相補的プローブ配列」ということがある。一方、プローブGC連続配列におけるグアニン又はシトシンが脱塩基化された、又は置換されたプローブ配列を、「置換/脱塩基プローブ配列」といい、置換/脱塩基プローブ配列における、プローブGC連続配列に相当する配列を「置換/脱塩基プローブGC連続配列」という。例えば、図1Aのプローブは完全相補的プローブ配列におけるプローブGC連続配列を示し、図1Bのプローブは、置換/脱塩基プローブ配列における、置換/脱塩基プローブGC連続配列を示す。
本発明において、「ヌクレオ塩基」とは、天然に存在するヌクレオチドの他、ヌクレオチドアナログを含む。天然に存在するヌクレオチドは、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、及び/又はウラシル(U)の塩基を有するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドである。ヌクレオチドアナログとは、上述の天然に存在するデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドと同じ塩基を有するが、リボースの化学構造、及び/又はホスホジエステル結合の化学構造が人為的に改変された人工ヌクレオチドやヌクレオチドミメティックを意味する。例えば、グリコール核酸(Glycol nucleic acid:GNA)、架橋化核酸(Bridged Nucleic Acid:BNA)、2’,4’-架橋化核酸(locked nucleic acid:LNA)、ペプチド核酸(Peptide Nucleic Acid:PNA)、トレオース核酸(Threose nucleic acid:TNA)、及びモルホリノ核酸を挙げることができる。本明細書において、GNA,BNA,LNA、PNA、TNA、及びモルホリノ核酸は、文脈によってモノマーと解釈してもよいし、ポリマーと解釈してもよい。
本発明において、「ポリヌクレオ塩基」とは、上述のヌクレオ塩基が直鎖状に重合した高分子化合物を意味する。ポリヌクレオ塩基は、1種類のヌクレオ塩基のみ(天然に存在するポリヌクレオチドのみ、又はPNAの構成単位のみなど)からなるホモポリマーであってもよい。また、ポリヌクレオ塩基は、2種類以上のヌクレオ塩基(天然に存在するポリヌクレオチドとPNA、又はBNAとLNAなど)のコポリマーであってもよい。よって、DNA及びRNA等のポリヌクレオチド、並びに、GNA、BNA、LNA、PNA、TNA、及びモルホリノ核酸のポリマーもポリヌクレオ塩基に含まれる。本明細書において、ポリヌクレオ塩基は、ピロールイミダゾールポリアミド(Peter B. Dervan et. al., Nature (1998)391-468; P. B. Dervan and R. W. Burli, Current Opinion in Chemical Biology 3 (1999) 688-693; P. B. Dervan, Bioorganic & Medicinal Chemistry 9 (2001) 215-2235.)を含んでいても良い。この場合、本明細書における塩基はピロール及び/又はイミダゾールと置き換えることができる。
本明細書において「プローブ」又は「ポリヌクレオ塩基プローブ」とは同意義であり、標的配列とのハイブリダイゼーションにより二本鎖を形成するために用いられるポリヌクレオ塩基を意味する。本発明のポリヌクレオ塩基プローブは、標的配列と結合する部分として、標的GC連続配列を少なくとも1つ有する標的配列に対して相補的な完全相補的プローブ配列をベースとし、当該完全相補的プローブ配列におけるプローブGC連続配列中の少なくとも1個の塩基が脱塩基化されている、又は置換されている配列(置換/脱塩基プローブ配列)か、あるいは、プローブGC連続配列中の少なくとも1個の塩基から完全相補的プローブの一方の末端までの全ての塩基が切断されている配列を含む。なお、本明細書において、「切断」とは、プローブの設計段階において、プローブの末端に、プローブGC連続配列を構成するアミノ酸のうち2塩基以下のみを残すように設計することを意味し、実際にプローブの製造過程において「切断」することを必要とするものではない。よって、「前記標的配列における配列番号1-10のいずれか1つの配列における2塩基以下の配列と相補的な配列を末端に少なくとも1つ有するように切断された配列」とは、完全相補的プローブに含まれる「プローブGC連続配列部分の」一方の末端に位置する2個以下の塩基を除いた残りの塩基と当該残りの塩基に隣接する「完全相補的プローブの」一方の末端までの全ての塩基が欠落している配列、あるいは、プローブGC連続配列部分の末端に由来する2個以下の塩基をプローブの末端に含む配列を意味する。
標的配列において標的GC連続配列が2か所以上存在する場合、プローブにおける切断、置換又は脱塩基を、いずれか1か所のプローブGC連続配列において行ってもよいし、2か所以上のプローブGC連続配列において行ってもよい。好ましくは、本発明のプローブは、全ての箇所のプローブGC連続配列において切断、置換又は脱塩基されている。例えば、標的配列において標的GC連続配列を2か所以上存在する場合、本発明のプローブは、いずれか1か所のプローブGC連続配列中で切断されて、他のプローブGC連続配列で置換又は脱塩基されていてもよい。あるいは、標的配列において標的GC連続配列を2か所以上存在する場合、本発明のプローブは、2箇所のプローブGC連続配列において切断されており、他のプローブGC連続配列が存在する場合には、当該プローブGC連続配列で置換又は脱塩基されていてもよい。あるいは、標的配列において標的GC連続配列を2か所以上存在する場合、全ての箇所のプローブGC連続配列において置換又は脱塩基されていてもよい。すなわち、全ての箇所のプローブGC連続配列において、切断、置換、及び脱塩基のいずれかのみを用いてもよいし、1つのプローブ内に複数存在するプローブGC連続配列の各々について、それぞれ切断、置換、及び脱塩基のいずれかを用いて、結果的に1つのプローブ内で切断、置換、及び脱塩基が組み合わせて用いられてもよい。また、切断、置換、及び脱塩基は、1箇所のプローブGC連続配列内で組み合わせて用いられてもよい。好ましくは、本発明のプローブは、最初に選択された完全相補的プローブ配列における全ての箇所のプローブGC連続配列において切断、置換又は脱塩基された結果、プローブGC連続配列を持たない。
また、本発明のプローブ又はポリヌクレオ塩基プローブは、上述の標的配列と結合する部分の他に、標的配列と結合しない部分を有していても良い。このような標的配列と結合しない部分は、標識やリンカーであったり、他の分子と結合していたり、安定性向上を目的としていたりすることができる。例えば、このような標的配列と結合しない部分は、タグ配列やリンカー配列等の標的配列に対して相補的でないポリヌクレオ塩基を含んでいても良いし、低分子化合物やタンパク質が結合していてもよい。一例において、標的配列と結合しない部分は、後述の「修飾」である。
本明細書において、「脱塩基化」とは、ヌクレオ塩基における塩基部分が存在しないことを意味する。DNAやRNAの脱塩基は、糖の1’位に塩基が結合しておらず、水酸基、水素原子、低級アシル基(アセチル基等)や低級アルキル基(メチル基等)が結合していることを含む。PNAの脱塩基は、グリシン骨格の3級アミンに結合しているメチルカルボニル基の置換基が、塩基の代わりに水酸基、水素原子、低級アシル基(アセチル基等)や低級アルキル基(メチル基等)であることを含む。又は、PNAの脱塩基は、グリシン骨格の窒素原子が、炭素原子(低級アシル基(アセチル基等)や低級アルキル基(メチル基等)を置換基として有していてもよい)で置換されていることを含む。
また、本明細書において、塩基が「置換」されているとは、ヌクレオ塩基における塩基部分が相補的でない塩基と置換されていることを含む。また、プローブ配列中の塩基が「置換」されているとは、ヌクレオ塩基における塩基部分がアデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、及びチミン以外の基(例えば、フェニル基、アントラキノン基など)に置換されていることを含む。塩基の置換により導入される基は、好ましくは、当該プローブ配列中の置換されていない他の塩基による、標的配列との二本鎖の形成を阻害しない基である。
プローブGC連続配列において、脱塩基化され、若しくは置換される塩基の位置は特に制限されるものではないが、例えば、プローブGC連続配列の内部(G*G、C*CCなど。ここで、「*」は脱塩基化又は置換される塩基を表す。本明細書において、以下同様。)、又は末端(GG*、*CCなど)の塩基であってもよい。好ましくは、プローブGC連続配列の内部のうち、特に中央におけるグアニン又はシトシンが脱塩基化され、若しくは置換される(例えば、C*C、GG*GGなど)。例えば、プローブGC連続配列がGGGの場合、G*Gが好ましく、同様にCCCの場合はC*Cが好ましい。また、好ましくは、置換又は脱塩基後のGC連続配列は、G又はCが3塩基以上連続した配列を持たない。
プローブGC連続配列において、脱塩基化される、又は置換される塩基の数は、標的配列との結合力が維持される限り特に制限されるものではないが、例えば、6~7個のグアニン又はシトシンに対して2又は3個、3~5個のグアニン又はシトシンに対して1又は2個、3~4個のグアニン又はシトシンに対して1個、あるいは、3個のグアニン又はシトシンに対して1個の割合であってよい。
置換/脱塩基プローブGC連続配列の例としては、例えば、G*GG*GG(配列番号11)、GG*G*GG(配列番号12),GG*GG*G(配列番号13)、*G*G*GG(配列番号14)、*G*GG*G(配列番号15)、*GG*G*G(配列番号16)、*GG*GG*(配列番号17)、G*G*G*G(配列番号18)、G*GG*G*(配列番号19)、G*G*GG*(配列番号20)、GG*G*G*(配列番号21)、C*CC*CC(配列番号22)、CC*C*CC(配列番号23)、CC*CC*C(配列番号24)、*C*C*CC(配列番号25)、*C*CC*C(配列番号26)、*CC*C*C(配列番号27)、*CC*CC*(配列番号28)、C*C*C*C(配列番号29)、C*C*CC*(配列番号30)、C*CC*C*(配列番号31)、CC*C*C*(配列番号32)、*GG*GG(配列番号33)、G*G*GG(配列番号34)、G*GG*G(配列番号35)、GG*G*G(配列番号36)、GG*GG*(配列番号37)、*G*G*G(配列番号38)、*G*GG*(配列番号39)、*GG*G*(配列番号40)、G*G*G*(配列番号41)、*CC*CC(配列番号42)、C*C*CC(配列番号43)、C*CC*C(配列番号44)、CC*C*C(配列番号45)、CC*CC*(配列番号46)、*C*C*C(配列番号47)、*C*CC*(配列番号48)、*CC*C*(配列番号49)、C*C*C*(配列番号50)、GG*GG(配列番号51)、*G*GG(配列番号52)、*GG*G(配列番号53)、G*G*G(配列番号54)、G*GG*(配列番号55)、GG*G*(配列番号56)、CC*CC(配列番号57)、*C*CC(配列番号58)、*CC*C(配列番号59)、C*C*C(配列番号60)、C*CC*(配列番号61)、CC*C*(配列番号62)、G*GG(配列番号63)、GG*G(配列番号64)、*G*G(配列番号65)、*GG*(配列番号66)、G*G*(配列番号67)、C*CC(配列番号68)、CC*C(配列番号69)、*C*C(配列番号70)、*CC*(配列番号71)、C*C*(配列番号72)、*GG(配列番号73)、G*G(配列番号74)、GG*(配列番号75)、*G*(配列番号76)、*CC(配列番号77)、C*C(配列番号78)、CC*(配列番号79)、及び*C*(配列番号80)を挙げることができる。
本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、プローブGC連続配列が存在することにより、標的配列以外の配列を有する核酸との結合率(偽陽性率)が高くなる長さであり、具体的には、10~50merである。例えば、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、10mer以上、11mer以上、12mer以上、13mer以上、14mer以上、15mer以上、16mer以上、17mer以上、又は18mer以上とすることができる。
また、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、50mer以下、45mer以下、40mer以下、35mer以下、30mer以下、29mer以下、28mer以下、27mer以下、26mer以下、又は25mer以下とすることができる。
例えば、本発明のポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長は、10~40mer、13~30mer、15~28mer、又は18~25merとすることができる。
なお、上述の「ポリヌクレオ塩基プローブにおける、標的配列と結合する部分の鎖長」は、ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長と読み替えてもよい。
本明細書におけるヌクレオ塩基プローブは、適宜「修飾」されていてもよい。例えば、修飾としては、検出のための標識や、結合のための官能基などが挙げられる。標識としては、核酸検出の分野で利用可能なものであれば特に制限なく利用することができ、例えば、放射性物質(RI)、酵素(ビオチンなど)、ハプテン(ジゴキシゲニン(DIG)など)、アフィニティタグ、及び蛍光色素など様々な手法が知られている。
蛍光色素としては、赤、橙、黄、緑、青、及び紫の様々なものが知られており、ダンシル、TRITC、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、IAEDANS、シアニン色素(Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7)、Hoechst、BFP、CFP、WGFP、GFP、YFP、RFP、EGFP、FITC、AlexaFluor、tdTomato、TRITC、TXRED、mCherry-A、及びmCherry-C等が利用できる。
また、本発明のプローブは固相に固定化されていても良い。例えば、アレイ、ビーズ、又はチップに結合していてもよい。
「結合のための官能基」は、本明細書におけるヌクレオ塩基プローブを固相又は他の物質と結合するために用いられる基であれば特に限定されるものではなく、例えば、水酸基、ハロゲン原子、アミノ基、アミド基、イミド基、グアニジド基、ウレア基、アルケン、アルキン、スルホン酸、カルボン酸基、又はエステル基等を挙げることができる。
本明細書において「標的核酸」とは、本発明のプローブにより存在を検出し、又は定量しようとする目的の核酸であって、GC連続配列を有する核酸を意味する。例えば、本発明のプローブを疾患や障害の診断目的で利用する場合、標的核酸は生体由来のDNA又はRNAを意味する。標的核酸は、GC連続配列を1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、又は1個有していても良い。
標的核酸の長さは特に限定されるものではないが、本発明のプローブは特に標的GC連続配列を避けたプローブを設計できない標的核酸との二本鎖形成に有効であることから、50mer以下、45mer以下、40mer以下、35mer以下、30mer以下、29mer以下、28mer以下、27mer以下、26mer以下、又は25mer以下の標的核酸が好ましい。例えば、標的核酸の鎖長は、10mer以上、11mer以上、12mer以上、13mer以上、14mer以上、15mer以上、16mer以上、17mer以上、又は18mer以上とすることができる。一例として、標的核酸の鎖長は、10~50mer、10~40mer、13~30mer、15~28mer、又は18~25merである。
標的核酸の代表例としては、GC連続配列を有するmiRNAを挙げることができる。このような配列としては、以下の表に記載の配列を挙げることができる。表中において、下線はGC連続配列を示す。配列の横の数値は順に、配列の全長、標的核酸に含まれる標的GC連続配列の数、標的核酸に含まれる最長の標的GC連続配列の長さを表す。
GC連続配列を有する標的配列若しくは標的配列と相補的な配列、又はmiRNAとしては、例えば、次のものを挙げることができる:hsa-miR-3676-5p:AGGAGAUCCUGGGUU(配列番号81)、hsa-miR-4279:CUCUCCUCCCGGCUUC(配列番号82)、hsa-miR-4310:GCAGCAUUCAUGUCCC(配列番号83)、hsa-miR-4261:AGGAAACAGGGCCCA(配列番号84)、hsa-miR-1281:UCGCCUCCUCCUCUCCC(配列番号85)、hsa-miR-3201:GGGAUAUGAAGAAAAAU(配列番号86)、hsa-miR-4251:CCUGAGAAAAGGGCCAA(配列番号87)、hsa-miR-4296:AUGUGGGCUCAGGCUCA(配列番号88)、hsa-miR-4304:CCGGCAUGUCCAGGGCA(配列番号89)、hsa-miR-4317:ACAUUGCCAGGGAGUUU(配列番号90)、hsa-miR-4318:CACUGUGGGUACAUGCU(配列番号91)、hsa-miR-4319:UCCCUGAGCAAAGCCAC(配列番号92)、hsa-miR-4328:CCAGUUUUCCCAGGAUU(配列番号93)、hsa-miR-4419a :UGAGGGAGGAGACUGCA(配列番号94)、hsa-miR-4441:ACAGGGAGGAGAUUGUA(配列番号95)、hsa-miR-4442:GCCGGACAAGAGGGAGG(配列番号96)、hsa-miR-4443:UUGGAGGCGUGGGUUUU(配列番号97)、hsa-miR-4455:AGGGUGUGUGUGUUUUU(配列番号98)、hsa-miR-4481:GGAGUGGGCUGGUGGUU(配列番号99)、hsa-miR-4486:GCUGGGCGAGGCUGGCA(配列番号100)、
hsa-miR-4499:AAGACUGAGAGGAGGGA(配列番号101)、hsa-miR-4535:GUGGACCUGGCUGGGAC(配列番号102)、hsa-miR-1274b:UCCCUGUUCGGGCGCCA(配列番号103)、hsa-miR-1280:UCCCACCGCUGCCACCC(配列番号104)、hsa-miR-4294:GGGAGUCUACAGCAGGG(配列番号105)、hsa-miR-4497:CUCCGGGACGGCUGGGC(配列番号106)、hsa-miR-3195:CGCGCCGGGCCCGGGUU(配列番号107)、hsa-miR-1207-3p:UCAGCUGGCCCUCAUUUC(配列番号108)、hsa-miR-1260:AUCCCACCUCUGCCACCA(配列番号109)、hsa-miR-1274a:GUCCCUGUUCAGGCGCCA(配列番号110)、hsa-miR-1308:GCAUGGGUGGUUCAGUGG(配列番号111)、hsa-miR-1321:CAGGGAGGUGAAUGUGAU(配列番号112)、hsa-miR-1825:UCCAGUGCCCUCCUCUCC(配列番号113)、hsa-miR-3155b:CCAGGCUCUGCAGUGGGA(配列番号114)、hsa-miR-4300:UGGGAGCUGGACUACUUC(配列番号115)、hsa-miR-4308:UCCCUGGAGUUUCUUCUU(配列番号116)、hsa-miR-4320:GGGAUUCUGUAGCUUCCU配列番号117)、hsa-miR-4519:CAGCAGUGCGCAGGGCUG(配列番号118)、hsa-miR-5587-5p:AUGGUCACCUCCGGGACU(配列番号119)、hsa-miR-5703:AGGAGAAGUCGGGAAGGU(配列番号120)、hsa-miR-6126:GUGAAGGCCCGGCGGAGA(配列番号121)、mmu-miR-696:GCGUGUGCUUGCUGUGGG(配列番号122)、hsa-miR-4314:CUCUGGGAAAUGGGACAG(配列番号123)、hsa-miR-4505:AGGCUGGGCUGGGACGGA(配列番号124)、hsa-miR-4530:CCCAGCAGGACGGGAGCG配列番号125)、hsa-miR-4710:GGGUGAGGGCAGGUGGUU配列番号126)、hsa-miR-4417:GGUGGGCUUCCCGGAGGG(配列番号127)、hsa-miR-1224-5p:GUGAGGACUCGGGAGGUGG(配列番号128)、hsa-miR-1290:UGGAUUUUUGGAUCAGGGA(配列番号129)、hsa-miR-3176:ACUGGCCUGGGACUACCGG(配列番号130)、hsa-miR-3649:AGGGACCUGAGUGUCUAAG(配列番号131)、hsa-miR-4289:GCAUUGUGCAGGGCUAUCA(配列番号132)、hsa-miR-4329:CCUGAGACCCUAGUUCCAC(配列番号133)、hsa-miR-4487:AGAGCUGGCUGAAGGGCAG(配列番号134)、hsa-miR-4736:AGGCAGGUUAUCUGGGCUG(配列番号135)、hsa-miR-5588-3p:AAGUCCCACUAAUGCCAGC(配列番号136)、hsa-miR-585:UGGGCGUAUCUGUAUGCUA(配列番号137)、hsa-miR-6070:CCGGUUCCAGUCCCUGGAG(配列番号138)、hsa-miR-6130:UGAGGGAGUGGAUUGUAUG(配列番号139)、hsa-miR-6131:GGCUGGUCAGAUGGGAGUG(配列番号140)、hsa-miR-632:GUGUCUGCUUCCUGUGGGA(配列番号141)、hsa-miR-648:AAGUGUGCAGGGCACUGGU(配列番号142)、mmu-miR-684:AGUUUUCCCUUCAAGUCAA(配列番号143)、mmu-miR-698:CAUUCUCGUUUCCUUCCCU(配列番号144)、hsa-miR-3141:GAGGGGGGUGGAGGAGGA(配列番号145)、hsa-miR-3181:AUCGGGCCCUCGGCGCCGG(配列番号146)、hsa-miR-4265:CUGUGGGCUCAGCUCUGGG(配列番号147)、hsa-miR-4287:UCUCCCUUGAGGGCACUUU(配列番号148)、hsa-miR-4290:UGCCCUCCUUUCUUCCCUC(配列番号149)、hsa-miR-6080:UCUAGUGCGGGCGUUCCCG(配列番号150)、hsa-miR-6129:UGAGGGAGUUGGGUGUAUA(配列番号151)、hsa-miR-6133:UGAGGGAGGAGGUUGGGUA(配列番号152)、hsa-miR-6127:UGAGGGAGUGGGGGGAGG(配列番号153)、rno-miR-347:UGUCCCUCUGGGUCGCCCA(配列番号154)、hsa-miR-1205:UCUGCAGGGUUUGCUUUGAG(配列番号155)、hsa-miR-1231:GUGUCUGGGCGGACAGCUGC(配列番号156)、hsa-miR-1276:UAAAGAGCCCUGUGGAGACA(配列番号157)、hsa-miR-1976:CCUCCUGCCCUCCUUGCUGU(配列番号158)、hsa-miR-3115:AUAUGGGUUUACUAGUUGGU(配列番号159)、hsa-miR-3622b-5p:AGGCAUGGGAGGUCAGGUGA(配列番号160)、hsa-miR-3917:GCUCGGACUGAGCAGGUGGG(配列番号161)、hsa-miR-4301:UCCCACUACUUCACUUGUGA(配列番号162)、hsa-miR-4326:UGUUCCUCUGUCUCCCAGAC(配列番号163)、hsa-miR-4429:AAAAGCUGGGCUGAGAGGCG(配列番号164)、hsa-miR-4485:UAACGGCCGCGGUACCCUAA(配列番号165)、hsa-miR-4506:AAAUGGGUGGUCUGAGGCAA(配列番号166)、hsa-miR-4784:UGAGGAGAUGCUGGGACUGA(配列番号167)、hsa-miR-490-5p:CCAUGGAUCUCCAGGUGGGU(配列番号168)、hsa-miR-572:GUCCGCUCGGCGGUGGCCCA(配列番号169)、hsa-miR-591:AGACCAUGGGUUCUCAUUGU(配列番号170)、hsa-miR-6083:CUUAUAUCAGAGGCUGUGGG(配列番号171)、hsa-miR-609:AGGGUGUUUCUCUCAUCUCU(配列番号172)、hsa-miR-6722-5p:AGGCGCACCCGACCACAUGC(配列番号173)、hsa-miR-877:GUAGAGGAGAUGGCGCAGGG(配列番号174)、mmu-miR-805:GAAUUGAUCAGGACAUAGGG(配列番号175)、hsa-miR-1233:UGAGCCCUGUCCUCCCGCAG(配列番号176)、hsa-miR-202:AGAGGUAUAGGGCAUGGGAA(配列番号177)、hsa-miR-326:CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG(配列番号178)、hsa-miR-4324:CCCUGAGACCCUAACCUUAA配列番号179)、hsa-miR-4648:UGUGGGACUGCAAAUGGGAG(配列番号180)、hsa-miR-4701-3p:AUGGGUGAUGGGUGUGGUGU(配列番号181)、hsa-miR-6086:GGAGGUUGGGAAGGGCAGAG(配列番号182)、mmu-miR-343:UCUCCCUUCAUGUGCCCAGA(配列番号183)、hsa-miR-4507:CUGGGUUGGGCUGGGCUGGG(配列番号184)、gga-miR-757:GCAGAGCUGCAGAUGGGAUUC(配列番号185)、hsa-miR-1178:UUGCUCACUGUUCUUCCCUAG(配列番号186)、hsa-miR-1181:CCGUCGCCGCCACCCGAGCCG(配列番号187)、hsa-miR-1185:AGAGGAUACCCUUUGUAUGUU(配列番号188)、hsa-miR-1203:CCCGGAGCCAGGAUGCAGCUC配列番号189)、hsa-miR-1257:AGUGAAUGAUGGGUUCUGACC(配列番号190)、hsa-miR-1286:UGCAGGACCAAGAUGAGCCCU(配列番号191)、hsa-miR-1288:UGGACUGCCCUGAUCUGGAGA(配列番号192)、hsa-miR-1295:UUAGGCCGCAGAUCUGGGUGA(配列番号193)、hsa-miR-129-5p:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC(配列番号194)、hsa-miR-1302:UUGGGACAUACUUAUGCUAAA(配列番号195)、hsa-miR-1302:UUGGGACAUACUUAUGCUAAA(配列番号196)、hsa-miR-1302:UUGGGACAUACUUAUGCUAAA(配列番号197)、hsa-miR-1302:UUGGGACAUACUUAUGCUAAA(配列番号198)、hsa-miR-1302:UUGGGACAUACUUAUGCUAAA(配列番号199)、hsa-miR-130b*:ACUCUUUCCCUGUUGCACUAC(配列番号200)、
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hsa-miR-1268:CGGGCGUGGUGGUGGGGG(配列番号895)、hsa-miR-4253:AGGGCAUGUCCAGGGGGU(配列番号896)、hsa-miR-4274:CAGCAGUCCCCCCCCUG(配列番号897)、hsa-miR-4278:CUAGGGGGUUUGCCCUUG(配列番号898)、hsa-miR-4488:AGGGGGGGGCUCCGGCG(配列番号899)、hsa-miR-4327:GGCUUGCAUGGGGGACUGG(配列番号900)、
hsa-miR-4271:GGGGGAAGAAAAGGUGGGG(配列番号901)、hsa-miR-6085:AAGGGGCUGGGGGAGCACA(配列番号902)、hsa-miR-2392:UAGGAUGGGGGUGAGAGGUG(配列番号903)、hsa-miR-3676-3p:CCGUGUUUCCCCCACGCUUU(配列番号904)、hsa-miR-371-5p:ACUCAAACUGUGGGGGCACU(配列番号905)、hsa-miR-3960:GGCGGCGGCGGAGGCGGGGG(配列番号906)、hsa-miR-4749-3p:CGCCCCUCCUGCCCCCACAG(配列番号907)、hsa-miR-6124:GGGAAAAGGAAGGGGGAGGA配列番号908)、hsa-miR-4313:AGCCCCCUGGCCCCAAACCC(配列番号909)、hsa-miR-6716-5p:UGGGAAUGGGGGUAAGGGCC(配列番号910)、hsa-miR-1202:GUGCCAGCUGCAGUGGGGGAG(配列番号911)、hsa-miR-1237:UCCUUCUGCUCCGUCCCCCAG(配列番号912)、hsa-miR-4687-3p:UGGCUGUUGGAGGGGGCAGGC(配列番号913)、hsa-miR-5195-3p:AUCCAGUUCUCUGAGGGGGCU(配列番号914)、hsa-miR-625:AGGGGGAAAGUUCUAUAGUCC(配列番号915)、mmu-miR-715:CUCCGUGCACACCCCCGCGUG(配列番号916)、mmu-miR-721:CAGUGCAAUUAAAAGGGGGAA(配列番号917)、hsa-miR-1228*:GUGGGGGGGGCAGGUGUGUG(配列番号918)、hsa-miR-4433-3p:ACAGGAGUGGGGGGGGACAU(配列番号919)、mmu-miR-680:GGGCAUCUGCUGACAUGGGGG(配列番号920)、hsa-miR-149*:AGGGGGGACGGGGGCUGUGC(配列番号921)、hsa-miR-6069:GGGCUAGGGCCUGCUGCCCCC(配列番号922)、hsa-miR-940:AAGGCAGGGCCCCCGCUCCCC(配列番号923)、hsa-miR-150*:CUGGUACAGGCCUGGGGGACAG(配列番号924)、hsa-miR-1913:UCUGCCCCCUCCGCUGCUGCCA(配列番号925)、hsa-miR-302c*:UUUAACAUGGGGGUACCUGCUG(配列番号926)、hsa-miR-3675-3p:CAUCUCUAAGGAACUCCCCCAA(配列番号927)、hsa-miR-373*:ACUCAAAAUGGGGGCGCUUUCC(配列番号928)、hsa-miR-4689:UUGAGGAGACAUGGUGGGGGCC(配列番号929)、hsa-miR-4697-5p:AGGGGGCGCAGUCACUGACGUG(配列番号930)、hsa-miR-4716-3p:AAGGGGGAAGGAAACAUGGAGA(配列番号931)、hsa-miR-4716-5p:UCCAUGUUUCCUUCCCCCUUCU(配列番号932)、hsa-miR-4731-3p:CACACAAGUGGCCCCCAACACU(配列番号933)、hsa-miR-4731-5p:UGCUGGGGGCCACAUGAGUGUG(配列番号934)、hsa-miR-5010-5p:AGGGGGAUGGCAGAGCAAAAUU(配列番号935)、hsa-miR-5698:UGGGGGAGUGCAGUGAUUGUGG(配列番号936)、hsa-miR-625*:GACUAUAGAACUUUCCCCCUCA(配列番号937)、mmu-miR-290-5p:ACUCAAACUAUGGGGGCACUUU(配列番号938)、mmu-miR-292-5p:ACUCAAACUGGGGGCUCUUUUG(配列番号939)、hsa-miR-1225-3p:UGAGCCCCUGUGCCGCCCCCAG(配列番号940)、hsa-miR-4640-3p:CACCCCCUGUUUCCUGGCCCAC(配列番号941)、hsa-miR-4787-5p:GCGGGGGUGGCGGCGGCAUCCC(配列番号942)、hsa-miR-615-5p:GGGGGCCCCGGUGCUCGGAUC配列番号943)、hsa-miR-4750-3p:CCUGACCCCCCCCCCCGCAG(配列番号944)、hsa-miR-361-3p:UCCCCCAGGUGUGAUUCUGAUUU(配列番号945)、hsa-miR-3937:ACAGGCGGCUGUAGCAAUGGGGG(配列番号946)、hsa-miR-3943:UAGCCCCCAGGCUUCACUUGGCG(配列番号947)、hsa-miR-4665-5p:CUGGGGGACGCGUGAGCGCGAGC(配列番号948)、hsa-miR-498:UUUCAAGCCAGGGGGCGUUUUUC(配列番号949)、hsa-miR-4723-5p:UGGGGGAGCCAUGAGAUAAGAGCA(配列番号950)、hsa-miR-637:ACUGGGGGCUUUCGGGCUCUGCGU(配列番号951)、hsa-miR-939:UGGGGAGCUGAGGCUCUGGGGGUG(配列番号952)、hsa-miR-1975:CCCCCACAACCGCGCUUGACUAGCU配列番号953)、hsa-miR-4665-3p:CUCGGCCGCGGCGCGUAGCCCCCGCC(配列番号954)、hsa-miR-4472:GGUGGGGGGUGUUGUUUU(配列番号955)、hsa-miR-4281:GGGCCCGGGGGGGGGG(配列番号956)、hsa-miR-1228:UCACACCUGCCUCGCCCCCC(配列番号957)、hsa-miR-6515-3p:UCUCUUCAUCUACCCCCCAG(配列番号958)、hsa-miR-4525:GGGGGGAUGUGCAUGCUGGUU配列番号959)、hsa-miR-4433-5p:CGUCCCCCCCCCACUCCUGU(配列番号960)、hsa-miR-3679-3p:CUUCCCCCCAGUAAUCUUCAUC(配列番号961)、hsa-miR-1225-5p:GUGGGUACGGCCCAGUGGGGGG(配列番号962)、hsa-miR-6087:UGAGGCGGGGGGGCGAGC(配列番号963)、hsa-miR-6088:AGAGAUGAAGCGGGGGGGCG(配列番号964)、hsa-miR-296-5p:AGGGCCCCCCCUCAAUCCUGU(配列番号965)、及びhsa-miR-1249:ACGCCCUUCCCCCCCUUCUUCA(配列番号966)(下線は標的GC連続配列を示す)。
本明細書において「標的配列」とは、プローブが結合する標的核酸に含まれる配列であって、少なくとも1個の標的GC連続配列を有する配列である。別の表現では、標的配列は、本発明のプローブと二本鎖を形成させることを目的とする配列、すなわち、完全相補的プローブ配列と相補的な配列を意味する。標的配列は、標的核酸の全長配列又は標的核酸の部分配列であってよい。例えば、標的配列は、標的GC連続配列を1~5個、1~4個、1~3個、1~2個、又は1個有していても良い。標的配列が2か所以上の標的GC連続配列を有する場合、これらの標的GC連続配列は互いに離れた位置に存在していても良いし、配列番号873や配列番号965の例のように隣接して存在していてもよい。標的配列の長さは、10~50merである。例えば、本発明の標的配列の鎖長は、10mer以上、11mer以上、12mer以上、13mer以上、14mer以上、15mer以上、16mer以上、17mer以上、又は18mer以上とすることができる。また、本発明の標的配列の鎖長は、50mer以下、45mer以下、40mer以下、35mer以下、30mer以下、29mer以下、28mer以下、27mer以下、26mer以下、又は25mer以下とすることができる。本発明の標的配列の鎖長は、10~40mer、13~30mer、15~28mer、又は18~25merとすることができる。
本明細書において「非標的核酸」とは、本発明のプローブにより存在を検出することを目的とせず、又は本発明のプローブにより定量することを目的としない核酸であって、標的配列と同様のGC連続配列を有する核酸を意味する。「標的配列と同様のGC連続配列」とは、標的配列が有するGC連続配列と同一の配列、及び標的配列が有するGC連続配列より1~数塩基長いか又は短いGC連続配列を意味する。
また、「非標的配列」とは、非標的核酸が有する配列を意味し、標的配列と同様のGC連続配列を有する配列を意味する。
本明細書において、「特異度」とは、プローブと標的核酸とを結合させる場合において、プローブが誤って非標的核酸と結合しない(陰性)割合を意味し、(プローブと結合しなかった非標的核酸の数)/(非標的核酸の総数)で表される。
また、本明細書において、「偽陽性」(false positive)とは、非標的核酸であるにもかかわらず、プローブが誤って結合することを意味する。また、「偽陽性率」とは、非標的核酸を標的核酸として誤って検出する割合を意味し、1-(特異度)、又は(プローブが誤って結合した非標的核酸の数)/(非標的核酸の総数)で表される。本明細書において、「非特異的結合」とは、プローブが非標的核酸と結合することを意味する。「特異的結合」とは、プローブが非標的核酸と結合することなく、標的核酸と結合することをいう。「プローブが非標的核酸と結合することない」とは、「特異度が高い」又は「高い特異度」及び「偽陽性率が低い」と同義であり、例えば、プローブが完全相補的プローブと比較して非標的配列を偽陽性として検出(又は定量)する割合が低いことを意味してもよく、あるいは、特異度0.8、0.9、0.95、0.98、0.99、0.999であってもよい。
本発明のプローブは、標的配列と完全相補的な配列を有するプローブと比較して、非特異的配列への結合が少ないことから、核酸検出における偽陽性率の低い検出又は定量を可能とする。特に、本発明のプローブは、プローブそのものの結合活性を変化させることにより、標的配列と非標的配列への結合力の差を増大させることから、ライゲーションや増幅などの複雑なステップを必要とすることなくシンプルな二本鎖形成により短鎖の核酸を特異度高く検出する又は定量することができる。
図1は、上図のAが、標的配列をGGGとした場合の、完全相補的プローブ配列(CCC)との結合様式を模式化した図を表し、下図のBが、本発明のプローブ(C*C)との結合様式を模式化した図を表す。 図2Aは、プローブ1(TCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号967)-Linker))と標的/非標的配列との間の結合のTm値を測定した結果を示すグラフである。グラフ左縦軸は規格化済み吸光度A(n、T)、右縦軸は規格化済み吸光度の一次微分dA(n、T)/dT、横軸は測定温度T[℃]を表す。実線は規格化済み吸光度A(n、T)、点線は規格化済み吸光度の一次微分dA(n、T)/dTを示す。 図2Bはプローブ2(TCGCCCTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号968)-Linker)と標的/非標的配列との間の結合のTm値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図2Aと同様である。 図2Cはプローブ3(TCGC*CTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号969)-Linker)と標的/非標的配列との間の結合のTm値測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図2Aと同様である。 図2Dはプローブ4(TCGC*CTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号970)-Linker)と標的/非標的配列との間の結合のTm値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図2Aと同様である。 図3Aは、プローブ23merと標的/非標的配列との間の結合のTm値を測定した結果を示すグラフである。グラフ左縦軸は規格化済み吸光度A(n、T)、右縦軸は規格化済み吸光度の一次微分dA(n、T)/dT、横軸は測定温度T[℃]である。グラフの実線は規格化済み吸光度A(n、T)、点線は規格化済み吸光度の一次微分dA(n、T)/dTを示す。 図3Bは、プローブ18merと標的/非標的配列との間の結合のTm値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図3Aと同様である。 図3Cは、プローブ17merと標的/非標的配列との間の結合のTm値を測定した結果を示すグラフである。実線、点線、グラフ左縦軸、右縦軸、及び横軸は図3Aと同様である。 図4は、作用電極表面をプローブおよびHHTで修飾した状態を示す図である。 図5は、作用電極表面をプローブおよびHHTで修飾した状態であり、かつ、マーカーが作用電極表面まで到達する状態を示す図である。 図6は、作用電極表面をプローブおよびHHTで修飾した状態の時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図7は、図6の状態に非標的配列のみを試料として加えた結果を示す。作用電極表面をプローブおよびHHTで修飾した状態であり、かつプローブとハイブリダイゼーションする核酸が存在しなかったために、マーカーが作用電極表面まで到達する状態の時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図8は、作用電極表面をプローブおよびHHTで修飾し、プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションした状態で、マーカーが作用電極表面まで到着しづらい状態を示す図である。 図9は、作用電極表面をプローブおよびHHTで修飾し、プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションした状態で、マーカーが作用電極表面まで到着しづらい状態の時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図10Aは、プローブ1に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図10Bは、プローブ2に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図10Cは、プローブ3に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図10Dは、プローブ4に対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図11Aは、プローブ23merに対して表劇配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図11Bは、プローブ18merに対して表劇配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。 図11Cは、プローブ17merに対して表劇配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示すグラフである。グラフ縦軸が電流を、グラフ横軸が電圧を示す。
1.ポリヌクレオ塩基プローブの設計方法
一態様において、本発明は、配列番号1-10のいずれか1つの配列(GC連続配列)を少なくとも1つ有する標的配列を有する標的核酸と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列におけるGC連続配列と相補的な部分において、少なくとも1個の塩基を脱塩基化させかつ/若しくは置換させることにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、及び/又は、
(ii)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列におけるGC連続配列と相補的な部分が連続する2塩基以下となるように該完全相補的プローブ配列を切断することにより、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法、に関する。
好ましくは、本発明のポリヌクレオ塩基プローブ配列は、プローブ配列中の標的GC連続配列と相補的なポリヌクレオ塩基配列(プローブGC連続配列)において、グアニン又はシトシンのどちらか一方が連続する塩基数が2塩基以下となるように、脱塩基化、置換又は切断して設計される。
本発明の方法において、標的配列は、標的核酸に含まれ、少なくとも1個のGC連続配列を含む任意の配列を選択することができる。標的配列の長さは、標的核酸の特異的検出が可能な長さであれば特に制限されるものではなく、上述の標的配列の長さとすることができる。完全相補的プローブ配列は、前記標的配列と完全に相補的なポリヌクレオ塩基配列として得ることができる。
脱塩基化させる又は置換させる塩基の位置及び数は、上述の本発明のプローブGC連続配列における置換/脱塩基のいずれを採用することもできる。「脱塩基化」は、塩基部分を水素原子、水酸基、低級アルキル基、低級アシル基等で置換することにより行うことができる。また、PNAの場合、脱塩基化は、グリシン骨格の窒素原子を、炭素原子(低級アシル基(アセチル基等)や低級アルキル基(メチル基等)を置換基として有していてもよい)と置換することにより行っても良い。また、「置換」は、塩基部分を相補的でない塩基(天然の塩基又は人工塩基など)と置換することにより行うこともできるし、他の塩基による二重らせん構造の形成を阻害しない基、例えば、フェニル基、アントラキノン基などと置換して行ってもよい。好ましくは、置換/脱塩基プローブ配列は、プローブGC連続配列を持たないように設計される。
完全相補的プローブ配列の切断は、プローブGC連続配列内で該完全相補的プローブ配列を切断することにより行う。切断は、切断により得られる断片のうち、ポリヌクレオ塩基プローブとして利用することを意図する断片が、プローブGC連続配列に由来するグアニン又はシトシンをその末端に2塩基以下有することとなるような位置で行う。よって、切断により得られるポリヌクレオ塩基プローブは、一方又は両方の末端に、1若しくは2塩基のグアニンを有するか又は1若しくは2塩基のシトシンを有する。
完全相補的プローブ配列が、2か所以上のプローブGC連続配列を有する場合、以上の置換、脱塩基、及び切断は、単独で又は組み合わせて当該2か所以上のGC連続配列で行うことにより、ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計してもよい。好ましくは、本発明の設計においてプローブ中の全てのプローブGC連続配列において、置換、脱塩基、及び切断が行われる。よって、好ましくは、ポリヌクレオ塩基プローブ配列はプローブGC連続配列を持たないように設計される。
本明細書において、GC連続配列を少なくとも1つ有する標的配列を「高い特異度で結合、検出、又は定量」する、又は「特異的に検出/結合」するとは、(置換/脱塩基されていない)標的配列と相補的なプローブ(完全相補的プローブ配列を有するプローブ、以下「完全相補的プローブ」という)と比較して、低い割合で非標的配列を偽陽性として検出(又は定量)することを意味する。被検プローブが完全相補的プローブと比較して非標的配列を偽陽性として検出(又は定量)する割合が低いか否かは、例えば、両プローブの非標的配列への結合について二本鎖の50%が解離して一本鎖になる温度(メルティング・テンパレーチャー:Tm値)を測定し、被検プローブのTm値が完全相補的プローブのTm値よりも低いか、あるいは、被検プローブのTm値が測定できない(二本鎖を形成しない)場合に、当該被検プローブは、完全相補的プローブと比較して非標的配列を偽陽性として検出(又は定量)する割合が低いと判定することができる。あるいは、特異度0.8、0.9、0.95、0.98、0.99、0.999などで、結合、検出、又は定量することを意味してもよい。
2.ポリヌクレオ塩基プローブの製造
本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブは、上述の設計方法により設計されたプローブを、本技術分野において周知の方法を利用して製造することができる。特に、DNA/RNA、PNA、LNA等のポリヌクレオ塩基は1塩基ずつ結合させる化学合成に方法が良く知られており、このような方法を採用することができる。例えば、PNAはFmoc固相合成法を用いて、脱塩基する箇所を塩基で伸長する代わりに5-[(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)amino]pentanoic acidで伸長することにより、塩基を炭素骨格で置換することができる。また、必要に応じて、合成したポリヌクレオ塩基プローブを固相や標識などの修飾物質に結合することもできる。
3.本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを用いたGC連続配列を有する標的核酸の検出又は定量方法
別の態様において本発明は、被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を高い特異度で検出する方法であって、
前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出することを含む方法に関する。
別の態様において本発明は、被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を高い特異度で定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブを前記被検サンプルと接触させること、及び
前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を定量することを含む方法に関する。
本発明の検出方法及び定量方法において、被検サンプルは、検出又は定量対象となる標的核酸の存在又は量を調べようとする目的の試料を用いて調製することができる。例えば、診断目的の場合、DNA又はRNAが検出されうる試料であれば特に制限されるものではなく、リンパ液、血液(血清、血漿)、尿、便、唾液、髄液、涙、バイオプシー、毛、皮膚、爪、浸出液、細胞(例えば、血中循環腫瘍細胞(CTC))などの体液や組織、エクソソーム、又はセルフリーDNAを用いることができる。これらの試料は適宜DNA又はRNAの検出に適したサンプルとして調製される。
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと、被検サンプルとの接触は、例えば、バッファー中で本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと被検サンプルとを混合することにより行うことができる。特に、本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブが固相に結合している場合、静置状態で静的に接触させるほか、マイクロ流路等により動的に接触させることもできる。
ポリヌクレオ塩基プローブと結合した標的核酸の検出又は定量は、核酸検出の分野で広く知られた方法を採用することができる。プローブに標識が結合している場合、当該標識の種類に応じた検出・定量方法を採用することができる。また、プローブに標識が結合していない場合、二本鎖に挿入される挿入剤を用いて電気的に検出又は定量することもできる(特開2006-061061号等参照)。
4.本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブの他の利用方法
本発明のプローブは、上述のハイブリダイゼーション後に直接測定する検出及び定量方法の他、ハイブリダイゼーションを利用した後に、増幅やライゲーションを利用して検出や定量する方法において用いることもできる。特に増幅を利用する場合には、プライマーとして用いることができる。また、本発明のプローブは、アンチセンスDNAとして用いることができる。このような、アンチセンスDNAは、遺伝子発現のノックアウト/ノックダウンに用いることができる。また、このようなアンチセンスDNAを治療目的で用いることもでき、例えば、遺伝子治療用とすることもできる。
例えば、本発明に係るプローブは、以下の方法に用いることができる:
被検サンプル中の標的核酸を、配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に相補的なプローブ(プライマー)を用いた検出又は定量と比較して高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブ(プライマー)を前記被検サンプルと接触させること、
前記標的核酸と相補的な核酸を増幅させること、及び
増幅した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
あるいは、本発明に係るプローブは、以下の方法に用いることができる:
被検サンプル中の標的核酸を、配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に相補的なプローブを用いた検出又は定量と比較して高い特異度で検出又は定量する方法であって、
前記標的核酸を定量するための被検サンプルを調整すること、
(i)少なくとも1種類の本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと、(ii)本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブと重複する標的配列を有しない相補的なプローブであって、本発明に係るポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列と1~数塩基離れた塩基を前記標的配列の末端とするプローブを前記被検サンプルと接触させること、
前記標的核酸と相補鎖を形成した二種類のプローブをライゲーションにより結合させること、及び
二種類のプローブの結合物を検出又は定量することを含む方法。
以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本出願は、2017年2月22日に日本国において出願された特願2017-030553号に基づく優先権を主張するものであり、当該出願に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。また、本願において引用した全ての特許、特許出願及び文献に記載された内容は全て、参照によりそのまま本明細書に援用される。
(実施例1)Tm値決定方法
プローブと標的とが形成する二本鎖のTm値は、温度を変化させながら各セルの260nmおよび320nmにおける吸光度を測定し、得られた吸光度対温度データから決定した。吸光度変化量の測定装置及び条件は以下の通りとした。吸光度測定は、測定ソフト設定に従って、アニーリングとTm値測定の間行われた。
----------------------------------
測定装置 吸光光度計 UV-2600(島津製作所製)
温度コントローラー TMSPC-8(島津製作所製)
8連セル 208-92097-11(島津製作所製)
測定ソフト UVProbe ver.2.52(島津製作所製)
恒温槽 CCA-1111(EYERA製)
測定ソフト設定 吸光度測定前待機時間:4min.
吸光度測定間隔 :1℃
スリット幅 :1.0nm
積算時間 :3
温度ブランク SSC(1×)
20% DMSO水溶液
測定試料 SSC(1×)
20% DMSO水溶液
プローブ 2μM
標的 2μM
----------------------------------
SSC:Saline Sodium Citrate Buffer
具体的には、測定する各プローブ/標的の組み合わせ核酸試料又は温度ブランクを加えたセルを、95℃で10分間アニーリング前待機させた後、95℃から20℃まで0.5℃/分で降温させてアニーリングさせた。その後、20℃で60分間Tm値測定前待機させた後、20℃から95℃まで0.5℃/分で昇温させてTm値を測定した。温度ブランクを用いてベースラインを測定し、温度ブランクセルのデータを用いて、波長範囲330nm~250nmについてベースライン補正を行った。
得られた2波長(260nm、320nm)における吸光度に基づき、試料内核酸の吸光度A260(n、T)から、環境依存性の吸光度変動A320(n、T)を差し引く2波長補正を行い、温度補正済み吸光度Awを計算した。
Aw(n、T)=A260(n、T)-A320(n、T)
n:セル番号(n=1、2、...、8)
T:測定時温度(T=20、21、...、95)
Aw(n、T):セル番号nの温度Tにおける温度補正済み吸光度
A260(n、T):セル番号nの温度Tにおける波長260nmの吸光度
A320(n、T):セル番号nの温度Tにおける波長320nmの吸光度
更に、溶媒の温度変化による吸光度変動分を除くため、核酸試料のAw(n、T)から温度ブランクセルのAw(1、T)を差し引いて温度補正を行って温度ブランク補正済み吸光度Atを計算した。
At(n、T)=Aw(n、T)-Aw(1、T)
At(n、T):セル番号nの温度ブランク補正済み吸光度
得られたAt(n、T)の最大値が1となるように規格化することで、規格化済み吸光度Aを計算した。これにより、Max(A(n、T))=1となる。
A(n、T)=At(n、T)/Max(At(n、T))
A(n、T):規格化済み吸光度
Max(At(n、T)):セル番号nのAt(n、T)における最大値
上記計算により得られたA(n、T)を元に、塩基対形成量の多寡を示すセル番号nの吸光度変化量[%]△abs(n)、並びに、Tm値[℃]を示すセル番号nの温度による一次微分の最大値Tm(n)を以下の式に従い求めた。以下の式において、Min(At(n、T))は、セル番号nのAt(n、T)における最小値を表す。
△abs(n)=(Max(A(n、T))-Min(A(n、T)))*100
Tm(n)=Max(dA(n、T)/dT)
(実施例2)脱塩基プローブ
本発明の一形態であるPNAを用いたプローブの一部を5-aminopentanoic acid(以下Ape)で置換することにより脱塩基を行った。以下において、「Linker」はプローブを金電極に結合させるためのチオール基を含む構造を表す。本実施例における標的GC連続配列はGGGとし、プローブGC連続配列はCCCとした。Apeによる置換部位を「*」で示す。
図1Aは脱塩基非含有の状態を示し、PNAプローブ(図中下部)のCCCと標的RNA(図中上部)のGGGが塩基対を形成している。図1BはシトシンのApe置換による脱塩基を適用した状態を示し、プローブ(図中下部)のC*Cと試料中RNA(図中上部)のGGGは一部塩基対を形成できていない様子を示している。
脱塩基効果を確認するため、以下の配列を有するプローブ1~4の4種類のプローブを用いて、標的配列(プローブと相補的な配列)および非標的配列(プローブと相補的でない配列)との塩基対形成について、上述の方法によりTm値を測定した。非標的配列はプローブと相補的ではない配列を有するが、標的配列と同じGC連続配列(GGG)を含む。このため、非標的配列はプローブと塩基対を形成しやすく、非標的配列がプローブと塩基対を形成することは偽陽性となることを意味する。
(標的配列及び非標的配列)
標的配列 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA(配列番号971)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGGGGG(配列番号972)
(プローブ)
プローブ1 TCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号967)-Linker
プローブ2 TCGCCCTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号968)-Linker
プローブ3 TCGC*CTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号969)-Linker
プローブ4 TCGC*CTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号970)-Linker
前記プローブと標的/非標的配列の組み合わせ8通りのTm値を、実施例1で示した手法により測定した結果を図2A~図2Dに示す。プローブ1と非標的配列との結合のTm値は58℃である。△absは10%と高く、プローブ1が本来非相補鎖である非標的配列と塩基対を形成していることが示された。それに対し、脱塩基プローブ2、3、及び4では、非標的配列に対する△absにおいて差が顕れており、脱塩基1部位よりも2部位のプローブ4では更に減少傾向がみえる。2箇所以上のGC連続配列を有する標的配列に対して、相補的なプローブにおける両方のGC連続配列に相補的な部分をApeで置換したプローブ(2部位置換プローブ)を用いることで、非標的配列との非特異的塩基対形成(偽陽性)を効果的に減少できることが示された。プローブ4では、非標的配列との塩基対形成におけるdA(n、T)/dTの変動はノイズレベルでありTm値は求めることができなかった。よって、プローブ4は、どの温度においても非標的配列とは結合していないと考えられる。一方で、標的配列に対するTm値も脱塩基部位の増加にともない低下する傾向をみせたが、2部位置換プローブでも58℃あり、△absも高い。このことから、標的と問題なく二重鎖を形成していることが確認された。よって、脱塩基プローブを用いて温度を適切にコントロールすることにより、偽陽性率の低い標的配列の検出が可能であることが示された。
(実施例3)鎖長違いプローブ
上述の実施例2に示した通り、配列中の塩基を欠失させた脱塩基プローブを用いた実験により、GC連続配列の脱塩基が効果的に偽陽性率の低い検出を可能とすることが示された。このことから、GC連続配列が末端付近に存在している配列において、GC連続配列の途中で切断して配列長を短くしたプローブでも同じく偽陽性率の低い検出が可能か否かを調べた。
具体的には、本発明の一形態であるPNAを用いたプローブにおけるGC連続配列を切断して、以下の配列を有する鎖長の異なるプローブを3種類作製した。標的配列(プローブと相補的な配列)および非標的配列(プローブと相補的でない配列)との塩基対形成について、上述の方法によりTm値を測定した。非標的配列はプローブと相補的ではない配列を有するが、標的配列と同じGC連続配列(GGG)を含む。このため、非標的配列はプローブと塩基対を形成しやすく、プローブと塩基対を形成することは偽陽性となることを意味する。本実施例において標的GC連続配列はGGGとし、相補的なプローブGC連続配列はCCCとした。
(標的配列及び非標的配列)
標的配列 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(配列番号973)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号974)
(プローブ)
プローブ23mer GAAACCCAGCAGACAATGTAGCT(配列番号975)-Linker
プローブ18mer CCAGCAGACAATGTAGCT(配列番号976)-Linker
プローブ17mer CAGCAGACAATGTAGCT(配列番号977)-Linker
前記プローブと標的/非標的配列の組み合わせ6通りのTm値を、実施例1で示した手法により測定した結果を図3A~図3Cに示す。
プローブ23merとプローブ18mer又はプローブ17merとの間では、非標的配列に対する△absに大きな差がみられる。しかし、プローブ18merとプローブ17merとの間では差が見られず、3連続シトシンから1塩基短くなるだけで非標的配列との塩基対をほとんど形成しなくなることが示された。一方で、標的配列に対するTm値は鎖長を短くするにつれ低下する傾向をみせたが、17merプローブでもTm値は70℃であり△absも高い。このため、標的と二重鎖を形成していることが確認された。よって、プローブ又は標的配列の末端付近にGC連続配列が存在する場合、プローブの鎖長を短くすることで非標的配列との非特異的塩基対形成(偽陽性)を減らす効果があることが示された。プローブ18mer及びプローブ17merでは、非標的配列との塩基対形成におけるdA(n、T)/dTの変動はノイズレベルでありTm値は求めることができなかった。よって、プローブ18mer及びプローブ17merは、どの温度においても非標的配列とは結合していないと考えられる。よって、短鎖プローブを用いて温度を適切にコントロールすることにより、偽陽性率の低い標的配列の検出が可能であることが示された。
(実施例4)電気化学測定による核酸検出方法の確立
本実施例において「修飾」とは、対応する溶液をピペットにより作用電極上に滴下した後に指定時間だけ指定温度中で静置する工程を指す。また、本実施例において「洗浄」とは、指定温度の指定洗浄液により金電極表面を洗浄する工程を指す。
(1)測定液の調整
リン酸二水素ナトリウム水溶液に対し、pH7.0となるよう水酸化ナトリウムで調整した後、過塩素酸ナトリウムとヘキサシアノ鉄(II)酸カリウムを加えた。測定液の最終濃度は、リン酸二水素ナトリウム 2.5 mM、過塩素酸ナトリウム 5 mM、及びヘキサシアノ鉄(II)酸カリウム 1 mMとした。
(2)測定方法
本実施例における電気化学測定は、以下の工程により行った。以下の表において、RT:室温(約25℃)、TFA:トリフルオロ酢酸、DMSO:ジメチルスルホキシド、Milli-Q:超純水を表す。
Figure 0007106517000001
試料としては、規定濃度の標的核酸または非標的核酸のいずれかを含む溶液を用いた。測定は、作用電極:金電極 直径300μm、対向電極:BAS社製 Ptカウンター電極 5cm、参照電極:BAS社製 RE-1B水系参照電極(Ag/AgCl)、ポテンショスタット(BioDeviceTechnology社製 miniSTAT100)を用いサイクリックボルタンメトリー(以下、CV)で行った。測定条件(miniStat100設定内容)は、以下の通りとした。
Figure 0007106517000002
(3)測定1
作用電極表面をプローブおよび6-Hydroxy-1-hexanethiol(HHT)で修飾した(図4)。この状態では作用電極表面は帯電していない。そのため、測定液中では設定電位に応じてヘキサシアノ鉄(II)酸イオン(以下、マーカーと称す)は作用電極表面まで到達することができる(図5)。この状態のときのCVによる測定波形(図6)を基本値とする。また、測定1において最大電流値i1を記録した電圧値をV1とする。
(4)測定2-非標的核酸
非標的核酸を含む試料で電極を修飾した(以下、非相補電極)。非標的核酸はプローブとほとんどハイブリダイゼーションしないため、初期状態(図5)と同様にマーカーが電極表面に到達した。そのため、測定2においても測定1と同様のCV波形(図7)が得られ、測定1において最大電流値i1を記録した電圧値V1における電流値i2は、測定誤差を除けば理論的には測定1における最大電流値i1と同じ値となった。
(5)測定2-標的核酸
次に、標的核酸を含む試料で電極を修飾した(以下、相補電極)。プローブと標的核酸がハイブリダイゼーションしたため、核酸の負電荷によりマーカーが斥力を受けて電極表面に到達しづらくなった(図8)。そのため、得られるCV波形も測定1において最大電流値i1を記録した電圧値V1における電流値i2が低下した(図9)。
(6)ハイブリダイゼーション判定方法の決定
以上の結果から、測定した電極が相補電極であったか非相補電極であったかは、測定1において最大電流値i1を記録した電圧値V1における電流値により判定することとした。測定1,2で得られた電流値比i2/i1は、理想的には非相補電極であれば1となり、相補電極であれば1よりも小さくなる。実際的には、測定誤差を考慮して
電流値比i2/i1≧0.9のときは非相補電極であり
電流値比i2/i1<0.9のときは相補電極である
と判定することとした。
(実施例5)プローブのGC連続配列の脱塩基による核酸検出への影響評価
上述のCV測定法を用いて、以下の標的配列及び非標的配列に対するプローブ1~4のハイブリダイゼーションの測定を行った。
標的配列 AAAAGCUGGGUUGAGAGGGCGA(配列番号971)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号972)
(プローブ)
プローブ1 TCGCCCTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号967)-Linker
プローブ2 TCGCCCTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号968)-Linker
プローブ3 TCGC*CTCTCAACCCAGCTTTT(配列番号969)-Linker
プローブ4 TCGC*CTCTCAAC*CAGCTTTT(配列番号970)-Linker
図10に各プローブに対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示す。測定1のCV波形を点線、測定2のCV波形を実線で示して、左上に電流値比を記載した。
標的配列-プローブ1~4:測定1に対する測定2の電流値比がいずれも0.1以下まで低下しているため、標的配列と正しくハイブリダイゼーションした。
非標的配列-プローブ1:電流値比が0.3であり、非標的配列とミスハイブリダイゼーションを起こした。
非標的配列-プローブ2,3:電流値比は0.4、0.7であり、プローブ1の電流値比0.3よりも値が高くなっている為、GC連続配列を一箇所脱塩基したことによるミスハイブリダイゼーションの低減効果が認められた。
非標的配列-プローブ4:電流値比が0.9であり、ミスハイブリダイゼーションを起こさなかった。GC連続配列を二箇所とも脱塩基した効果が認められた。
(実施例6)プローブのGC連続配列切断による核酸検出への影響評価
上述のCV測定法を用いて、以下の標的配列及び非標的配列に対するプローブ1~4のハイブリダイゼーションの測定を行った。
標的配列 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC(配列番号973)
非標的配列 UGGCAGGGAGGCUGGGAGGGG(配列番号974)
(プローブ)
プローブ23mer GAAACCCAGCGACAATGTAGCT(配列番号975)-Linker
プローブ18mer CCAGCAGACAATGTAGCT(配列番号976)-Linker
プローブ17mer CAGCAGACAATGTAGCT(配列番号977)-Linker
図11に各プローブに対して標的配列・非標的配列をそれぞれ修飾した時のCV波形を示す。測定1のCV波形を点線、測定2のCV波形を実線で示して、左上に電流値比を記載した。
標的配列-プローブ23mer:電流値比が0.0まで低下しており、標的配列と正しくハイブリダイゼーションした。
標的配列-プローブ18,17mer:鎖長が短くなるにつれ電流値比が高くなるが、0.2までで抑えられた。これは、完全長に比べれば標的配列とのハイブリダイゼーションが減少していることを意味するが、それでも相補判定には十分な電流値比低下を保っていた。
非標的配列-プローブ23mer:電流値比が0.7であり、非標的配列とミスハイブリダイゼーションを起こした。
非標的配列-プローブ18,17mer:電流値比が1.0であり、ミスハイブリダイゼーションを完全に抑制した。GC連続配列を3連続塩基未満となるように切断した効果が認められる。

Claims (14)

  1. 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ標的配列と高い特異度で検出又は定量するための組成物であって、
    前記組成物はポリヌクレオ塩基プローブを含み、
    前記標的配列は配列番号1-6のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有し、
    前記ポリヌクレオ塩基プローブは、前記配列番号1-のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号1-のいずれか1つの配列と相補的な部分における少なくとも1個の塩基が脱塩基化れた配列を有し、
    前記標的配列における配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合である、組成物。
  2. 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ標的配列と高い特異度で検出又は定量するための組成物であって、
    前記組成物はポリヌクレオ塩基プローブを含み、
    前記標的配列は配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有し、
    前記ポリヌクレオ塩基プローブは、前記配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有する標的配列に対して相補的な配列において、前記標的配列における当該配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分それぞれにおける少なくとも1個の塩基が脱塩基化された配列を有し、
    前記標的配列における配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分それぞれにおいて、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合である、組成物。
  3. 前記ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長が10~50merである、請求項1又は2に記載の組成物。
  4. 前記ポリヌクレオ塩基プローブの鎖長が15~28merである、請求項に記載の組成物。
  5. 前記ポリヌクレオ塩基プローブに標識が結合している、請求項1~請求項のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 前記ポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列における配列番号1-のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されいる塩基の少なくとも1つが、該標的配列における当該配列番号1-のいずれか1つの配列と相補的な部分の内部に位置する、請求項1及び請求項1を引用する請求項3~請求項5のいずれか1項に記載の組成物。
  7. 前記ポリヌクレオ塩基プローブの前記標的配列における配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、該標的配列における当該配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分の内部に位置する、請求項2及び請求項2を引用する請求項3~請求項5のいずれか1項に記載の組成物。
  8. 前記標的核酸が、10~50merのDNA又はRNAである、請求項1~請求項のいずれか1項に記載の組成物。
  9. 前記標的核酸が、miRNAである、請求項に記載の組成物。
  10. DNA、RNA、LNA、GNA,BNA又はPNAである、請求項1~請求項のいずれか1項に記載の組成物。
  11. 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ配列番号1-のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
    A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
    B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-のいずれか1つの配列と相補的な部分において、少なくとも1個の塩基を脱塩基化させ、前記標的配列における配列番号1-6のいずれか1つの配列と相補的な部分において、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合となるように、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計することを含む方法。
  12. 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有する標的配列と高い特異度で結合可能なポリヌクレオ塩基プローブ配列の設計方法であって、
    A)該標的配列と完全に相補的な10~50merの配列を完全相補的プローブ配列として選択すること、
    B)(i)該完全相補的プローブ配列における、前記標的配列における配列番号1-10の2つの配列と相補的な部分において、それぞれ少なくとも1個の塩基を脱塩基化させ、前記標的配列における配列番号1-10のいずれか2つの配列と相補的な部分それぞれにおいて、前記脱塩基化されている塩基の少なくとも1つが、3~5個のグアニン又はシトシンのどちらか一方に対して1個の割合となるように、前記ポリヌクレオ塩基プローブ配列を設計すること、を含む方法。
  13. 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ被検サンプル中の配列番号1-のいずれか1つの配列を少なくとも1つ有する標的核酸を、高い特異度で検出又は定量する方法であって、
    前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
    少なくとも1種類の請求項1及び請求項1を引用する請求項3~請求項10のいずれか1項に記載の組成物を前記被検サンプルと接触させること、及び
    前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
  14. 非標的配列に対する偽陽性を低減しつつ被検サンプル中の配列番号1-10のいずれか1つの配列を少なくとも2つ有する標的核酸を、高い特異度で検出又は定量する方法であって、
    前記標的核酸を検出するための被検サンプルを調整すること、
    少なくとも1種類の請求項2及び請求項2を引用する請求項3~請求項10のいずれか1項に記載の組成物を前記被検サンプルと接触させること、及び
    前記ポリヌクレオ塩基プローブと結合した前記標的核酸を検出又は定量することを含む方法。
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